JP2003514579A5

JP2003514579A5 -

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Publication number: JP2003514579A5
Application number: JP2001540156A
Authority: JP
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2020-11-22

Description

【書類名】明細書
【発明の名称】ビタミンＤ核内受容体から誘導されるポリペプチドおよび特にビタミンＤ類似体のスクリーニングのためのその使用
【特許請求の範囲】
【請求項１】ビタミンＤ核内受容体を有するヒトまたは異なる動物種におけるビタミンＤ核内受容体から誘導されたポリペプチドであって、核内受容体は、リガンド結合ドメインすなわちＬＢＤを含み、このＬＢＤは、可撓性挿入ドメインを含み、
該誘導されたポリペプチドが、下記：
−該核内受容体のペプチド配列：
＊ＬＢＤの可撓性挿入ドメインが、少なくとも約３０アミノ酸のか、更に好ましくは少なくとも約４０アミノ酸のか、またはこの挿入ドメインを含むすべてのアミノ酸の置換または欠失によって修飾され、
＊および、適切な場合には、該ＶＤＲのペプチド配列の位置１〜約１２５に、特に位置１〜１１７または１２３に位置する１以上またはすべてのアミノ酸が、置換または欠失によって修飾され、
該誘導されたポリペプチドが、下記：
＊ビタミンＤ受容体のリガンド結合およびＬＢＤトランス活性化特性が、保存され、
＊それらは、安定であり、すなわち、特にpH７の１００mM ＮａＣｌ中で少なくとも約１週間で不安定な非修飾ＬＢＤとは対照的に、ＬＢＤの上述した特性に影響を及ぼさずに保存することができ、
＊懸濁液滴蒸気拡散法によって、特に４℃で、それらを水性溶媒中で結晶化でき、
＊それらが、水性溶媒中で可溶性である、
という特徴を有する、ペプチド配列、
−または、１以上のアミノ酸の特に欠失、付加または置換によって、上で定義されるペプチド配列から誘導されるペプチド配列であって、該誘導された配列が、該誘導されたポリペプチドの上述の特性を有する、ペプチド配列、
を含むことを特徴とする、誘導されたポリペプチド。
【請求項２】区切られたペプチド断片が、欠失される、ビタミンＤ核内受容体のペプチド配列を含有することを特徴とする、請求項１記載の誘導されたポリペプチドであって、
−一方では、ヒトまたは動物起源のビタミンＤ核内受容体のペプチド配列の位置１５５〜１７５の１つにほぼ位置するアミノ酸により、更に詳細には、これらの配列の位置１５９〜１６８の１つに位置するアミノ酸により、
−および、他方では、ヒトまたは動物起源のビタミンＤ核内受容体のペプチド配列の位置２０４〜２２５の１つにほぼ位置するアミノ酸による、
誘導されたポリペプチド。
【請求項３】 −ヒトまたは動物起源のＶＤＲのペプチド配列の位置１１８および４２７、または位置１２４および４２７の位置に位置するアミノ酸によって区切られ、ＶＤＲの該ペプチド配列の位置１６５〜２１５に位置する残基が欠失している、アミノ酸配列、
−または、特に１以上のアミノ酸の欠失、付加または置換によって上述のアミノ酸配列から誘導されたペプチド配列であって、誘導された配列が、請求項１記載の該誘導されたペプチドの上述の特徴を有するペプチド配列
を含むポリペプチドから選択される、請求項１または２記載の誘導されたポリペプチド。
【請求項４】配列番号４、配列番号６および配列番号８のポリペプチドから選択される、請求項１〜３いずれか一項記載の誘導されたポリペプチド。
【請求項５】場合により、ビタミンＤ、または作用性もしくは拮抗性ビタミンＤ類似体と結合し、請求項１〜４いずれか一項記載のポリペプチドを含む結晶。
【請求項６】請求項１〜４いずれか一項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項７】下記ヌクレオチド配列：
−配列番号３、配列番号５および配列番号７の配列、
−または、上述のヌクレオチド配列の遺伝的コードの縮重によって誘導され、請求項４記載のｈＶＤＲから誘導されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
−または、特に１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加によって上述のヌクレオチド配列から誘導され、上で定義したｈＶＤＲから誘導されるポリペプチドから誘導されるペプチド配列をコードし、請求項１記載の上述した該誘導されたペプチドの特徴を有するヌクレオチド配列、
から選択される、請求項６記載のヌクレオチド配列。
【請求項８】本配列の転写に必要な要素、特に転写プロモーターまたはターミネーターと結合した、請求項６または７記載のヌクレオチド配列を含む組換えヌクレオチド配列。
【請求項９】請求項６〜８のいずれか一項記載のヌクレオチド配列を含むベクター、特にプラスミド。
【請求項１０】特にバクテリア例えば大腸菌、またはバキュロウィルスによって感染可能な昆虫細胞から選択される、請求項９記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】下記工程：
−請求項９記載の組換えベクターによる細胞の形質転換、
−このようにして形質転換された細胞の培養および該細胞によって産生された該ポリペプチドの、場合により精製後の回収、
を含むことを特徴とする、請求項１〜４いずれか一項記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項１２】ビタミンＤ類似体のスクリーニング方法を実施するための、請求項１〜４いずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項５記載の結晶の使用。
【請求項１３】特に癌性症状、乾癬、自己免疫疾患、骨形成異常症、または骨粗鬆症の処置における医薬組成物に使用可能な作用性または拮抗性ビタミンＤ類似体のスクリーニング方法を実施するための、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】下記工程：
