JP2002516983A - 核受容体活性を調節するための方法及び化合物 - Google Patents
核受容体活性を調節するための方法及び化合物Info
- Publication number
- JP2002516983A JP2002516983A JP2000541516A JP2000541516A JP2002516983A JP 2002516983 A JP2002516983 A JP 2002516983A JP 2000541516 A JP2000541516 A JP 2000541516A JP 2000541516 A JP2000541516 A JP 2000541516A JP 2002516983 A JP2002516983 A JP 2002516983A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- receptor
- ligand
- nuclear
- amino acid
- nuclear receptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/06—Antiarrhythmics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
- G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
Abstract
(57)【要約】
本発明は核受容体活性、及び核受容体のリガンド結合を調節するための方法及び作用薬／拮抗薬化合物に関する。本発明は注目の核受容体のリガンド結合ドメインを含んで成る残基の同定方法を含む。核受容体、及び特にエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインに結合する作用薬及び／又は拮抗薬の同定方法もまた含まれる。本発明はエストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン及びこの部位に結合する化合物の同定及び操作によって例示される。本方法を、ＴＲ，ＧＲ及びＰＲを他の核受容体に適用することができる。
Description
【０００１】謝辞 この発明は、the U. S. Army Medical and Research Material Command grant
DAMD 19-94-J-4228, the National Cancer Institute Cancer Center Support
grant P30 CA-14599, NIGMS grant GM31627, American Cancer Society grant B
E61、及びthe National Institutes of Health grant DK51083からの寄付金によ
って、一部援助された。米国政府はこの発明の権利を有するであろう。
DAMD 19-94-J-4228, the National Cancer Institute Cancer Center Support
grant P30 CA-14599, NIGMS grant GM31627, American Cancer Society grant B
E61、及びthe National Institutes of Health grant DK51083からの寄付金によ
って、一部援助された。米国政府はこの発明の権利を有するであろう。
【０００２】序文 技術分野 本発明は核受容体活性を調節するために向上した方法及び化合物に関する。特
に、本発明はエストロゲン受容体活性を調節するために向上した方法及び化合物
に関する。
に、本発明はエストロゲン受容体活性を調節するために向上した方法及び化合物
に関する。
【０００３】背景 細胞は、タンパク質、ホルモン及び／又は薬剤を含む様々な分子と結合するこ
とによって、生物学的な応答を顕在化することができる受容体を含む。核受容体
は、細胞型−、リガンド−及びプロモーター−依存性において転写を増強又は抑
制するホルモン／リガンド活性転写因子であるタンパク質のスーパーファミリー
を代表する。古典的な核受容体、エストロゲン受容体α（ＥＲα）は神経、骨格
、心臓血管及び生殖組織の分化及び維持を制御する鍵因子である（Korach, Scie
nce 266 : 1524-1527 (1994) ; Smith, et al., New Engl. J. Med. 331 : 1056
-1061 (1994))。前記核受容体ファミリーはまた、糖質コルチコイド、アンドロ
ゲン、鉱質コルチコイド、プロゲスチン、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、レチノ
イド、ペルオキソーム増殖因子及びエイコサノイドのための受容体を含む。核受
容体ファミリーのサブセットは、エストロゲン、糖質コルチコイド及びプロゲス
チン受容体を含む、ステロイド受容体である。
とによって、生物学的な応答を顕在化することができる受容体を含む。核受容体
は、細胞型−、リガンド−及びプロモーター−依存性において転写を増強又は抑
制するホルモン／リガンド活性転写因子であるタンパク質のスーパーファミリー
を代表する。古典的な核受容体、エストロゲン受容体α（ＥＲα）は神経、骨格
、心臓血管及び生殖組織の分化及び維持を制御する鍵因子である（Korach, Scie
nce 266 : 1524-1527 (1994) ; Smith, et al., New Engl. J. Med. 331 : 1056
-1061 (1994))。前記核受容体ファミリーはまた、糖質コルチコイド、アンドロ
ゲン、鉱質コルチコイド、プロゲスチン、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、レチノ
イド、ペルオキソーム増殖因子及びエイコサノイドのための受容体を含む。核受
容体ファミリーのサブセットは、エストロゲン、糖質コルチコイド及びプロゲス
チン受容体を含む、ステロイド受容体である。
【０００４】 核受容体間の全体の配列の保存性は、受容体の異なるファミリー間で変化する
が；受容体の、機能領域、又はモジュールの間の配列の保存性は高い。例えば、
核受容体はＮ末端転写活性ドメイン、セントラルＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）
、及びＣ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含んで成る機能的モジュールを
形成することができる。核受容体のＬＢＤは、ホルモン／リガンド依存の分子ス
イッチを表わし、そしてそれらのサイズ、形及び化学的特性における様々な化合
物の違いを認識する。従って、エストロゲンホルモンは、エストロゲン受容体に
結合することによって、それらの生理学的な作用を行吏する（Beato, et al., C
ell 83 (6) : 851-857 (1995) ; Tsai, et al., Annu. Rev. Biochem. 63 : 451
-86 (1994)。核受容体のＬＢＤへのホルモンの結合はまた、ＤＮＡの転写を調節
するその能力を変化させるが、それらは転写から独立した働きも有するだろう。
が；受容体の、機能領域、又はモジュールの間の配列の保存性は高い。例えば、
核受容体はＮ末端転写活性ドメイン、セントラルＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）
、及びＣ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含んで成る機能的モジュールを
形成することができる。核受容体のＬＢＤは、ホルモン／リガンド依存の分子ス
イッチを表わし、そしてそれらのサイズ、形及び化学的特性における様々な化合
物の違いを認識する。従って、エストロゲンホルモンは、エストロゲン受容体に
結合することによって、それらの生理学的な作用を行吏する（Beato, et al., C
ell 83 (6) : 851-857 (1995) ; Tsai, et al., Annu. Rev. Biochem. 63 : 451
-86 (1994)。核受容体のＬＢＤへのホルモンの結合はまた、ＤＮＡの転写を調節
するその能力を変化させるが、それらは転写から独立した働きも有するだろう。
【０００５】 全てのＥＲαのリガンドが、排他的にＣ末端のＬＢＤに結合する。内因性のエ
ストロゲン、１７β−エストラジオール（Ｅ2）、及び合成非ステロイドエスト
ロゲン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を含む、これらリガンドのいく
つかは純粋な作用薬として機能するが、一方他のもの、例えばＩＣＩ−１６４，
３８４は純粋な拮抗薬として機能する。合成リガンド、例えばタモキシフェン及
びラロキシフェン（ＲＡＬ）は、選択的なエストロゲン受容体のモジュレーター
（ＳＥＲＭ）として知られている分子の増大するクラスに属し、これらは特異的
な組織及びプロモーター前後において、拮抗薬として機能する（Grese, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 14105-10 (1997))。タモキシフェンの注目
すべき組織特異的挙動は、Smigel, J. Natl. Cancer Inst. 90 : 647-8 (1998)
に報告された、乳ガンの予防の試みにおいて最近証明され、ここでは６年以上の
タモキシフェンの処置を受けた乳ガンの高い危険性のある一群の女性が、子宮内
膜ガンの発生の増大を示したが、骨折の発生をいくらか減少させ、乳ガンの発生
が劇的に４５％減少した。新規ＳＥＲＭの合理的な設計及び既存のものの最適化
は、ＥＲαの転写活性に対する、異なるリガンドの化学的性質及び構造の作用の
理解を必要とする。
ストロゲン、１７β−エストラジオール（Ｅ2）、及び合成非ステロイドエスト
ロゲン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を含む、これらリガンドのいく
つかは純粋な作用薬として機能するが、一方他のもの、例えばＩＣＩ−１６４，
３８４は純粋な拮抗薬として機能する。合成リガンド、例えばタモキシフェン及
びラロキシフェン（ＲＡＬ）は、選択的なエストロゲン受容体のモジュレーター
（ＳＥＲＭ）として知られている分子の増大するクラスに属し、これらは特異的
な組織及びプロモーター前後において、拮抗薬として機能する（Grese, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 14105-10 (1997))。タモキシフェンの注目
すべき組織特異的挙動は、Smigel, J. Natl. Cancer Inst. 90 : 647-8 (1998)
に報告された、乳ガンの予防の試みにおいて最近証明され、ここでは６年以上の
タモキシフェンの処置を受けた乳ガンの高い危険性のある一群の女性が、子宮内
膜ガンの発生の増大を示したが、骨折の発生をいくらか減少させ、乳ガンの発生
が劇的に４５％減少した。新規ＳＥＲＭの合理的な設計及び既存のものの最適化
は、ＥＲαの転写活性に対する、異なるリガンドの化学的性質及び構造の作用の
理解を必要とする。
【０００６】 核受容体はまた、受容体の機能に関係するタンパク質、例えばシャペロン複合
体、コンプレッサー、又はコアクチベーターと結合する。特に核受容体による転
写のリガンド依存活性化は、コアクチベーターとの相互作用によって媒介される
。受容体の作用薬は、コアクチベーターの結合を促進し、そして拮抗薬は、コア
クチベーターの結合を防ぐ。核受容体によるホルモンの結合は、これらのタンパ
ク質に対する結合親和性を増大又は減少することができ、そして転写に対する核
受容体の複数の働きを左右し又は媒介することができる。
体、コンプレッサー、又はコアクチベーターと結合する。特に核受容体による転
写のリガンド依存活性化は、コアクチベーターとの相互作用によって媒介される
。受容体の作用薬は、コアクチベーターの結合を促進し、そして拮抗薬は、コア
クチベーターの結合を防ぐ。核受容体によるホルモンの結合は、これらのタンパ
ク質に対する結合親和性を増大又は減少することができ、そして転写に対する核
受容体の複数の働きを左右し又は媒介することができる。
【０００７】 ＥＲαによる転写の活性化は少なくとも２つの異なる活性化機能（ＡＦ）によ
って媒介され、これはタンパク質、Ｎ末端のＡＦ−１、及びＬＢＤのＡＦ−２の
異なるドメイン内に位置する。これらのＡＦは、細胞型及びプロモーター関連の
ものに依存し、独立して又は協力して働くことができる。ＡＦ−１の活性はＭＡ
Ｄキナーゼ経路を通して働く増殖因子によって制御され（Kato, et al., Scienc
e 270 : 1491-1494 (1995))、そしてリガンド依存性で活性化されることが一般
的に信じられているが、ＡＦ−２の活性（“転写活性”）は、リガンドの結合に
反応する（Kumar, et al., Cell 51 (6) : 941-951 (1987))。作用薬の結合は転
写活性を引き起こすが、拮抗薬の結合は起こさない（Berry, et al., EMBO. J.
9 : 2811-8 (1990))。更に、コアクチベーターは転写活性を媒介する。コアクチ
ベーターが結合する部位の構造的及び機能的性質は、１９９８年３月３０日に提
出された、Apriletti, et al., US Provisional No. 60/079,956にごく最近定義
され、この開示は引用によって本明細書に組入れられる。
って媒介され、これはタンパク質、Ｎ末端のＡＦ−１、及びＬＢＤのＡＦ−２の
異なるドメイン内に位置する。これらのＡＦは、細胞型及びプロモーター関連の
ものに依存し、独立して又は協力して働くことができる。ＡＦ−１の活性はＭＡ
Ｄキナーゼ経路を通して働く増殖因子によって制御され（Kato, et al., Scienc
e 270 : 1491-1494 (1995))、そしてリガンド依存性で活性化されることが一般
的に信じられているが、ＡＦ−２の活性（“転写活性”）は、リガンドの結合に
反応する（Kumar, et al., Cell 51 (6) : 941-951 (1987))。作用薬の結合は転
写活性を引き起こすが、拮抗薬の結合は起こさない（Berry, et al., EMBO. J.
9 : 2811-8 (1990))。更に、コアクチベーターは転写活性を媒介する。コアクチ
ベーターが結合する部位の構造的及び機能的性質は、１９９８年３月３０日に提
出された、Apriletti, et al., US Provisional No. 60/079,956にごく最近定義
され、この開示は引用によって本明細書に組入れられる。
【０００８】 近年の構造の研究は、リガンドがＬＢＤの構造に直接作用することによって転
写活性を制御することを示している。ヒトレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）（
Renaud, et al., Nature 378 : 681-689 (1995)及びWurtz, et al., Nat. Struc
t. Biol. 3 : 87-94 (1996))、甲状腺ホルモン受容体α（ＴＲα）（Wagner, et
al., Nature 378 : 690-697 (1995))、プロゲステロン受容体（Williams, et a
l., Nature 393 : 392-395 (1998))及びＥＲα（Brzozowski, et al., Nature 3
89 : 753-758 (1997) ; Tanebanm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :
5998-6003 (1998))の、配位したＬＢＤの構造との、未配位のヒトレチノイドＸ
受容体αのＬＢＤの比較は、ヘリックス１２、ＬＢＤの最もＣ末端のヘリックス
の再配置に関係する、作用薬誘導の立体配座の変化が、転写活性に重要であるこ
とを示している。ヘリックス３，５及び１２のある点突然変異が転写活性を欠く
が、リガンド又はＤＮＡの結合に対する作用を持たないために、ＬＢＤのこれら
の領域が、一般的な転写機構へ受容体を連結する分子のために、作用薬の存在下
作製される認識表面の一部を形成することが予測された（Danielian, et al., E
MBO J. 11 : 1025-33 (1992) ; Feng, etal., Science 280 : 1749-9 (1998) ;
Henttu, etal., Mol. Cell. Biol. 17 : 1832-9 (1997) ; Wrenn, et al., J. B
iol. Chem. 268 : 24089-24098 (1993))。Ｅ2及びＲＡＬと複合したＬＢＤの構
造は、両リガンドがＬＢＤのコア内の同一の部位で結合するが（Brzozowski, et
al., supra)、これらのリガンドのそれぞれがヘリックス１２の異なる立体配座
を誘導することを示している。Ｅ2−ＬＢＤ複合体のヘリックス１２が、他の作
用薬が結合したＮＲ ＬＢＤ構造における相当するヘリックスで観察された立体
配座のヘリックス３，５／６及び１１を包むが、ＲＡＬ−ＬＢＤ複合体のヘリッ
クス１２は、ヘリックス３及び５由来の残基から構成される疎水性の溝に結合す
る。ヘリックス１２のこのもう１つの配向は、転写活性に必要な前記の溝に残基
を部分的に埋め、このことはＲＡＬ及びおそらく他の拮抗薬が、コアクチベータ
ー結合部位の表面のトポグラフィーを混乱させることによって転写活性を妨害す
ることを示している。
写活性を制御することを示している。ヒトレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）（
Renaud, et al., Nature 378 : 681-689 (1995)及びWurtz, et al., Nat. Struc
t. Biol. 3 : 87-94 (1996))、甲状腺ホルモン受容体α（ＴＲα）（Wagner, et
al., Nature 378 : 690-697 (1995))、プロゲステロン受容体（Williams, et a
l., Nature 393 : 392-395 (1998))及びＥＲα（Brzozowski, et al., Nature 3
89 : 753-758 (1997) ; Tanebanm, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :
5998-6003 (1998))の、配位したＬＢＤの構造との、未配位のヒトレチノイドＸ
受容体αのＬＢＤの比較は、ヘリックス１２、ＬＢＤの最もＣ末端のヘリックス
の再配置に関係する、作用薬誘導の立体配座の変化が、転写活性に重要であるこ
とを示している。ヘリックス３，５及び１２のある点突然変異が転写活性を欠く
が、リガンド又はＤＮＡの結合に対する作用を持たないために、ＬＢＤのこれら
の領域が、一般的な転写機構へ受容体を連結する分子のために、作用薬の存在下
作製される認識表面の一部を形成することが予測された（Danielian, et al., E
MBO J. 11 : 1025-33 (1992) ; Feng, etal., Science 280 : 1749-9 (1998) ;
Henttu, etal., Mol. Cell. Biol. 17 : 1832-9 (1997) ; Wrenn, et al., J. B
iol. Chem. 268 : 24089-24098 (1993))。Ｅ2及びＲＡＬと複合したＬＢＤの構
造は、両リガンドがＬＢＤのコア内の同一の部位で結合するが（Brzozowski, et
al., supra)、これらのリガンドのそれぞれがヘリックス１２の異なる立体配座
を誘導することを示している。Ｅ2−ＬＢＤ複合体のヘリックス１２が、他の作
用薬が結合したＮＲ ＬＢＤ構造における相当するヘリックスで観察された立体
配座のヘリックス３，５／６及び１１を包むが、ＲＡＬ−ＬＢＤ複合体のヘリッ
クス１２は、ヘリックス３及び５由来の残基から構成される疎水性の溝に結合す
る。ヘリックス１２のこのもう１つの配向は、転写活性に必要な前記の溝に残基
を部分的に埋め、このことはＲＡＬ及びおそらく他の拮抗薬が、コアクチベータ
ー結合部位の表面のトポグラフィーを混乱させることによって転写活性を妨害す
ることを示している。
【０００９】 生物化学的及び遺伝的な試みは、SRC-1/N-CoA1 (Onate, et al., Science 270
: 1354-1357 (1995)), GRIP 1/TIF2/SRC-2 (Hong, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93 (10) : 4948-4952 (1996)及びVoegel, et al., EMBO J. 15 : 366
7-3675 (1996)), p/CIP/RAC3/ACTR/AIBI/SRC-3 (Anzick, et al., Science 277
: 965-968 (1997), Chen, et al., Cell 90 (3) : 569-80 (1997), Li, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 8479-84 (1997)及びTorchia, et al., Natu
re 387 : 677-684 (1997))及びCBP/p300 (Hanstein, et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 93 : 11540-11545 (1996))を含む、ERα（Horwiz, et al., Mol. En
docrinol. 10 : 1167-1177 (1996))とのリガンド依存性において会合するいくつ
かのタンパク質の同定を導いた。これらのタンパク質が転写コアクチベーターと
して分類されるのは、ＥＲα及びいくつかの他のＮＲによって、それらがリガン
ド依存の転写活性を増強するためである（Glass, et al., Curr. Opin. Cell. B
iol. 9 : 222-32 (1997) ; Torchia, et al., Supra)。分断したＳＲＣ−１遺伝
子によるマウスの部分的なホルモン耐性の観察（Xu, et al., Science 279 : 19
22-1925 (1998)は、コアクチベーターがｉｎ ｖｉｖｏでのＮＲの機能を必要と
するという賞賛される証明を提供する。ＡＦ−２が方向づける転写活性における
その提案される役割と一致して、ＳＲＣ−１はヒストンアセチラーゼ活性並びに
作用薬が結合した受容体だけでなく、他のコアクチベーター及びいくつかの一般
的な転写因子と相互作用する能力を有する（Kamei, et al., Cell 85 (3) : 403
-14 (1996) ; Onate, et al., Supra ; Spencer, et al., Nature 389 : 194-8
(1997) ; Takeshita, et al., Endocrinology 137 : 3594-7 (1996))。ＳＲＣ−
１及びＧＲＩＤ１もまた、推定されるコアクチベーター結合部位を用いて、ヒト
ＴＲβ及びヒトＥＲα、その両方の作用薬が結合したＬＢＤに結合する（Feng,
et al., Supra)。
: 1354-1357 (1995)), GRIP 1/TIF2/SRC-2 (Hong, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93 (10) : 4948-4952 (1996)及びVoegel, et al., EMBO J. 15 : 366
7-3675 (1996)), p/CIP/RAC3/ACTR/AIBI/SRC-3 (Anzick, et al., Science 277
: 965-968 (1997), Chen, et al., Cell 90 (3) : 569-80 (1997), Li, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 8479-84 (1997)及びTorchia, et al., Natu
re 387 : 677-684 (1997))及びCBP/p300 (Hanstein, et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 93 : 11540-11545 (1996))を含む、ERα（Horwiz, et al., Mol. En
docrinol. 10 : 1167-1177 (1996))とのリガンド依存性において会合するいくつ
かのタンパク質の同定を導いた。これらのタンパク質が転写コアクチベーターと
して分類されるのは、ＥＲα及びいくつかの他のＮＲによって、それらがリガン
ド依存の転写活性を増強するためである（Glass, et al., Curr. Opin. Cell. B
iol. 9 : 222-32 (1997) ; Torchia, et al., Supra)。分断したＳＲＣ−１遺伝
子によるマウスの部分的なホルモン耐性の観察（Xu, et al., Science 279 : 19
22-1925 (1998)は、コアクチベーターがｉｎ ｖｉｖｏでのＮＲの機能を必要と
するという賞賛される証明を提供する。ＡＦ−２が方向づける転写活性における
その提案される役割と一致して、ＳＲＣ−１はヒストンアセチラーゼ活性並びに
作用薬が結合した受容体だけでなく、他のコアクチベーター及びいくつかの一般
的な転写因子と相互作用する能力を有する（Kamei, et al., Cell 85 (3) : 403
-14 (1996) ; Onate, et al., Supra ; Spencer, et al., Nature 389 : 194-8
(1997) ; Takeshita, et al., Endocrinology 137 : 3594-7 (1996))。ＳＲＣ−
１及びＧＲＩＤ１もまた、推定されるコアクチベーター結合部位を用いて、ヒト
ＴＲβ及びヒトＥＲα、その両方の作用薬が結合したＬＢＤに結合する（Feng,
et al., Supra)。
【００１０】 コアクチベーターのｐ１６０ファミリーのメンバー、例えばＳＲＣ−１，ＧＲ
ＩＰ１／ＴＩＦ２／ＳＲＣ−２並びにｐ／ＣＩＰ／ＲＡＣ３／ＡＣＴＲ／ＡＩＢ
Ｉ／ＳＲＣ−３及び他のコアクチベーターは、ＮＲボックス（Ding, et al., Mo
l. Endocrinol. 12 : 302-313 (1998) ; Heery, et al., Nature 387 : 733-736
(1997) ; Le Douarin, et al., EMBO J. 15 :6701-15 (1996) ; Torchia, et a
l., Supra)としても知られる、短い特徴配列モチーフ、ＬＸＸＬＬ（配列番号１
）（ここでＬはロイシンであり、そしてＸはいずれかのアミノ酸である）を通し
て、作用薬が結合したＮＲ ＬＢＤを認識する。変異の研究はＮＲ ＬＢＤのた
めのコアクチベーターの親和性が排他的でなければ主に、これらのＮＲボックス
によって決定されることを示している（Ding, et al., Supra ; Heery, et al.,
Nature 387 : 733-736 (1997) ; Le Douarin, et al., EMBO J. 15 : 6701-15
(1996) ; Torchia, et al., Supra)。各ｐ１６０コアクチベーターは、いくつか
のＮＲボックスを含む。ＳＲＣ−１，ＧＲＩＰ１及びＴＩＦ２内のＮＲボックス
は、異なる親和性で異なるＮＲを認識することが証明されたが（Ding, et al., supra ; Kalkhoven, et al., EMBO J. 17 : 232-43 (1998) ; Voegel, et al., EMBO J. 17 : 507-19 (1998))、これらの結合選択性の理由は知られていない。
ＩＰ１／ＴＩＦ２／ＳＲＣ−２並びにｐ／ＣＩＰ／ＲＡＣ３／ＡＣＴＲ／ＡＩＢ
Ｉ／ＳＲＣ−３及び他のコアクチベーターは、ＮＲボックス（Ding, et al., Mo
l. Endocrinol. 12 : 302-313 (1998) ; Heery, et al., Nature 387 : 733-736
(1997) ; Le Douarin, et al., EMBO J. 15 :6701-15 (1996) ; Torchia, et a
l., Supra)としても知られる、短い特徴配列モチーフ、ＬＸＸＬＬ（配列番号１
）（ここでＬはロイシンであり、そしてＸはいずれかのアミノ酸である）を通し
て、作用薬が結合したＮＲ ＬＢＤを認識する。変異の研究はＮＲ ＬＢＤのた
めのコアクチベーターの親和性が排他的でなければ主に、これらのＮＲボックス
によって決定されることを示している（Ding, et al., Supra ; Heery, et al.,
Nature 387 : 733-736 (1997) ; Le Douarin, et al., EMBO J. 15 : 6701-15
(1996) ; Torchia, et al., Supra)。各ｐ１６０コアクチベーターは、いくつか
のＮＲボックスを含む。ＳＲＣ−１，ＧＲＩＰ１及びＴＩＦ２内のＮＲボックス
は、異なる親和性で異なるＮＲを認識することが証明されたが（Ding, et al., supra ; Kalkhoven, et al., EMBO J. 17 : 232-43 (1998) ; Voegel, et al., EMBO J. 17 : 507-19 (1998))、これらの結合選択性の理由は知られていない。
【００１１】 Darimont等の“Structure and Specificity of nuclear receptor-coactivato
r interactions”Genes Dev. 12 : 3343-3356 (1998)は、ＴＲβとＧＲＩＰ１
ＮＲボックスIIペプチドとの間の複合体の構造的研究及びＴＲβ及びＧＲに結合
するＧＲＩＰ１の生物化学的研究を記載している。ＰＰＡＲγ／ＳＲＣ−１ペプ
チドの複合体はNolte, et al., Nature 395 : 137-143 (1998)に記載されている
。
r interactions”Genes Dev. 12 : 3343-3356 (1998)は、ＴＲβとＧＲＩＰ１
ＮＲボックスIIペプチドとの間の複合体の構造的研究及びＴＲβ及びＧＲに結合
するＧＲＩＰ１の生物化学的研究を記載している。ＰＰＡＲγ／ＳＲＣ−１ペプ
チドの複合体はNolte, et al., Nature 395 : 137-143 (1998)に記載されている
。
【００１２】 核受容体の医学的重要性は重大である。それらは乳ガン、前立腺ガン、心臓の
不整脈、不妊症、骨粗鬆症、甲状腺機能亢進症、高コレステロール血症、肥満及
び他の症状に関係していた。例えば、ＥＲαの転写活性を調節する化合物は、骨
粗鬆症、心臓血管疾患及び乳ガンを治療するために現在使用されている（Gradis
har, et al., J. Clin. Oncol. 15 : 840-52 (1997)及びJordan, J. Natl. Canc
er Inst. 90 : 967-71 (1998))。
不整脈、不妊症、骨粗鬆症、甲状腺機能亢進症、高コレステロール血症、肥満及
び他の症状に関係していた。例えば、ＥＲαの転写活性を調節する化合物は、骨
粗鬆症、心臓血管疾患及び乳ガンを治療するために現在使用されている（Gradis
har, et al., J. Clin. Oncol. 15 : 840-52 (1997)及びJordan, J. Natl. Canc
er Inst. 90 : 967-71 (1998))。
【００１３】 前記核受容体のリガンド結合ドメイン内の鍵となる残基、及びこれらの部位に
結合することによって前記受容体に作用する分子の更なる同定及び特徴づけのた
めの必要性が存在し続けている。これらの相互作用の理解は、相互作用する薬剤
の設計、合成、及び選別のための基礎を提供する。前記核受容体、及び特にエス
トロゲン受容体によって制御される生理学的な過程を調節するために、これらの
結合部位を標的化し、そしてそれらを器官に投与する化合物を発見するために必
要とされる時間を減少させるための方法及び組成物を考案することも有利であろ
う。発明の要約 本発明は核受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の更なる同定及び操作に
関し、このことはＬＢＤに結合し、そして核受容体活性、及び特にエストロゲン
受容体を調節する化合物の設計を容易にする。前記化合物は核受容体活性を調節
する作用薬及び拮抗薬を含み、そして受容体−、細胞−及び／又は組織−特異的
であることができる。特に、前記化合物はコアクチベーター−コアクチベーター
の結合部位相互作用に影響を与えることによって、核受容体活性を調節する。
結合することによって前記受容体に作用する分子の更なる同定及び特徴づけのた
めの必要性が存在し続けている。これらの相互作用の理解は、相互作用する薬剤
の設計、合成、及び選別のための基礎を提供する。前記核受容体、及び特にエス
トロゲン受容体によって制御される生理学的な過程を調節するために、これらの
結合部位を標的化し、そしてそれらを器官に投与する化合物を発見するために必
要とされる時間を減少させるための方法及び組成物を考案することも有利であろ
う。発明の要約 本発明は核受容体のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の更なる同定及び操作に
関し、このことはＬＢＤに結合し、そして核受容体活性、及び特にエストロゲン
受容体を調節する化合物の設計を容易にする。前記化合物は核受容体活性を調節
する作用薬及び拮抗薬を含み、そして受容体−、細胞−及び／又は組織−特異的
であることができる。特に、前記化合物はコアクチベーター−コアクチベーター
の結合部位相互作用に影響を与えることによって、核受容体活性を調節する。
【００１４】 本発明はまた、ＬＢＤに結合した作用薬及びコアクチベーター結合部位に結合
したペプチドとの前記核受容体のタンパク質共結晶並びにそれらの製造方法を含
む。同様に、本発明はまた、ＬＢＤに結合した拮抗薬との前記核受容体のタンパ
ク質共結晶及びそれらの製造方法を含む。前記共結晶は、ＬＢＤ及びコアクチベ
ーター結合部位を形成し、そして前記の部位に結合する分子と相互作用する特異
的アミノ酸及びそれらの原子の、原子モデル化情報を得るための手段を提供する
。前記共結晶はまた、リガンド：核受容体及びコアクチベーター：核受容体の相
互作用に関係するモデリング情報、並びにそれらに結合するリガンドの構造を提
供する。
したペプチドとの前記核受容体のタンパク質共結晶並びにそれらの製造方法を含
む。同様に、本発明はまた、ＬＢＤに結合した拮抗薬との前記核受容体のタンパ
ク質共結晶及びそれらの製造方法を含む。前記共結晶は、ＬＢＤ及びコアクチベ
ーター結合部位を形成し、そして前記の部位に結合する分子と相互作用する特異
的アミノ酸及びそれらの原子の、原子モデル化情報を得るための手段を提供する
。前記共結晶はまた、リガンド：核受容体及びコアクチベーター：核受容体の相
互作用に関係するモデリング情報、並びにそれらに結合するリガンドの構造を提
供する。
【００１５】 更に本発明は核受容体の原子モデルを用いて、核受容体に結合するリガンドを
調節する分子の同定及び設計のための方法を提供する。前記方法は、核受容体Ｌ
ＢＤ又はその一部を含んで成る原子構造のモデルを用いる、核受容体のＬＢＤに
空間的にはまる試験化合物のモデリング、核受容体のＬＢＤへの試験化合物の結
合を特徴とする、生物学的アッセイの様なアッセイにおける試験化合物のスクリ
ーニング、及び前記受容体に結合するリガンドを調節する試験化合物の同定に関
与する。
調節する分子の同定及び設計のための方法を提供する。前記方法は、核受容体Ｌ
ＢＤ又はその一部を含んで成る原子構造のモデルを用いる、核受容体のＬＢＤに
空間的にはまる試験化合物のモデリング、核受容体のＬＢＤへの試験化合物の結
合を特徴とする、生物学的アッセイの様なアッセイにおける試験化合物のスクリ
ーニング、及び前記受容体に結合するリガンドを調節する試験化合物の同定に関
与する。
【００１６】 本発明はまた、核受容体のＬＢＤ内の鍵となる残基を同定するための組成物及
び方法を含む。前記方法はリガンド及び／又はコアクチベーターの結合を調節す
る残基を同定するために、注目の核受容体の表面の試験を含む。本明細書に記載
のヒトＥＲαのＬＢＤ内の鍵となる残基に対する相同性によって、前記残基を同
定することができる。核受容体のＬＢＤ、及び／又はその一部の三次元モデルに
よるオーバーレイ及びスーパーポジショニングもまた、この目的のために使用す
ることができる。更に、アラインメント及び／又はモデリングを、関連する細胞
における部位の性質を特徴づけるために、ＬＢＤの表面上の変異の配置のための
手引きとして使用することができる。
び方法を含む。前記方法はリガンド及び／又はコアクチベーターの結合を調節す
る残基を同定するために、注目の核受容体の表面の試験を含む。本明細書に記載
のヒトＥＲαのＬＢＤ内の鍵となる残基に対する相同性によって、前記残基を同
定することができる。核受容体のＬＢＤ、及び／又はその一部の三次元モデルに
よるオーバーレイ及びスーパーポジショニングもまた、この目的のために使用す
ることができる。更に、アラインメント及び／又はモデリングを、関連する細胞
における部位の性質を特徴づけるために、ＬＢＤの表面上の変異の配置のための
手引きとして使用することができる。
【００１７】 核受容体の活性を調節する方法もまた提供される。前記方法はｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ又はｉｎ ｖｉｖｏであることができる。前記方法は、前記のリガンド結合ド
メインに結合し、そして作用薬又は拮抗薬のいずれかとして働く化合物の十分な
量の投与を含んで成る。好ましい化合物は、注目の細胞において見出されたリガ
ンドよりも大きい親和性を有する部位に結合する。
ｏ又はｉｎ ｖｉｖｏであることができる。前記方法は、前記のリガンド結合ド
メインに結合し、そして作用薬又は拮抗薬のいずれかとして働く化合物の十分な
量の投与を含んで成る。好ましい化合物は、注目の細胞において見出されたリガ
ンドよりも大きい親和性を有する部位に結合する。
【００１８】 更に本発明は核受容体に結合するリガンドの作用薬又は拮抗薬を同定するため
の方法を含む。前記方法はコンピューターを用いたモデリング系；核受容体のリ
ガンド結合ドメインに空間的にはまるモデル化合物に、核受容体のリガンド結合
ドメイン又はその一部を含んで成る原子配位を提供すること、並びに核受容体活
性のための、アッセイ、例えば生物学的なアッセイにおいて、リガンド結合ドメ
インへの結合を通して、核受容体の活性を増大又は減少させる化合物を同定する
ことを含んで成る。
の方法を含む。前記方法はコンピューターを用いたモデリング系；核受容体のリ
ガンド結合ドメインに空間的にはまるモデル化合物に、核受容体のリガンド結合
ドメイン又はその一部を含んで成る原子配位を提供すること、並びに核受容体活
性のための、アッセイ、例えば生物学的なアッセイにおいて、リガンド結合ドメ
インへの結合を通して、核受容体の活性を増大又は減少させる化合物を同定する
ことを含んで成る。
【００１９】 前記のリガンド結合ドメイン又はその一部を含んで成る、原子モデルの構築及
び操作のための情報を有する機械可読のデータ記憶媒体もまた提供される。前記
媒体は、前記データを用いるための命令でプログラムされた機械を用いるとき、
核受容体のリガンド結合ドメインのための分子又は分子複合体の、図表による三
次元的な表示を描くことができる機械可読のデータでコードされる、データの記
憶資料を含んで成る。
び操作のための情報を有する機械可読のデータ記憶媒体もまた提供される。前記
媒体は、前記データを用いるための命令でプログラムされた機械を用いるとき、
核受容体のリガンド結合ドメインのための分子又は分子複合体の、図表による三
次元的な表示を描くことができる機械可読のデータでコードされる、データの記
憶資料を含んで成る。
【００２０】 他の核受容体と比較される核受容体のある型の活性を選択的に調節する化合物
の同定方法もまた提供される。核受容体の原子構造モデルを用いての、注目の核
受容体のリガンド結合ドメインに空間的及び選択的にはまる試験化合物のモデリ
ング、その部位付近のＬＢＤに独特の１又は複数の残基と相互作用する化合物の
選択、並びにアッセイ、例えば生物学的アッセイにおける、リガンド結合活性の
ための、他の核受容体と比較してＬＢＤに選択的に結合する化合物の同定によっ
て前記方法は例示される。受容体選択的リガンド結合に関係する独特の構成を、
異なる核受容体又は同一型の受容体のイソ型の原子モデルを比較することによっ
て同定することができる。
の同定方法もまた提供される。核受容体の原子構造モデルを用いての、注目の核
受容体のリガンド結合ドメインに空間的及び選択的にはまる試験化合物のモデリ
ング、その部位付近のＬＢＤに独特の１又は複数の残基と相互作用する化合物の
選択、並びにアッセイ、例えば生物学的アッセイにおける、リガンド結合活性の
ための、他の核受容体と比較してＬＢＤに選択的に結合する化合物の同定によっ
て前記方法は例示される。受容体選択的リガンド結合に関係する独特の構成を、
異なる核受容体又は同一型の受容体のイソ型の原子モデルを比較することによっ
て同定することができる。
【００２１】 本発明は本発明の方法によって同定されるペプチド、ペプチド擬似体、並びに
他の化合物、例えば小さい有機分子、特に核受容体を基にした障害、特にステロ
イド受容体を基にした障害、及び更に具体的にエストロゲン受容体を基にした障
害の治療において有用な新規誘導化合物の使用を見出す。具体的な態様の説明 本発明は核受容体活性、特にステロイド受容体活性、及び更に特別にエストロ
ゲン受容体活性を調節する化合物を同定するための方法及び組成物を提供する。
前記化合物はリガンド結合ドメインに結合する、核受容体の作用薬又は拮抗薬で
ある。ＬＢＤに結合する化合物もまた提供される。前記化合物は天然又は合成で
あることができる。好ましい化合物は小さい有機分子、ペプチド及びペプチド擬
似体（例えば、サイクリックペプチド、ペプチド類似体、又は不自然なペプチド
である）である。
他の化合物、例えば小さい有機分子、特に核受容体を基にした障害、特にステロ
イド受容体を基にした障害、及び更に具体的にエストロゲン受容体を基にした障
害の治療において有用な新規誘導化合物の使用を見出す。具体的な態様の説明 本発明は核受容体活性、特にステロイド受容体活性、及び更に特別にエストロ
ゲン受容体活性を調節する化合物を同定するための方法及び組成物を提供する。
前記化合物はリガンド結合ドメインに結合する、核受容体の作用薬又は拮抗薬で
ある。ＬＢＤに結合する化合物もまた提供される。前記化合物は天然又は合成で
あることができる。好ましい化合物は小さい有機分子、ペプチド及びペプチド擬
似体（例えば、サイクリックペプチド、ペプチド類似体、又は不自然なペプチド
である）である。
【００２２】 ＥＲαのＬＢＤ内のある残基が、特に重要であると同定された：Ｍｅｔ３４３
，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，
Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇ
ｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８（図４Ａ参照）。こ
れらのうちのいくつかは、ヘリックス１２の配置に直接的又は間接的に作用する
ことが見出された：Ｍｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５
及びＭｅｔ５２８。これらの特定の残基との相互作用は、例えばＤＥＳが前記受
容体に結合するとき起こり、コアクチベーターの結合を促進するＬＢＤの立体配
座を安定化する。これらの残基との結合又は相互作用を増強するリガンドの修飾
は、受容体活性の向上した作用薬を提供するだろう。同様に、これらの残基との
結合又は相互作用に反対に作用するリガンドの修飾は、向上した拮抗薬を提供す
るだろう。
，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，
Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇ
ｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８（図４Ａ参照）。こ
れらのうちのいくつかは、ヘリックス１２の配置に直接的又は間接的に作用する
ことが見出された：Ｍｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５
及びＭｅｔ５２８。これらの特定の残基との相互作用は、例えばＤＥＳが前記受
容体に結合するとき起こり、コアクチベーターの結合を促進するＬＢＤの立体配
座を安定化する。これらの残基との結合又は相互作用を増強するリガンドの修飾
は、受容体活性の向上した作用薬を提供するだろう。同様に、これらの残基との
結合又は相互作用に反対に作用するリガンドの修飾は、向上した拮抗薬を提供す
るだろう。
【００２３】 更に、前記のＥＲαのＴｙｒ５３７残基が未配位の受容体を安定化する役割を
果たし、その結果ヘリックス１２が自由であり、コアクチベーター結合部位と相
互作用することが信じられている。ＥＲが、この位置でチロシンを有することに
おいて極めて独特であるのは、ｈＥＲαのＴｙｒ５３７残基に相当する位置で、
ｈＴＲβ，ｒＴＲα，ｈＲＡＲγ，ｈＧＲ，ｈＰＲ，ｈＭＲ及びｈＡＲの全てが
プロリン残基を有し、ｈＲＸＲαがアスパラギン酸残基を有し、ｈＰＰＡＲγが
ヒスチジン残基を有し、ｈＶＤＲがスレオニン残基を有しているためである。従
って、選択的な作用薬及び拮抗薬を、Ｔｙｒ５３７と相互作用するエストロゲン
受容体のために設計することができる。
果たし、その結果ヘリックス１２が自由であり、コアクチベーター結合部位と相
互作用することが信じられている。ＥＲが、この位置でチロシンを有することに
おいて極めて独特であるのは、ｈＥＲαのＴｙｒ５３７残基に相当する位置で、
ｈＴＲβ，ｒＴＲα，ｈＲＡＲγ，ｈＧＲ，ｈＰＲ，ｈＭＲ及びｈＡＲの全てが
プロリン残基を有し、ｈＲＸＲαがアスパラギン酸残基を有し、ｈＰＰＡＲγが
ヒスチジン残基を有し、ｈＶＤＲがスレオニン残基を有しているためである。従
って、選択的な作用薬及び拮抗薬を、Ｔｙｒ５３７と相互作用するエストロゲン
受容体のために設計することができる。
【００２４】 伝統的な拮抗薬、例えばＯＨＴ又はＲＡＬは、それが作用薬複合体（ＤＥＳ又
はＥ2）に存在する場合に、ヘリックス１２の配置を直接妨害する側鎖を有する
。更に、リガンドが誘導する変化は、ヘリックス１２をコアクチベーターのヘリ
ックス結合部位に到達させることを必要とし、その結果、コアクチベーターの結
合を阻止し、そして転写活性を阻害することが予想される。１又は複数のこれら
のＬＢＤ残基との適当な相互作用によるその様な変化又は干渉が前記受容体を弛
緩させることで、前記受容体の２次構造を解離し、そしてヘリックス１１の巻き
戻しをもたらすことが見出された。ヘリックス１１の巻き戻しはヘリックス１１
と１２の間のループの長さを増大し、その結果ヘリックス１２をリガンド結合ポ
ケットから遠ざけ、そしてコアクチベーター結合部位に近づけ、ここでそれは前
記コアクチベーターの相互作用をまねることで前記コアクチベーターの認識の溝
をふさぎ、そしてその結果コアクチベーターの認識を阻害する（図７参照）。１
又は複数の指摘したアミノ酸との結合又は相互作用で干渉するリガンドの修飾は
受容体の弛緩を招き、その結果受容体の２次構造に作用し、そしてヘリックス１
２の巻き戻しを招く。その様な修飾をしたリガンドに基づく化合物は、拮抗薬と
して働くだろう。
はＥ2）に存在する場合に、ヘリックス１２の配置を直接妨害する側鎖を有する
。更に、リガンドが誘導する変化は、ヘリックス１２をコアクチベーターのヘリ
ックス結合部位に到達させることを必要とし、その結果、コアクチベーターの結
合を阻止し、そして転写活性を阻害することが予想される。１又は複数のこれら
のＬＢＤ残基との適当な相互作用によるその様な変化又は干渉が前記受容体を弛
緩させることで、前記受容体の２次構造を解離し、そしてヘリックス１１の巻き
戻しをもたらすことが見出された。ヘリックス１１の巻き戻しはヘリックス１１
と１２の間のループの長さを増大し、その結果ヘリックス１２をリガンド結合ポ
ケットから遠ざけ、そしてコアクチベーター結合部位に近づけ、ここでそれは前
記コアクチベーターの相互作用をまねることで前記コアクチベーターの認識の溝
をふさぎ、そしてその結果コアクチベーターの認識を阻害する（図７参照）。１
又は複数の指摘したアミノ酸との結合又は相互作用で干渉するリガンドの修飾は
受容体の弛緩を招き、その結果受容体の２次構造に作用し、そしてヘリックス１
２の巻き戻しを招く。その様な修飾をしたリガンドに基づく化合物は、拮抗薬と
して働くだろう。
【００２５】 従って、本発明の１つの観点は、核受容体活性を調節（すなわち増大又は減少
）する化合物の同定方法であり、これは以下の事を含んで成る：エストロゲン受
容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部の原子構造モデルを用いての、注目
の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的にはまる試験化合物をモデリングし
、アッセイ、例えば前記リガンド結合ドメインへの試験化合物の結合を特徴とす
る生物学的なアッセイにおいて前記試験化合物をスクリーニングし、そして核受
容体活性を調節する試験化合物を同定することであり、ここで前記の原子構造モ
デルは、ヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５
０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４
，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，
Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基に相当するアミノ酸残基の原子配位を含ん
で成り、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５
及びＭｅｔ５２８である。好ましい態様において、核受容体はＥＲである。前記
試験化合物は作用薬であることができ、そして核受容体活性は、以下で定義する
コアクチベーター結合部位への、コアクチベーター又はコアクチベーターを擬態
する化合物の結合によって測定される。一方、前記試験化合物は拮抗薬であるこ
とができ、そして核受容体活性はヘリックス１２の巻き戻し及び／又はコアクチ
ベーター結合部位に結合するコアクチベーターの妨害によって測定される。前記
のスクリーニングは典型的にｉｎ ｖｉｔｒｏであり、そして高処理量スクリー
ニングが好ましい。適当な試験化合物を後述の様に設計することができ、又は化
合物のライブラリーから得ることができ、そして例示によって限定されないが、
小さい有機分子、ペプチド及びペプチド擬似体を含む。上述した方法もまた、前
記のモデリング段階の前に、コンピューターを用いるモデリング系にエストロゲ
ン受容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部を提供する段階を含みうる。
）する化合物の同定方法であり、これは以下の事を含んで成る：エストロゲン受
容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部の原子構造モデルを用いての、注目
の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的にはまる試験化合物をモデリングし
、アッセイ、例えば前記リガンド結合ドメインへの試験化合物の結合を特徴とす
る生物学的なアッセイにおいて前記試験化合物をスクリーニングし、そして核受
容体活性を調節する試験化合物を同定することであり、ここで前記の原子構造モ
デルは、ヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５
０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４
，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，
Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基に相当するアミノ酸残基の原子配位を含ん
で成り、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５
及びＭｅｔ５２８である。好ましい態様において、核受容体はＥＲである。前記
試験化合物は作用薬であることができ、そして核受容体活性は、以下で定義する
コアクチベーター結合部位への、コアクチベーター又はコアクチベーターを擬態
する化合物の結合によって測定される。一方、前記試験化合物は拮抗薬であるこ
とができ、そして核受容体活性はヘリックス１２の巻き戻し及び／又はコアクチ
ベーター結合部位に結合するコアクチベーターの妨害によって測定される。前記
のスクリーニングは典型的にｉｎ ｖｉｔｒｏであり、そして高処理量スクリー
ニングが好ましい。適当な試験化合物を後述の様に設計することができ、又は化
合物のライブラリーから得ることができ、そして例示によって限定されないが、
小さい有機分子、ペプチド及びペプチド擬似体を含む。上述した方法もまた、前
記のモデリング段階の前に、コンピューターを用いるモデリング系にエストロゲ
ン受容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部を提供する段階を含みうる。
【００２６】 本明細書で使用した様に、“その一部”の語は、前記の部位と結合することが
できる化合物と相互作用するＬＢＤの十分な数の残基又はそれらの原子に相当す
る原子配位を意味することを意図する。これは、結合した化合物又はそのフラグ
メントの４．５Å以内の原子を有する受容体の残基を含む。従って、例えば前記
のモデリング系に提供される原子配位は、核受容体のＬＢＤの原子、ＬＢＤに相
当する原子の様なＬＢＤの一部又はＬＢＤに結合する化合物のモデリング及び設
計において有用な原子のサブセットを含むことができる。
できる化合物と相互作用するＬＢＤの十分な数の残基又はそれらの原子に相当す
る原子配位を意味することを意図する。これは、結合した化合物又はそのフラグ
メントの４．５Å以内の原子を有する受容体の残基を含む。従って、例えば前記
のモデリング系に提供される原子配位は、核受容体のＬＢＤの原子、ＬＢＤに相
当する原子の様なＬＢＤの一部又はＬＢＤに結合する化合物のモデリング及び設
計において有用な原子のサブセットを含むことができる。
【００２７】 前記のリガンド結合ドメインにはまる化合物の原子配位はまた、前記部位に結
合する化合物又はフラグメントを同定するためのモデリングに使用することがで
きる。“モデリング”によって、原子構造情報及び受容体−リガンド作用薬／拮
抗薬相互作用モデルに基づいた分子構造／機能の定量及び定性解析が意図される
。これは従来の数を基にした分子の動的及びエネルギーの最小化モデル、相互作
用コンピューターグラフィックモデル、修飾した分子の力学モデル、距離の幾何
学及び他の構造を基にした束縛モデルを含む。モデリングは、好ましくはコンピ
ューターを用いて行われ、そして更に知られている方法を用いて最適化すること
ができる。“空間的にはまる”ことによって、化合物の三次元構造が核受容体の
ＬＢＤの穴又はポケットによって幾何学的に適応することが意図される。
合する化合物又はフラグメントを同定するためのモデリングに使用することがで
きる。“モデリング”によって、原子構造情報及び受容体−リガンド作用薬／拮
抗薬相互作用モデルに基づいた分子構造／機能の定量及び定性解析が意図される
。これは従来の数を基にした分子の動的及びエネルギーの最小化モデル、相互作
用コンピューターグラフィックモデル、修飾した分子の力学モデル、距離の幾何
学及び他の構造を基にした束縛モデルを含む。モデリングは、好ましくはコンピ
ューターを用いて行われ、そして更に知られている方法を用いて最適化すること
ができる。“空間的にはまる”ことによって、化合物の三次元構造が核受容体の
ＬＢＤの穴又はポケットによって幾何学的に適応することが意図される。
【００２８】 他の核受容体上の相当するアミノ酸の標的化は、同一の作用を持つことが予測
される。従って、本発明の１つの態様は、核受容体のＬＢＤに結合するが、ヒト
ＥＲαの残基Ｍｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅ
ｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ
４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ
５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５
及びＭｅｔ５２８に相当する（すなわち同一又は等価の）ＬＢＤ内の１又は複数
の残基と相互作用しない拮抗薬の設計方法に適している。同様に、本発明の別の
態様は、核受容体のＬＢＤに結合し、そしてヒトＥＲαのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ
３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３
９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２
１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，
Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当するＬＢＤ
内の１又は複数の残基と増強した相互作用を有する作用薬の設計方法に適してい
る。増強した相互作用の例は、内因性のリガンドと比較して、前記作用薬が１又
は複数の前記残基とのより大きな結合親和性を有する場合である。前記核受容体
ファミリーの他のメンバーのためのその様な相当する位置を表１に示し、これは
ヒトエストロゲン受容体（ｈＥＲα）上で表わされた位置に相当する複数の核受
容体のリガンド結合ドメイン由来の残基を含むアミノ酸配列（一文字アミノ酸表
記）のアラインメントを提供する：組換え甲状腺ホルモン（ｒＴＲα）、レチノ
イド（ｈＲＡＲγ及びｈＲＸＲα）、糖質コルチコイド（ｈＧＲα）、プロゲス
チン（ｈＰＲ）、鉱質コルチコイド（ｈＭＲ）及びアンドロゲン（ｈＡＲα）。
表１は本発明の例示にすぎず、そしてあらゆる方法において限定されると解釈さ
れないことが理解される。従って、他の核受容体、例えば他のエストロゲン受容
体、甲状腺受容体、レチノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン
受容体、鉱質コルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容
体及びビタミンＤ受容体の相当するアミノ酸残基もまた、本発明の方法において
使用することができる。
される。従って、本発明の１つの態様は、核受容体のＬＢＤに結合するが、ヒト
ＥＲαの残基Ｍｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅ
ｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ
４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ
５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５
及びＭｅｔ５２８に相当する（すなわち同一又は等価の）ＬＢＤ内の１又は複数
の残基と相互作用しない拮抗薬の設計方法に適している。同様に、本発明の別の
態様は、核受容体のＬＢＤに結合し、そしてヒトＥＲαのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ
３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３
９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２
１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，
Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当するＬＢＤ
内の１又は複数の残基と増強した相互作用を有する作用薬の設計方法に適してい
る。増強した相互作用の例は、内因性のリガンドと比較して、前記作用薬が１又
は複数の前記残基とのより大きな結合親和性を有する場合である。前記核受容体
ファミリーの他のメンバーのためのその様な相当する位置を表１に示し、これは
ヒトエストロゲン受容体（ｈＥＲα）上で表わされた位置に相当する複数の核受
容体のリガンド結合ドメイン由来の残基を含むアミノ酸配列（一文字アミノ酸表
記）のアラインメントを提供する：組換え甲状腺ホルモン（ｒＴＲα）、レチノ
イド（ｈＲＡＲγ及びｈＲＸＲα）、糖質コルチコイド（ｈＧＲα）、プロゲス
チン（ｈＰＲ）、鉱質コルチコイド（ｈＭＲ）及びアンドロゲン（ｈＡＲα）。
表１は本発明の例示にすぎず、そしてあらゆる方法において限定されると解釈さ
れないことが理解される。従って、他の核受容体、例えば他のエストロゲン受容
体、甲状腺受容体、レチノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン
受容体、鉱質コルチコイド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容
体及びビタミンＤ受容体の相当するアミノ酸残基もまた、本発明の方法において
使用することができる。
【００２９】
【表１】
【００３０】 “コアクチベーター結合部位”の語は、構造的なセグメント又は前述の様に折
りたたまれた核受容体のポリペプチド鎖のセグメントを表わすために本明細書で
使用され、その結果結合しているコアクチベーターのための適当な外形及びアミ
ノ酸残基の立体配座を与える。これは、コアクチベーター結合部位のポケット又
は穴を形成する三次元構造内のタンパク質の原子の物理的配置である。Aprilett
i, et al., supraに記載の様に、核受容体上のコアクチベーター結合部位を形成
する残基は、図８に示す様にヒトＴＲのＣ末端のヘリックス３（Ｉｌｅ２８０，
Ｔｈｒ２８１，Ｖａｌ２８３，Ｖａｌ２８４，Ａｌａ２８７、及びＬｙｓ２８８
）、ヘリックス４（Ｐｈｅ２９３）、ヘリックス５（Ｇｌｎ３０１，Ｉｌｅ３０
２，Ｌｅｕ３０５，Ｌｙｓ３０６）、ヘリックス６（Ｃｙｓ３０９）、及びヘリ
ックス１２（Ｐｒｏ４５３，Ｌｅｕ４５４，Ｇｌｕ４５７，Ｖａｌ４５８及びＰ
ｈｅ４５９）の残基に相当する（すなわち同一又は等価である）アミノ酸である
。前記のコアクチベーター結合部位は、前記の核受容体スーパーファミリー間で
高度に保存されている。従って、この部位は、驚いたことに顕著な疎水性の割れ
目を形成するＬＢＤの表面上の小さいクラスターに相当する。前記の疎水性の割
れ目は、ヒトＴＲのＣ末端のヘリックス３（Ｉｌｅ２８０，Ｖａｌ２８３，Ｖａ
ｌ２８４、及びＡｌａ２８７）、ヘリックス４（Ｐｈｅ２９３）、ヘリックス５
（Ｉｌｅ３０２及びＬｅｕ３０５）、ヘリックス６（Ｃｙｓ３０９）、及びヘリ
ックス１２（Ｌｅｕ４５４，Ｖａｌ４５８及びＰｈｅ４５９）の残基に相当する
疎水性残基によって形成される。前記のコアクチベーター結合部位の疎水性の割
れ目はまた、前記の核受容体のスーパーファミリー間で高度に保存されている。
りたたまれた核受容体のポリペプチド鎖のセグメントを表わすために本明細書で
使用され、その結果結合しているコアクチベーターのための適当な外形及びアミ
ノ酸残基の立体配座を与える。これは、コアクチベーター結合部位のポケット又
は穴を形成する三次元構造内のタンパク質の原子の物理的配置である。Aprilett
i, et al., supraに記載の様に、核受容体上のコアクチベーター結合部位を形成
する残基は、図８に示す様にヒトＴＲのＣ末端のヘリックス３（Ｉｌｅ２８０，
Ｔｈｒ２８１，Ｖａｌ２８３，Ｖａｌ２８４，Ａｌａ２８７、及びＬｙｓ２８８
）、ヘリックス４（Ｐｈｅ２９３）、ヘリックス５（Ｇｌｎ３０１，Ｉｌｅ３０
２，Ｌｅｕ３０５，Ｌｙｓ３０６）、ヘリックス６（Ｃｙｓ３０９）、及びヘリ
ックス１２（Ｐｒｏ４５３，Ｌｅｕ４５４，Ｇｌｕ４５７，Ｖａｌ４５８及びＰ
ｈｅ４５９）の残基に相当する（すなわち同一又は等価である）アミノ酸である
。前記のコアクチベーター結合部位は、前記の核受容体スーパーファミリー間で
高度に保存されている。従って、この部位は、驚いたことに顕著な疎水性の割れ
目を形成するＬＢＤの表面上の小さいクラスターに相当する。前記の疎水性の割
れ目は、ヒトＴＲのＣ末端のヘリックス３（Ｉｌｅ２８０，Ｖａｌ２８３，Ｖａ
ｌ２８４、及びＡｌａ２８７）、ヘリックス４（Ｐｈｅ２９３）、ヘリックス５
（Ｉｌｅ３０２及びＬｅｕ３０５）、ヘリックス６（Ｃｙｓ３０９）、及びヘリ
ックス１２（Ｌｅｕ４５４，Ｖａｌ４５８及びＰｈｅ４５９）の残基に相当する
疎水性残基によって形成される。前記のコアクチベーター結合部位の疎水性の割
れ目はまた、前記の核受容体のスーパーファミリー間で高度に保存されている。
【００３１】 本明細書に記載の例に基づき、エストロゲン受容体上のコアクチベーター結合
部位を形成する残基が、ヒトＴＲのための上述したそれらの位置に相当すること
が見出された。従って、ＥＲα上でコアクチベーター結合部位を形成する残基は
、図８に示した様にヒトＥＲαのＣ末端のヘリックス３（Ｌｅｕ３５４，Ｖａｌ
３５５，Ｍｅｔ３５７，Ｉｌｅ３５８，Ａｌａ３６１、及びＬｙｓ３６２）、ヘ
リックス４（Ｐｈｅ３６７）、ヘリックス５（Ｇｌｎ３７５，Ｖａｌ３７６，Ｌ
ｅｕ３７９，Ｇｌｎ３８０）、ヘリックス６（Ｔｒｐ３８３）、及びヘリックス
１２（Ａｓｐ５３８，Ｌｅｕ５３９，Ｇｌｎ５４２，Ｍｅｔ５４３及びＬｅｕ５
４４）の残基である。上述した様に、一般に前記核受容体ファミリーにとって、
この部位はＬＢＤの表面上の残基に相当し、これはヒトＥＲαのＣ末端のヘリッ
クス３（Ｌｅｕ３５４，Ｍｅｔ３５７，Ｉｌｅ３５８及びＡｌａ３６１）、ヘリ
ックス４（Ｐｈｅ３６７）、ヘリックス５（Ｖａｌ３７６，Ｌｅｕ３７９）、ヘ
リックス６（Ｔｒｐ３８３）、及びヘリックス１２（Ｌｅｕ５３９，Ｍｅｔ５４
３及びＬｅｕ５４４）の残基に相当する疎水性残基によって形成される顕著な疎
水性の割れ目を形成する。これは、核受容体ファミリーのためにApriletti, et
al., supraによって示されたデータを確証するものである。
部位を形成する残基が、ヒトＴＲのための上述したそれらの位置に相当すること
が見出された。従って、ＥＲα上でコアクチベーター結合部位を形成する残基は
、図８に示した様にヒトＥＲαのＣ末端のヘリックス３（Ｌｅｕ３５４，Ｖａｌ
３５５，Ｍｅｔ３５７，Ｉｌｅ３５８，Ａｌａ３６１、及びＬｙｓ３６２）、ヘ
リックス４（Ｐｈｅ３６７）、ヘリックス５（Ｇｌｎ３７５，Ｖａｌ３７６，Ｌ
ｅｕ３７９，Ｇｌｎ３８０）、ヘリックス６（Ｔｒｐ３８３）、及びヘリックス
１２（Ａｓｐ５３８，Ｌｅｕ５３９，Ｇｌｎ５４２，Ｍｅｔ５４３及びＬｅｕ５
４４）の残基である。上述した様に、一般に前記核受容体ファミリーにとって、
この部位はＬＢＤの表面上の残基に相当し、これはヒトＥＲαのＣ末端のヘリッ
クス３（Ｌｅｕ３５４，Ｍｅｔ３５７，Ｉｌｅ３５８及びＡｌａ３６１）、ヘリ
ックス４（Ｐｈｅ３６７）、ヘリックス５（Ｖａｌ３７６，Ｌｅｕ３７９）、ヘ
リックス６（Ｔｒｐ３８３）、及びヘリックス１２（Ｌｅｕ５３９，Ｍｅｔ５４
３及びＬｅｕ５４４）の残基に相当する疎水性残基によって形成される顕著な疎
水性の割れ目を形成する。これは、核受容体ファミリーのためにApriletti, et
al., supraによって示されたデータを確証するものである。
【００３２】 構造的な解析は、タモキシフェン及び他のＳＥＲＭがリガンド結合ドメインに
結合し、そしてコアクチベーター結合及びつまり転写活性を妨害することによっ
て前記の機構を明らかにした。このことによって、リガンド及びコアクチベータ
ー結合の理解もまた達成されてきた。従って、上述のコアクチベーター結合部位
の残基は、本発明の方法において幅広い適用を有するコアクチベーターの擬似体
の設計において有用である。その様な“コアクチベーター擬似体”は、コアクチ
ベーター結合部位に結合するコアクチベーターの競合阻害剤として働く様な、コ
アクチベーターの表面上のコアクチベーター結合部位の認識領域を擬態するペプ
チド又はポリペプチドである。コアクチベーター擬似体は、受容体活性及びすな
わち試験化合物の作用薬又は拮抗薬的性質を決定するためのアッセイにおいて使
用されることがあり、ここで作用薬は、コアクチベーター結合部位にコアクチベ
ーター擬似体を結合させ、一方拮抗薬はその様な結合を妨害するだろう。更に、
その様なコアクチベーター擬似体が治療的な効能を有しうるのは、本発明の作用