−試験済みの類似体による、有利には固体担体に結合された、請求項１〜４いずれか一項記載のポリペプチド、または請求項５記載の結晶の導入であって、有利には該誘導されたポリペプチドまたはビタミンＤ類似体の１つが、特に蛍光、放射性または酵素マーカーによってマーキングされている導入、
−特に前工程で使用した担体をすすいだ後に、使用したマーカーを測定することによる、該ポリペプチドまたは該結晶と試験済みの類似体との間のいずれかの結合の検出、
を含むことを特徴とする、ビタミンＤ類似体のスクリーニング方法。
【請求項１５】該ポリペプチドまたは該結晶と特定分子との間で形成された複合体の三次元構造を解析する方法を実施するための、請求項１〜４いずれか一項記載のポリペプチド、または請求項５記載の結晶の使用。
【請求項１６】請求項１〜４いずれか一項記載のポリペプチドまたは請求項５記載の結晶と特定分子との間で形成された複合体の三次元構造を解析する方法であって、下記工程：
−特定分子を含む、該誘導されたポリペプチドまたは該結晶の導入、
−該誘導されたポリペプチドまたは該結晶と特定分子との間で形成された複合体の、特に蒸気拡散による結晶化、および該複合体の、特に分子置換による三次元解析、
−または特にＮＭＲによる、可溶相における該複合体の三次元解析、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はビタミンＤ核内受容体から誘導されるポリペプチド、これらのポリペプチドのヌクレオチド配列コード化、および特に合成ビタミンＤ類似体のスクリーニングでの、または、例えばＧａ１４によって融合されるポリペプチドを含む構築物を使用した、ビタミンＤ受容体と相互作用する他のタンパク質（活性体、抑制体など）を識別する試験（例えば２倍または３倍ハイブリッドなど）の実施での、または結晶学またはＮＭＲ技術によって該ポリペプチドおよび特定の分子の間で形成される複合体の三次元構造の解析での、これらのポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）は、核内受容体（ＮＲ）の、スーパーファミリーに属するリガンド依存性の転写レギュレーターである（Mangelsdorf et al., 1995）。
【０００３】
本科のメンバは、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびより可変的なリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を備えた同じモジュラー構造を有する（Mangelsdorf et al., 1995; Wurtz et al., 1996）。
【０００４】
ＶＤＲは、レチノイン酸Ｘ受容体（ＲＸＲ）を備えたヘテロダイマー形の標的遺伝子のプロモーター領域において、タイプＤＲ３の対応する応答要素に結合し、転写コファクターおよび基底転写機構との相互作用によって、転写の活性化または抑制に至る（Deluca&Zierold, 1998）。
【０００５】
ビタミンＤ代謝産物は、骨形成異常症、骨粗鬆症、乾癬、癌および自己免疫疾患に対する各種の治療で使用されるか、使用されることができる（Bouillon et al., 1995）。
【０００６】
ビタミンＤ（または１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃または１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃）によって生じる過カルシウム血症は、これらの臨床応用への天然リガンドの使用を制限し、二次効果を低減させることができる類似体の開発に至っている。
【０００７】
ｈＶＤＲのＬＢＤ配列は、ヒトγレチノイン酸受容体（ｈＲＡＲγ）およびヒトαレチノイン酸Ｘ受容体（ｈＲＸＲα）の配列と比較すると、不完全に保存されている（それぞれ２５％および１７％がｈＶＤＲと同一）。
【０００８】
ヘリックスＨ１およびＨ３を結合しているＶＤＲのＬＢＤでの挿入ドメインの存在は、ＶＤＲの代表的な特性を示す。本結合領域のサイズは、ＶＤＲのファミリーにおいて７２〜８１の間の残基で変動するが、他の核内受容体においては、１５〜２５の間の残基で変動する。
【０００９】
以下において、各種ＶＤＲのペプチド配列に使用するアミノ酸ナンバリングシステムが、ヒトＶＤＲのアミノ酸ナンバリングと一致することを強調する必要がある。本ナンバリングシステムは、以下の図１ａで示すアライメントに基づいて、ヒトＶＤＲ以外の配列に明確に拡張することができる。
【００１０】
本挿入ドメインの配列保存率は、非常に低い（ｈＶＤＲのアミノ酸１５７−２１５の間で９％の同一性）。本領域は、プロテアーゼに接近可能であり、そして位置２０８のセリンのレベルでのリン酸化部位を含み、それについての機能的役割を明確にすることができていない。
【００１１】
本ドメインの存在は、ＶＤＲのＬＢＤの結晶化においてこれまでに発生した問題を説明することができた。実際には本ドメインは、かなり低い統計量を用いてごくわずかな短鎖を予測する二次構造解析で示すように、乏しく構造化されており、負に荷電した残基を非常に高いパーセンテージで含む。これらの２つの係数は、本ループへのコンフォーマーの数を増加させることができ、そのためにタンパク質の安定性に影響を及ぼし、結晶化プロセスを妨げる非特異的接触を促す。
【００１２】
本発明は、可溶形のビタミンＤ核内受容体から誘導され、結晶化可能であるポリペプチドを提供することを目的としている。
【００１３】
本発明は、提供することを意図するこれらの誘導されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および該ヌクレオチド配列を用いた適切な細胞の形質転換によって誘導される該ポリペプチドの調製の方法を提供することも目的としている。
【００１４】
本発明は、ビタミンＤ類似体化合物をスクリーニングする新規方法および／またはこれらのポリペプチドおよび特定の分子との間で形成される複合体の三次元構造の分析を提供することも目的としており、該方法は、上述の誘導されたポリペプチドによって実施される。
【００１５】
本発明は、上述の方法を実現するためのキットを提供することも目的としている。
【００１６】
本発明は、ビタミンＤ核内受容体を有するヒトまたは異なる動物種におけるビタミンＤ核内受容体から誘導されたポリペプチドであって、核内受容体は、リガンド結合ドメインすなわちＬＢＤを含み、このＬＢＤは、可撓性挿入ドメインを含み、