薬化合物と組合わせて投与される場合である。
結合し、そしてコアクチベーター結合及びつまり転写活性を妨害することによっ
て前記の機構を明らかにした。このことによって、リガンド及びコアクチベータ
ー結合の理解もまた達成されてきた。従って、上述のコアクチベーター結合部位
の残基は、本発明の方法において幅広い適用を有するコアクチベーターの擬似体
の設計において有用である。その様な“コアクチベーター擬似体”は、コアクチ
ベーター結合部位に結合するコアクチベーターの競合阻害剤として働く様な、コ
アクチベーターの表面上のコアクチベーター結合部位の認識領域を擬態するペプ
チド又はポリペプチドである。コアクチベーター擬似体は、受容体活性及びすな
わち試験化合物の作用薬又は拮抗薬的性質を決定するためのアッセイにおいて使
用されることがあり、ここで作用薬は、コアクチベーター結合部位にコアクチベ
ーター擬似体を結合させ、一方拮抗薬はその様な結合を妨害するだろう。更に、
その様なコアクチベーター擬似体が治療的な効能を有しうるのは、本発明の作用
薬化合物と組合わせて投与される場合である。
【００３３】 本発明の別の態様は、典型的にリガンド結合ドメインに結合することによって
、核受容体に結合するリガンドを調節する化合物を同定する方法に適している。
この方法はエストロゲン受容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部の原子構
造モデルを用いて、注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的にはまる試
験化合物をモデリングし、前記の結合ドメインへの試験化合物の結合によって特
徴づけられるアッセイにおいて前記試験化合物をスクリーニングし、そして前記
核受容体に結合するリガンドを調節する試験化合物を同定する段階を含んで成り
、ここで前記の原子構造モデルは、ヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，
Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌ
ｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌ
ｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３
４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基に相
当するアミノ酸残基の原子配位を含んで成る。好ましい方法において、核受容体
はＥＲ，ＴＲ，ＧＲ又はＰＲである。前記スクリーニングは高処理量スクリーニ
ングによる様に、典型的にｉｎ ｖｉｔｒｏである。適当な試験化合物を設計又
は化合物のライブラリーから得ることができ、そして例示によって限定されない
が、小さい有機分子、ペプチド及びペプチド擬似体を含むことができる。前記試
験化合物はリガンド結合の作用薬又は拮抗薬のいずれかであることができる。
、核受容体に結合するリガンドを調節する化合物を同定する方法に適している。
この方法はエストロゲン受容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部の原子構
造モデルを用いて、注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的にはまる試
験化合物をモデリングし、前記の結合ドメインへの試験化合物の結合によって特
徴づけられるアッセイにおいて前記試験化合物をスクリーニングし、そして前記
核受容体に結合するリガンドを調節する試験化合物を同定する段階を含んで成り
、ここで前記の原子構造モデルは、ヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，
Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌ
ｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌ
ｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３
４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基に相
当するアミノ酸残基の原子配位を含んで成る。好ましい方法において、核受容体
はＥＲ，ＴＲ，ＧＲ又はＰＲである。前記スクリーニングは高処理量スクリーニ
ングによる様に、典型的にｉｎ ｖｉｔｒｏである。適当な試験化合物を設計又
は化合物のライブラリーから得ることができ、そして例示によって限定されない
が、小さい有機分子、ペプチド及びペプチド擬似体を含むことができる。前記試
験化合物はリガンド結合の作用薬又は拮抗薬のいずれかであることができる。
【００３４】 本発明はまた、核受容体のリガンド結合ドメイン内の鍵となる残基を同定する
ための組成物及び方法を含む。前記方法はリガンド及び／又はコアクチベーター
結合を調節する残基を同定するための、注目の核受容体の表面の試験を含む。本
明細書に記載のヒトＥＲαのＬＢＤ上の鍵となる残基に対する相同性によって、
前記の残基を同定することができる。好ましい方法は、ヒトＥＲαのＭｅｔ３４
３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７
，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，
Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅ
ｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基
に相当する（すなわち等価）、いずれかの核受容体の残基とのアラインメントで
ある。核受容体のＬＢＤ、あるいはこれら又は相当する残基を含むその一部の三
次元モデルとのオーバーレイ及びスーパーポジショニングもまた、この目的のた
めに使用することができる。例えば、ＴＲ，ＧＲ及びＰＲのＬＢＤの三次元構造
を、この目的のために使用することができる。例えば、相同性のアラインメント
によって同定可能な核受容体は、ヒトにおいて見出された核受容体に構造的に関
連している標準の核受容体又はタンパク質、ヒトにおいて見出された核受容体の
天然の変異体、動物、及び非哺乳類生物、例えば有害生物又は感染生物、若しく
はウィルスにおいて見出された標準又は変異の受容体を含む。
ための組成物及び方法を含む。前記方法はリガンド及び／又はコアクチベーター
結合を調節する残基を同定するための、注目の核受容体の表面の試験を含む。本
明細書に記載のヒトＥＲαのＬＢＤ上の鍵となる残基に対する相同性によって、
前記の残基を同定することができる。好ましい方法は、ヒトＥＲαのＭｅｔ３４
３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７
，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，
Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅ
ｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基
に相当する（すなわち等価）、いずれかの核受容体の残基とのアラインメントで
ある。核受容体のＬＢＤ、あるいはこれら又は相当する残基を含むその一部の三
次元モデルとのオーバーレイ及びスーパーポジショニングもまた、この目的のた
めに使用することができる。例えば、ＴＲ，ＧＲ及びＰＲのＬＢＤの三次元構造
を、この目的のために使用することができる。例えば、相同性のアラインメント
によって同定可能な核受容体は、ヒトにおいて見出された核受容体に構造的に関
連している標準の核受容体又はタンパク質、ヒトにおいて見出された核受容体の
天然の変異体、動物、及び非哺乳類生物、例えば有害生物又は感染生物、若しく
はウィルスにおいて見出された標準又は変異の受容体を含む。
【００３５】 アラインメント及び／又はモデリングもまた、ＬＢＤの表面上での変異の配置
のための手引きとして使用し、関係する細胞の部位の性質を特徴づけることがで
きる。作用薬の場合において全体の受容体構造及び溶解性を保存するために、又
は拮抗薬の場合、その様な構造を分離し、そしてヘリックス１２を巻き戻すため
に、選択した残基を変異する。リガンドの結合及び結合の相互作用の強度におけ
る相対的な変化のために、変異体を試験することができる。リガンド依存のコア
クチベーターの相互作用アッセイもまた、この目的、例えば本明細書に記載した
もののために試験することができる。
のための手引きとして使用し、関係する細胞の部位の性質を特徴づけることがで
きる。作用薬の場合において全体の受容体構造及び溶解性を保存するために、又
は拮抗薬の場合、その様な構造を分離し、そしてヘリックス１２を巻き戻すため
に、選択した残基を変異する。リガンドの結合及び結合の相互作用の強度におけ
る相対的な変化のために、変異体を試験することができる。リガンド依存のコア
クチベーターの相互作用アッセイもまた、この目的、例えば本明細書に記載した
もののために試験することができる。
【００３６】 特に、本発明は２つの化学的に関係する化合物、作用薬であるジエチルスチル
ベストロール（ＤＥＳ）、及びタモキシフェンの活性代謝産物である、選択的な
拮抗薬４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）の結合しているエストロゲン受
容体のＬＢＤに対する構造的及び機能的作用に関する。本実施例に記載の共結晶
に由来する原子モデルの解析と組合わせた変異及び結合の研究は、ヒトエストロ
ゲン受容体αのリガンド結合ドメイン（ＥＲαＬＢＤ）の構造を明らかにし、こ
こでそれはコアクチベーター結合部位に結合したＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIの
ペプチド配列（配列番号４）を含んで成るペプチド分子（すなわちｐ１６０のコ
アクチベーターＧＲＩＰ１のＮＲボックスII領域に由来するペプチド）及び前記
作用薬ＤＥＳと共結晶化している。前記拮抗薬ＯＨＴと共結晶化したＥＲαのＬ
ＢＤの構造もまた明らかにされた。本実施例は、ＤＥＳ及び前記コアクチベータ
ーに結合したｈＥＲαのＬＢＤの２．０３Åの分解能の結晶構造並びにＯＨＴに
結合したｈＥＲαのＬＢＤの１．９ÅのＸ線結晶構造を提供し、すなわち前記結
晶はそれぞれ少なくとも２．０３Å又は１．９Åで偏光する。
ベストロール（ＤＥＳ）、及びタモキシフェンの活性代謝産物である、選択的な
拮抗薬４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）の結合しているエストロゲン受
容体のＬＢＤに対する構造的及び機能的作用に関する。本実施例に記載の共結晶
に由来する原子モデルの解析と組合わせた変異及び結合の研究は、ヒトエストロ
ゲン受容体αのリガンド結合ドメイン（ＥＲαＬＢＤ）の構造を明らかにし、こ
こでそれはコアクチベーター結合部位に結合したＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIの
ペプチド配列（配列番号４）を含んで成るペプチド分子（すなわちｐ１６０のコ
アクチベーターＧＲＩＰ１のＮＲボックスII領域に由来するペプチド）及び前記
作用薬ＤＥＳと共結晶化している。前記拮抗薬ＯＨＴと共結晶化したＥＲαのＬ
ＢＤの構造もまた明らかにされた。本実施例は、ＤＥＳ及び前記コアクチベータ
ーに結合したｈＥＲαのＬＢＤの２．０３Åの分解能の結晶構造並びにＯＨＴに
結合したｈＥＲαのＬＢＤの１．９ÅのＸ線結晶構造を提供し、すなわち前記結
晶はそれぞれ少なくとも２．０３Å又は１．９Åで偏光する。
【００３７】 本発明の更なる別の観点において、注目の化合物が発見され、すなわちリガン
ド結合の作用薬又は拮抗薬が、核受容体に結合するリガンドの作用薬又は拮抗薬
の同定方法によって同定される。前記方法はＥＲαのＬＢＤ又はその一部の原子
配位をコンピューターを使用するモデル系に提供し、ＬＢＤに空間的にはまる化
合物をモデリングし、そして核受容体の活性のためのアッセイにおいて、前記核
受容体のＬＢＤの結合によって前記核受容体の活性を増大又は減少させる化合物
を同定する段階を含んで成る。好ましくは前記原子配位はヒトエストロゲン受容
体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８
４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１
，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８
、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭ
ｅｔ５２８の残基に相当するアミノ酸残基のものである。
ド結合の作用薬又は拮抗薬が、核受容体に結合するリガンドの作用薬又は拮抗薬
の同定方法によって同定される。前記方法はＥＲαのＬＢＤ又はその一部の原子
配位をコンピューターを使用するモデル系に提供し、ＬＢＤに空間的にはまる化
合物をモデリングし、そして核受容体の活性のためのアッセイにおいて、前記核
受容体のＬＢＤの結合によって前記核受容体の活性を増大又は減少させる化合物
を同定する段階を含んで成る。好ましくは前記原子配位はヒトエストロゲン受容
体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８
４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１
，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８
、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭ
ｅｔ５２８の残基に相当するアミノ酸残基のものである。
【００３８】 特に注目の化合物はリガンド結合ドメインに空間的に及び選択的にはまる。“
空間的に及び選択的にはまる”ことは、化合物が核受容体のＬＢＤと選択的に相
互作用する三次元構造及び立体配座を有することが意図される。ＬＢＤに空間的
に及び選択的にはまる化合物は、この部位の疎水性の割れ目を形成するアミノ酸
残基と相互作用する。本発明はまた、核受容体活性を選択的に調節することがで
きる化合物の同定方法を含む。前記方法は、核受容体の原子構造モデルを用いて
、注目の核受容体のＬＢＤに空間的及び選択的にはまる試験化合物をモデリング
し、核受容体のＬＢＤへの試験化合物の選択的な結合によって特徴づけられた核
受容体活性のためのアッセイにおいて前記試験化合物をスクリーニングし、そし
て核受容体の活性を選択的に調節する試験化合物を同定する段階を含んで成る。
その様な受容体特異的化合物は、核受容体のある型と核受容体の第２の型とのＬ
ＢＤ間の差異を利用して選択される。
空間的に及び選択的にはまる”ことは、化合物が核受容体のＬＢＤと選択的に相
互作用する三次元構造及び立体配座を有することが意図される。ＬＢＤに空間的
に及び選択的にはまる化合物は、この部位の疎水性の割れ目を形成するアミノ酸
残基と相互作用する。本発明はまた、核受容体活性を選択的に調節することがで
きる化合物の同定方法を含む。前記方法は、核受容体の原子構造モデルを用いて
、注目の核受容体のＬＢＤに空間的及び選択的にはまる試験化合物をモデリング
し、核受容体のＬＢＤへの試験化合物の選択的な結合によって特徴づけられた核
受容体活性のためのアッセイにおいて前記試験化合物をスクリーニングし、そし
て核受容体の活性を選択的に調節する試験化合物を同定する段階を含んで成る。
その様な受容体特異的化合物は、核受容体のある型と核受容体の第２の型とのＬ
ＢＤ間の差異を利用して選択される。
【００３９】 本発明はまた、核受容体のイソ型を識別する新規化合物の製造に適用できる。
これは組織特異的又は機能特異的、いずれかの化合物の製造を容易にすることが
できる。例えば、ＧＲサブファミリーのメンバーは、例外はあるが、通常単一の
遺伝子によってコードされる、ある受容体を有する。例えば、２つのＰＲのイソ
型、Ａ及びＢがあり、これは異なるＡＵＧコドンからの異なる開始によって、同
一のｍＲＮＡから翻訳される。２つのＧＲの形態があり、このうちの１つはリガ
ンドと結合しない。この方法は、少なくとも２つ（ＥＲ：α、β）の遺伝子によ
ってコードされ、又は選択的ＲＮＡスプライシングを有する、複数の受容体を通
常有するＥＲサブファミリーに特に適用可能である。
これは組織特異的又は機能特異的、いずれかの化合物の製造を容易にすることが
できる。例えば、ＧＲサブファミリーのメンバーは、例外はあるが、通常単一の
遺伝子によってコードされる、ある受容体を有する。例えば、２つのＰＲのイソ
型、Ａ及びＢがあり、これは異なるＡＵＧコドンからの異なる開始によって、同
一のｍＲＮＡから翻訳される。２つのＧＲの形態があり、このうちの１つはリガ
ンドと結合しない。この方法は、少なくとも２つ（ＥＲ：α、β）の遺伝子によ
ってコードされ、又は選択的ＲＮＡスプライシングを有する、複数の受容体を通
常有するＥＲサブファミリーに特に適用可能である。
【００４０】 本発明の受容体特異的化合物は、核受容体の第２の型と比較して、核受容体の
ある型の間で保存されているＬＢＤの、立体配座的に不自然な残基と好ましくは
相互作用する。“立体配座的に不自然”は、様々な局所的な幾何学的及び物理化
学的制約によって固定されるその結合についての、ある回転を有する化学的三次
元構造又はその一部を意味することが意図される。ＬＢＤの立体配座的に不自然
な構造の構成は、様々な幾何学的及び物理化学的制約、例えば局所的主鎖、局所
的側鎖、及びトポロジカルな制約によって固定される、それらの天然の自由な立
体配座を有する残基を含む。これらの制約の型は、受容体−コアクチベーターの
認識及び結合に関与する原子の配置を制限するために利用される。
ある型の間で保存されているＬＢＤの、立体配座的に不自然な残基と好ましくは
相互作用する。“立体配座的に不自然”は、様々な局所的な幾何学的及び物理化
学的制約によって固定されるその結合についての、ある回転を有する化学的三次
元構造又はその一部を意味することが意図される。ＬＢＤの立体配座的に不自然
な構造の構成は、様々な幾何学的及び物理化学的制約、例えば局所的主鎖、局所
的側鎖、及びトポロジカルな制約によって固定される、それらの天然の自由な立
体配座を有する残基を含む。これらの制約の型は、受容体−コアクチベーターの
認識及び結合に関与する原子の配置を制限するために利用される。
【００４１】 本発明はまた、核受容体の結晶に基づく核受容体の三次元モデルを用いる、コ
ンピューターによる方法を提供する。一般に、核受容体のリガンドを設計するた
めのコンピューターを用いる方法は、前記リガンドの化学的部分（少なくとも１
つ）と相互作用するアミノ酸又は核受容体ＬＢＤのアミノ酸を決定し、ここでは
結合したリガンドと一緒の核受容体のＬＢＤを含んで成る結晶化したタンパク質
の三次元モデルを用いて、そして前記の化学的な部分の化学的修飾（少なくとも
１つ）を選択し、その結果、相互作用するアミノ酸と化学的部分との間の相互作
用と比較して、相互作用するアミノ酸と第２の化学的部分との間の相互作用を減
少させるか又は増大させる、いずれかの構造を有する第２の化学的部分が提供さ
れる。本発明において、ＤＥＳ／ペプチド及びＯＨＴと一緒のｈＥＲαの結晶構
造は、ｈＥＲαのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，
Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍ
ｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭ
ｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５
２５及び／又はＭｅｔ５２８に相当するアミノ酸残基が、前記リガンド上の少な
くとも１つの化学的部分と相互作用することを示した。
ンピューターによる方法を提供する。一般に、核受容体のリガンドを設計するた
めのコンピューターを用いる方法は、前記リガンドの化学的部分（少なくとも１
つ）と相互作用するアミノ酸又は核受容体ＬＢＤのアミノ酸を決定し、ここでは
結合したリガンドと一緒の核受容体のＬＢＤを含んで成る結晶化したタンパク質
の三次元モデルを用いて、そして前記の化学的な部分の化学的修飾（少なくとも
１つ）を選択し、その結果、相互作用するアミノ酸と化学的部分との間の相互作
用と比較して、相互作用するアミノ酸と第２の化学的部分との間の相互作用を減
少させるか又は増大させる、いずれかの構造を有する第２の化学的部分が提供さ
れる。本発明において、ＤＥＳ／ペプチド及びＯＨＴと一緒のｈＥＲαの結晶構
造は、ｈＥＲαのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，
Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍ
ｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭ
ｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５
２５及び／又はＭｅｔ５２８に相当するアミノ酸残基が、前記リガンド上の少な
くとも１つの化学的部分と相互作用することを示した。
【００４２】 従って、本発明の１つの態様は、核受容体のリガンドの設計のコンピューター
を用いる方法であり、ここでヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ
３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３
９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２
１，ＨｉＳ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，
Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、核受
容体のＬＢＤの少なくとも１つのアミノ酸残基が、前記リガンドの少なくとも１
つの化学的部分と相互作用し、これは相互作用するアミノ酸と第１の化学的部分
との間の相互作用と比較して、相互作用するアミノ酸と第２の化学的部分との間
の相互作用を減少させるか又は増大させる、いずれかの構造を用いて、第２の化
学的部分を生成するために第１の化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選
択する段階を含んで成る。
を用いる方法であり、ここでヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ
３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３
９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２
１，ＨｉＳ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，
Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、核受
容体のＬＢＤの少なくとも１つのアミノ酸残基が、前記リガンドの少なくとも１
つの化学的部分と相互作用し、これは相互作用するアミノ酸と第１の化学的部分
との間の相互作用と比較して、相互作用するアミノ酸と第２の化学的部分との間
の相互作用を減少させるか又は増大させる、いずれかの構造を用いて、第２の化
学的部分を生成するために第１の化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選
択する段階を含んで成る。
【００４３】 更にこのコンピューターによる方法は、第１の化学的部分の化学的修飾の後に
、相互作用するアミノ酸と前記リガンドとの間の相互作用における変化の決定を
含んで成ることができる。前記の化学的修飾は、第１の化学的部分と、相互作用
するアミノ酸との間の相互作用と比較して、第２の化学的部分と、相互作用する
アミノ酸との間の、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファン
デルワールス相互作用又は双極子相互作用を、増強させるか又は減少させるか、
そのいずれかを行うことができる。
、相互作用するアミノ酸と前記リガンドとの間の相互作用における変化の決定を
含んで成ることができる。前記の化学的修飾は、第１の化学的部分と、相互作用
するアミノ酸との間の相互作用と比較して、第２の化学的部分と、相互作用する
アミノ酸との間の、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファン
デルワールス相互作用又は双極子相互作用を、増強させるか又は減少させるか、
そのいずれかを行うことができる。
【００４４】 化学的修飾は、ＬＢＤアミノ酸の原子と、ＬＢＤリガンドの原子との相互作用
をしばしば増強又は減少するだろう。立体障害は活性ドメインを有する、ＬＢＤ
が結合する割れ目の相互作用を変化させる一般的な手段であるだろう。化学的修
飾は、好ましくはリガンドのＣ−Ｈ，Ｃ−及びＣ−ＯＨ位で導入され、ここで前
記炭素は修飾が完了した後に、同一のままのリガンド構造の一部である。Ｃ−Ｈ
の場合において、Ｃは１，２又は３つの水素を有することができるが、通常１つ
の水素のみが置換されるだろう。前記のＨ又はＯＨは、修飾完了後に除去され、
そして所望の化学的部分で置換される。
をしばしば増強又は減少するだろう。立体障害は活性ドメインを有する、ＬＢＤ
が結合する割れ目の相互作用を変化させる一般的な手段であるだろう。化学的修
飾は、好ましくはリガンドのＣ−Ｈ，Ｃ−及びＣ−ＯＨ位で導入され、ここで前
記炭素は修飾が完了した後に、同一のままのリガンド構造の一部である。Ｃ−Ｈ
の場合において、Ｃは１，２又は３つの水素を有することができるが、通常１つ
の水素のみが置換されるだろう。前記のＨ又はＯＨは、修飾完了後に除去され、
そして所望の化学的部分で置換される。
【００４５】 この様な化学的修飾は、好ましくはＤＥＳのＡ’環の遊離炭素のいずれかへの
置換基の付加を含み、ＤＥＳに位置するこれらの置換基はｈＥＲαのＭｅｔ３４
３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７
，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，
Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅ
ｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５又はＭｅｔ５２８及び相
当する１又は複数の残基と選択的に接触又は結合する。典型的な置換基は疎水性
基であり、これは例によって限定されないが、アルキル基、例えばエチル、プロ
ピル、イソプロピルなど、並びに芳香環基、例えばベンジルなどを含む。
置換基の付加を含み、ＤＥＳに位置するこれらの置換基はｈＥＲαのＭｅｔ３４
３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７
，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，
Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅ
ｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５又はＭｅｔ５２８及び相
当する１又は複数の残基と選択的に接触又は結合する。典型的な置換基は疎水性
基であり、これは例によって限定されないが、アルキル基、例えばエチル、プロ
ピル、イソプロピルなど、並びに芳香環基、例えばベンジルなどを含む。
【００４６】 慣行において、作用薬／拮抗薬の設計に基づき、化学的なバックボーンとして
注目の核受容体のために、知られているリガンドを用いて開始することができる
。前記の知られているリガンドは上述した様に修飾されるだろう。例えば１７−
βエストラジオールはｈＥＲαの内因性のリガンドである。エストラジオールの
場合、注目の位置はＣ６α，Ｃ７α，Ｃ１２α，Ｃ１５α，Ｃ１６α及びＣ１７
αである。１７β−エストラジオールのバックボーン上の、１又は複数のこれら
の遊離炭素の修飾は、１又は複数のＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０
，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，
Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌ
ｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ
５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基とのリガンドの相互作用に影響し
、その結果作用薬の設計に基づくであろう相互作用の増強、又は拮抗薬の設計に
基づくであろう相互作用の減少のいずれかを提供する。
注目の核受容体のために、知られているリガンドを用いて開始することができる
。前記の知られているリガンドは上述した様に修飾されるだろう。例えば１７−
βエストラジオールはｈＥＲαの内因性のリガンドである。エストラジオールの
場合、注目の位置はＣ６α，Ｃ７α，Ｃ１２α，Ｃ１５α，Ｃ１６α及びＣ１７
αである。１７β−エストラジオールのバックボーン上の、１又は複数のこれら
の遊離炭素の修飾は、１又は複数のＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０
，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，
Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌ
ｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ
５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基とのリガンドの相互作用に影響し
、その結果作用薬の設計に基づくであろう相互作用の増強、又は拮抗薬の設計に
基づくであろう相互作用の減少のいずれかを提供する。
【００４７】 他の知られているリガンドの他の化学的バックボーンを、同様の方法で使用す
ることができる。例えば、他の知られている作用薬はジエチルスチルベストロー
ル（合成）、モキセストロール（合成）、メソヘキセストロール（合成）、クメ
ストロール（クローバー）、Δ9−ＴＨＣ（大麻）、ｏ，ｐ−ＤＤＴ（殺虫剤）
、ゼアラレノン（菌類）及びケポン（殺虫剤）を含む。知られているエストロゲ
ン受容体の拮抗薬は、修飾したステロイドのＩＣＩシリーズ、例えばＩＣＩ１６
４，３８４及びＥＭ８００を含む。知られているＳＥＲＭはタモキシフェン、ラ
ロキシフェン及びＧＷ５６３８を含む。
ることができる。例えば、他の知られている作用薬はジエチルスチルベストロー
ル（合成）、モキセストロール（合成）、メソヘキセストロール（合成）、クメ
ストロール（クローバー）、Δ9−ＴＨＣ（大麻）、ｏ，ｐ−ＤＤＴ（殺虫剤）
、ゼアラレノン（菌類）及びケポン（殺虫剤）を含む。知られているエストロゲ
ン受容体の拮抗薬は、修飾したステロイドのＩＣＩシリーズ、例えばＩＣＩ１６
４，３８４及びＥＭ８００を含む。知られているＳＥＲＭはタモキシフェン、ラ
ロキシフェン及びＧＷ５６３８を含む。
【００４８】 あるいは、知られている作用薬を、コンピューター又は人力によるドッキング
を通して、リガンド結合ポケットに配置することができる。次に、置換のための
位置は、これらの化合物の予想される結合の配向に基づき選択されるだろう。更
に、混成分子も生成することができ、これは作用薬が結合した位置をヘリックス
１２に採用させない側鎖も有する。新規ＳＥＲＭを、２つの異なる作用；ヘリッ
クス１２の置換及び２次構造の解体の強度を変化させることによって生成するこ
とができる。
を通して、リガンド結合ポケットに配置することができる。次に、置換のための
位置は、これらの化合物の予想される結合の配向に基づき選択されるだろう。更
に、混成分子も生成することができ、これは作用薬が結合した位置をヘリックス
１２に採用させない側鎖も有する。新規ＳＥＲＭを、２つの異なる作用；ヘリッ
クス１２の置換及び２次構造の解体の強度を変化させることによって生成するこ
とができる。
【００４９】 拮抗薬を作製するための以前の努力は、典型的に試行錯誤を通しての作用薬へ
の大きなかさの置換基の付加と関係しており、そして本明細書に記載の薬剤設計
方法は、新規の潜在的な拮抗薬の開発に重要と思われるリガンドの設計の代わり
の戦略を提供する。 モデリングのために、ドッキングのアルゴリズム及びそれらを適用するコンピ
ュータープログラムを、リガンド結合ドメインにはまる化合物を同定するために
使用することができる。例えば、注目の分子が核受容体のＬＢＤと相互作用でき
るかどうかを予測するために、ドッキングプログラムを使用することができる。
フラグメントを基にしたドッキングもまた、分子間相互作用を最適化するために
、前記部位に相補的な化学的フラグメントを配置することによってＬＢＤの内側
に新しい分子を構築することにおいて使用することができる。前記の技術を結合
の相互作用の結合構造を最適化するために使用することができる。この設計の試
みは、ＬＢＤの構造の同定によって可能となり、その結果、現在では分子認識の
原理をこの部位の構造に相補的である化合物を設計するために使用することがで
きる。ＬＢＤにはまる化合物を、繰り返しの設計、合成及び試験周期のための起
点として与え、その結果新規化合物が選択され、そして親和性、効率、及び選択
性を含む所望の特性のために最適化される。例えば、前記化合物を更なる修飾に
かけることができ、例えば結合している分子の特定の種類のために同定したコア
構造のＲ基の置換基の置換及び／又は付加、所望ならばモデリング及び／又は活
性のスクリーニングであり、そして次に、追加の一連の試験にかけることができ
る。コンピューターの小さい分子のデータベースは、注目の核受容体のリガンド
結合ドメインに全体又は部分的に結合することができる化学的存在物又は化合物
をスクリーニングすることができる。このスクリーニングにおいて、その様な存
在物又は化合物が結合部位にはまる質を、形の相補性（DesJalais, et al., J.
Med. Chem. 31 : 722-729 (1988))、又は相互作用エネルギーの評価（Meng, et
al., J. Comp. Chem. 13 : 505-524 (1992))のいずれかによって判断することが
できる。前記の分子のデータベースはあらゆる仮想的又は有形のデータベース、
例えば電子的及び物理的な化合物ライブラリーのデータベースを含み、そして好
ましくはコアクチベーターの結合を調節する化合物の開発において使用される。
の大きなかさの置換基の付加と関係しており、そして本明細書に記載の薬剤設計
方法は、新規の潜在的な拮抗薬の開発に重要と思われるリガンドの設計の代わり
の戦略を提供する。 モデリングのために、ドッキングのアルゴリズム及びそれらを適用するコンピ
ュータープログラムを、リガンド結合ドメインにはまる化合物を同定するために
使用することができる。例えば、注目の分子が核受容体のＬＢＤと相互作用でき
るかどうかを予測するために、ドッキングプログラムを使用することができる。
フラグメントを基にしたドッキングもまた、分子間相互作用を最適化するために
、前記部位に相補的な化学的フラグメントを配置することによってＬＢＤの内側
に新しい分子を構築することにおいて使用することができる。前記の技術を結合
の相互作用の結合構造を最適化するために使用することができる。この設計の試
みは、ＬＢＤの構造の同定によって可能となり、その結果、現在では分子認識の
原理をこの部位の構造に相補的である化合物を設計するために使用することがで
きる。ＬＢＤにはまる化合物を、繰り返しの設計、合成及び試験周期のための起
点として与え、その結果新規化合物が選択され、そして親和性、効率、及び選択
性を含む所望の特性のために最適化される。例えば、前記化合物を更なる修飾に
かけることができ、例えば結合している分子の特定の種類のために同定したコア
構造のＲ基の置換基の置換及び／又は付加、所望ならばモデリング及び／又は活
性のスクリーニングであり、そして次に、追加の一連の試験にかけることができ
る。コンピューターの小さい分子のデータベースは、注目の核受容体のリガンド
結合ドメインに全体又は部分的に結合することができる化学的存在物又は化合物
をスクリーニングすることができる。このスクリーニングにおいて、その様な存
在物又は化合物が結合部位にはまる質を、形の相補性（DesJalais, et al., J.
Med. Chem. 31 : 722-729 (1988))、又は相互作用エネルギーの評価（Meng, et
al., J. Comp. Chem. 13 : 505-524 (1992))のいずれかによって判断することが
できる。前記の分子のデータベースはあらゆる仮想的又は有形のデータベース、
例えば電子的及び物理的な化合物ライブラリーのデータベースを含み、そして好
ましくはコアクチベーターの結合を調節する化合物の開発において使用される。
【００５０】 化合物を利用可能な構造及び機能の情報を活用することによって理性的に設計
することができ、これは定量的な構造−活性の関連性（ＱＳＡＲ）の理解を得て
、その理解を用いて新規の化合物ライブラリー、特にコア構造の１又は複数の特
定のグループの化学的多様性を有する集中したライブラリーを設計し、そしてあ
らゆる構造的なデータを繰り返しの設計過程に組込むことによって行われる。例
えば、当業者はいくつかの方法の１つを用いて、注目の核受容体のリガンド結合
ドメインと会合するそれらの能力のために、化学的存在物又はフラグメントをス
クリーニングすることができる。この過程は、例えばコンピューターの画面上で
のＬＢＤの映像による検分によって開始することができる。次に、選択したフラ
グメント又は化学的存在物を前記部位の全て又は一部に配置することができる。
ソフトウェア、例えばＱｕａｎｔａ及びＳｙｂｙｌを用いて、続けて標準的な分
子力学の力の場によるエネルギーの最小化及び分子動力学、例えばＣＨＡＲＭＭ
及びＡＭＢＥＲによってドッキングを達成することができる。
することができ、これは定量的な構造−活性の関連性（ＱＳＡＲ）の理解を得て
、その理解を用いて新規の化合物ライブラリー、特にコア構造の１又は複数の特
定のグループの化学的多様性を有する集中したライブラリーを設計し、そしてあ
らゆる構造的なデータを繰り返しの設計過程に組込むことによって行われる。例
えば、当業者はいくつかの方法の１つを用いて、注目の核受容体のリガンド結合
ドメインと会合するそれらの能力のために、化学的存在物又はフラグメントをス
クリーニングすることができる。この過程は、例えばコンピューターの画面上で
のＬＢＤの映像による検分によって開始することができる。次に、選択したフラ
グメント又は化学的存在物を前記部位の全て又は一部に配置することができる。
ソフトウェア、例えばＱｕａｎｔａ及びＳｙｂｙｌを用いて、続けて標準的な分
子力学の力の場によるエネルギーの最小化及び分子動力学、例えばＣＨＡＲＭＭ
及びＡＭＢＥＲによってドッキングを達成することができる。
【００５１】 特殊化したコンピュータープログラムもまた、化学的な存在物のフラグメント
又は化合物全体を選択する過程において役立つことができる。これらはGRID (Go
odford. J. Med. Chem. 28 : 849-857 (1985). Oxford University, Oxford, UK
から入手可能）；MCSS (Miranker. et al., “Proteins : Structure. Funcitio
n and Genetics”11 : 29-34 (1991), Molecular Simulations, Burlington. MA
から入手可能）；AUTODOCK (Goodsell, et al., “Proteins : Structure. Func
tion and Genetics”8 : 195-202 (1990), Scripps Research Institute. La Jo
lla, CAから入手可能）；及びDOCK (Kuntz, et al., J. Mol. Biol. 161 : 269-
288 (1982), University of California. San Francisco, CAから入手可能）を
含む。
又は化合物全体を選択する過程において役立つことができる。これらはGRID (Go
odford. J. Med. Chem. 28 : 849-857 (1985). Oxford University, Oxford, UK
から入手可能）；MCSS (Miranker. et al., “Proteins : Structure. Funcitio
n and Genetics”11 : 29-34 (1991), Molecular Simulations, Burlington. MA
から入手可能）；AUTODOCK (Goodsell, et al., “Proteins : Structure. Func
tion and Genetics”8 : 195-202 (1990), Scripps Research Institute. La Jo
lla, CAから入手可能）；及びDOCK (Kuntz, et al., J. Mol. Biol. 161 : 269-
288 (1982), University of California. San Francisco, CAから入手可能）を
含む。
【００５２】 小さい分子化合物のための、更に商業的に利用可能なコンピューターのデータ
ベースは、Cambridge Structural Database及びFine Chemical Database (Rusin
ko, Chem. Des. Auto. News 8 : 44-47 (1993))を含む。 一度適当な化学的存在物又はフラグメントが選択されると、それらは単一の化
合物に会合することができる。核受容体の構造配位に関してコンピューターのス
クリーン上に表示された三次元イメージ上の、互いに対する前記フラグメントの
関係の映像による検分によって、会合を進めることができる。Ｑｕａｎｔａ又は
Ｓｙｂｙｌの様なソフトウェアを用いる、マニュアルモデル構築がこれに続くこ
とができる。
ベースは、Cambridge Structural Database及びFine Chemical Database (Rusin
ko, Chem. Des. Auto. News 8 : 44-47 (1993))を含む。 一度適当な化学的存在物又はフラグメントが選択されると、それらは単一の化
合物に会合することができる。核受容体の構造配位に関してコンピューターのス
クリーン上に表示された三次元イメージ上の、互いに対する前記フラグメントの
関係の映像による検分によって、会合を進めることができる。Ｑｕａｎｔａ又は
Ｓｙｂｙｌの様なソフトウェアを用いる、マニュアルモデル構築がこれに続くこ
とができる。
【００５３】 個々の化学的存在物又はフラグメントの連結において、当業者を助けるのに有
用なプログラムは： CAVEAT (Bartlett. et al., “CAVEAT : A Program to Facilitate the Struc
ture-Derived Design of Biologically Active Molecules”. In Molecular Rec
ognition in Chemical and Biological Problems, Special Pub., Royal Chem.
Soc. 78 : 182-196 (1989), the University of California. Berkeley. CAから
入手可能）；3Dデータベースシステム、例えばMACCS-3D (MDL Information Syst
ems. San Leandro. CA. Martin. J. Med. Chem. 35 : 2145-2154 (1992)におい
て概説）；及びHOOK (Molecular Simulations. Burlington. MAから入手可能）
を含む。
用なプログラムは： CAVEAT (Bartlett. et al., “CAVEAT : A Program to Facilitate the Struc
ture-Derived Design of Biologically Active Molecules”. In Molecular Rec
ognition in Chemical and Biological Problems, Special Pub., Royal Chem.
Soc. 78 : 182-196 (1989), the University of California. Berkeley. CAから
入手可能）；3Dデータベースシステム、例えばMACCS-3D (MDL Information Syst
ems. San Leandro. CA. Martin. J. Med. Chem. 35 : 2145-2154 (1992)におい
て概説）；及びHOOK (Molecular Simulations. Burlington. MAから入手可能）
を含む。
【００５４】 段階を追う方法における化合物の構築、上述した様な１つのフラグメント又は
化学的存在物の同時の構築に加えて、注目のリガンド結合ドメインに結合する化
合物もまた、空のＬＢＤ又は前記部位に結合することが知られている分子、例え
ば知られているリガンドのいくつかの部分を任意に含むもののいずれかを用いて
、全体的に又は新規に設計することができる。これらの方法は： LUDI (Bohm. J. Comp. Aid. Molec. Design 6 : 61-78 (1992). Biosm Techno
logies. San Diego, CAから入手可能）；LEGEND (Nishibata, et al., Tetrahed
ron 47 : 8985 (1991), Molecular Simulations. Burlington. MAから入手可能
）；及び LeapFrog (Tripos Associates. St. Louis. MOから入手可能）を含む
。
化学的存在物の同時の構築に加えて、注目のリガンド結合ドメインに結合する化
合物もまた、空のＬＢＤ又は前記部位に結合することが知られている分子、例え
ば知られているリガンドのいくつかの部分を任意に含むもののいずれかを用いて
、全体的に又は新規に設計することができる。これらの方法は： LUDI (Bohm. J. Comp. Aid. Molec. Design 6 : 61-78 (1992). Biosm Techno
logies. San Diego, CAから入手可能）；LEGEND (Nishibata, et al., Tetrahed
ron 47 : 8985 (1991), Molecular Simulations. Burlington. MAから入手可能
）；及び LeapFrog (Tripos Associates. St. Louis. MOから入手可能）を含む
。
【００５５】 他の分子モデリング技術もまた、この発明に従い適用することができる。例え
ば、Cohen, et al., J. Med. Chem. 33 : 883-894 (1990)及びNavia, et al., C
arrent Opinions in Stractural Biology 2 : 202-210 (1992)を参照のこと。例
えば、試験化合物の構造が知られている場合、前記試験化合物のモデルを、本発
明の構造のモデルに重ねることができる。この段階のための多くの方法及び技術
が、当業界で知られており、この中のいずれかを使用することができる。例えば
、Farmer, “Drug Design”10 : 119-143, Ariens, ed., Academic Press, New
York (1980) ;米国特許第５，３３１，５７３号；米国特許第５，５００，８０
７号；Verlinde, Structure 2 : 577-587 (1994) ;及びKuntz, et al., Science
257 : 1078-1082 (1992)を参照のこと。本明細書に記載のモデル構築技術及び
コンピューター評価システムは、本発明における限定ではない。
ば、Cohen, et al., J. Med. Chem. 33 : 883-894 (1990)及びNavia, et al., C
arrent Opinions in Stractural Biology 2 : 202-210 (1992)を参照のこと。例
えば、試験化合物の構造が知られている場合、前記試験化合物のモデルを、本発
明の構造のモデルに重ねることができる。この段階のための多くの方法及び技術
が、当業界で知られており、この中のいずれかを使用することができる。例えば
、Farmer, “Drug Design”10 : 119-143, Ariens, ed., Academic Press, New
York (1980) ;米国特許第５，３３１，５７３号；米国特許第５，５００，８０
７号；Verlinde, Structure 2 : 577-587 (1994) ;及びKuntz, et al., Science
257 : 1078-1082 (1992)を参照のこと。本明細書に記載のモデル構築技術及び
コンピューター評価システムは、本発明における限定ではない。
【００５６】 これらのコンピューターモデリングシステムを用いて、多くの化合物を素速く
、そして容易に試験することができ、そして費用及び時間がかかる生化学的試験
を避けることができる。更に、多くの化合物の実際の合成の必要性を実質的に減
らし、そして／あるいは効率的に排除することができる。 モデリングによって同定した化合物を、当業界で公知のアッセイにおいてスク
リーニングすることができる。生物学的なアッセイを含むその様なアッセイは、
リガンド結合活性のために、注目のリガンド結合ドメインに前記化合物を結合さ
せることを特徴とする。スクリーニングを、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞培養
において、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。生物学的なスクリー
ニングは、好ましくは活性を基にした応答モデル、結合アッセイ（これは、化合
物が受容体にどの位結合しているかを測定する）、及び細菌、酵母及び動物細胞
系（これは細胞における化合物の生物学的作用を測定する）に集中する。前記ア
ッセイを高容量−高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）のために自動化することが
でき、ここでは多くの化合物を、所望の活性を有する化合物を同定するために使
用することができる。
、そして容易に試験することができ、そして費用及び時間がかかる生化学的試験
を避けることができる。更に、多くの化合物の実際の合成の必要性を実質的に減
らし、そして／あるいは効率的に排除することができる。 モデリングによって同定した化合物を、当業界で公知のアッセイにおいてスク
リーニングすることができる。生物学的なアッセイを含むその様なアッセイは、
リガンド結合活性のために、注目のリガンド結合ドメインに前記化合物を結合さ
せることを特徴とする。スクリーニングを、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞培養
において、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。生物学的なスクリー
ニングは、好ましくは活性を基にした応答モデル、結合アッセイ（これは、化合
物が受容体にどの位結合しているかを測定する）、及び細菌、酵母及び動物細胞
系（これは細胞における化合物の生物学的作用を測定する）に集中する。前記ア
ッセイを高容量−高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）のために自動化することが
でき、ここでは多くの化合物を、所望の活性を有する化合物を同定するために使
用することができる。
【００５７】 例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合アッセイを行うことができ、ここでは注目
のリガンド結合ドメインにリガンド、フラグメント、複合体又はそのペプチドが
結合するのを防ぐ化合物の能力が試験される。細胞及び組織の培養アッセイのた
めに、それらを行ない、細胞のコアクチベーター、例えばコアクチベータータン
パク質のｐ１６０ファミリーのメンバー、例えばＳＲＣ−１，ＡＩＢ１，ＲＡＣ
３，ｐ／ＣＩＰ、並びにＧＲＩＰ１及びその相同体ＴＩＦ２及びＮｃｏＡ−２、
並びに受容体及び／又はイソ型特異的結合親和性を示すものの機能を阻害する化
合物の能力を評価することができる。好ましい態様において、本発明の化合物は
内因性のリガンドよりも大きい親和性でリガンド結合ドメインに結合する。組織
のプロファイリング及び適当な動物モデルもまた、化合物を選択するために使用
することができる。異なる細胞型及び組織もまた、これらの生物学的スクリーニ
ングアッセイのために使用することができる。その様なスクリーニングに適した
アッセイは、本明細書並びにShibata. et al., Recent Prog. Horm Res. 52: 14
1-164 (1997); Tagami. et al., Mol. Cell. Biol. 17 (5) : 2642-2648 (1997)
; Zhu, et al., J. Biol. Chem. 272 (14) : 9048-9054 (1997) ; Lin. et al.
, Mol. Cell. Biol. 17 (10) : 6131-6138 (1997) ; Kakizawa, et al., J. Bio
l. Chem. 272 (38) : 23799-23804 (1997) ;及びChang, et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 94 (17) : 9040-9045 (1997)に記載され、これらは引用によって
それらの全体が本明細書に組み入れられる。
のリガンド結合ドメインにリガンド、フラグメント、複合体又はそのペプチドが
結合するのを防ぐ化合物の能力が試験される。細胞及び組織の培養アッセイのた
めに、それらを行ない、細胞のコアクチベーター、例えばコアクチベータータン
パク質のｐ１６０ファミリーのメンバー、例えばＳＲＣ−１，ＡＩＢ１，ＲＡＣ
３，ｐ／ＣＩＰ、並びにＧＲＩＰ１及びその相同体ＴＩＦ２及びＮｃｏＡ−２、
並びに受容体及び／又はイソ型特異的結合親和性を示すものの機能を阻害する化
合物の能力を評価することができる。好ましい態様において、本発明の化合物は
内因性のリガンドよりも大きい親和性でリガンド結合ドメインに結合する。組織
のプロファイリング及び適当な動物モデルもまた、化合物を選択するために使用
することができる。異なる細胞型及び組織もまた、これらの生物学的スクリーニ
ングアッセイのために使用することができる。その様なスクリーニングに適した
アッセイは、本明細書並びにShibata. et al., Recent Prog. Horm Res. 52: 14
1-164 (1997); Tagami. et al., Mol. Cell. Biol. 17 (5) : 2642-2648 (1997)
; Zhu, et al., J. Biol. Chem. 272 (14) : 9048-9054 (1997) ; Lin. et al.
, Mol. Cell. Biol. 17 (10) : 6131-6138 (1997) ; Kakizawa, et al., J. Bio
l. Chem. 272 (38) : 23799-23804 (1997) ;及びChang, et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 94 (17) : 9040-9045 (1997)に記載され、これらは引用によって
それらの全体が本明細書に組み入れられる。
【００５８】 選択される化合物は、作用薬及び／又は拮抗薬の特性を有することができる。
前記化合物はまた、新規特性を示すものを含み、これらは作用薬及び拮抗薬の混
合物の活性を変え、ホルモン依存性又はホルモン非依存性のいずれかである核受
容体の異なる活性に関係するリガンド結合を変える作用に依存し、これらはコア
クチベーターと異なるタンパク質によって媒介され、そしてコアクチベーター結
合部位と異なる位置で受容体を相互作用する。前記化合物はまた、ホルモンの結
合に立体配座的に敏感な受容体の配置に対するそれらの結合を通して、前記受容
体へのアロステリック作用を有するものを含み、この作用は前記受容体のホルモ
ンが結合した立体配座の安定化又は膜安定化によるものであるか、あるいはホル
モンの結合によって前記受容体に導入される同一、類似、又は異なる立体配座の
変化を直接導入することによるものである。
前記化合物はまた、新規特性を示すものを含み、これらは作用薬及び拮抗薬の混
合物の活性を変え、ホルモン依存性又はホルモン非依存性のいずれかである核受
容体の異なる活性に関係するリガンド結合を変える作用に依存し、これらはコア
クチベーターと異なるタンパク質によって媒介され、そしてコアクチベーター結
合部位と異なる位置で受容体を相互作用する。前記化合物はまた、ホルモンの結
合に立体配座的に敏感な受容体の配置に対するそれらの結合を通して、前記受容
体へのアロステリック作用を有するものを含み、この作用は前記受容体のホルモ
ンが結合した立体配座の安定化又は膜安定化によるものであるか、あるいはホル
モンの結合によって前記受容体に導入される同一、類似、又は異なる立体配座の
変化を直接導入することによるものである。
【００５９】 特に注目されるのは、哺乳類の核受容体活性の調節方法におけるその様な化合
物の使用であり、これは注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的に及び
選択的にはまる化合物の十分な量を、これを必要とする哺乳類に投与することで
ある。“調節”は核受容体の活性が増大又は減少することを意図する。例えば、
臨床前の候補化合物を、効力、吸収作用、薬理動態及び毒性を測定するために適
当な動物モデルにおいて、当業界で知られている標準的な技術に従い、適当な動
物モデルにおいて試験することができる。次に、所望の特性を示す化合物を、様
々な核受容体を基にした障害の治療における使用のための臨床的な試みにおいて
試験することができる。これらはＥＲを基にした障害、例えばエストロゲン産生
の欠損に由来する更年期後の徴候及びガン、並びにエストロゲンの補足治療から
生ずる骨粗鬆症及び心臓血管疾患を含む。これ以外のものは、ＧＲを基にした障
害を含み、これはII型の糖尿病及び炎症性の症状、例えばリウマチ性疾患を含む
。
物の使用であり、これは注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的に及び
選択的にはまる化合物の十分な量を、これを必要とする哺乳類に投与することで
ある。“調節”は核受容体の活性が増大又は減少することを意図する。例えば、
臨床前の候補化合物を、効力、吸収作用、薬理動態及び毒性を測定するために適
当な動物モデルにおいて、当業界で知られている標準的な技術に従い、適当な動
物モデルにおいて試験することができる。次に、所望の特性を示す化合物を、様
々な核受容体を基にした障害の治療における使用のための臨床的な試みにおいて
試験することができる。これらはＥＲを基にした障害、例えばエストロゲン産生
の欠損に由来する更年期後の徴候及びガン、並びにエストロゲンの補足治療から
生ずる骨粗鬆症及び心臓血管疾患を含む。これ以外のものは、ＧＲを基にした障
害を含み、これはII型の糖尿病及び炎症性の症状、例えばリウマチ性疾患を含む
。
【００６０】 多くの核受容体にとっての目的は新規の合成作用薬又は拮抗薬の発見であるが
、いくつかの核受容体、特にエストロゲン受容体にとって、標的の組織における
所望の作用薬及び拮抗薬の作用を有する化合物の開発の価値を知覚することが重
要である。その様な化合物を、本明細書に記載の方法によって発見及び／又は設
計することができ、それに続いて当業界で公知の方法によって組織特異性をスク
リーニングすることができる。例えば、大きな必要性があるのは存在している治
療の向上並びに新規の作用薬及び拮抗薬の開発であり、ここで前記作用薬は心臓
血管及び脳組織及び骨においてエストロゲンの様に働くものであり、前記拮抗薬
は子宮及び胸部の組織において、エストロゲン受容体に働くものである。理想的
には、化合物はこれらの特性のうち１つ以上を有し、すなわち化合物はある組織
において作用薬として働き、一方別の組織において拮抗薬として働くだろう。Ｓ
ＥＲＭ、例えばＯＨＴ及びＲＡＬの組織選択的拮抗性は多くの因子によるもので
あるが（Grainger, et al., Nature Medicine 2 (4) : 381-385 (1996) ; Grese
, et al., Supra ; 及びJordan, J. Natl. Carcer Inst. 90 : 967-71 (1998))
、これらのリガンドの作用機構の詳細は、それらがどのようにＬＢＤに働き、そ
して他の細胞性因子とその相互作用を制御しているかについての包括的な理解を
必要としている。本発明は、受容体の拮抗性に寄与しているのが、以外にも側鎖
効果単独ではなく、リガンド結合ポケット内及びその周りのリガンドが媒介する
構造的な変化であることを示す。従って、これら２つの作用の間のバランスを調
節することは、向上するＳＥＲＭの設計のための新規戦略を提供する。
、いくつかの核受容体、特にエストロゲン受容体にとって、標的の組織における
所望の作用薬及び拮抗薬の作用を有する化合物の開発の価値を知覚することが重
要である。その様な化合物を、本明細書に記載の方法によって発見及び／又は設
計することができ、それに続いて当業界で公知の方法によって組織特異性をスク
リーニングすることができる。例えば、大きな必要性があるのは存在している治
療の向上並びに新規の作用薬及び拮抗薬の開発であり、ここで前記作用薬は心臓
血管及び脳組織及び骨においてエストロゲンの様に働くものであり、前記拮抗薬
は子宮及び胸部の組織において、エストロゲン受容体に働くものである。理想的
には、化合物はこれらの特性のうち１つ以上を有し、すなわち化合物はある組織
において作用薬として働き、一方別の組織において拮抗薬として働くだろう。Ｓ
ＥＲＭ、例えばＯＨＴ及びＲＡＬの組織選択的拮抗性は多くの因子によるもので
あるが（Grainger, et al., Nature Medicine 2 (4) : 381-385 (1996) ; Grese
, et al., Supra ; 及びJordan, J. Natl. Carcer Inst. 90 : 967-71 (1998))
、これらのリガンドの作用機構の詳細は、それらがどのようにＬＢＤに働き、そ
して他の細胞性因子とその相互作用を制御しているかについての包括的な理解を
必要としている。本発明は、受容体の拮抗性に寄与しているのが、以外にも側鎖
効果単独ではなく、リガンド結合ポケット内及びその周りのリガンドが媒介する
構造的な変化であることを示す。従って、これら２つの作用の間のバランスを調
節することは、向上するＳＥＲＭの設計のための新規戦略を提供する。
【００６１】 この知識によって、治療的化合物を設計することは特に重要であり、これらは
ヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌ
ｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ
４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５
２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４