該誘導されたポリペプチドが、下記：
−該核内受容体のペプチド配列：
＊ＬＢＤの可撓性挿入ドメインが、少なくとも約３０アミノ酸のか、更に好ましくは少なくとも約４０アミノ酸のか、またはこの挿入ドメインを含むすべてのアミノ酸の置換または欠失によって修飾され、
＊および、適切な場合には、該ＶＤＲのペプチド配列の位置１〜約１２５に、特に位置１〜１１７または１２３に位置する１以上またはすべてのアミノ酸が、置換または欠失によって修飾され、
該誘導されたポリペプチドは、下記：
＊ビタミンＤ受容体のリガンド結合およびＬＢＤトランス活性化特性が、保存され、
＊それらは、安定であり、すなわち、特にpH７の１００mM ＮａＣｌ中で少なくとも約１週間で不安定な非修飾ＬＢＤとは対照的に、ＬＢＤの上述した特性に影響を及ぼさずに保存することができ、
＊懸濁液滴蒸気拡散法によって、特に４℃で、それらを水性溶媒中で結晶化でき、
＊それらが、水性溶媒中で可溶性である、
という特徴を有する、ペプチド配列、
−または、１以上のアミノ酸の特に欠失、付加または置換によって、上で定義されるペプチド配列から誘導されるペプチド配列であって、該誘導された配列が、該誘導されたポリペプチドの上述の特性を有する、ペプチド配列、
を含むことを特徴とする、誘導されたポリペプチドに関する。
【００１７】
本発明は更に詳細には、上で定義したヒトまたは動物起源のＶＤＲから誘導されるポリペプチドに関し、該誘導されたポリペプチドは、区切られたペプチド断片が欠失される該核内受容体のペプチド配列を含むという点を特徴とする：
−一方では、ヒトまたは動物起源のビタミンＤ核内受容体のペプチド配列の位置１５５〜１７５の１つにほぼ位置するアミノ酸によって、詳細には図１ａに示すＶＤＲのペプチド配列によって、更に詳細には、これらの配列の位置１５９〜１６８の位置の１つに位置するアミノ酸による。
−および他方では、ヒトまたは動物起源のビタミンＤ核内受容体のペプチド配列の位置２０４〜２２５のほぼ１つに位置するアミノ酸によって、詳細には図１ａに示すＶＤＲのペプチド配列による。
【００１８】
本発明は更に詳細には、上で定義したような誘導されたポリペプチドに関し、該誘導されたポリペプチドは、
−ヒトまたは動物起源のＶＤＲのペプチド配列の、特に図１ａに示すＶＤＲのペプチド配列の、位置１１８および４２７に位置するか、または位置１２４および４２７に位置するアミノ酸によって区切られ、ＶＤＲの該ペプチド配列の位置１６５〜２１５に位置する残基が欠失された、アミノ酸配列、
−または、特に１以上のアミノ酸の欠失、付加または置換によって、上述のアミノ酸配列によって誘導されるペプチド配列であって、該誘導ポリペプチドの上述の特性を有する該誘導された配列、
を含むポリペプチドから選択される。
【００１９】
本発明は、更に詳細には、
−ヒト起源のＶＤＲから誘導され、位置１６５および２１５に位置するアミノ酸によって区切られているペプチド断片が欠失されている、配列番号：４ポリペプチド、
−ヒト起源のＶＤＲから誘導され、位置１および１１７に位置するアミノ酸によって区切られるペプチド断片、および位置１６５および２１５に位置するアミノ酸によって区切られるペプチド断片が欠失されている、配列番号：６のポリペプチド〔ｈＶＤＲ（１１８−４２７Δ１６５−２１５）とも称される〕、
−ヒト起源のＶＤＲから誘導され、位置１および１２３に位置するアミノ酸によって区切られるペプチド断片、および位置１６５および２１５に位置するアミノ酸によって区切られるペプチド断片が欠失されている、配列番号：８ポリペプチド〔ｈＶＤＲ（１２４−４２７Δ１６５−２１５）とも称される〕、
から選択される、上で定義したような誘導ポリペプチドに関する。
【００２０】
本発明は、上で定義したように誘導されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にも関する。
【００２１】
本基本に基づく本発明は、更に詳細には、下記：
−図６、７および８によってそれぞれ表される、配列番号：３、配列番号：５および配列番号：７の配列、
−または、上述のヌクレオチド配列の遺伝的コードの縮重によって誘導され、上で定義したｈＶＤＲから誘導されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
−または、特に１以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加によって、上述のヌクレオチド配列から誘導され、上で定義したｈＶＤＲから誘導されるポリペプチドから誘導されるペプチド配列をコードし、該誘導されたポリペプチドの上述の特性を有するヌクレオチド配列、
から選択されるヌクレオチド配列に関する。
【００２２】
本発明は、後者の配列の転写に必要な要素、特に転写プロモーターおよびターミネーターに結合して、上で定義したヌクレオチド配列を含む組換えヌクレオチド配列にも関する。
【００２３】
本発明は、上で定義したヌクレオチド配列を含むベクター、特にプラスミドまたはバキュロウィルスなどのウィルスにも関する。
【００２４】
本発明は、上述したベクターによって形質転換される宿主細胞にも関し、該細胞は、特に、大腸菌などのバクテリアまたはバキュロウイルスによる感染が可能な昆虫細胞から選択される。
【００２５】
本発明は、上で定義した誘導ポリペプチドの調製方法にも関し、該方法は、下記工程：
−上で定義した組換えベクターによる細胞の形質転換、
−そのように形質転換された細胞の培養および該細胞によって産生される該ポリペプチドの、場合により精製後の回収、
を含む。
【００２６】
本発明は、ビタミンＤに、またはビタミンＤ類似体、特に、高親和性、すなわち約１０^-6Mを超える親和性を有する該ポリペプチドに結合可能な任意のリガンドに結合した、上で定義したビタミンＤ核内受容体から誘導されるポリペプチドにも関する。
【００２７】
本発明は、場合によりビタミンＤまたはビタミンＤ類似体に結合し、上で定義したビタミンＤ核内受容体によって誘導されるポリペプチドまたはそれ自体結晶形で表されるポリペプチドにも関する。
【００２８】
有利なことに、本発明の上述の結晶は、特に沈殿剤としての硫酸アンモニウムの存在下で、または他の沈殿剤の存在下で、蒸気拡散によって得られる。
【００２９】
なお有利なことに、本発明の結晶は、Ｘ線結晶技術に使用できる。
【００３０】
上述の結晶は、２５Å未満のＸ線結晶学によって測定される分解能を達成することが可能であり、これにより、標的分子と受容体との間の相互作用の情報が原子レベルで提供される。
【００３１】
本発明は更に詳細には、ａ＝４５．１９３Å、ｂ＝５２．４４３Å、ｃ＝１３３．２８６Å、α＝β＝γ＝９０°による斜方晶系の空間群（Ｐ２₁２₁２₁）に属することを特徴とする、１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃との複合されたｈＶＤＲ（１１８−４２７Δ１６５−２１５）の結晶に関する。
【００３２】
本発明は、合成ビタミンＤ類似体をスクリーニングする方法を実施するための、場合により上述した結晶の形の、上で定義したポリペプチドの使用にも関する。
【００３３】
本発明は、特に癌性症状、骨形成異常症、骨粗鬆症、乾癬および自己免疫疾患の治療の薬学組成物で使用可能な作用性または拮抗性ビタミンＤ類似体をスクリーニングする方法を実施するための、選択的に上述した結晶の形の、上で定義したポリペプチドの使用にも関する。
【００３４】
本発明は、下記工程：
−試験を行う類似体またはコファクターによって有利に担体に結合した、場合により上述した結晶の形の、上で定義した誘導されるポリペプチドの導入であって、該の誘導されたポリペプチドまたはビタミンＤ誘導体の１つが、特に蛍光、放射性または酵素マーカーによって有利にマーキングされており、
−特に前の工程で使用した担体をすすいだ後の、使用するマーカーを測定することによる該誘導されたペプチドと試験された類似体間での任意の結合の検出、
を含む、ビタミンＤ類似体または補助因子をスクリーニングする方法に関する。
【００３５】
本発明は、該ポリペプチドと特異性分子の間で形成された複合体の三次元構造の解析方法を実施するために、選択的に上述した結晶の形の、上で定義したポリペプチドの使用にも関する。
【００３６】
これに基づいて、本発明は更に詳細には、選択的に上述した結晶の形の、上で定義したように誘導されたポリペプチドと、特定分子との間で形成された複合体の三次元構造の解析方法に関し、該方法は、下記工程：
−特定分子による、場合により上述した結晶の形の、上で定義したように誘導されたポリペプチドの導入、
−特に蒸気拡散による、該誘導されたポリペプチドと特定分子との間で形成された複合体の結晶化、および特に分子置換による、該複合体の三次元解析、
−または、特にＮＭＲによる、溶液中での該複合体の三次元解析、
を含む。
【００３７】
本発明は、上で定義したように、作用性または拮抗性となりうるビタミンＤ化合物の設計に上述の解析方法を応用することにも関する。
【００３８】
本発明は更に詳細には、上述のスクリーニングプロセスの実施によって得られる作用性または拮抗性ビタミンＤ類似体はもちろんのこと、許容可能な医薬品ビヒクルとともに、これらの類似体を含む医薬組成物にも関する。
【００３９】
本発明は、上述のスクリーニング方法または解析方法を実施するためのキット（またはパッケージ）にも関し、該キットは、上述のプロセスまたは方法を実施するための１つ以上の試薬とともに、場合により上述の結晶形の、上述のように誘導されたポリペプチドを含む。
【００４０】
本発明は、ｈＶＤＲ誘導ポリペプチド（１１８−４２７Δ１６５−２１５）の以下に示す詳細な説明、そして結晶構造の解析およびそのように得られた誘導ポリペプチドの特性によって更に明らかにされる。
【００４１】
図７に示す誘導ペプチド（ＶＤＲＬＢＤ突然変異体とも呼ばれる（残基１１８−４２７Δ１６５−２１５）とも称される）は、ｈＶＤＲ残基１６５〜２１５を欠失し（図１ａ）、ヘリックスＨ１およびＨ３を結合するために約３０の残基を残すことによって、その可撓性挿入ドメイン内に調製された。
【００４２】
ＶＤＲＬＢＤ突然変異体（残基１１８−４２７Δ１６５−２１５）は、大腸菌において過剰発現され、後述する方法に従って、親和性およびイオン交換クロマトグラフィにより、およびゲル濾過によって精製された。
【００４３】
Ａ）ＶＤＲＬＢＤ突然変異体１１８−４２７Δ１６５−２１５の発現および精製
突然変異ＶＤＲ受容体（残基１１８−４２７Δ１６５−２１５）は、ヘキサヒスチジンタグを有するペプチドの形で過剰産生された。ＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡは、ベクターｐＥＴ１５ｂ（Novagen）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングされた。次にプラスミドは、ＸＬ−１ブルー大腸菌バクテリア内で増幅され配列を検査し、過剰発現のためにＢＬ２１ＤＥ３大腸菌バクテリアに導入された。２００μg アンピシリン／mlを含む２００mlのＬＢの予備培養物を、２００μg アンピシリン／mlを含む６ｘ１ＬのＬＢに接種した。細胞は、０．６の吸光度まで３７℃にて培養し、次いで、培養物に１mMのＩＰＴＧを添加して、２０℃にて６時間、タンパク質の発現を誘動させた。細胞を、超遠心分離によって分離し、−８０℃にて保管した。
【００４４】
１Ｌの培養物を意味する細胞残留物は、２０mM Tris pH８．０、２５０mM ＮａＣｌ、５mMイミダゾール、５％グリセリン、０．５μg/mlプロテアーゼ阻害剤混液、１mMβ−メルカプトエタノールおよび１mM ＰＭＳＦを含む２５mlの緩衝液に入れられた。細胞の溶解は、超音波処理によって実施され、粗抽出物は、１時間３０分、４５Ｋでの超遠心分離によって得られた。精製は、３つの工程で実施された。最初に粗抽出物を、金属親和性カラム（Talon,Clonetech）に詰めた。洗浄後、２０mM Tris pH８．０、２５０mM ＮａＣｌ、１５０mMイミダゾールおよび５％グリセリンを含む緩衝液によってタンパク質を溶出させた。次にタンパク質を、Centiprep 30によって濃縮し、２０mM Tris pH７．５、５０mM ＮａＣｌおよび５mM ＤＴＴを含む４倍の体積の緩衝液で希釈した。サンプルを、次にアニオン性交換カラムＱ１５（Sartorius）に詰め、ＮａＣｌ勾配（０→１M）によって溶出させた。ヘキサヒスチジンタグを切断するために、タンパク質を、５mM ＣａＣｌ₂の存在下で、４℃で１２時間、トロンビンによって消化させた（タンパク質１mgにつき１単位）。最後にタンパク質を、１０mM Tris pH７．０、１００mM ＮａＣｌ、１０mM ＤＴＴによって平衡させたSuperdex 75 16/60 濾過ゲル（Pharmacia）に加え、同じ緩衝液で溶出させた。次にリガンドを過剰に添加し、４℃にて１２時間、タンパク質ともにインキュベートした。次いで複合体を、結晶化のためにCentricon 30によって濃縮した。