，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基に相当する少なくとも１つのアミノ酸残
基をゆがめるだろう。従って、本発明の１つの観点は核受容体活性の調節方法で
あり、これは注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的に及び選択的には
まるリガンドの十分な量を、それを必要としている哺乳類に投与することであり
、ここで前記リガンドはコンピューターによる方法によって設計され、ｈＥＲα
のＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，
Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌ
ｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好
ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ
５２８に相当する核受容体のＬＢＤの少なくとも１つのアミノ酸残基が、少なく
とも１つの前記リガンドの第１の化学的部分と相互作用する。その様な方法は、
第１の化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選択し、そして相互作用して
いるアミノ酸と第１の化学的部分との間の相互作用と比較して、相互作用するア
ミノ酸と第２の化学的部分との間の相互作用を減少させるか又は増大させる、い
ずれかの構造を有する第２の化学的部分を生成せしめることに関係する。
ヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌ
ｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ
４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５
２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４
，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基に相当する少なくとも１つのアミノ酸残
基をゆがめるだろう。従って、本発明の１つの観点は核受容体活性の調節方法で
あり、これは注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的に及び選択的には
まるリガンドの十分な量を、それを必要としている哺乳類に投与することであり
、ここで前記リガンドはコンピューターによる方法によって設計され、ｈＥＲα
のＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，
Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌ
ｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好
ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ
５２８に相当する核受容体のＬＢＤの少なくとも１つのアミノ酸残基が、少なく
とも１つの前記リガンドの第１の化学的部分と相互作用する。その様な方法は、
第１の化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選択し、そして相互作用して
いるアミノ酸と第１の化学的部分との間の相互作用と比較して、相互作用するア
ミノ酸と第２の化学的部分との間の相互作用を減少させるか又は増大させる、い
ずれかの構造を有する第２の化学的部分を生成せしめることに関係する。
【００６２】 この方法によって設計される化合物は、作用薬又は拮抗薬のいずれかであるこ
とができ、そして核受容体活性を調節する方法は、拮抗薬単独、作用薬単独ある
いは、コアクチベーター又はコアクチベーター結合部位に結合することによって
コアクチベーターを擬態する化合物と組合わせた作用薬の投与を含んで成ること
ができる。
とができ、そして核受容体活性を調節する方法は、拮抗薬単独、作用薬単独ある
いは、コアクチベーター又はコアクチベーター結合部位に結合することによって
コアクチベーターを擬態する化合物と組合わせた作用薬の投与を含んで成ること
ができる。
【００６３】 前記コアクチベーターは知られているコアクチベーターである。前記コアクチ
ベーター擬似体をコンピューターを用いる方法によって設計することができ、こ
こでｈＥＲαのヘリックス３の残基Ｌｅｕ３５４，Ｖａｌ３５５，Ｍｅｔ３５７
，Ｉｌｅ３５８，Ａｌａ３６１及びＬｙｓ３６２、ヘリックス４の残基Ｐｈｅ３
６７、ヘリックス５の残基Ｇｌｎ３７５，Ｖａｌ３７６，Ｌｅｕ３７９及びＧｌ
ｕ３８０、ヘリックス６の残基Ｔｒｐ３８３、並びにヘリックス１２の残基Ａｓ
ｐ５３８，Ｌｅｕ５３９，Ｇｌｕ５４２，Ｍｅｔ５４３及びＬｅｕ５４４に相当
する核受容体のコアクチベーター結合部位の少なくとも１つのアミノ酸残基は、
前記コアクチベーター擬似体の少なくとも１つの第１の化学的部分と相互作用す
る。前記方法は第１の化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選択し、そし
て相互作用するアミノ酸と第１の化学的部分との間の相互作用と比較して、相互
作用するアミノ酸と第２の化学的部分との相互作用を増大させるか又は減少させ
る、いずれかの構造を有する第２の化学的部分を生成せしめることに関係する。
ベーター擬似体をコンピューターを用いる方法によって設計することができ、こ
こでｈＥＲαのヘリックス３の残基Ｌｅｕ３５４，Ｖａｌ３５５，Ｍｅｔ３５７
，Ｉｌｅ３５８，Ａｌａ３６１及びＬｙｓ３６２、ヘリックス４の残基Ｐｈｅ３
６７、ヘリックス５の残基Ｇｌｎ３７５，Ｖａｌ３７６，Ｌｅｕ３７９及びＧｌ
ｕ３８０、ヘリックス６の残基Ｔｒｐ３８３、並びにヘリックス１２の残基Ａｓ
ｐ５３８，Ｌｅｕ５３９，Ｇｌｕ５４２，Ｍｅｔ５４３及びＬｅｕ５４４に相当
する核受容体のコアクチベーター結合部位の少なくとも１つのアミノ酸残基は、
前記コアクチベーター擬似体の少なくとも１つの第１の化学的部分と相互作用す
る。前記方法は第１の化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選択し、そし
て相互作用するアミノ酸と第１の化学的部分との間の相互作用と比較して、相互
作用するアミノ酸と第２の化学的部分との相互作用を増大させるか又は減少させ
る、いずれかの構造を有する第２の化学的部分を生成せしめることに関係する。
【００６４】 コアクチベーター又はコアクチベーター擬似体と組合わせた作用薬の使用もま
た、新規の組織特異的作用を有する治療法を行うための独特の戦略を提供する。
例えば、コアクチベーター擬似体を、ヘリックス１２がその作用薬結合状態内に
あるときにだけ転写活性に関与する部位に結合するように設計することができる
。その様なコアクチベーター擬似体が、特定の受容体のこの部位に特異的である
ならば、作用薬の存在下でのみ、選択的にその受容体を阻害することができる。
これは、内因性の作用薬のレベルに基づいた、新規の、組織特異的拮抗性を導く
ことができる。本発明の方法によって設計される作用薬を、コアクチベーター擬
似体の特異性を決定するためのアッセイに使用することができる。あるいは、与
えられた組織における効果的な濃度を、知られている本発明の方法によって設計
される拮抗薬又は拮抗薬を与えることによって調節することができる。本明細書
に記載のＬＢＤ／ＤＥＳ／ＧＲＩＰ１ペプチド複合体の結晶構造は、標的化され
ることが必要と思われる結合部位を正確に定義する。
た、新規の組織特異的作用を有する治療法を行うための独特の戦略を提供する。
例えば、コアクチベーター擬似体を、ヘリックス１２がその作用薬結合状態内に
あるときにだけ転写活性に関与する部位に結合するように設計することができる
。その様なコアクチベーター擬似体が、特定の受容体のこの部位に特異的である
ならば、作用薬の存在下でのみ、選択的にその受容体を阻害することができる。
これは、内因性の作用薬のレベルに基づいた、新規の、組織特異的拮抗性を導く
ことができる。本発明の方法によって設計される作用薬を、コアクチベーター擬
似体の特異性を決定するためのアッセイに使用することができる。あるいは、与
えられた組織における効果的な濃度を、知られている本発明の方法によって設計
される拮抗薬又は拮抗薬を与えることによって調節することができる。本明細書
に記載のＬＢＤ／ＤＥＳ／ＧＲＩＰ１ペプチド複合体の結晶構造は、標的化され
ることが必要と思われる結合部位を正確に定義する。
【００６５】 上述及び実施例において例示する様に、ＥＲのＬＢＤはコアクチベーター結合
部位に結合したコアクチベーターＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド配列（配
列番号４）及び２．０３Åの分解能まで精密化した共結晶構造を有するＤＥＳを
含んで成るペプチド分子と共結晶化し、そして１．９Åの分解能まで精密化した
共結晶構造を有するＯＨＴと共結晶化する。従って、本発明はまたリガンド結合
ドメインに結合したリガンド及びコアクチベーター結合部位に結合した分子との
、核受容体のリガンド結合ドメインから生成した共結晶を提供する。好ましくは
、前記結晶構造は３．６Åより大きな分解能まで精密化され、すなわち３．６Å
以下の分解能の値を有する。更に好ましくは、前記結晶構造は、３．４Å、３．
２Å、３．０Å、２．８Å、２．６Å、２．４Å、２．２Å以上、更に好ましく
は２．０３Å以上の分解能にまで精密化される。更に本発明は、リガンド結合ド
メインに結合したリガンドを用いて、核受容体のリガンド結合ドメインから生成
した共結晶を提供する。好ましくは前記共結晶構造は３．６Å以上の分解能まで
精密化され、すなわち３．６Å以下の分解能の値を有する。更に好ましくは、前
記共結晶構造は、３．４Å、３．２Å、３．０Å、２．８Å、２．６Å、２．４
Å、２．２Å、２．０Å以上、より更に好ましくは１．９Å以上の分解能まで精
密化される。
部位に結合したコアクチベーターＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド配列（配
列番号４）及び２．０３Åの分解能まで精密化した共結晶構造を有するＤＥＳを
含んで成るペプチド分子と共結晶化し、そして１．９Åの分解能まで精密化した
共結晶構造を有するＯＨＴと共結晶化する。従って、本発明はまたリガンド結合
ドメインに結合したリガンド及びコアクチベーター結合部位に結合した分子との
、核受容体のリガンド結合ドメインから生成した共結晶を提供する。好ましくは
、前記結晶構造は３．６Åより大きな分解能まで精密化され、すなわち３．６Å
以下の分解能の値を有する。更に好ましくは、前記結晶構造は、３．４Å、３．
２Å、３．０Å、２．８Å、２．６Å、２．４Å、２．２Å以上、更に好ましく
は２．０３Å以上の分解能にまで精密化される。更に本発明は、リガンド結合ド
メインに結合したリガンドを用いて、核受容体のリガンド結合ドメインから生成
した共結晶を提供する。好ましくは前記共結晶構造は３．６Å以上の分解能まで
精密化され、すなわち３．６Å以下の分解能の値を有する。更に好ましくは、前
記共結晶構造は、３．４Å、３．２Å、３．０Å、２．８Å、２．６Å、２．４
Å、２．２Å、２．０Å以上、より更に好ましくは１．９Å以上の分解能まで精
密化される。
【００６６】 通常、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）の様な細胞の培養によって発現した、精製核受容
体のＬＢＤから、結晶は生成される。Ｅ．コリは、たいてい好ましい発現系であ
る。甲状腺の受容体は、Apriletti, et al., SupraにおいてＥ．コリでの発現が
成功した。しかしながら、エストロゲン受容体の成功した組換え発現には、熱シ
ョックタンパク質が必要であることが長い間信じられてきた。故に、エストロゲ
ン受容体がＥ．コリにおいて活性タンパク質として発現できることを見出したの
は、全く予期していないことであった。
体のＬＢＤから、結晶は生成される。Ｅ．コリは、たいてい好ましい発現系であ
る。甲状腺の受容体は、Apriletti, et al., SupraにおいてＥ．コリでの発現が
成功した。しかしながら、エストロゲン受容体の成功した組換え発現には、熱シ
ョックタンパク質が必要であることが長い間信じられてきた。故に、エストロゲ
ン受容体がＥ．コリにおいて活性タンパク質として発現できることを見出したの
は、全く予期していないことであった。
【００６７】 好ましくは、同一の核受容体の異なる結晶（共結晶）は、異なるコアクチベー
ター型分子、例えばタンパク質フラグメント、融合体又は小ペプチドを用いて別
々に生成される。前記のコアクチベーター型分子は、好ましくはコアクチベータ
ー結合部位に結合する必要性があるＮＲ−ボックス配列、又はＮＲ−ボックス配
列の誘導体を含む。他の分子を共結晶化に使用することができ、例えば小さい有
機体はコアクチベーター又はホルモンの結合部位に結合する。重原子の置換をＬ
ＢＤ及び／又は共結晶化分子に含めることができる。
ター型分子、例えばタンパク質フラグメント、融合体又は小ペプチドを用いて別
々に生成される。前記のコアクチベーター型分子は、好ましくはコアクチベータ
ー結合部位に結合する必要性があるＮＲ−ボックス配列、又はＮＲ−ボックス配
列の誘導体を含む。他の分子を共結晶化に使用することができ、例えば小さい有
機体はコアクチベーター又はホルモンの結合部位に結合する。重原子の置換をＬ
ＢＤ及び／又は共結晶化分子に含めることができる。
【００６８】 共結晶の三次元構造決定後、構造情報をコンピューターによる方法に使用し、
核受容体のための合成化合物を設計することができ、そして更に構造−活性の関
連性を、本明細書に記載され、そして当業界で知られているアッセイを用いての
慣行の試験によって決定することができる。 核受容体ＬＢＤが１つ以上の結晶形態で結晶化しうるので、付表１及び２に与
えたその様な受容体の構造配位又はその一部は、核受容体のそれらの他の結晶形
態の構造を解明するために特に有用である。それらをまた十分な相同性を有する
変異体又は共複合体の構造を解明するために使用することができる。
核受容体のための合成化合物を設計することができ、そして更に構造−活性の関
連性を、本明細書に記載され、そして当業界で知られているアッセイを用いての
慣行の試験によって決定することができる。 核受容体ＬＢＤが１つ以上の結晶形態で結晶化しうるので、付表１及び２に与
えたその様な受容体の構造配位又はその一部は、核受容体のそれらの他の結晶形
態の構造を解明するために特に有用である。それらをまた十分な相同性を有する
変異体又は共複合体の構造を解明するために使用することができる。
【００６９】 この目的のために適用されうる方法は、分子の置換である。この方法において
、付表１及び２に与えた、この発明の構造配位を用いて、未知の結晶構造を決定
することができる。ＤＥＳ−ＥＲα ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIのペ
プチド複合体の付表１の配位、及びＯＨＴ−ＥＲα ＬＢＤ複合体の付表２の配
位は、Brookhaven National Lahoratory Protein Data Bankにより寄託され、そ
してBrookhaven Protein Data Bankの受け入れ番号２ｅｒｄ及び２ｅｒｔをそれ
ぞれ割り当てられた。この方法は、未知の結晶の正確な構造形態を提供し、これ
は初めからその様な情報を決定することを試みるよりも素速く、そして効率的で
あろう。
、付表１及び２に与えた、この発明の構造配位を用いて、未知の結晶構造を決定
することができる。ＤＥＳ−ＥＲα ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIのペ
プチド複合体の付表１の配位、及びＯＨＴ−ＥＲα ＬＢＤ複合体の付表２の配
位は、Brookhaven National Lahoratory Protein Data Bankにより寄託され、そ
してBrookhaven Protein Data Bankの受け入れ番号２ｅｒｄ及び２ｅｒｔをそれ
ぞれ割り当てられた。この方法は、未知の結晶の正確な構造形態を提供し、これ
は初めからその様な情報を決定することを試みるよりも素速く、そして効率的で
あろう。
【００７０】 本発明の結晶から集めた原子配位の情報を蓄積することができる。好ましい態
様において、前記情報は機械可読のデータ記憶媒体の形態において提供される。
この媒体は、リガンド結合ドメイン又はその一部の原子モデルを構築し、そして
／あるいは操作するための情報を含む。例えば、リガンド結合ドメインのための
機械可読のデータは、ｈＥＲαのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，
Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐ
ｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅ
ｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５
２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当するアミノ酸の構造配位、あるいは
前記部位を含んで成る分子の相同体又は分子複合体を含んで成る。前記相同体は
前記アミノ酸の主鎖の原子由来の、１．５Å以下の根平均２乗偏差を有するＬＢ
Ｄを含んで成る。好ましい分子は複合体は、ＬＢＤに結合した化合物を表わす。
様において、前記情報は機械可読のデータ記憶媒体の形態において提供される。
この媒体は、リガンド結合ドメイン又はその一部の原子モデルを構築し、そして
／あるいは操作するための情報を含む。例えば、リガンド結合ドメインのための
機械可読のデータは、ｈＥＲαのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，
Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐ
ｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅ
ｕ５２５及びＭｅｔ５２８、好ましくはＭｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５
２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当するアミノ酸の構造配位、あるいは
前記部位を含んで成る分子の相同体又は分子複合体を含んで成る。前記相同体は
前記アミノ酸の主鎖の原子由来の、１．５Å以下の根平均２乗偏差を有するＬＢ
Ｄを含んで成る。好ましい分子は複合体は、ＬＢＤに結合した化合物を表わす。
【００７１】 前記の機械可読のデータ記憶媒体は相互作用の薬剤設計及び分子の置換の研究
のために使用することができる。例えば、データの記憶材料は第１の機械可読デ
ータの集合によってコードされ、これは第２の機械可読データの集合と組合わせ
ることができる。分子の置換のために、前記の第１のデータの集合は、注目の核
受容体又はその一部の構造配位の少なくとも一部のフーリエ変換したものを含ん
で成ることができ、そして前記の第２のデータの集合は、注目の分子又は分子複
合体のＸ線回折パターンを含んで成る。前記の第１及び第２のデータ集合を用い
るための命令によってプログラムされた機械を用いて、第２のデータに相当する
構造配位の一部又は全てを決定することができる。
のために使用することができる。例えば、データの記憶材料は第１の機械可読デ
ータの集合によってコードされ、これは第２の機械可読データの集合と組合わせ
ることができる。分子の置換のために、前記の第１のデータの集合は、注目の核
受容体又はその一部の構造配位の少なくとも一部のフーリエ変換したものを含ん
で成ることができ、そして前記の第２のデータの集合は、注目の分子又は分子複
合体のＸ線回折パターンを含んで成る。前記の第１及び第２のデータ集合を用い
るための命令によってプログラムされた機械を用いて、第２のデータに相当する
構造配位の一部又は全てを決定することができる。
【００７２】 本明細書に記載の結晶及びアッセイのためのタンパク質を、本明細書に記載の
及び当業界で知られている発現及び精製技術を用いて製造することができる。例
えば、核受容体ＬＢＤの高レベルの発現を、適当な発現宿主、例えばＥ．コリに
おいて得ることができる。例えば、Ｅ．コリにおけるＬＢＤの発現はＥＲαＬＢ
Ｄ並びにＧＲ及びＰＲを含んでいる他の核受容体を含む。酵母及び他の真核の発
現系を、熱ショックタンパク質と結合する核受容体と共に使用することができる
のは、これらの核受容体が細菌において発現するのが一般的により難しいためで
あり、そして例外として細菌において発現可能なＥＲがある。代表的な核受容体
又はそれらのリガンド結合ドメインはクローン化され、そして配列が決定された
：ヒトＥＲ（Seielstad, et al., Molecular. Erdocrirology 9 (6) : 647-658
(1995)に記載しており、これは引用によって本明細書に組入れられる）、ヒトＧ
Ｒ、及びヒトＰＲ。これら受容体の各ＬＢＤが同定された。
及び当業界で知られている発現及び精製技術を用いて製造することができる。例
えば、核受容体ＬＢＤの高レベルの発現を、適当な発現宿主、例えばＥ．コリに
おいて得ることができる。例えば、Ｅ．コリにおけるＬＢＤの発現はＥＲαＬＢ
Ｄ並びにＧＲ及びＰＲを含んでいる他の核受容体を含む。酵母及び他の真核の発
現系を、熱ショックタンパク質と結合する核受容体と共に使用することができる
のは、これらの核受容体が細菌において発現するのが一般的により難しいためで
あり、そして例外として細菌において発現可能なＥＲがある。代表的な核受容体
又はそれらのリガンド結合ドメインはクローン化され、そして配列が決定された
：ヒトＥＲ（Seielstad, et al., Molecular. Erdocrirology 9 (6) : 647-658
(1995)に記載しており、これは引用によって本明細書に組入れられる）、ヒトＧ
Ｒ、及びヒトＰＲ。これら受容体の各ＬＢＤが同定された。
【００７３】 コアクチベータータンパク質を当業界で知られている技術を用いて発現するこ
とができ、特に、既にクローン化及び／又は発現されたコアクチベータータンパ
ク質のｐ１６０ファミリーのメンバー、例えばＳＲＣ−１，ＡＩＢ１，ＲＡＣ３
，ｐ／ＣＩＰ、そしてＧＲＩＰ１並びにその相同体ＴＩＦ２及びＮｃｏＡ−２が
ある。コアクチベータータンパク質の発現のための好ましい方法は、転写活性化
活性を保持するフラグメントを発現することであり、これにはＧＲＩＰ１発現に
ついての出版物Hong, et al., Mol. Cell. Biol. 17 : 2735-44 (1997) 及びPro
c. Natl. Acad. Sci. USA 93 (10) : 4948-52 (1996)に記載の“Ｓｏｎｇ及びＦ
ｉｅｌｄｓ”の方法（“酵母の２−ハイブリッド”法としても言及される）を用
い、この参考文献は引用により本明細書に組入れられる。
とができ、特に、既にクローン化及び／又は発現されたコアクチベータータンパ
ク質のｐ１６０ファミリーのメンバー、例えばＳＲＣ−１，ＡＩＢ１，ＲＡＣ３
，ｐ／ＣＩＰ、そしてＧＲＩＰ１並びにその相同体ＴＩＦ２及びＮｃｏＡ−２が
ある。コアクチベータータンパク質の発現のための好ましい方法は、転写活性化
活性を保持するフラグメントを発現することであり、これにはＧＲＩＰ１発現に
ついての出版物Hong, et al., Mol. Cell. Biol. 17 : 2735-44 (1997) 及びPro
c. Natl. Acad. Sci. USA 93 (10) : 4948-52 (1996)に記載の“Ｓｏｎｇ及びＦ
ｉｅｌｄｓ”の方法（“酵母の２−ハイブリッド”法としても言及される）を用
い、この参考文献は引用により本明細書に組入れられる。
【００７４】 前記タンパク質は成熟又は全長配列のフラグメントとして単独で、あるいは異
種の配列との融合体として発現することができる。例えば、ＥＲαはＤＢＤのい
ずれかの部分又はアミノ末端ドメイン無しで発現することができる。ＤＢＤ又は
アミノ末端の一部を含めることができるのは、ＬＢＤに隣接しているアミノ酸と
の更なる構造情報が望まれる場合である。一般に、結晶のために使用されるＥＲ
αのＬＢＤは、長さが３２０アミノ酸以下であろう。好ましくは、ＥＲαのＬＢ
Ｄは少なくとも２２０アミノ酸の長さ及び最も好ましくは少なくとも２５０アミ
ノ酸の長さであろう。例えば、結晶化のために使用されるＬＢＤは、ＥＲαの２
９７〜５５４にわたるアミノ酸を含んで成ることができる。
種の配列との融合体として発現することができる。例えば、ＥＲαはＤＢＤのい
ずれかの部分又はアミノ末端ドメイン無しで発現することができる。ＤＢＤ又は
アミノ末端の一部を含めることができるのは、ＬＢＤに隣接しているアミノ酸と
の更なる構造情報が望まれる場合である。一般に、結晶のために使用されるＥＲ
αのＬＢＤは、長さが３２０アミノ酸以下であろう。好ましくは、ＥＲαのＬＢ
Ｄは少なくとも２２０アミノ酸の長さ及び最も好ましくは少なくとも２５０アミ
ノ酸の長さであろう。例えば、結晶化のために使用されるＬＢＤは、ＥＲαの２
９７〜５５４にわたるアミノ酸を含んで成ることができる。
【００７５】 典型的に、前記のＬＢＤは結晶化のための均質性まで精製される。ＬＢＤの純
度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）、質量分析（ＭＳ）及び疎水性高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）を用いて測定することができる。結晶化のために精製したＬＢＤは少なくとも
９７．５％の純度、好ましくは少なくとも９９．０％の純度、及び更に好ましく
は少なくとも９９．５％の純度であるべきである。
度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）、質量分析（ＭＳ）及び疎水性高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）を用いて測定することができる。結晶化のために精製したＬＢＤは少なくとも
９７．５％の純度、好ましくは少なくとも９９．０％の純度、及び更に好ましく
は少なくとも９９．５％の純度であるべきである。
【００７６】 始めに、未配位の受容体の精製を、従来技術、例えば疎水性相互作用クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びヘ
パリン親和性クロマトグラフィーによって得ることができる。核受容体、特にエ
ストロゲン受容体の向上した結晶のための、より高度な精製を達成するために、
前記受容体を電荷に従い分離するカラム、例えばイオン交換又は疎水性相互作用
カラム、そしてその結果溶出した受容体をリガンド、特に作用薬と結合させるカ
ラムを用いて、前記受容体をリガンド−シフト精製することができる。前記リガ
ンドは受容体の表面電荷における変化を誘導し、その結果配位した受容体は未配
位の受容体と異なる位置で溶出する。通常、飽和濃度のリガンドを前記カラムに
おいて使用することができ、そして前記タンパク質は、それをカラムに通過させ
る前に、リガンドとあらかじめインキュベートすることができる。本明細書で詳
述した構造的な研究は、結晶化のための超純粋核受容体ＬＢＤを得るためのこの
技術の一般的な適用を示している。
グラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びヘ
パリン親和性クロマトグラフィーによって得ることができる。核受容体、特にエ
ストロゲン受容体の向上した結晶のための、より高度な精製を達成するために、
前記受容体を電荷に従い分離するカラム、例えばイオン交換又は疎水性相互作用
カラム、そしてその結果溶出した受容体をリガンド、特に作用薬と結合させるカ
ラムを用いて、前記受容体をリガンド−シフト精製することができる。前記リガ
ンドは受容体の表面電荷における変化を誘導し、その結果配位した受容体は未配
位の受容体と異なる位置で溶出する。通常、飽和濃度のリガンドを前記カラムに
おいて使用することができ、そして前記タンパク質は、それをカラムに通過させ
る前に、リガンドとあらかじめインキュベートすることができる。本明細書で詳
述した構造的な研究は、結晶化のための超純粋核受容体ＬＢＤを得るためのこの
技術の一般的な適用を示している。
【００７７】 精製もまた、精製ハンドル又は“標識”の使用によって達成することができ、
これは例えばタンパク質の末端、例えばＮ末端に位置するように操作したヒスチ
ジンのアミノ酸を用いたものであり、そして次に精製のためにニッケル又はコバ
ルトのキレート化カラムを用いる（Jankenecht, Proc. Natl, Acad. Sci. USA,
88 : 8972-8976 (1991)、これは引用によって組入れられる）。典型的に精製し
たＬＢＤ、例えばＥＲαＬＢＤは、前記タンパク質が完全に保たれる温度で、リ
ガンドの飽和濃度で平衡化される。リガンドの平衡は２〜３７℃の間で安定する
ことができるが、前記受容体は２〜２０℃の範囲でより安定化する傾向にある。
好ましくは、結晶を本明細書に詳述した懸滴法を用いて生成する。制御される温
度調節は、結晶の安定性及び質を向上するために望ましい。４〜２５℃の間の温
度が一般に使用され、そして多くの場合、温度範囲以上で結晶化を試験すること
が好ましい。次に、前記結晶は標準的な手順の後、蒸気拡散にかけられ、そして
Ｘ線で衝激を与えられ、その結果Ｘ線回折パターンが得られる。
これは例えばタンパク質の末端、例えばＮ末端に位置するように操作したヒスチ
ジンのアミノ酸を用いたものであり、そして次に精製のためにニッケル又はコバ
ルトのキレート化カラムを用いる（Jankenecht, Proc. Natl, Acad. Sci. USA,