【００４５】
精製されたタンパク質の量は、２mg/l の培養物であった。タンパク質の品質および均一性を、変性および未変性条件での電気泳動によって分析した。タンパク質は、９５％を越えて純粋であり、単一バンドが未変性ゲルで観察された。タンパク質は、ゲル濾過の溶出および光拡散測定によって単一であった。タンパク質濃度を、ブラッドフォード方法におよび分光測定法によって測定した。サンプルは、光拡散測定によって単分散であった。
【００４６】
Ｂ）ＶＤＲ１１８−４２７Δ１６５−２１５の解析および特性。
１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃に結合する突然変異タンパク質の量を、組換タンパク質の粗抽出物を使用して、スキャッチャード法によって測定した。（図２ａ：スキャッチャード解析を、デキストラン／炭素に対して実施した；野生型または突然変異体ｈＶＤＲ／ｐＥＴ１５ｂを発現するＢＬ２１大腸菌（ＤＥ３）の粗抽出物を、１０００倍に希釈し、２０mM Tris、２５０mM ＮａＣｌ、５mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０％グリセリン中で（³Ｈ−２６、２７、Amersham）１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の量を増加させながら、４℃にて１６時間インキュベートした；インキュベーションの後、２５μlのデキストラン／炭素（１．５％）を、２５μlのタンパク質混合物に添加した；５分後に、管を１３，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離した；結合リガンド（Ｂ）の濃度を、上清に対する液体シンチレーション計数法によって測定した；リガンド総濃度を、デキストラン／炭素の添加前に、１５μlタンパク質混合物に対する液体シンチレーション計数法によって測定した；Ｕは、未結合リガンドを示す；各点は、３つの値の平均を示す：結果を、Claire et al., 1978が述べた方法による、最小２乗非線形法によって解析した；実線による曲線および点線の曲線はそれぞれ、誘導突然変異ポリペプチドと野生型タンパク質で得られた実験結果に相当し、誘導突然変異ポリペプチドのパラメータとしてＮ＝０．０７３±０．００６nM，Ｋｄ＝０．３７±０．０５nM，β＝０．０５８±０．００２を、野生型タンパク質のパラメータとしてＮ＝０．１０±０．０１nM，Ｋｄ＝０．５５±０．０８nM，β＝０．０５１±０．００３、更にＮ＝部位数、Ｋｄ＝解離定数およびβ＝非特異性結合を用いた。実験は、２回繰り返した。
【００４７】
有意な変化は、野生型および突然変異体のＶＤＲ解離定数の間では見られず、値は受容体全体について以前に述べられた値と類似していた（Bouillon et al., 1995）。２つのタンパク質のトランス活性化特性を比較するために、野生型および突然変異体ＬＢＤを、ＧＡＬ４酵母活性体ＤＮＡ結合ドメインで融合した。キメラタンパク質を、Ｃｏｓ細胞への形質移入によって発現させ、そして、トランス活性化をＧＡＬ４に対応する適切なリポータによって測定した。２つのタンパク質は、本系において匹敵するトランス活性化特性を有する（図２ｂ：野生型または突然変異体ＶＤＲのＬＢＤは、ベクターＰＸＪ４４０のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位への、ｃＤＮＡのクローン化によって、ＧＡＬ４（１−１４７）酵母活性体ＤＮＡ結合ドメインにて融合された（Xiao et al., 1991）；Ｃｏｓ細胞は、２μgの１７ｍ５−ＴＡＴＡ−ＣＡＴリポータ遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼを発現する２μg内部制御組換体ｐＣＨ１１０ｌａｃＺ（Pharmacia）およびｈＶＤＲの野生型または突然変異体ＬＢＤを含むベクター（２５０ng）を用いて、Xiao et al., 1991、が述べた方法によって形質移入して、ＤＮＡ支持体と合わせて合計２０μgになった。細胞を、ＥｔＯＨまたは１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃ １０^-7Mによって処理した。β−ガラクトシダーゼの同じ単位で標準化したＣＡＴ活性は、１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の存在下で、野生型ＶＤＲによって誘起されるＣＡＴ活性（１００％）について発現された。
【００４８】
結果的に、挿入ドメインの欠損は、リガンド結合、ＲＸＲαのＬＢＤによるトランス活性化または二量体化に対して大きな影響を及ぼさなかった。
【００４９】
ＶＤＲＬＢＤにおける可撓性挿入ドメインの欠失によって、より可溶性のタンパク質が生成し、それは１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃との複合体の形で結晶化できる。沈殿剤として硫酸アンモニウムを使用する蒸気拡散技術によって、結晶を得ることが可能である。結晶構造は、部分的なＲＡＲγ模型を用いた、分子置換の組合せ（Renaud et al. 1995; Klaholz et al., 1998）および水銀誘導体による同一構造置換によって解明された。得られた結果を、以下の表１に要約した。
【００５０】
【表１】

【００５１】
表１：結晶化実験は、懸濁した液滴蒸気拡散法を用いて４℃にて実施した；タンパク質を、４〜１０mg/mlに濃縮した；１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃と複合したｈＶＤＲ結晶（１１８−４２７Δ１６５−２１５）を、０．７M硫酸アンモニウム、硫酸アンモニウム１．４M Ｍｅｓ０．１M pH＝６．０を含むリザーバーに対して平衡にされた緩衝液Ｍｅｓ５０mM pH６．０，Tris ５mM，ＤＴＴ５mMを含む溶液から、４日後に得られた；結晶は、ａ＝４５．１９３Å、ｂ＝５２．４３３Å、ｃ＝１３３．２８６Å、α＝β＝γ＝９０°、斜方晶系空間群（Ｐ２₁２₁２₁）に属した；非対称単位は、モノマーを１個含んだ；結晶の溶媒含有率は、４８％であった；ウィルソン方法を使用して推定されたＢ−因子は、２９であった。重原子誘導体を、チメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）に結晶を４日間浸漬することによって得た；天然結晶のＸ線拡散の結果を、ハンブルグシンクロトロンビームラインＢＷ７Ｂで、４℃にて測定した；結果を、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫソフトウェアを使用して処理した（Otwinoswski et al., 1997）；初期位相は、初期モデルとしてＲＡＲγを使用して、ＡＭＯＲＥによる分子置換によって得た（Navaza et al., 1994）；本モデルは、保存されたヘリックスＨ１、Ｈ３−Ｈ５、Ｈ７−Ｈ１０を含んだ（図１ａ）；ＡＭＯＲＥ剛体置換の後、溶液は、３１％の相関および５３．６％のＲ因子を有した；回折データが４℃にて研究所のMar Research二次元画像検出器に登録されている水銀誘導体を使用して得られた位相によって完了された；誘導された部位が発見され、ＳＯＬＶＥソフトウェアを使用して純化された（Tervilliger et al., 1987）。
【００５２】
合わせた相によって得られたマップを、溶媒補正を使用した３Åの分解能で計算した。純化を、ＣＮＳソフトウェアを用いて実施した（Brunnger et al., 1998）。Ｏソフトウェア（Jones et al., 1991）および最小２乗最小化を用いたモデル構築サイクルの後には、最終モデルに至る個別のＢ因子異方性純化が続いた。２０および１．８Åの間の結果はすべて、カットオフ域値なしの純化に含まれた。第１水和層における溶媒分子を、ＣＮＳソフトウェアを用いて、３σでＦ_ｏ−Ｆ_ｃマップに配置された。最大のＢ-因子の値（４０−５０）は、Ｈ１前のループ内の残基、接合およびループＨ９−Ｈ１０およびＨ１１−Ｈ１２内の残基に一致する。最終モデルの品質を、ＰＲＯＣＨＥＣＫソフトウェアを使用して解析した（Laskowski et al., 1993）。Ramachadranの角度分布は、９２．４％の最も好都合のコンホメーションと７．６％の認可されたコンホメーションを示す。
【００５３】
最終モデルは、２５０個の残基、１６６個の水分子および１個のリガンド分子を含む。最初の２個のＮ末端残基および最後の４個のＣ末端の残基には、明確な密度は観察されなかった。３個の追加の残基、Ｈ９−Ｈ１０ループ内の３７５〜３７７は、本領域の電子密度マップが中位の品質であるため、純化に含まれなかった。
【００５４】
ＶＤＲＬＢＤ（図１ｂ）の全体的なトポロジーは、核内受容体の他のＬＢＤと同様であり、１３個のヘリックスが３つの層と３個の鎖を持つβシートに挟まれている。命名は、ｈＲＸＲαの構造に基づく（Bourguet et al., 1995）。ヘリックスＨ１およびＨ３を結合しているドメインは、２個の小さなヘリックスＨ２およびＨ３ｎ含む。新規のヘリックスＨ３ｎは、構造の基部を形成し、ＲＡＲγの構造内のΩループにとって代わる。接合点に位置する３個のグリシン残基（１６２−１６４）の固有の可撓性は、穏やかな適合を示す。
【００５５】
３個の残基のこの断片は、リガンドからむしろ遠く、結果的にリガンド結合での役割を果たすとは思えない。ＶＤＲ構造は、作用物質と複合したＲＡＲγの構造により近い。タンパク質は、１７９個の残基（Ｃαに対する２．５Åのカットオフ域値）上に、１．２Åのｒｍｓｄが重ね合わされ、除外された領域は、Ｈ３にＨ１を結合しているペプチド、β２鎖、Ｈ６ヘリックスおよび一部の結合ループである。
【００５６】
最も顕著な相違は、ヘリックスＨ１とＨ３との間の結合のレベルで発見され、ＲＡＲγにおいてはβシートを包囲し、ＶＤＲにおいては、ＥＲαのそれと同一である、Ｈ３とβシート末端との間の経路に続く（Brzozowski et al., 1997）。結果的に、βシートの末端は、外側に代わり、ビタミンＤ結合空洞（図３ａおよび３ｂ）を拡大する。すべてのβ鎖は、リガンドと接触する残基を有する。β１鎖において、ＶＤＲ受容体に特異的なＴｒｐ２８６は、リガンドの位置決めで重要な役割を奏する。それ自体は水素結合によって、Ｇｌｎ３１７およびＭｅｔ２７２のカルボニルに結合されるＳｅｒ２７５を含む、水素結合ネットワークの一部を形成する。このようにβシートの末端は、ヘリックスＨ２およびＨ３ｎとの間の結合ループの、Ｇｌｕ２９２およびＬｙｓ２９４、ならびにＡｒｇ１５８の間のカルボニル基の間の水素結合によって安定する。
【００５７】
位置決めが同時活性化およびトランス活性化結合にとって重要であるヘリックスＨ１２は、作用物質位置にある（図３ｃ）。ヘリックスは、疎水性接点（Ｈ５のＩｌｅ２６８およびＨ１２のＰｈｅ４２２）および極性相互作用によってこの方向で安定化される。これらの最後の相互作用は、保存されたＬｙｓ２６４−Ｇｌｕ４２０のブリッジならびにＨ３のＳｅｒ２３５とＴｈｒ４１５との間の水素結合を含む。更に、Ｈ１１−Ｈ１２ループのＭｅｔ４１２およびＬｅｕ４１４のカルボニル基はＨ結合によって、それ自体でＡｓｐ２３２（Ｈ３）とのＨ結合を形成するＡｒｇ１５４（Ｈ１２の末端）に結合される。これらの残基はすべて、ＶＤＲ受容体に保存される。塩類ブリッジを確立する残基Ｌｙｓ２６４およびＧｌｕ４２０の誘導された突然変異誘発は、これらの突然変異がリガンドに依存したトランス活性化を抑制するが、リガンド結合、ＲＸＲまたはＤＮＡ結合によるヘテロ二量体化に対する影響を及ぼさないことが示されている（Nakajima et al., 1998）。
【００５８】