88 : 8972-8976 (1991)、これは引用によって組入れられる）。典型的に精製し
たＬＢＤ、例えばＥＲαＬＢＤは、前記タンパク質が完全に保たれる温度で、リ
ガンドの飽和濃度で平衡化される。リガンドの平衡は２〜３７℃の間で安定する
ことができるが、前記受容体は２〜２０℃の範囲でより安定化する傾向にある。
好ましくは、結晶を本明細書に詳述した懸滴法を用いて生成する。制御される温
度調節は、結晶の安定性及び質を向上するために望ましい。４〜２５℃の間の温
度が一般に使用され、そして多くの場合、温度範囲以上で結晶化を試験すること
が好ましい。次に、前記結晶は標準的な手順の後、蒸気拡散にかけられ、そして
Ｘ線で衝激を与えられ、その結果Ｘ線回折パターンが得られる。
【００７８】 前記のリガンド結合ドメインと結合するリガンド単独、又は前記のコアクチベ
ーター結合部位に結合するペプチドと組合わせた共結晶のために、様々な濃度の
リガンド及び注目の核受容体のコアクチベーター結合部位に結合する配列を含む
ペプチドを微結晶化の試みにおいて使用することができ、そして更なる結晶化の
ために適当な化合物が選択される。リガンド及びペプチドを、注目の核受容体の
リガンド結合ドメイン及びコアクチベーター結合部位への結合のためにアッセイ
することができ、これは本明細書に記載したそれらのアッセイを含む、いくつか
の技術による。ＥＲαＬＢＤを用いる結晶化の試みにとって、懸滴蒸気拡散法が
好ましい。PH、溶媒及び溶質の成分並びに濃度及び温度の条件を、例えば本実施
例に記載した様に調節することができる。懸滴法において、Ｘ線回折解析のため
に適当な結晶を得るために、前記複合体の微結晶で調製した滴の核化を使用する
ことができる。構造情報の収集を、本明細書で決定したＥＲαＬＢＤの構造を用
いる分子の置換によって決定することができる。前記構造は、当業界で知られて
いる標準的な技術によって精密化される。
ーター結合部位に結合するペプチドと組合わせた共結晶のために、様々な濃度の
リガンド及び注目の核受容体のコアクチベーター結合部位に結合する配列を含む
ペプチドを微結晶化の試みにおいて使用することができ、そして更なる結晶化の
ために適当な化合物が選択される。リガンド及びペプチドを、注目の核受容体の
リガンド結合ドメイン及びコアクチベーター結合部位への結合のためにアッセイ
することができ、これは本明細書に記載したそれらのアッセイを含む、いくつか
の技術による。ＥＲαＬＢＤを用いる結晶化の試みにとって、懸滴蒸気拡散法が
好ましい。PH、溶媒及び溶質の成分並びに濃度及び温度の条件を、例えば本実施
例に記載した様に調節することができる。懸滴法において、Ｘ線回折解析のため
に適当な結晶を得るために、前記複合体の微結晶で調製した滴の核化を使用する
ことができる。構造情報の収集を、本明細書で決定したＥＲαＬＢＤの構造を用
いる分子の置換によって決定することができる。前記構造は、当業界で知られて
いる標準的な技術によって精密化される。
【００７９】 本発明によって得られる多くの使用及び利点がある。例えば、本明細書に記載
の方法及び組成物は、核受容体活性を調節するペプチド、ペプチド擬似体又は小
さい天然又は合成の有機分子を同定するために有用である。前記化合物は核受容
体を基にした障害の治療において有用である。本発明の方法及び組成物はまた、
天然及び合成のリガンドの構造／機能の関係を特徴づけることにおける使用を見
出す。
の方法及び組成物は、核受容体活性を調節するペプチド、ペプチド擬似体又は小
さい天然又は合成の有機分子を同定するために有用である。前記化合物は核受容
体を基にした障害の治療において有用である。本発明の方法及び組成物はまた、
天然及び合成のリガンドの構造／機能の関係を特徴づけることにおける使用を見
出す。
【００８０】 以下の考察は、得られた結果及び／又は達した結論に沿って、実施例のための
基本の理解を提供する。 上述した様に、多くのコアクチベーターは核受容体ＬＢＤに結合した作用薬を
、配列ＬＸＸＬＬ（配列番号１）を通して認識し、ここでＬはロイシンであり、
Ｘはいずれかのアミノ酸（ＮＲボックス）である。ＤＥＳ−ｈＥＲαＬＢＤ−Ｇ
ＲＩＰ１ペプチド複合体の構造は、ＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号１）が、前記
受容体の表面上の高度に相補的な疎水性の溝によって認識される、短かい両親媒
性のαヘリックスのコアを形成することを明らかにした。他の変異及び構造の研
究の結論と一致して（Brzozowski, et al., supra及び Feng, et al., supra)、
ヘリックス３，４，５及び１２に由来する残基によって形成される、このペプチ
ドが結合する溝、並びにヘリックス３及び４の間のターンは転写活性、すなわち
コアクチベーター結合部位に関連するＥＲαの表面にある。更に、ＴＲβとＧＲ
ＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドとの間の複合体の構造的な研究並びにＴＲβ及
びＧＲに結合するＧＲＩＰ１の生化学的研究（Darimont, et al., supra)並びに
ＰＰＡＲγ／ＳＲＣ−１ペプチド複合体の一般的構成の研究（Nolte, et al., s
upra) は、本明細書に記載のＥＲα／ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合
体のそれと同様であり、このことはＮＲボックスの認識機構が、前記の核受容体
ファミリーを通して保存されていることを示している。
基本の理解を提供する。 上述した様に、多くのコアクチベーターは核受容体ＬＢＤに結合した作用薬を
、配列ＬＸＸＬＬ（配列番号１）を通して認識し、ここでＬはロイシンであり、
Ｘはいずれかのアミノ酸（ＮＲボックス）である。ＤＥＳ−ｈＥＲαＬＢＤ−Ｇ
ＲＩＰ１ペプチド複合体の構造は、ＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号１）が、前記
受容体の表面上の高度に相補的な疎水性の溝によって認識される、短かい両親媒
性のαヘリックスのコアを形成することを明らかにした。他の変異及び構造の研
究の結論と一致して（Brzozowski, et al., supra及び Feng, et al., supra)、
ヘリックス３，４，５及び１２に由来する残基によって形成される、このペプチ
ドが結合する溝、並びにヘリックス３及び４の間のターンは転写活性、すなわち
コアクチベーター結合部位に関連するＥＲαの表面にある。更に、ＴＲβとＧＲ
ＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドとの間の複合体の構造的な研究並びにＴＲβ及
びＧＲに結合するＧＲＩＰ１の生化学的研究（Darimont, et al., supra)並びに
ＰＰＡＲγ／ＳＲＣ−１ペプチド複合体の一般的構成の研究（Nolte, et al., s
upra) は、本明細書に記載のＥＲα／ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合
体のそれと同様であり、このことはＮＲボックスの認識機構が、前記の核受容体
ファミリーを通して保存されていることを示している。
【００８１】 前記コアクチベーターのヘリックス（図３Ａ）と相互作用する１１個のＡＦ−
２の残基の側鎖のうち、４個（Ｌｙｓ３６２，Ｌｅｕ３７９，Ｇｌｎ３７５及び
Ｇｌｕ５４２）のみが、前記核受容体のファミリーを通して高度に保存されてい
る（Wurtz, et al., supra)。 Ｇｌｎ３７５及びＬｅｕ３７９の側鎖は、ＧＲＩ
Ｐ１が結合していないときでさえも支配的に埋もれており、そして転写活性に関
与する表面上の構造の不可欠な部分を形成しているようである。対照的に、ｌｙ
ｓ３６２及びＧｌｕ５４２の側鎖は、コアクチベーターの不在において大きく溶
媒にさらされており、そしてコアクチベーターのヘリックスと、無極性の相互作
用及び受容体のみが介在する極性の相互作用の両方を行う。これら２つのキャッ
ピング相互作用の残基は、好ましくはコアクチベーター結合部位の溝の反対側の
末端に位置し、これは前記コアクチベーターの主鎖の立体配座を安定化するため
だけでなく、分子のカリパスとして働くためであり；Ｌｙｓ３６２とＧｌｕ５４
２との間の１５Åの距離が、短かい２つのターンを有するコアクチベーターαの
ヘリックス（図３）の１１Åまでの軸の長さを区画するために非常に適している
。同様の受容体が介在するキャッピング相互作用もまた、ＴＲβＬＢＤとＮＲボ
ックスIIペプチドとの複合体において観察された（Darimont, et al., supra)。
これら２つの残基のいずれかの変異は、ＥＲα及びＴＲβによるコアクチベータ
ーの結合を激しく損わせる（実施例、Apriletti, et al., supra及びFeng, et a
l., supra及びHenttu, et al., supraを見よ）。故に、ヘリックスのキャッピン
グ相互作用の形成は、核受容体によるコアクチベーター認識の一般的な構成であ
りうる。
２の残基の側鎖のうち、４個（Ｌｙｓ３６２，Ｌｅｕ３７９，Ｇｌｎ３７５及び
Ｇｌｕ５４２）のみが、前記核受容体のファミリーを通して高度に保存されてい
る（Wurtz, et al., supra)。 Ｇｌｎ３７５及びＬｅｕ３７９の側鎖は、ＧＲＩ
Ｐ１が結合していないときでさえも支配的に埋もれており、そして転写活性に関
与する表面上の構造の不可欠な部分を形成しているようである。対照的に、ｌｙ
ｓ３６２及びＧｌｕ５４２の側鎖は、コアクチベーターの不在において大きく溶
媒にさらされており、そしてコアクチベーターのヘリックスと、無極性の相互作
用及び受容体のみが介在する極性の相互作用の両方を行う。これら２つのキャッ
ピング相互作用の残基は、好ましくはコアクチベーター結合部位の溝の反対側の
末端に位置し、これは前記コアクチベーターの主鎖の立体配座を安定化するため
だけでなく、分子のカリパスとして働くためであり；Ｌｙｓ３６２とＧｌｕ５４
２との間の１５Åの距離が、短かい２つのターンを有するコアクチベーターαの
ヘリックス（図３）の１１Åまでの軸の長さを区画するために非常に適している
。同様の受容体が介在するキャッピング相互作用もまた、ＴＲβＬＢＤとＮＲボ
ックスIIペプチドとの複合体において観察された（Darimont, et al., supra)。
これら２つの残基のいずれかの変異は、ＥＲα及びＴＲβによるコアクチベータ
ーの結合を激しく損わせる（実施例、Apriletti, et al., supra及びFeng, et a
l., supra及びHenttu, et al., supraを見よ）。故に、ヘリックスのキャッピン
グ相互作用の形成は、核受容体によるコアクチベーター認識の一般的な構成であ
りうる。
【００８２】 ６個の疎水性ＡＦ−２の残基（Ｉｌｅ３５８，Ｌｅｕ３７２，Ｖａｌ３７６，
Ｌｅｕ３７９，Ｌｅｕ５３９及びＭｅｔ５４３）の側鎖は、コアクチベーターの
ヘリックスの疎水性面を用いて前記受容体によって作られたファンデルワールス
接触の高度に協同的なネットワークの大部分を形成する（図３Ａ及び３Ｃ）。Ｉ
ｌｅ３５８，Ｖａｌ３７６及びＬｅｕ５３９における変異は、ＧＲＩＰ１の結合
を排除する（実施例及び Feng, et al., supraを見よ）。一般的に、これらの残
基はＬｙｓ３６２又はＧｌｕ５４２、そのどちらよりも、核受容体を通じてあま
り保存されていないが、それらの疎水性の特徴は、Ｌｅｕ３７２を除いて保存さ
れている。異なるＮＲのＬＢＤが同一の全体的な折りたたみを採用しているので
（Moras, et al., Curr. Opin. Cell Biol, 10 : 384-91 (1998))、 異なる核受
容体のコアクチベーターの結合部位の表面の疎水性領域が、別個に織り込まれて
いることがわかる。この仮定の支持において、結晶化に使用したＮＲボックスII
ペプチドは、非常に異なる効率でＥＲα、ＴＲβ及び糖質コルチコイド受容体（
ＧＲ）のＬＢＤに対するＧＲＩＰ１の結合を阻害した（Ding, et al., supra)。
Ｌｅｕ３７９，Ｌｅｕ５３９及びＭｅｔ５４３）の側鎖は、コアクチベーターの
ヘリックスの疎水性面を用いて前記受容体によって作られたファンデルワールス
接触の高度に協同的なネットワークの大部分を形成する（図３Ａ及び３Ｃ）。Ｉ
ｌｅ３５８，Ｖａｌ３７６及びＬｅｕ５３９における変異は、ＧＲＩＰ１の結合
を排除する（実施例及び Feng, et al., supraを見よ）。一般的に、これらの残
基はＬｙｓ３６２又はＧｌｕ５４２、そのどちらよりも、核受容体を通じてあま
り保存されていないが、それらの疎水性の特徴は、Ｌｅｕ３７２を除いて保存さ
れている。異なるＮＲのＬＢＤが同一の全体的な折りたたみを採用しているので
（Moras, et al., Curr. Opin. Cell Biol, 10 : 384-91 (1998))、 異なる核受
容体のコアクチベーターの結合部位の表面の疎水性領域が、別個に織り込まれて
いることがわかる。この仮定の支持において、結晶化に使用したＮＲボックスII
ペプチドは、非常に異なる効率でＥＲα、ＴＲβ及び糖質コルチコイド受容体（
ＧＲ）のＬＢＤに対するＧＲＩＰ１の結合を阻害した（Ding, et al., supra)。
【００８３】 ＮＲボックスのヘリックスの疎水性面は、３つのモチーフのロイシン及び前記
モチーフに先行するイソロイシン（Ｉｌｅ６８９）の側鎖によって形成される。
受容体の結合における保存されているロイシンの機能的な重要性が、多くのｉｎ
ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの研究によって証明されてきた。対照的に、受
容体の結合における前記モチーフの前の残基の役割はほとんど特徴づけられてこ
なかった。生化学的及び構造的、その両方のデータは、Ｉｌｅ６８９が受容体の
結合の決定子の鍵として関係していることを示している。結晶において、前記モ
チーフのロイシン及びＩｌｅ６８９の側鎖のみが、両者の非結晶性の対称に関係
しているペプチドのＬＢＤと広範囲にわたり接触している。アラニンへのＩｌｅ
６８９の変異は前記ペプチドの能力を減少させ、競合的なアッセイにおいて、Ｅ
ＲαへのＧＲＩＰ１の結合を３０倍まで阻害する（データは示さない）。Ｉｌｅ
６８９の側鎖は、どちらかと言えば化学的に異なる環境にあり：この残基は、Ａ
ｓｐ５３８の側鎖、Ｌｅｕ５３９の側鎖及びＧｌｕ５４２のγ−カルボン酸の脂
肪性の部分とのファンデルワールス接触を形成する（図７Ａ及び３Ａ）。この負
に荷電したＧｌｕ５４２の部分のＩｌｅ６８９の疎水性の側鎖への近接は、前記
の側鎖のカルボン酸の静電ポテンシャルを増強し、そして前記コアクチベーター
のヘリックスのＮ末端との、その安定化する相互作用を強化する。受容体の認識
における、その明らかに重要な役割にもかかわらず、知られているＮＲボックス
のすぐ前に位置している残基の同一性はほとんど保存されていない。この配列の
変異性は、ＥＲαとのパッキングの相互作用だけでなく、Ｇｌｕ５４２の化学的
な環境及び決定的に重要な配向、その両方に対しても作用を有するはずである。
次に、このことは前記受容体の親和性における変化に現れるはずである。事実、
ＧＲＩＰ１由来の３つのＮＲボックスは、それぞれがＬＸＸＬＬモチーフ（配列
番号１）の前に異なる残基を含み、ＥＲαに対する異なる親和性を有する（Ding
, et al., supra, Voegel, et al., EMBO J. 17 : 507-19 (1998))。
モチーフに先行するイソロイシン（Ｉｌｅ６８９）の側鎖によって形成される。
受容体の結合における保存されているロイシンの機能的な重要性が、多くのｉｎ
ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの研究によって証明されてきた。対照的に、受
容体の結合における前記モチーフの前の残基の役割はほとんど特徴づけられてこ
なかった。生化学的及び構造的、その両方のデータは、Ｉｌｅ６８９が受容体の
結合の決定子の鍵として関係していることを示している。結晶において、前記モ
チーフのロイシン及びＩｌｅ６８９の側鎖のみが、両者の非結晶性の対称に関係
しているペプチドのＬＢＤと広範囲にわたり接触している。アラニンへのＩｌｅ
６８９の変異は前記ペプチドの能力を減少させ、競合的なアッセイにおいて、Ｅ
ＲαへのＧＲＩＰ１の結合を３０倍まで阻害する（データは示さない）。Ｉｌｅ
６８９の側鎖は、どちらかと言えば化学的に異なる環境にあり：この残基は、Ａ
ｓｐ５３８の側鎖、Ｌｅｕ５３９の側鎖及びＧｌｕ５４２のγ−カルボン酸の脂
肪性の部分とのファンデルワールス接触を形成する（図７Ａ及び３Ａ）。この負
に荷電したＧｌｕ５４２の部分のＩｌｅ６８９の疎水性の側鎖への近接は、前記
の側鎖のカルボン酸の静電ポテンシャルを増強し、そして前記コアクチベーター
のヘリックスのＮ末端との、その安定化する相互作用を強化する。受容体の認識
における、その明らかに重要な役割にもかかわらず、知られているＮＲボックス
のすぐ前に位置している残基の同一性はほとんど保存されていない。この配列の
変異性は、ＥＲαとのパッキングの相互作用だけでなく、Ｇｌｕ５４２の化学的
な環境及び決定的に重要な配向、その両方に対しても作用を有するはずである。
次に、このことは前記受容体の親和性における変化に現れるはずである。事実、
ＧＲＩＰ１由来の３つのＮＲボックスは、それぞれがＬＸＸＬＬモチーフ（配列
番号１）の前に異なる残基を含み、ＥＲαに対する異なる親和性を有する（Ding
, et al., supra, Voegel, et al., EMBO J. 17 : 507-19 (1998))。
【００８４】 ＴＩＦ２のＮＲボックス、ＧＲＩＰ１のヒトの相同体は、受容体結合親和性に
おける、それらの個々の差異にもかかわらず、部分的に、機能的に重複している
ことが見出された。ＴＩＦ２のＮＲボックスの３つ全てを変異させ、ＥＲαとの
相互作用を完全に排除させる必要がある（Voegel, et al., EMBO J. 17 : 507-1
9 (1998))。我々のデータは、単一のＮＲボックスのペプチドが、単一のＥＲα
のＬＢＤと隙間のない複合体を形成するのに十分であることを示している。更に
、ｐ１６０のコアクチベーターは複数のＮＲボックスを有している。複数のＮＲ
ボックスの存在のための可能な説明は、それらが幅広い特異性を有するコアクチ
ベーターを提供するということである。受容体の結合は、複数のファンデルワー
ルス相互作用の複雑な形成に依存し、更に様々な核受容体は異なるコアクチベー
ター結合部位の表面を有するようである。前記ＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号１
）のすぐ前に位置する異なるアミノ酸は、これらの異なる表面にいくらかの適応
性の程度を与えるが；全ての核受容体に効率的に結合することができるＮＲボッ
クス配列は存在していないようである。故に、複数のＮＲボックスが、様々な標
的を認識するのに必要な界面の多様性を、コアクチベーターに提供しているよう
である。
おける、それらの個々の差異にもかかわらず、部分的に、機能的に重複している
ことが見出された。ＴＩＦ２のＮＲボックスの３つ全てを変異させ、ＥＲαとの
相互作用を完全に排除させる必要がある（Voegel, et al., EMBO J. 17 : 507-1
9 (1998))。我々のデータは、単一のＮＲボックスのペプチドが、単一のＥＲα
のＬＢＤと隙間のない複合体を形成するのに十分であることを示している。更に
、ｐ１６０のコアクチベーターは複数のＮＲボックスを有している。複数のＮＲ
ボックスの存在のための可能な説明は、それらが幅広い特異性を有するコアクチ
ベーターを提供するということである。受容体の結合は、複数のファンデルワー
ルス相互作用の複雑な形成に依存し、更に様々な核受容体は異なるコアクチベー
ター結合部位の表面を有するようである。前記ＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号１
）のすぐ前に位置する異なるアミノ酸は、これらの異なる表面にいくらかの適応
性の程度を与えるが；全ての核受容体に効率的に結合することができるＮＲボッ
クス配列は存在していないようである。故に、複数のＮＲボックスが、様々な標
的を認識するのに必要な界面の多様性を、コアクチベーターに提供しているよう
である。
【００８５】 ＥＲαの転写活性は、拮抗薬、例えばＯＨＴ及びＲＡＬによって妨害される。
ＥＲαのＬＢＤに配位したＯＨＴ及びＲＡＬの構造の最も著しい特徴は、ヘリッ
クス１２がコアクチベーターの認識の溝の静止領域に結合することである（図３
Ｂ及びBrzozowski, et al., supra)。コアクチベーター／ＬＢＤ複合体の構造と
の、これら２つの構造の比較は、前記拮抗薬の複合体における、ＮＲボックス様
配列（ＬＸＸＭＬ対ＬＸＸＬＬ）（配列番号２対配列番号１）を有するヘリック
ス１２の領域が、前記コアクチベーターのヘリックスの分子内擬似体として働く
ことを明らかにしている（図５及びBrzozowski, et al., supra)。他の案（Broz
ozowski, et al., supra及びDarimont, et al., supra)と一致して、ヘリックス
１２のこの性質は、２通りの方法で転写活性の原因である、前記表面の構造及び
機能に直接影響する。第１に、ヘリックス１２の残基がコアクチベーターの結合
部位の表面の不可欠な部分を形成するので、ヘリックス１２が拮抗薬結合立体配
座内に存在するときに、前記表面は不完全である。特にＬｅｕ５３９，Ｇｌｕ５
４２及びＭｅｔ５４３はコアクチベーター認識にとって不正確な配向である。第
２に、この表面の静止領域由来の残基はヘリックス１２に結合し、そしてコアク
チベーターとの相互作用を妨害されている（図３Ａ及び３Ｂ）。
ＥＲαのＬＢＤに配位したＯＨＴ及びＲＡＬの構造の最も著しい特徴は、ヘリッ
クス１２がコアクチベーターの認識の溝の静止領域に結合することである（図３
Ｂ及びBrzozowski, et al., supra)。コアクチベーター／ＬＢＤ複合体の構造と
の、これら２つの構造の比較は、前記拮抗薬の複合体における、ＮＲボックス様
配列（ＬＸＸＭＬ対ＬＸＸＬＬ）（配列番号２対配列番号１）を有するヘリック
ス１２の領域が、前記コアクチベーターのヘリックスの分子内擬似体として働く
ことを明らかにしている（図５及びBrzozowski, et al., supra)。他の案（Broz
ozowski, et al., supra及びDarimont, et al., supra)と一致して、ヘリックス
１２のこの性質は、２通りの方法で転写活性の原因である、前記表面の構造及び
機能に直接影響する。第１に、ヘリックス１２の残基がコアクチベーターの結合
部位の表面の不可欠な部分を形成するので、ヘリックス１２が拮抗薬結合立体配
座内に存在するときに、前記表面は不完全である。特にＬｅｕ５３９，Ｇｌｕ５
４２及びＭｅｔ５４３はコアクチベーター認識にとって不正確な配向である。第
２に、この表面の静止領域由来の残基はヘリックス１２に結合し、そしてコアク
チベーターとの相互作用を妨害されている（図３Ａ及び３Ｂ）。
【００８６】 前記ＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号１）に対するＥＲαＬＢＤのヘリックス１
２の類似性は、核受容体間で独特の様である。他の核受容体におけるヘリックス
１２の、この領域の残基の同一性は、性質が一般に疎水性であるが、ＥＲαのも
のとＮＲボックスの配列とではほとんど類似していない（Wurtz, et al., supra
)。 しかしながら、最適に次ぐ状態の認識を有する分子内阻害剤が、その極度に
高い局所的濃度が与えられたコアクチベーターの結合と競合することは可能であ
る。
２の類似性は、核受容体間で独特の様である。他の核受容体におけるヘリックス
１２の、この領域の残基の同一性は、性質が一般に疎水性であるが、ＥＲαのも
のとＮＲボックスの配列とではほとんど類似していない（Wurtz, et al., supra
)。 しかしながら、最適に次ぐ状態の認識を有する分子内阻害剤が、その極度に
高い局所的濃度が与えられたコアクチベーターの結合と競合することは可能であ
る。
【００８７】 ＥＲαに対するＯＨＴの結合は、ヘリックス１２の立体配座がコアクチベータ
ーの結合を阻害するよう促進する。ＯＨＴは、ヘリックス１２のいずれの残基と
も直接的に相互作用しない（図４Ｂ）。更に、ＯＨＴ複合体のヘリックス１２と
相互作用するコアクチベーター結合部位の溝の領域におけるＬＢＤの構造は、Ｄ
ＥＳ及びＥ2の複合体と同一である（図３Ａ，３Ｂ及び５）。
ーの結合を阻害するよう促進する。ＯＨＴは、ヘリックス１２のいずれの残基と
も直接的に相互作用しない（図４Ｂ）。更に、ＯＨＴ複合体のヘリックス１２と
相互作用するコアクチベーター結合部位の溝の領域におけるＬＢＤの構造は、Ｄ
ＥＳ及びＥ2の複合体と同一である（図３Ａ，３Ｂ及び５）。
【００８８】 多くの研究が受容体の拮抗性におけるＯＨＴの側鎖の重要性を証明してきた（
Jordan, et al., supra及びRobertson, et al., J. Med. Chem. 25 : 167-71 (1
982))。 ＯＨＴ及びＤＥＳの複合体の構造の比較は、ＯＨＴの側鎖の結合形態が
、ヘリックス１２の作用薬誘導の立体配座を妨害することを明らかにした。ＯＨ
Ｔの側鎖はヘリックス３と１１の間のリガンド結合ポケットの外に突き出ている
（図２Ｂ，６Ｂ及び６Ｃ）。その結果、前記のリガンド結合ポケットの外のヘリ
ックス１２の配置は、それが作用薬結合立体配座内にあるとき、ＯＨＴの側鎖の
正に荷電したジメチルアミノ基を、疎水性の穴に埋め込み、そして側鎖のジメチ
ルアミノエチル領域とＬｅｕ５４０の側鎖との間の静的な衝突を生む。
Jordan, et al., supra及びRobertson, et al., J. Med. Chem. 25 : 167-71 (1
982))。 ＯＨＴ及びＤＥＳの複合体の構造の比較は、ＯＨＴの側鎖の結合形態が
、ヘリックス１２の作用薬誘導の立体配座を妨害することを明らかにした。ＯＨ
Ｔの側鎖はヘリックス３と１１の間のリガンド結合ポケットの外に突き出ている
（図２Ｂ，６Ｂ及び６Ｃ）。その結果、前記のリガンド結合ポケットの外のヘリ
ックス１２の配置は、それが作用薬結合立体配座内にあるとき、ＯＨＴの側鎖の
正に荷電したジメチルアミノ基を、疎水性の穴に埋め込み、そして側鎖のジメチ
ルアミノエチル領域とＬｅｕ５４０の側鎖との間の静的な衝突を生む。
【００８９】 機能的な条件において、しかしながらＯＨＴは単なる“側鎖を有する作用薬”
ではない。ＯＨＴの結合は、ＤＥＳ又はＥ2のいずれかの結合によって安定化し
たものとは異なるＬＢＤの立体配座を促進する。これらの異なる立体配座は、ヘ
リックス１２の配置に異なる制限を課す。 ＤＥＳ及びＥ2の複合体におけるヘリックス３，８及び１１は、ＯＨＴ複合体
よりも１〜２ターン長い（図６Ａ及び Brzozowski, et al., supra)。ヘリック
ス１１は、ＤＥＳ及びＥ2の複合体においてＣｙｓ５３０で終わり、そしてＯＨ
Ｔ複合体において、それはＴｙｒ５２６で終わる。ヘリックス１２は、ＯＨＴ複
合体においてＬｅｕ５３６で始まる。これは必要なことと思われ；拮抗薬複合体
においてＬｅｕ５３６は非極性接触の協同的なネットワーク並びにヘリックス１
２のＮ末端を安定化するＧｌｕ３８０及びＴｙｒ５３７との水素結合を形成する
（図１Ｂ）。従って、ヘリックス１２が作用薬の存在下、コアクチベーター結合
部位の静電的領域と結合するならば、ヘリックス１１及び１２に連結するループ
は、５残基を超えて１７Åにまで及ぶ必要があるだろう。理論的に可能だが、こ
の立体配座は高度にひずんでおり、従って好ましくないであろう。対照的に、Ｏ
ＨＴ複合体のヘリックス１１及び１２に連結している、より長いループは、ヘリ
ックス１２をコアクチベーターが結合する溝の静電的領域まで伸長させる。
ではない。ＯＨＴの結合は、ＤＥＳ又はＥ2のいずれかの結合によって安定化し
たものとは異なるＬＢＤの立体配座を促進する。これらの異なる立体配座は、ヘ
リックス１２の配置に異なる制限を課す。 ＤＥＳ及びＥ2の複合体におけるヘリックス３，８及び１１は、ＯＨＴ複合体
よりも１〜２ターン長い（図６Ａ及び Brzozowski, et al., supra)。ヘリック
ス１１は、ＤＥＳ及びＥ2の複合体においてＣｙｓ５３０で終わり、そしてＯＨ
Ｔ複合体において、それはＴｙｒ５２６で終わる。ヘリックス１２は、ＯＨＴ複
合体においてＬｅｕ５３６で始まる。これは必要なことと思われ；拮抗薬複合体
においてＬｅｕ５３６は非極性接触の協同的なネットワーク並びにヘリックス１
２のＮ末端を安定化するＧｌｕ３８０及びＴｙｒ５３７との水素結合を形成する
（図１Ｂ）。従って、ヘリックス１２が作用薬の存在下、コアクチベーター結合
部位の静電的領域と結合するならば、ヘリックス１１及び１２に連結するループ
は、５残基を超えて１７Åにまで及ぶ必要があるだろう。理論的に可能だが、こ
の立体配座は高度にひずんでおり、従って好ましくないであろう。対照的に、Ｏ
ＨＴ複合体のヘリックス１１及び１２に連結している、より長いループは、ヘリ
ックス１２をコアクチベーターが結合する溝の静電的領域まで伸長させる。
【００９０】 ＤＥＳ及びＥ2の複合体において、ヘリックス１２並びにヘリックス１１と１
２に連結しているループは、ヘリックス３及び１１に接してまとまるが、一方Ｏ
ＨＴ複合体においてはまとまらない（図２Ａ及び２Ｂ並びにBrzozowsk, et al.,
supra)。最近記述されたＥ2−ＬＢＤ複合体の構造は、ＤＥＳ及びＥ2の複合体
における、より長いヘリックスが作用薬結合の立体配座におけるヘリックス１２
が形成する相互作用に依存していないことを示している（Tanenbaum, et al., s
upra)。 この構造において、結晶をパックする人工物は、ヘリックス１２を対称
的に符号する分子と接触させる。ヘリックス１２はこの構造のリガンド結合ポケ
ットの外に、明らかに位置していない。それにもかかわらず、ヘリックス３，８
及び１１は、ＯＨＴ複合体のものより長い（図６Ａ）。故に、前記作用薬複合体