強い結晶性接点は、ヘリックスＨ３ｎならびに対称結合分子のヘリックスＨ３、Ｈ４およびＨ１２との間で見られる（図３ｄ）。Ｈ３ｎは、ＰＰＡＲの三元複合体で見られたペプチドＳＲＣ１の接点を模倣しているが（Nolte et al., 1998）、大半の活性化補助因子で見られるモチーフＬＸＸＬＬを含まない。このヘリックスは、Ｈ３ｎ（Ｓｅｒ２１６，Ｖａｌ２１７およびＴｈｒ２１８）のＮ末端領域とＧｌｕ４２０（Ｈ１２）との間のＨ結合にわたる極性接点によって固定される。ヘリックスＨ３ｎのＣ末端の領域で、Ｓｅｒ２２２はＬｙｓ２４６（ヘリックスＨ３の末端）に、水素結合によって結合される。この溶解素の機能的重要性は、トランス活性化に強い影響を及ぼすグリシン内への突然変異によって証明された（Whitfield et al., 1995）。残基Ｌｙｓ２４６およびＧｌｕ４２０との間に、ヘリックスＨ３、Ｈ４およびＨ１２によって、疎水性空洞が形成される。ヘリックスＨ３ｎ（Ｖａｌ２１７、Ｔｈｒ２１８、Ｌｅｕ２１９、Ｌｅｕ２２１およびＳｅｒ２２２）の残基は、ファンデルワールス結合によって、Ｉｌｅ２４２（Ｈ３）、Ｉｌｅ２６０（Ｈ４）、Ｌｅｕ４１７およびＶａｌ４２１（Ｈ１２）に接触している。この観察結果は、核内受容体の認識プロセスにおいて、ＬＸＸＬＬ以外の配列を考慮する必要があることを示している。
【００５９】
天然リガンドへのＶＤＲの結合の構造により、活性ビタミンＤのコンホメーションに関する多くの曖昧点や疑問の解明が可能となってきた。ビタミンＤの自由分子の結晶学的構造との比較（Suwinska et al., 1996）によって、２個のリガンドが核Ａ、ＣおよびＤについて同一のコンホメーションを有することが示されている（図４ａ）。最も評価できる相違は、複合体における共役トリエンの非平面形状であり、その形状は受容体に固定するために必要なリガンドの、湾曲した形によるものである。リガンド結合ポケットには、支配的な疎水性残基が接している（図４ｂおよび４ｃ）。伸張されたリガンドは、ヘリックスＨ５のＣ末端に向けられた核Ａ（図３ｂおよび３ｃ）とヘリックスＨ７およびＨ１１の近くにヒドロキシル２５基を備えたヘリックスＨ３を含む。メチル２７基は、ヘリックスＨ１２（Ｖａｌ４１８）との、弱い相互作用を生じる。核Ａのヒドロキシル基、１−ＯＨおよび３−ＯＨのヒドロキシル−２５部分を隔てている距離はそれぞれ、１３Åおよび１５．４Åである。
【００６０】
複合体において、核Ａは、それぞれ赤道方向および軸方向の基１−ＯＨおよび３−ＯＨによってひとまとめにされたコンホメーションＢをとる。位置１のヒドロキシル部は、Ｓｅｒ２３７（Ｈ３）およびＡｒｇ２７４によって２個のＨ結合を形成するが、基３−ＯＨはＳｅｒ２７８（Ｈ５）および哺乳類のみで保存されるＴｙｒ１４３によって２個のＨ結合を形成する。Ａｒｇ２７４は、Ｈ１末端に水分子およびＴｈｒ１４２のカルボニルを有する、Ｈ結合の堅固なネットワークに含まれている（図４ｃ）。
【００６１】
核ＡおよびＣを結合している共役トリエン（図４ａ）は、片側はＳｅｒ２７５（Ｈ５−βループ）およびＴｒｐ２８６（β１）、反対側はＬｅｕ２３３（Ｈ３）で挟まれた疎水性管内に位置している。単結合Ｃ６−Ｃ７は、平面形状から３０％編位しているトランスコンホメーションを有する。この編位は、結合Ｃ６−Ｃ７のトランスまたはシス立体コンホメーションを有する類似体に生物活性が欠けていることを説明する（Norman et al., 1997）。疎水性残基は、排他的な方法でこの鎖を囲む。ヒドロキシル２５基は、Ｈ結合によって、Ｈｉｓ３０５（Ｈ６−Ｈ７ループ）およびＨｉｓ３９７（Ｈ１１）に結合する（図４）。ヒスチジン残基周囲のＨ結合ネットワークは、Ｈｉｓ３０５およびＨｉｓ３９７がそれぞれＨ結合受容体および供与体であることを示している。Ｓｅｒ３０６を除く、Ｈ結合ネットワークに含まれるすべての残基は、ＶＤＲ内で保存される。ビタミンＤ耐性くる病素因に見られる天然突然変異体、Ａｒｇ２７３ＬｅｕおよびＨｉｓ３０５Ｇｌｎ（Kristjansson et al., 1993）は、それぞれ１−ＯＨおよび２５−ＯＨの固着に関与する、Ａｒｇ２７４およびＨｉｓ３０５のリガンドへの結合に関する役割が不可欠であることを確認する。
【００６２】
リガンド１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃がエストラジオール、プロゲステロンおよびすべてのトランスレチノイン酸より大きいという事実により、ＶＤＲリガンド結合ポケットは、ＥＲ（３６９Å³）、ＰＲ（４２７Å³）およびＲＡＲγ（４２１Å³）のものよりも大きい（６９７Å³）（図４ｄ）。しかし、それぞれ、６３％、６７％および６６％であるエストラジオール、プロゲステロンおよびすべてのトランスレチノイン酸と比較すると、１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃はＶＤＲリガンド結合のわずか５６％しか占めていないため、サイズの増大は比例していない。
【００６３】
ＶＤＲ空洞の接近できる体積は、核Ａの位置２の近くでポケットの膨張を示しており、２個の水分子に占有され、４０Å³を示す。この付加的空間は、実際に天然リガンドより４倍大きな結合親和性を有する合成リガンド２αメチル１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の、巨大なメチル基を受容することができる（Fujishima et al., 1998）。更に、脂肪族鎖の周囲に更に隙間があるため、異なる鎖長に適応することが可能である。
【００６４】
いくつかのビタミンＤ類似体は、共活性体のトランス活性化および動員に関して、天然リガンドとは異なる挙動を示している（Takeyama et al., 1999; Rachez et al., 1998）。この特異性を理解するために、予備的なリガンドモデル化研究を実施した。位置１７に、ＭＣ９０３などの（２２エン−２６，２７−シクロプロピル−１α、２４Ｓ（ＯＨ）₂ Ｄ₃またはＥＢ１０８９（２２，２４ジエン−２４，２６，２７，トリホモ１α，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃）（それぞれ１個または２個の二重結合）かなり堅固な脂肪族鎖を有する合成リガンドは、１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の形状をごくわずかに調整することによって、結合ポケットに適応することができる。核ＣおよびＤは、ＥＢ１０８９の位置２６および２７のメチル基またはＭＣ９０３のシクロプロピル核を収容するために、置換のみが必要である。類似体２０−エピ−１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃およびＲＨ１０６０の場合、Ｃ２０周囲の左の逆コンホメーションを有する、低エネルギーコンホーマーのみが適用できる。このような形状によって、Ｃ２１のメチル基は、天然リガンドと同じ空洞内に向いているが、残りの鎖は、Ｃ２０−Ｃ２２の逆コンホメーションおよびＣ２０のエピマー化の組合せによって、結合空洞の反対側に接している。このようなパス変化は、２個のエピマーの異なる接点を生じさせる。１−ヒドロキシル部から２５−ヒドロキシル部への距離は、２０−エピ類似体においてよりも短いため、その長鎖はＫＨ１０６０の場合と同様に適用できる。より長い脂肪族鎖を備えたリガンドは、より小型のコンホメーションをとり、結合空洞ともに更なるファンデルワールス接点を形成し、この接点が次に、位置Ｈ１２のヘリックスを安定させ、および／またはＨ６−Ｈ７ループのように、結合ポケットのあまり堅固でない領域に影響を及ぼすことができる。
【００６５】
かなり堅固な結合空洞とのこれらの各種接点は、半減期および転写活性の相違を説明することができる。
【００６６】
ビタミンＤの構造は、ここ１０年間、多数の研究の主題であった。本発明は、活性コンホメーションにおける１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃像を初めて提供する。１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の天然側鎖は今まで、新しい特異的な作用性リガンドを発見する目的とした化学修飾の主要な標的であった。
【００６７】
リガンド結合能を失わずに、核Ａ、Ｄで構成された骨格を修飾することは、不可能であった。Ｃおよび／またはＤ核全体を欠いているが、ヒドロキシル基の正常間隔を有する類似体は、結合ポケット内部で正常接点を形成でき、それらの正常な生物学的能力を説明している（Verstuyf et al., 1998）。
【００６８】
本発明による複合体は、１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の周囲の結合ポケットの三次元配列を開示し、原骨格の設計に関する新しい展望を提供する。
【００６９】
【表２】

【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
異なる種のＶＤＲのペプチド配列のアライメント（ｈＶＤＲ：homosapiens〔ヒト〕のＶＤＲ；ｂＶＤＲ：bos taurus〔ウシ〕のＶＤＲ；ｇＶＤＲ：gallus gallus〔ニワトリ〕のＶＤＲ；ｒＶＤＲ：ratus norvegicus〔ラット〕のＶＤＲ；ｍＶＤＲ：mus musculus〔マウス〕のＶＤＲ；ｃＶＤＲ：cotumic japonica〔ウズラ〕のＶＤＲ；ｘＶＤＲ；xenopus laevi〔アフリカツメガエル〕のＶＤＲと、ヒトＲＸＲα〔ｈＲＸＲα〕およびヒトＲＡＲγ（ｈＲＡＲγ）配列。欠失されたＶＤＲの挿入ドメインは、ボックス内である。
【図１ｂ】
ｈＶＤＲのリガンド結合ドメインのドメインの一般的コンホメーション；ヘリックスを円筒によって表し、βシートを矢印によって表す。
【図２ａ】
１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の、野性型ｈＶＤＲのＬＢＤに対する結合（１１８−４２７；三角形で示される点線の曲線）およびｈＶＤＲから誘導される突然変異体のＬＢＤに対する結合（１１８−４２７Δ１６５−２１５；菱形によって示される完全な曲線）の、スキャッチャード分析；１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃のマークがついた結合の量は、横軸にnMで表され、結合（Ｂ）または未結合（Ｕ）野生型ＬＢＤの間のＢ／Ｕ比は縦軸に示される。
【図２ｂ】
野性種ｈＶＤＲのおよび突然変異体ｈＶＤＲのＣＡＴ活性；これらの活性は、パーセンテージとして縦軸に示される；カラム１は、野性型（野生類）ｈＶＤＲのおよび突然変異体（断端）ｈＶＤＲの、ビタミンＤ（ＶＤ）の不在下で測定されるＣＡＴ活性と一致する；カラム２は、ＶＤの存在下、ならびに野生型ｈＶＤＲおよび突然変異体ｈＶＤＲの不在下で測定されたＣＡＴ活性に一致する；カラム３は、野生型ｈＶＤＲの存在下、ならびにＶＤおよび突然変異体ｈＶＤＲの不在下で測定されたＣＡＴ活性に一致する；カラム４は、ＶＤおよび野生型ｈＶＤＲの存在下、ならびに突然変異体ｈＶＤＲの不在下で測定されるＣＡＴ活性に一致する；カラム５は、突然変異体ｈＶＤＲの存在下、ならびにＶＤおよび野生型ｈＶＤＲの不在下で測定されるＣＡＴ活性に一致する；カラム６は、突然変異体ｈＶＤＲならびにＶＤの存在下、ならびに野生型ｈＶＤＲの不在下で測定されるＣＡＴ活性に一致する。
【図３ａ】
ＲＡＲγのβシート領域の表示、
【図３ｂ】
上記のＲＡＲγのβシート領域との同じ方向のＶＤＲのβシート領域の表示、
【図３ｃ】
ＶＤＲのヘリックスＨ１２の分子内相互作用の表示、
【図３ｄ】
ＶＤＲのＬＢＤおよび対称的に、結合された分子のヘリックスＨ３ｎとの間の界面。
【図４ａ】
１，２５（ＯＨ）₂ Ｄ₃の図、
【図４ｂ】
ｈＶＤＲリガンド結合ポケットの線図、
【図４ｃ】
１σで電子密度の輪郭を描いたビタミンＤ、
【図４ｄ】
リガンドの空洞。
【図５】
野生型ｈＶＤＲをコードするヌクレオチド配列（配列番号：１）、および野生型ｈＶＤＲ（配列番号：２）のペプチド配列
【図６】
ｈＶＤＲ（１−４２７Δ１６５−２１５）より誘導された突然変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号：３）、および該ポリペプチドのペプチド配列（配列番号：４）、
【図７】
ｈＶＤＲ（１１８−４２７Δ１６５−２１５）より誘導された突然変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号：５）、および該ポリペプチドのペプチド配列（配列番号：６）、
【図８】
ｈＶＤＲ（１２４−４２７Δ１６５−２１５）より誘導された突然変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号：７）、および該ポリペプチドのペプチド配列（配列番号：８）。