のより長いヘリックスは、リガンド結合ポケットの外のヘリックス１２の配置か
ら独立して起こり、そしてその代わりとして作用薬結合の直接的な結果がある。
２に連結しているループは、ヘリックス３及び１１に接してまとまるが、一方Ｏ
ＨＴ複合体においてはまとまらない（図２Ａ及び２Ｂ並びにBrzozowsk, et al.,
supra)。最近記述されたＥ2−ＬＢＤ複合体の構造は、ＤＥＳ及びＥ2の複合体
における、より長いヘリックスが作用薬結合の立体配座におけるヘリックス１２
が形成する相互作用に依存していないことを示している（Tanenbaum, et al., s
upra)。 この構造において、結晶をパックする人工物は、ヘリックス１２を対称
的に符号する分子と接触させる。ヘリックス１２はこの構造のリガンド結合ポケ
ットの外に、明らかに位置していない。それにもかかわらず、ヘリックス３，８
及び１１は、ＯＨＴ複合体のものより長い（図６Ａ）。故に、前記作用薬複合体
のより長いヘリックスは、リガンド結合ポケットの外のヘリックス１２の配置か
ら独立して起こり、そしてその代わりとして作用薬結合の直接的な結果がある。
【００９１】 前記作用薬複合体とＯＨＴ複合体との二次構造の差異は、異なるリガンドによ
って誘導されるパッキングの相互作用の異なる配置から生じる。ヘリックス３，
７，８及び１１並びにβヘアピン由来の様々な疎水性残基間の、ＤＥＳ又はＥ2
の周囲に組織されたファンデルワールス接触の協同的なネットワークは、前記作
用薬複合体のより長いヘリックスを安定化するようである（図４Ａ及び６Ｄ）。
ＯＨＴのＢ環の配置は、それを囲むリガンド結合ポケットの残基の多くに、それ
らがＤＥＳ又はＥ2のいずれかの構造において採用するものと劇的に異なる立体
配座を採用させる。その結果、ＤＥＳ及びＥ2構造に存在する、残基間のパッキ
ング相互作用の多くは、ＯＨＴ構造において存在しないか又は変化するかのいず
れかである（図６Ｄ）。これらの構造的なゆがみは、残基３３９〜３４１，４２
１〜４２３、及び５２７〜５３０（これらは前記の作用薬の構造において、それ
ぞれヘリックス３，８及び１１の一部を形成する）由来の主鎖に、ＯＨＴ構造に
おいて伸長した立体配座を採用させるようである（図６Ａ〜Ｄ）。
って誘導されるパッキングの相互作用の異なる配置から生じる。ヘリックス３，
７，８及び１１並びにβヘアピン由来の様々な疎水性残基間の、ＤＥＳ又はＥ2
の周囲に組織されたファンデルワールス接触の協同的なネットワークは、前記作
用薬複合体のより長いヘリックスを安定化するようである（図４Ａ及び６Ｄ）。
ＯＨＴのＢ環の配置は、それを囲むリガンド結合ポケットの残基の多くに、それ
らがＤＥＳ又はＥ2のいずれかの構造において採用するものと劇的に異なる立体
配座を採用させる。その結果、ＤＥＳ及びＥ2構造に存在する、残基間のパッキ
ング相互作用の多くは、ＯＨＴ構造において存在しないか又は変化するかのいず
れかである（図６Ｄ）。これらの構造的なゆがみは、残基３３９〜３４１，４２
１〜４２３、及び５２７〜５３０（これらは前記の作用薬の構造において、それ
ぞれヘリックス３，８及び１１の一部を形成する）由来の主鎖に、ＯＨＴ構造に
おいて伸長した立体配座を採用させるようである（図６Ａ〜Ｄ）。
【００９２】 従って、ＯＨＴの結合は、ヘリックス１２の配置に対する２つの異なる作用を
有し、このいずれかが拮抗性に寄与している（図７）。ヘリックス１２は、ＯＨ
Ｔの側鎖によってリガンド結合ポケットの外に位置することを妨害されている。
更に、ＯＨＴの周辺のリガンド結合ポケットの残基の別のパッキングの配置は、
ＬＢＤの立体配座を安定化し、ヘリックス１２をコアクチベーター結合部位及び
擬似体が結合したコアクチベーターの静電的領域に到達させる。
有し、このいずれかが拮抗性に寄与している（図７）。ヘリックス１２は、ＯＨ
Ｔの側鎖によってリガンド結合ポケットの外に位置することを妨害されている。
更に、ＯＨＴの周辺のリガンド結合ポケットの残基の別のパッキングの配置は、
ＬＢＤの立体配座を安定化し、ヘリックス１２をコアクチベーター結合部位及び
擬似体が結合したコアクチベーターの静電的領域に到達させる。
【００９３】 これらの機構はＯＨＴに特異的ではないようである。ＲＡＬの側鎖は、ＯＨＴ
のそれと似ており、ヘリックス１２の作用薬結合立体配座を立体的に妨害する（
Brzozowski, et al., supra)。更に、ヘリックス１１は、ＲＡＬ複合体において
Ｍｅｔ５２８で終わるようである。これは、ＲＡＬの結合によって管理されるＨ
ｉｓ５２４の近接の結合ポケットにおけるひずみから生じるのであろう（Brzozo
wski, et al., supra)。
のそれと似ており、ヘリックス１２の作用薬結合立体配座を立体的に妨害する（
Brzozowski, et al., supra)。更に、ヘリックス１１は、ＲＡＬ複合体において
Ｍｅｔ５２８で終わるようである。これは、ＲＡＬの結合によって管理されるＨ
ｉｓ５２４の近接の結合ポケットにおけるひずみから生じるのであろう（Brzozo
wski, et al., supra)。
【００９４】 これらの結果は、以下の例において提供される実験データによって支持され、
これはこの発明の様々な観点を例示することを意図している。これらの例はこの
発明の範囲を制限しない。例 例１実験手順 タンパク質の発現及び精製 ヒトＥＲα−ＬＢＤ２９７−５５４を、ｈＥＲα（イェール大学のＰａｕｌ
Ｓｉｇｌｅｒ提供）の残基２９７〜５５４に融合した配列Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏを含む、改良ｐＥＴ−２３ｄ−ＥＲＧベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳ細胞において、既に記載された様に過剰発現させた（Seielstad,
et al., Mol. Endocrinol. 9 : 647-658 (1995))。 不純物を除いた細菌のライ
ゼートを、３Ｍ尿素及び０．７Ｍ ＮａＣｌに合わせ、そして次にエストラジオ
ールセファロースの１０mlカラムにかけた（Greene, et al., Proc. Natl. Acad
, Sci. USA 77 : 5115-5119 (1980) ; Landel, et al., Mol. Endocrinol. 8 :
1407-1419 (1994) ; Landel, et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 63 :
59-73 (1997)。
これはこの発明の様々な観点を例示することを意図している。これらの例はこの
発明の範囲を制限しない。例 例１実験手順 タンパク質の発現及び精製 ヒトＥＲα−ＬＢＤ２９７−５５４を、ｈＥＲα（イェール大学のＰａｕｌ
Ｓｉｇｌｅｒ提供）の残基２９７〜５５４に融合した配列Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏを含む、改良ｐＥＴ−２３ｄ−ＥＲＧベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ
３）ｐＬｙｓＳ細胞において、既に記載された様に過剰発現させた（Seielstad,
et al., Mol. Endocrinol. 9 : 647-658 (1995))。 不純物を除いた細菌のライ
ゼートを、３Ｍ尿素及び０．７Ｍ ＮａＣｌに合わせ、そして次にエストラジオ
ールセファロースの１０mlカラムにかけた（Greene, et al., Proc. Natl. Acad
, Sci. USA 77 : 5115-5119 (1980) ; Landel, et al., Mol. Endocrinol. 8 :
1407-1419 (1994) ; Landel, et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 63 :
59-73 (1997)。
【００９５】 溶媒に影響受けやすいシステインをカルボキシメチル化するために、結合ｈＥ
Ｒα−ＬＢＤを５mMヨード酢酸／１０mM Ｔｒｉｓ，pH８．１，２５０mM Ｎａ
ＳＣＮで処理した（Hegy, et al., Steroids 61 : 367-373 (1996)。タンパク質
を、３０〜１００mlの５０mM Ｔｒｉｓ，１mM ＥＤＴＡ，１mM ＤＤＴ及び２
５０mM ＮａＳＣＮ，pH８．５における１０〜５Ｍのリガンド（ＤＥＳ又はＯＨ
Ｔのいずれか）で３回溶出した。ｈＥＲα−ＬＢＤの収率は、典型的に１００％
に近い（Seielstad, et al., Biochemistry 34 : 12605-12615 (1995))。親和性
で精製した材料を限外濾過によって濃縮し、そしてpH８．１の２０mM Ｔｒｉｓ
，１mM ＥＤＴＡ，４mM ＤＴＴに交換した。前記タンパク質をＲｅｓｏｕｒｃ
ｅ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させ、そして次に２５〜３５０mM
ＮａＣｌ／２０mM Ｔｒｉｓ，pH８．１，１mM ＤＴＴの直線勾配で溶出した。
ｈＥＲα−ＬＢＤ−リガンド複合体を１５〜２００mM ＮａＣｌで溶出した。集
めた画分を限外濾過によって濃縮し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ネイティブＰＡ
ＧＥ、及び電子スプレーイオン化質量分析によって解析した。ＧＳＴ−プルダウンアッセイ グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とｈＥＲαのアミノ酸２８
２〜２９５との融合体を、ｐＳＧ５ ＥＲα−ＬＢＤ（Ｌｏｅｐｚ等により寄託
の原稿）由来のＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）にサブクローニングすることによって構築した。Ｉｌｅ３５８−＞Ａｒｇ，Ｌ
ｙｓ３６２−＞Ａｌａ、及びＬｅｕ５３９−＞Ａｒｇの変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃ
ｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、取扱い説明書に従い、Ｇ
ＳＴ−ＬＢＤコンストラクトに導入した。Ｖａｌ３７６−＞Ａｒｇ及びＧｌｕ５
４２−＞Ｌｙｓの変異を、既にこれらの変異を導入したものに、ｐＳＧ５−ＥＲ
−ＨＥＧＯ（Tora, et al., EMBO J. 8 : 1981-6 (1989))のＢｓｍＩ／Ｈｉｎｄ
III フラグメントをサブクローニングすることによってＧＳＴ−ＬＢＤコンスト
ラクト内に作製した。全コンストラクトを自動シークエンサーによって確認した
（University of Chicago Cancer Research Ceater DNA Sequencing Facility)
。
Ｒα−ＬＢＤを５mMヨード酢酸／１０mM Ｔｒｉｓ，pH８．１，２５０mM Ｎａ
ＳＣＮで処理した（Hegy, et al., Steroids 61 : 367-373 (1996)。タンパク質
を、３０〜１００mlの５０mM Ｔｒｉｓ，１mM ＥＤＴＡ，１mM ＤＤＴ及び２
５０mM ＮａＳＣＮ，pH８．５における１０〜５Ｍのリガンド（ＤＥＳ又はＯＨ
Ｔのいずれか）で３回溶出した。ｈＥＲα−ＬＢＤの収率は、典型的に１００％
に近い（Seielstad, et al., Biochemistry 34 : 12605-12615 (1995))。親和性
で精製した材料を限外濾過によって濃縮し、そしてpH８．１の２０mM Ｔｒｉｓ
，１mM ＥＤＴＡ，４mM ＤＴＴに交換した。前記タンパク質をＲｅｓｏｕｒｃ
ｅ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させ、そして次に２５〜３５０mM
ＮａＣｌ／２０mM Ｔｒｉｓ，pH８．１，１mM ＤＴＴの直線勾配で溶出した。
ｈＥＲα−ＬＢＤ−リガンド複合体を１５〜２００mM ＮａＣｌで溶出した。集
めた画分を限外濾過によって濃縮し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ネイティブＰＡ
ＧＥ、及び電子スプレーイオン化質量分析によって解析した。ＧＳＴ−プルダウンアッセイ グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とｈＥＲαのアミノ酸２８
２〜２９５との融合体を、ｐＳＧ５ ＥＲα−ＬＢＤ（Ｌｏｅｐｚ等により寄託
の原稿）由来のＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）にサブクローニングすることによって構築した。Ｉｌｅ３５８−＞Ａｒｇ，Ｌ
ｙｓ３６２−＞Ａｌａ、及びＬｅｕ５３９−＞Ａｒｇの変異を、Ｑｕｉｃｋ Ｃ
ｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、取扱い説明書に従い、Ｇ
ＳＴ−ＬＢＤコンストラクトに導入した。Ｖａｌ３７６−＞Ａｒｇ及びＧｌｕ５
４２−＞Ｌｙｓの変異を、既にこれらの変異を導入したものに、ｐＳＧ５−ＥＲ
−ＨＥＧＯ（Tora, et al., EMBO J. 8 : 1981-6 (1989))のＢｓｍＩ／Ｈｉｎｄ
III フラグメントをサブクローニングすることによってＧＳＴ−ＬＢＤコンスト
ラクト内に作製した。全コンストラクトを自動シークエンサーによって確認した
（University of Chicago Cancer Research Ceater DNA Sequencing Facility)
。
【００９６】 野生型及び変異体のＧＳＴ−ＬＢＤをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において発現さ
せた。全リガンド結合活性を、調節孔ガラスビーズアッセイ（Greene, et al., Mol. Endocrinol . 2 : 714-726 (1988))によって決定し、そしてタンパク質濃度
を、ｈＥＲαに対するモノクローナル抗体（Ｈ２２２）を用いたウェスタンブロ
ッティングによって測定した。ＧＳＴ−ＬＢＤを含む透き通った抽出物を、緩衝
液単独（５０mM Ｔｒｉｓ，pH７．４，１５０mM ＮａＣｌ，２mM ＥＤＴＡ，
１mM ＤＴＴ，０．５％ＮＰ−４０及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）又は１μ
ＭのＤＥＳ又はＯＨＴのいずれかと共に、４℃で１時間インキュベートした。次
に、３０pmolのＧＳＴ−ＬＢＤを含む抽出試料を、１０μｌのグルタチオンセフ
ァロース−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に、４℃で１時間インキュベ
ートした。ビーズを２０mM ＨＥＰＥＳ，pH７．４，４００mM ＮａＣｌ及び０
．０５％ＮＰ−４０で５回洗浄した。
せた。全リガンド結合活性を、調節孔ガラスビーズアッセイ（Greene, et al., Mol. Endocrinol . 2 : 714-726 (1988))によって決定し、そしてタンパク質濃度
を、ｈＥＲαに対するモノクローナル抗体（Ｈ２２２）を用いたウェスタンブロ
ッティングによって測定した。ＧＳＴ−ＬＢＤを含む透き通った抽出物を、緩衝
液単独（５０mM Ｔｒｉｓ，pH７．４，１５０mM ＮａＣｌ，２mM ＥＤＴＡ，
１mM ＤＴＴ，０．５％ＮＰ−４０及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）又は１μ
ＭのＤＥＳ又はＯＨＴのいずれかと共に、４℃で１時間インキュベートした。次
に、３０pmolのＧＳＴ−ＬＢＤを含む抽出試料を、１０μｌのグルタチオンセフ
ァロース−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に、４℃で１時間インキュベ
ートした。ビーズを２０mM ＨＥＰＥＳ，pH７．４，４００mM ＮａＣｌ及び０
．０５％ＮＰ−４０で５回洗浄した。
【００９７】 説明書に従い、ＴＮＴ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓ
ａｔｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び鋳型としてｐＳＧ５−ＧＲＩＰ１（南カ
リフォルニア大学のＭｉｃｈａｅｌ Ｓｔａｌｌｃｕｐ提供）を用いて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの転写及び翻訳によって35Ｓで標識したＧＲＩＰ１を合成した。固
定化したＧＳＴ−ＬＢＤを、３００μｌのトリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ）中に希釈
した粗製転写反応混合液の２．５μｌアリコートで、２．５時間インキュベート
した。０．０５％ＮＰ−４０を含むＴＢＳ中での５回の洗浄後、タンパク質を試
料緩衝液中で１０分間、ビーズを煮沸することによって溶出した。結合した35Ｓ
−ＧＲＩＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の蛍光光度法によって定量した。結晶化及びデータの収集 ＤＥＳ−ｈＥＲα ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体の結
晶を、懸滴蒸気拡散によって得た。結晶化の前に、ＤＥＳ−ｈＥＲαＬＢＤ（残
基２９７〜５５４）複合体を、２〜４倍以上のモル過剰のＧＲＩＰ１ ＮＲボッ
クスIIペプチド（配列番号４）と７〜１６時間インキュベートした。この溶液の
２μlを、２５〜２７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００，９０mM Ｔｒｉｓ（pH８．
７５〜９．０）及び１８０mM酢酸ナトリウムから成る保存緩衝液の等量の試料と
混合し、そして８００μl の保存緩衝液を含む穴で懸濁した。１９〜２１℃で、
４〜７日後、棒状結晶を得た。コアクチベーター複合体結晶は、セルディメンシ
ョンａ＝５４．０９，ｂ＝８２．２２，ｃ＝５８．０４及びβ＝１１１．３４で
空間群Ｐ２に存在する。ＤＥＳ−ＬＢＤコアクチベーターペプチドの２分子はそ
れぞれ、非対称単位を形成する。２００μｍ×４０μｍ×４０μｍの結晶を、２
５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００，１０％（ｗ／ｖ）エチレングリコール、１００
mM Ｔｒｉｓ（pH８．５）、２００mM酢酸ナトリウム及び１０μMペプチドを含
む凍結溶媒溶液に移し、そしてレーヨンループにおいて、−１７０℃のＮ2流中
で凍結させた。この結晶からの回析データを、１．０８Åの波長、ビームライン
７−１で、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＳＲＬ）の３００mm ＭＡＲイメージプレートを用い
て、−１７０℃で測定した。
ａｔｅシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び鋳型としてｐＳＧ５−ＧＲＩＰ１（南カ
リフォルニア大学のＭｉｃｈａｅｌ Ｓｔａｌｌｃｕｐ提供）を用いて、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの転写及び翻訳によって35Ｓで標識したＧＲＩＰ１を合成した。固
定化したＧＳＴ−ＬＢＤを、３００μｌのトリス緩衝塩溶液（ＴＢＳ）中に希釈
した粗製転写反応混合液の２．５μｌアリコートで、２．５時間インキュベート
した。０．０５％ＮＰ−４０を含むＴＢＳ中での５回の洗浄後、タンパク質を試
料緩衝液中で１０分間、ビーズを煮沸することによって溶出した。結合した35Ｓ
−ＧＲＩＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の蛍光光度法によって定量した。結晶化及びデータの収集 ＤＥＳ−ｈＥＲα ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体の結
晶を、懸滴蒸気拡散によって得た。結晶化の前に、ＤＥＳ−ｈＥＲαＬＢＤ（残
基２９７〜５５４）複合体を、２〜４倍以上のモル過剰のＧＲＩＰ１ ＮＲボッ
クスIIペプチド（配列番号４）と７〜１６時間インキュベートした。この溶液の
２μlを、２５〜２７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００，９０mM Ｔｒｉｓ（pH８．
７５〜９．０）及び１８０mM酢酸ナトリウムから成る保存緩衝液の等量の試料と
混合し、そして８００μl の保存緩衝液を含む穴で懸濁した。１９〜２１℃で、
４〜７日後、棒状結晶を得た。コアクチベーター複合体結晶は、セルディメンシ
ョンａ＝５４．０９，ｂ＝８２．２２，ｃ＝５８．０４及びβ＝１１１．３４で
空間群Ｐ２に存在する。ＤＥＳ−ＬＢＤコアクチベーターペプチドの２分子はそ
れぞれ、非対称単位を形成する。２００μｍ×４０μｍ×４０μｍの結晶を、２
５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００，１０％（ｗ／ｖ）エチレングリコール、１００
mM Ｔｒｉｓ（pH８．５）、２００mM酢酸ナトリウム及び１０μMペプチドを含
む凍結溶媒溶液に移し、そしてレーヨンループにおいて、−１７０℃のＮ2流中
で凍結させた。この結晶からの回析データを、１．０８Åの波長、ビームライン
７−１で、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＳＳＲＬ）の３００mm ＭＡＲイメージプレートを用い
て、−１７０℃で測定した。
【００９８】 ＯＨＴに複合したｈＥＲαＬＢＤの結晶を、懸滴蒸気拡散法によって得た。３
．９mg／mlのタンパク質リガンド複合体を含む溶液並びに９％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ
８０００，６％（ｗ／ｖ）エチレングリコール、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH６．７
）及び２００mM ＮａＣｌを含む保存溶液の等量アリコート（２μｌ）を混合し
、そして８００μｌの前記保存溶液中で懸濁した。六面の板状結晶が、２１〜２
３℃で、４〜７日後に形成した。結晶のサイズ及び質の両方が、マイクロシーデ
ィング（ｍｉｃｒｏ ｓｅｅｄｉｎｇ）技術によって向上した。これらの結晶は
、セルパラメーター、ａ＝ｂ＝５８．２４Å及びｃ＝２７７．４７Åで、空間群
Ｐ６5２２に属する。前記の非対称単位は、単一のＬＢＤ単量体から成り；２量
体の軸は、結晶学的な２つの折りたたみに沿って存在している。単一の結晶（４
００μｍ×２５０μｍ×４０μｍ）を、１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００，２５
％（ｗ／ｖ）エチレングリコール、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．０）及び２００
mM ＮａＣｌから成る凍結保護溶液中で簡単にインキュベートし、そして次にレ
ーヨンループに懸濁した液体窒素中で凍結した。回析データを、０．９８Åの波
長、ビームライン９−１で、ＳＳＲＬの３４５mm ＭＡＲイメージプレートを用
いて、−１７０℃で測定した。
．９mg／mlのタンパク質リガンド複合体を含む溶液並びに９％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ
８０００，６％（ｗ／ｖ）エチレングリコール、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH６．７
）及び２００mM ＮａＣｌを含む保存溶液の等量アリコート（２μｌ）を混合し
、そして８００μｌの前記保存溶液中で懸濁した。六面の板状結晶が、２１〜２
３℃で、４〜７日後に形成した。結晶のサイズ及び質の両方が、マイクロシーデ
ィング（ｍｉｃｒｏ ｓｅｅｄｉｎｇ）技術によって向上した。これらの結晶は
、セルパラメーター、ａ＝ｂ＝５８．２４Å及びｃ＝２７７．４７Åで、空間群
Ｐ６5２２に属する。前記の非対称単位は、単一のＬＢＤ単量体から成り；２量
体の軸は、結晶学的な２つの折りたたみに沿って存在している。単一の結晶（４
００μｍ×２５０μｍ×４０μｍ）を、１０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００，２５
％（ｗ／ｖ）エチレングリコール、５０mM ＨＥＰＥＳ（pH７．０）及び２００
mM ＮａＣｌから成る凍結保護溶液中で簡単にインキュベートし、そして次にレ
ーヨンループに懸濁した液体窒素中で凍結した。回析データを、０．９８Åの波
長、ビームライン９−１で、ＳＳＲＬの３４５mm ＭＡＲイメージプレートを用
いて、−１７０℃で測定した。
【００９９】 両方のデータ集合のイメージを、ＤＥＮＺＯを用いて処理し、デフォルト−３
σカットオフを用いてＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Otwinowski, et al., Methods Enzy
mol. 276 : 307-326 (1997))によって評価した。構造の決定及び精密化 ＤＥＳ−ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの構造を決定するため
の最初の試みは、低分解能（３．１Å）のデータ集合を利用した（データは示さ
ない）。ＰＯＬＡＲＲＦＮ（“Ｔｈｅ ＣＣＰ４スイート：タンパク質結晶学の
ためのプログラム”，Acta Crystallogr. D50 : 760-763 (1994)) によって行わ
れたセルフローテーションサーチは、非結晶性の２個群の存在を示した。非対称
における２つのＬＢＤは、サーチプローブとして、ヒトＲＡＲγＬＢＤ（Renaud
, et al., supra)の部分的アラニンモデルを用いて、ＡＭｏＲｅ（ＣＣＰ４，１
９９４）の分子置換によって位置づけられた（両単量体の配置後、Ｒ＝５８．２
％、ＣＣ＝３５．６％）。この時点で前記与えられたものは、不正確（Ｃα位に
基づく、このモデルと最後のモデルとの間 r.m.s.dは１．７Å）及び不完全（非
対称単位における全散乱物質のわずか４５％までを計算）、その両方であり、攻
撃的な密度修飾が行われなかった。ＤＭにおいて平均化する２つの折りたたみＮ
ＣＳの反復サイクルをＭＯＬＯＣ（Muller, et al., Bull. Soc. Chim. Belg. 9
7 : 655-667 (1988))におけるモデル構築に散在させ、ＲＥＦＭＡＣ（Murshudov
, et al., Acta Crystallogr. D53 : 240-255 (1997))のモデル精密化（厳密な
ＮＣＳの制限を用いる）を、ＬＢＤ単独のモデルを素速く構築するために使用し
た。この手法のために、ＭＡＭＡ（Kleywegt, et al., “Halloween ……masks
and bones. In From First Mapto Final Model”，Bailey, et al., eds., Warr
ington, England, SERC Daresbury Laboratory, 1994)を、全てのマスク操作の
ために使用し、そしてＰＨＡＳＥＳ（Furey, et al., PA33 Am. Cryst. Assoc.
Mtg. Abstr. 18 : 73 (1990)) 及びＣＣＰ４スイート（ＣＣＰ４，１９９４）を
、構造因子の産生及び重さの計算のために使用した。
σカットオフを用いてＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Otwinowski, et al., Methods Enzy
mol. 276 : 307-326 (1997))によって評価した。構造の決定及び精密化 ＤＥＳ−ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの構造を決定するため
の最初の試みは、低分解能（３．１Å）のデータ集合を利用した（データは示さ
ない）。ＰＯＬＡＲＲＦＮ（“Ｔｈｅ ＣＣＰ４スイート：タンパク質結晶学の
ためのプログラム”，Acta Crystallogr. D50 : 760-763 (1994)) によって行わ
れたセルフローテーションサーチは、非結晶性の２個群の存在を示した。非対称
における２つのＬＢＤは、サーチプローブとして、ヒトＲＡＲγＬＢＤ（Renaud
, et al., supra)の部分的アラニンモデルを用いて、ＡＭｏＲｅ（ＣＣＰ４，１
９９４）の分子置換によって位置づけられた（両単量体の配置後、Ｒ＝５８．２
％、ＣＣ＝３５．６％）。この時点で前記与えられたものは、不正確（Ｃα位に
基づく、このモデルと最後のモデルとの間 r.m.s.dは１．７Å）及び不完全（非
対称単位における全散乱物質のわずか４５％までを計算）、その両方であり、攻
撃的な密度修飾が行われなかった。ＤＭにおいて平均化する２つの折りたたみＮ
ＣＳの反復サイクルをＭＯＬＯＣ（Muller, et al., Bull. Soc. Chim. Belg. 9
7 : 655-667 (1988))におけるモデル構築に散在させ、ＲＥＦＭＡＣ（Murshudov
, et al., Acta Crystallogr. D53 : 240-255 (1997))のモデル精密化（厳密な
ＮＣＳの制限を用いる）を、ＬＢＤ単独のモデルを素速く構築するために使用し
た。この手法のために、ＭＡＭＡ（Kleywegt, et al., “Halloween ……masks
and bones. In From First Mapto Final Model”，Bailey, et al., eds., Warr
ington, England, SERC Daresbury Laboratory, 1994)を、全てのマスク操作の
ために使用し、そしてＰＨＡＳＥＳ（Furey, et al., PA33 Am. Cryst. Assoc.
Mtg. Abstr. 18 : 73 (1990)) 及びＣＣＰ４スイート（ＣＣＰ４，１９９４）を
、構造因子の産生及び重さの計算のために使用した。
【０１００】 しかしながら、ＤＥＳ−ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体
は、非対称単位における９０％までの散乱物質を説明したが、精密化は深刻なモ
デルの偏りによって妨害された。次に、ＯＨＴ複合体のデータ集合を収集した。
サーチプローブとして、予備的なＤＥＳ−ＬＢＤモデルの単量体の１つを用いて
開始し、ＡＭｏＲｅにおける分子置換を、Ｐ６1２２及びＰ６5２２の両方の、こ
の結晶形態におけるＬＢＤの位置を調べるために使用した。Ｐ６5２２における
並進探索は、正確な溶解度を与えた（Ｒ＝５３．８％，ＣＣ＝３８．２％）。モ
デルの偏りを減少させるために、次にＤＭＭＵＬＴＩ（ＣＣＰ４，１９９４）を
使用し、ＤＥＳ複合体由来の平均された密度をＯＨＴ複合体セルに投影せしめた
。ＭＯＬＯＣを用いて、ＬＢＤのモデルを生じた密度内に構築させた。前記モデ
ルを、最初にＲＥＦＭＡＣにおいて、次に最も見込まれる標的を用いるＸ−ＰＬ
ＯＲ（Brunger, X-PLOR Version 3.843, New Haven, Conneticut : Yale Uniuer
sity, 1996) のアニーリング、位置的及びＢ因子精密化プロトコールで擬態した
もので精密化した。異方性スケーリング及びバルク溶媒補正を使用し、そしてＢ
因子を等方性に精密化した。Ｒfree集合（前記のデータ集合の８％から成る無作
為サンプリング）を除き、４１〜１．９Åの全てのデータ（σカットオフ無し）
が含められた。最終モデルは残基３０６〜５５１、リガンド及び７９の水から成
る。ＰＲＯＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４，１９９４）に従い、前記モデルの全残基のう
ちの９１．６％が、ラマチャンドランプロットのコア領域に存在し、そして認め
られていない領域には存在しなかった。
は、非対称単位における９０％までの散乱物質を説明したが、精密化は深刻なモ
デルの偏りによって妨害された。次に、ＯＨＴ複合体のデータ集合を収集した。
サーチプローブとして、予備的なＤＥＳ−ＬＢＤモデルの単量体の１つを用いて
開始し、ＡＭｏＲｅにおける分子置換を、Ｐ６1２２及びＰ６5２２の両方の、こ
の結晶形態におけるＬＢＤの位置を調べるために使用した。Ｐ６5２２における
並進探索は、正確な溶解度を与えた（Ｒ＝５３．８％，ＣＣ＝３８．２％）。モ
デルの偏りを減少させるために、次にＤＭＭＵＬＴＩ（ＣＣＰ４，１９９４）を
使用し、ＤＥＳ複合体由来の平均された密度をＯＨＴ複合体セルに投影せしめた
。ＭＯＬＯＣを用いて、ＬＢＤのモデルを生じた密度内に構築させた。前記モデ
ルを、最初にＲＥＦＭＡＣにおいて、次に最も見込まれる標的を用いるＸ−ＰＬ
ＯＲ（Brunger, X-PLOR Version 3.843, New Haven, Conneticut : Yale Uniuer
sity, 1996) のアニーリング、位置的及びＢ因子精密化プロトコールで擬態した
もので精密化した。異方性スケーリング及びバルク溶媒補正を使用し、そしてＢ
因子を等方性に精密化した。Ｒfree集合（前記のデータ集合の８％から成る無作
為サンプリング）を除き、４１〜１．９Åの全てのデータ（σカットオフ無し）
が含められた。最終モデルは残基３０６〜５５１、リガンド及び７９の水から成
る。ＰＲＯＣＨＥＣＫ（ＣＣＰ４，１９９４）に従い、前記モデルの全残基のう
ちの９１．６％が、ラマチャンドランプロットのコア領域に存在し、そして認め
られていない領域には存在しなかった。
【０１０１】 ＤＥＳ−ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体の高分解能のデ
ータ集合は、ＯＨＴ−ＬＢＤモデルのＲfreeが３１％までのときに利用可能とな
った。ＤＥＳ複合体結晶の非対称単位の両単量体は、ＡＭｏＲｅを用いて再配置
され、そしてサーチプローブとしてＯＨＴ−ＬＢＴモデル（ヘリックス１２及び
再移動したヘリックス１１と１２の間のループを有する）を不完全に精密化した
。前記モデルの失われた部分を構築し、そして前記モデルの残りを、ＭＯＬＯＣ
及びＤＭにおいて生成した２倍に平均化したマップを用いて補正した。最初に、
厳密なＮＣＳの制限を用いてＲＥＦＭＡＣで改善を行った。後期の段階で、Ｘ−
ＰＬＯＲの擬態したアニーリングの、位置的な及びＢ因子の精密化並びに最も見
込まれる標的を用いて、前記モデルをＮＣＳの制限無しで精密化した。全てのＢ
因子を同方性に精密化し、そして異方性スケーリング及びバルク溶媒補正を使用
した。前記Ｒfree集合は、全データの６．５％の無作為試料を含んだ。精密化に
おいて、２７〜２．０３Åの全データ（σカットオフ無し）を使用した。最終モ
デルは、単量体Ａの残基３０５〜５４９、単量体Ｂの残基３０５〜４６１及び４
７０〜５５４、ペプチドＡの残基６８７〜６９７、ペプチドＢの残基６８６〜６
９６、２つのリガンド分子、１４７の水、２つのカルボキシメチル基並びに塩素
イオンから成る。ＰＲＯ ＣＨＥＣＫに従い、前記モデルの全残基の９３．７％
がラマチャンドランプロットのコア領域に存在し、認められていない領域には存
在しなかった。
ータ集合は、ＯＨＴ−ＬＢＤモデルのＲfreeが３１％までのときに利用可能とな
った。ＤＥＳ複合体結晶の非対称単位の両単量体は、ＡＭｏＲｅを用いて再配置
され、そしてサーチプローブとしてＯＨＴ−ＬＢＴモデル（ヘリックス１２及び
再移動したヘリックス１１と１２の間のループを有する）を不完全に精密化した
。前記モデルの失われた部分を構築し、そして前記モデルの残りを、ＭＯＬＯＣ
及びＤＭにおいて生成した２倍に平均化したマップを用いて補正した。最初に、
厳密なＮＣＳの制限を用いてＲＥＦＭＡＣで改善を行った。後期の段階で、Ｘ−
ＰＬＯＲの擬態したアニーリングの、位置的な及びＢ因子の精密化並びに最も見
込まれる標的を用いて、前記モデルをＮＣＳの制限無しで精密化した。全てのＢ
因子を同方性に精密化し、そして異方性スケーリング及びバルク溶媒補正を使用
した。前記Ｒfree集合は、全データの６．５％の無作為試料を含んだ。精密化に
おいて、２７〜２．０３Åの全データ（σカットオフ無し）を使用した。最終モ
デルは、単量体Ａの残基３０５〜５４９、単量体Ｂの残基３０５〜４６１及び４
７０〜５５４、ペプチドＡの残基６８７〜６９７、ペプチドＢの残基６８６〜６
９６、２つのリガンド分子、１４７の水、２つのカルボキシメチル基並びに塩素
イオンから成る。ＰＲＯ ＣＨＥＣＫに従い、前記モデルの全残基の９３．７％
がラマチャンドランプロットのコア領域に存在し、認められていない領域には存
在しなかった。
【０１０２】 図１Ａは、２．０３Åの分解能で計算され、そして１．０σで描かれた。２Ｆo −Ｆc電子密度マップの図を提供し、ＬＢＤとのＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIの
相互作用を示す。ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド（配列番号４）はマップ
の計算の前に前記モデルから削除された。前記ペプチド由来のＩｌｅ６８９及び
それと相互作用する３つの受容体残基のうちの２つ（Ｇｌｕ５４２及びＬｅｕ５
３９）を標識した。Ａｓｐ５３８は、明快にするために削除された。前記ペプチ
ドのＧｌｕ５４２のγ−カルボン酸と、残基６８９及び６９０のアミドとの間の
水素結合は、オレンジ色の結合で表わされる。図１Ｂは１．９０Åの分解能で計
算され、して１．０σで描かれた２Ｆo−Ｆc電子密度の図を提供し、ヘリックス
１２のＮ末端領域を示す。オレンジ色の結合は、Ｈｉｓ３７７のイミダゾール環
、Ｇｌｕ３８０のγ−カルボン酸、及びＴｙｒ５３７のアミドの間の、水が介在
する水素結合ネットワークを表わす。３つの標示した残基（Ｇｌｕ３８０，Ｌｅ
ｕ５３６及びＴｙｒ５３７）は、ファンデルワールス接触及び／又は水素結合を
通して互いに相互作用する。興味深いことに、これらの３つの残基それぞれの変
異が、未配位のＥＲαＬＢＤの転写活性を増大させる（Eng, et al., Mol. Cell
. Biol. 17 : 4644-4653 (1997) ; Lazennec, et al., Mol. Endocrinol. 11 :
1375-86 (1997) ; White, et al., EMBO J. 16 : 1427-35 (1997))。 例２構造決定 ＧＲＩＰ１、マウスのｐ１６０コアクチベーターは、作用薬に結合したＥＲα
ＬＢＤと、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ、その両方において相互作用す
るが（Ding, et al., supra)、拮抗薬に結合したＬＢＤとは相互作用しない（No
rris, et al., J. Biol. Chem. 273 : 6679-88 (1998))。ＧＲＩＰ１及びそのヒ
ト相同体ＴＩＦ２の変異体研究は、ＧＲＩＰ１由来の３つのＮＲボックスのうち
、ＮＲボックスII（残基６９０〜６９４）がＥＲαＬＢＤに最もきつく結合する
ことを示している（Ding, et al., supra及びVoegel, et al., supra)。
相互作用を示す。ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド（配列番号４）はマップ
の計算の前に前記モデルから削除された。前記ペプチド由来のＩｌｅ６８９及び
それと相互作用する３つの受容体残基のうちの２つ（Ｇｌｕ５４２及びＬｅｕ５
３９）を標識した。Ａｓｐ５３８は、明快にするために削除された。前記ペプチ
ドのＧｌｕ５４２のγ−カルボン酸と、残基６８９及び６９０のアミドとの間の
水素結合は、オレンジ色の結合で表わされる。図１Ｂは１．９０Åの分解能で計
算され、して１．０σで描かれた２Ｆo−Ｆc電子密度の図を提供し、ヘリックス
１２のＮ末端領域を示す。オレンジ色の結合は、Ｈｉｓ３７７のイミダゾール環
、Ｇｌｕ３８０のγ−カルボン酸、及びＴｙｒ５３７のアミドの間の、水が介在
する水素結合ネットワークを表わす。３つの標示した残基（Ｇｌｕ３８０，Ｌｅ
ｕ５３６及びＴｙｒ５３７）は、ファンデルワールス接触及び／又は水素結合を
通して互いに相互作用する。興味深いことに、これらの３つの残基それぞれの変
異が、未配位のＥＲαＬＢＤの転写活性を増大させる（Eng, et al., Mol. Cell
. Biol. 17 : 4644-4653 (1997) ; Lazennec, et al., Mol. Endocrinol. 11 :
1375-86 (1997) ; White, et al., EMBO J. 16 : 1427-35 (1997))。 例２構造決定 ＧＲＩＰ１、マウスのｐ１６０コアクチベーターは、作用薬に結合したＥＲα
ＬＢＤと、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ、その両方において相互作用す
るが（Ding, et al., supra)、拮抗薬に結合したＬＢＤとは相互作用しない（No
rris, et al., J. Biol. Chem. 273 : 6679-88 (1998))。ＧＲＩＰ１及びそのヒ
ト相同体ＴＩＦ２の変異体研究は、ＧＲＩＰ１由来の３つのＮＲボックスのうち
、ＮＲボックスII（残基６９０〜６９４）がＥＲαＬＢＤに最もきつく結合する
ことを示している（Ding, et al., supra及びVoegel, et al., supra)。
【０１０３】 競合的アッセイは、ＧＲＩＰ１の残基６８６〜６９８に相当し（Ding, et al.
, supra）、標準的な固相法によって合成される、ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスII
ペプチドの１３残基、ＮＨ2−ＫＨＫＩＬ ＨＲＬＬＱＤＳＳ−ＣＯ2Ｈ（配列番
号４）が、特異的に作用薬結合ＥＲαＬＢＤ（ＩＣ50＜０．４μＭ；Ｋｕｓｈｎ
ｅｒ、未発表）及び他の作用薬結合ＮＲ ＬＢＤ（Ding, et al., supra及びDar
imont, et al., supra)に結合することを示している。
, supra）、標準的な固相法によって合成される、ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスII
ペプチドの１３残基、ＮＨ2−ＫＨＫＩＬ ＨＲＬＬＱＤＳＳ−ＣＯ2Ｈ（配列番
号４）が、特異的に作用薬結合ＥＲαＬＢＤ（ＩＣ50＜０．４μＭ；Ｋｕｓｈｎ
ｅｒ、未発表）及び他の作用薬結合ＮＲ ＬＢＤ（Ding, et al., supra及びDar
imont, et al., supra)に結合することを示している。
【０１０４】 ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド（配列番号４）が、作用薬ＤＥＳの存在
下、ＥＲαＬＢＤに結合し、拮抗薬ＯＨＴの存在下結合しなかったことを証明す
るために、電気泳動移動度シフトアッセイを用いた。ＤＥＳ又はＯＨＴのいずれ
かが結合した精製ｈＥＲαＬＢＤのうち、８μｇの試料をＧＲＩＰ１ ＮＲボッ
クスIIペプチド（配列番号４）の非存在下、すなわち緩衝液のみ、あるいは２倍
又は１０倍のモル過剰のＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの存在下インキュ
ベートした。２０mM Ｔｒｉｓ，pH８．１，１mM ＤＴＴ、及び２００mM Ｎａ
Ｃｌを含む１０μｌの緩衝液中、氷上で４５分間、結合反応を行い、そして次に
６％のネイティブＰＡＧＥにかけた。ゲルをＧＥＬＣＯＤＥ青色染色液（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）で染色した。
下、ＥＲαＬＢＤに結合し、拮抗薬ＯＨＴの存在下結合しなかったことを証明す
るために、電気泳動移動度シフトアッセイを用いた。ＤＥＳ又はＯＨＴのいずれ
かが結合した精製ｈＥＲαＬＢＤのうち、８μｇの試料をＧＲＩＰ１ ＮＲボッ
クスIIペプチド（配列番号４）の非存在下、すなわち緩衝液のみ、あるいは２倍
又は１０倍のモル過剰のＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの存在下インキュ
ベートした。２０mM Ｔｒｉｓ，pH８．１，１mM ＤＴＴ、及び２００mM Ｎａ
Ｃｌを含む１０μｌの緩衝液中、氷上で４５分間、結合反応を行い、そして次に
６％のネイティブＰＡＧＥにかけた。ゲルをＧＥＬＣＯＤＥ青色染色液（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）で染色した。
【０１０５】 ＮＲボックスIIペプチドの存在下、ＤＥＳ−ＬＢＤ複合体の移動度は遅れた。
対照的に、ペプチドの添加はＯＨＴ−ＬＢＤ複合体の移動度に影響しなかった。
従って、ＧＲＩＰ１のこのペプチドフラグメントは、前記の全長タンパク質のリ
ガンド依存受容体結合部位の特性を有する。これらの観察は、ＧＲＩＰ１ ＮＲ
ボックスIIペプチドがＧＲＩＰ１とＥＲαＬＢＤとの相互作用を研究するのに有
効なモデルであることを示している。
対照的に、ペプチドの添加はＯＨＴ−ＬＢＤ複合体の移動度に影響しなかった。
従って、ＧＲＩＰ１のこのペプチドフラグメントは、前記の全長タンパク質のリ
ガンド依存受容体結合部位の特性を有する。これらの観察は、ＧＲＩＰ１ ＮＲ
ボックスIIペプチドがＧＲＩＰ１とＥＲαＬＢＤとの相互作用を研究するのに有
効なモデルであることを示している。
【０１０６】 ＧＲＩＰ ＮＲボックスIIペプチドとＥＲαＬＢＤとの相互作用を構造的に特
徴づけるために、組換えヒトＥＲαＬＢＤ（残基２９７〜５５４）を結晶化し、
ＤＥＳ及びＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの両方に結合させた。ＯＨＴに
結合したＥＲαＬＢＤもまた、この拮抗薬がコアクチベーター／ＥＲα相互作用
を妨害する機構を決定するために結晶化された。これらの結晶由来のＸ線回析デ
ータを測定し、そして前記構造を、分子置換（サーチモデルとして、Ｒｅｎａｕ
ｄ等のヒトレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）ＬＢＤの配位体の改良版を用いた
）及び攻撃的な密度修飾の組合わせによって決定した。
徴づけるために、組換えヒトＥＲαＬＢＤ（残基２９７〜５５４）を結晶化し、
ＤＥＳ及びＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの両方に結合させた。ＯＨＴに
結合したＥＲαＬＢＤもまた、この拮抗薬がコアクチベーター／ＥＲα相互作用
を妨害する機構を決定するために結晶化された。これらの結晶由来のＸ線回析デ
ータを測定し、そして前記構造を、分子置換（サーチモデルとして、Ｒｅｎａｕ
ｄ等のヒトレチノイン酸受容体γ（ＲＡＲγ）ＬＢＤの配位体の改良版を用いた
）及び攻撃的な密度修飾の組合わせによって決定した。
【０１０７】 ＤＥＳ−ＥＲαＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体の構造を
、図１Ａ及び表２に示した様に２．０３Åの分解能に対するデータを用いて、１
９．９％の結晶学的Ｒ因子（Ｒfree＝２５．０％）まで改善された。ＯＨＴ−Ｅ
ＲαＬＢＤ複合体の構造は、図１Ｂ及び表２に示した様に、１．９０Åに対する
データを用いて２３．０％の結晶学的なＲ因子（Ｒfree＝２６．２％）まで改善
された。
、図１Ａ及び表２に示した様に２．０３Åの分解能に対するデータを用いて、１
９．９％の結晶学的Ｒ因子（Ｒfree＝２５．０％）まで改善された。ＯＨＴ−Ｅ
ＲαＬＢＤ複合体の構造は、図１Ｂ及び表２に示した様に、１．９０Åに対する
データを用いて２３．０％の結晶学的なＲ因子（Ｒfree＝２６．２％）まで改善
された。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】 例３ＤＥＳ−ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体の全体構造 ＤＥＳ−ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体結晶の非対称単
位は、ＬＢＤの同一の非結晶学的二量体を含み、これらはＥ2及びＲＡＬの両方
に結合したＬＢＤの既に決定された構造内で観察された（Brzozowski, et al., supra 及びTanenbaum, et al., supra)。ヘリックス２と３及びヘリックス９と１
０の間の自由なループを越えて、前記二量体の２つのＬＢＤは同様の構造を採用
する（Ｃα位を基にした r.m.s.d. が０．４７Å）。ＤＥＳと複合した各ＬＢＤ
の立体配座は、Ｅ2に結合したＬＢＤのものと極めて似ておりBrzozowski, et al
., supra) ; 各単量体は、１１〜１２のヘリックス及び単一のベータヘアピンの
３つの層から成る、くさび型分子である（図２Ａ）。各ＬＢＤにおいて、ヘリッ
クス１２の疎水性面は、リガンド結合ポケットを覆うヘリックス３，５／６及び
１１に対してパックされている（図２Ａ）。１つのＧＲＩＰ１ ＮＲボックスII
ペプチドが、ヘリックス３，４，５及び１２並びに３と４の間のターン由来の残
基から成る疎水性の割れ目における各ＬＢＤに結合する（図２Ａ及び３Ａ）。非
対称単位における両ペプチドの密度は連続的であり、そして明白である（図１Ａ
）。ペプチドＡとして表わされる、ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド由来の
残基６８７〜６９７、及びペプチドＢとして表わされる、ＧＲＩＰ１ ＮＲボッ
クスIIペプチド由来の残基６８６〜６９６をモデル化し；残りの残基は不調であ
った。各ペプチドに与えられたそれは、結晶内に異なる環境で存在し、残基Ｉｌ
ｅ６８９〜Ｇｌｕ６９５から、各ペプチドは２つのターン、両親媒性のαヘリッ
クスを形成している（図２Ａ及び３Ａ）。一般的な二次構造のこの領域に接して
、前記ペプチドは類似していないランダムコイル立体配座を採用している。
位は、ＬＢＤの同一の非結晶学的二量体を含み、これらはＥ2及びＲＡＬの両方
に結合したＬＢＤの既に決定された構造内で観察された（Brzozowski, et al., supra 及びTanenbaum, et al., supra)。ヘリックス２と３及びヘリックス９と１
０の間の自由なループを越えて、前記二量体の２つのＬＢＤは同様の構造を採用
する（Ｃα位を基にした r.m.s.d. が０．４７Å）。ＤＥＳと複合した各ＬＢＤ
の立体配座は、Ｅ2に結合したＬＢＤのものと極めて似ておりBrzozowski, et al
., supra) ; 各単量体は、１１〜１２のヘリックス及び単一のベータヘアピンの
３つの層から成る、くさび型分子である（図２Ａ）。各ＬＢＤにおいて、ヘリッ
クス１２の疎水性面は、リガンド結合ポケットを覆うヘリックス３，５／６及び
１１に対してパックされている（図２Ａ）。１つのＧＲＩＰ１ ＮＲボックスII
ペプチドが、ヘリックス３，４，５及び１２並びに３と４の間のターン由来の残
基から成る疎水性の割れ目における各ＬＢＤに結合する（図２Ａ及び３Ａ）。非
対称単位における両ペプチドの密度は連続的であり、そして明白である（図１Ａ
）。ペプチドＡとして表わされる、ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド由来の
残基６８７〜６９７、及びペプチドＢとして表わされる、ＧＲＩＰ１ ＮＲボッ
クスIIペプチド由来の残基６８６〜６９６をモデル化し；残りの残基は不調であ
った。各ペプチドに与えられたそれは、結晶内に異なる環境で存在し、残基Ｉｌ
ｅ６８９〜Ｇｌｕ６９５から、各ペプチドは２つのターン、両親媒性のαヘリッ
クスを形成している（図２Ａ及び３Ａ）。一般的な二次構造のこの領域に接して
、前記ペプチドは類似していないランダムコイル立体配座を採用している。
【０１１０】 ＤＥＳ−ＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体及びＯＨＴ−Ｅ
ＲαＬＢＤ複合体の全体構造を図２に示す。図２Ａにおいて、コアクチベーター
ペプチド及びＬＢＤは、リボン図で表わされる。前記ペプチドは金色であり、そ
してヘリックス１２（残基５３８〜５４６）はマゼンタ色である。ヘリックス３
，４及び５（それぞれＨ３，Ｈ４及びＨ５と標識した）は青色である。緑色のＤ
ＥＳは充間モデルで表わされる。図２Ｂにおいて、ＬＢＤをリボン図で表わす。
図２Ａの様に、ヘリックス１２（残基５３６〜５４４）はマゼンタ色であり、そ
してヘリックス３，４及び５は青色である。赤色のＯＨＴは充間モデルで表わさ
れる。 例４ＮＲボックスIIペプチド−ＬＢＤの界面 ＥＲαＬＢＤへのＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの結合は、両分子由来
の１０００Å2の支配的に疎水性の表面を覆う。ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペ
プチドの結合部位はヘリックス３由来の残基Ｌｅｕ３５４，Ｖａｌ３５５，Ｉｌ
ｅ３５８，Ａｌａ３６１及びＬｙｓ３６２；ヘリックス４由来のＰｈｅ３６７及
びＶａｌ３６８；ヘリックス３と４の間のターン由来のＬｅｕ３７２；ヘリック
ス５由来のＧｌｎ３７５，Ｖａｌ３７６，Ｌｅｕ３７９及びＧｌｕ３８０；並び
にヘリックス１２由来のＡｓｐ５３８，Ｌｅｕ５３９，Ｇｌｕ５４２及びＭｅｔ
５４３から成る浅い溝である（図３Ａ）。この溝の底及び側面は完全な無極性で
あるが、この溝の末端は荷電している（図３Ｃ）。
ＲαＬＢＤ複合体の全体構造を図２に示す。図２Ａにおいて、コアクチベーター
ペプチド及びＬＢＤは、リボン図で表わされる。前記ペプチドは金色であり、そ
してヘリックス１２（残基５３８〜５４６）はマゼンタ色である。ヘリックス３
，４及び５（それぞれＨ３，Ｈ４及びＨ５と標識した）は青色である。緑色のＤ
ＥＳは充間モデルで表わされる。図２Ｂにおいて、ＬＢＤをリボン図で表わす。
図２Ａの様に、ヘリックス１２（残基５３６〜５４４）はマゼンタ色であり、そ
してヘリックス３，４及び５は青色である。赤色のＯＨＴは充間モデルで表わさ
れる。 例４ＮＲボックスIIペプチド−ＬＢＤの界面 ＥＲαＬＢＤへのＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの結合は、両分子由来
の１０００Å2の支配的に疎水性の表面を覆う。ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペ
プチドの結合部位はヘリックス３由来の残基Ｌｅｕ３５４，Ｖａｌ３５５，Ｉｌ
ｅ３５８，Ａｌａ３６１及びＬｙｓ３６２；ヘリックス４由来のＰｈｅ３６７及
びＶａｌ３６８；ヘリックス３と４の間のターン由来のＬｅｕ３７２；ヘリック
ス５由来のＧｌｎ３７５，Ｖａｌ３７６，Ｌｅｕ３７９及びＧｌｕ３８０；並び
にヘリックス１２由来のＡｓｐ５３８，Ｌｅｕ５３９，Ｇｌｕ５４２及びＭｅｔ
５４３から成る浅い溝である（図３Ａ）。この溝の底及び側面は完全な無極性で
あるが、この溝の末端は荷電している（図３Ｃ）。
【０１１１】 前記ＬＢＤは、Ｉｌｅ６８９の側鎖及び３つのＬＸＸＬＬモチーフ（配列番号
１）のロイシン（Ｌｅｕ６９０，Ｌｅｕ６９３及びＬｅｕ６９４）によって形成
されるＧＲＩＰ ＮＲボックスIIペプチドのαヘリックスの疎水性面と主に相互
作用する。Ｌｅｕ６９０の側鎖は前記の溝の中に深く埋まっており、そしてＩｌ
ｅ３５８，Ｖａｌ３７６，Ｌｅｕ３７９，Ｇｌｕ３８０及びＭｅｔ５４３の側鎖
とファンデルワールス接触を形成する（図３Ａ及び３Ｃ）。Ｌｅｕ６９４の側鎖
は前記溝の中で同様に単離され、そしてＩｌｅ３５８，Ｌｙｓ３６２，Ｌｅｕ３
７２，Ｇｌｎ３７５，Ｖａｌ３７６及びＬｅｕ３７９とファンデルワールス接触
を形成する（図３Ａ及び３Ｃ）。対照的に、Ｉｌｅ６８９及び第２のＮＲボック
スのロイシン、Ｌｅｕ６９３の両方の側鎖は前記溝の縁に接して存在する（図３
Ａ及び３Ｃ）。Ｉｌｅ６８９の側鎖はＡｓｐ５３８，Ｌｅｕ５３９及びＧｌｕ５
４２の側鎖によって形成される浅いくぼみに存在する。Ｌｅｕ６９３の側鎖はＩ
ｌｅ３５８及びＬｅｕ５３９の側鎖と無極性接触を形成する。
１）のロイシン（Ｌｅｕ６９０，Ｌｅｕ６９３及びＬｅｕ６９４）によって形成
されるＧＲＩＰ ＮＲボックスIIペプチドのαヘリックスの疎水性面と主に相互
作用する。Ｌｅｕ６９０の側鎖は前記の溝の中に深く埋まっており、そしてＩｌ
ｅ３５８，Ｖａｌ３７６，Ｌｅｕ３７９，Ｇｌｕ３８０及びＭｅｔ５４３の側鎖
とファンデルワールス接触を形成する（図３Ａ及び３Ｃ）。Ｌｅｕ６９４の側鎖
は前記溝の中で同様に単離され、そしてＩｌｅ３５８，Ｌｙｓ３６２，Ｌｅｕ３
７２，Ｇｌｎ３７５，Ｖａｌ３７６及びＬｅｕ３７９とファンデルワールス接触
を形成する（図３Ａ及び３Ｃ）。対照的に、Ｉｌｅ６８９及び第２のＮＲボック
スのロイシン、Ｌｅｕ６９３の両方の側鎖は前記溝の縁に接して存在する（図３
Ａ及び３Ｃ）。Ｉｌｅ６８９の側鎖はＡｓｐ５３８，Ｌｅｕ５３９及びＧｌｕ５
４２の側鎖によって形成される浅いくぼみに存在する。Ｌｅｕ６９３の側鎖はＩ
ｌｅ３５８及びＬｅｕ５３９の側鎖と無極性接触を形成する。
【０１１２】 前記ペプチドのヘリックスの疎水性面を形成する電荷及び極性の側鎖は前記受
容体から突き出て、溶媒と支配的に相互作用するか、又は対称の接触の形成をす
るかのいずれかを行う（図１Ａ）。ペプチドＢのＬｙｓ６８８を除いて、非対称
単位のいずれかのペプチドのヘリックス領域の外側の、極性及び電荷の残基のど
れも、自身の会合したＬＢＤ単量体との水素結合又は塩橋に関与しない。ペプチ
ドＢのＬｙｓ６８８のε−アミノ基は、単量体ＢのＧｌｕ３８０の側鎖のカルボ
ン酸と水素結合する。この相互作用はおそらく結晶の人工構造であり；ペプチド
ＢのＮ末端の３残基の主鎖原子は、単量体Ｂから置換され、そして対称的な関係
のＬＢＤと広範に相互作用する。
容体から突き出て、溶媒と支配的に相互作用するか、又は対称の接触の形成をす
るかのいずれかを行う（図１Ａ）。ペプチドＢのＬｙｓ６８８を除いて、非対称
単位のいずれかのペプチドのヘリックス領域の外側の、極性及び電荷の残基のど
れも、自身の会合したＬＢＤ単量体との水素結合又は塩橋に関与しない。ペプチ
ドＢのＬｙｓ６８８のε−アミノ基は、単量体ＢのＧｌｕ３８０の側鎖のカルボ
ン酸と水素結合する。この相互作用はおそらく結晶の人工構造であり；ペプチド
ＢのＮ末端の３残基の主鎖原子は、単量体Ｂから置換され、そして対称的な関係
のＬＢＤと広範に相互作用する。
【０１１３】 前記ペプチドのヘリックスの疎水性面との相互作用に加えて、前記ＬＢＤは前
記ペプチドヘリックスの両末端とのキャッピング相互作用を形成することによっ
て、ＮＲボックスIIペプチドの主鎖の立体配座を安定化する。Ｇｌｕ５４２及び
Ｌｙｓ３６２は前記ペプチドの結合部位の反対側の末端に位置する（図３Ａ）。
Ｇｌｕ５４２及びＬｙｓ３６２の側鎖は、前記ペプチドのヘリックスのＮ及びＣ
末端のターンそれぞれで、主鎖及び側鎖の原子とファンデルワールス接触を形成
する。これらの相互作用はＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドのヘリックスの
末端の近くの、Ｇｌｕ５４２のγ−カルボン酸及びＬｙｓ３６２のε−アミノ基
の安定している電荷に位置している（図３Ｃ）。Ｇｌｕ５４２の側鎖のカルボン
酸（γ−カルボン酸）は前記ペプチドヘリックスのＮ末端ターンの残基（ペプチ
ドＡの残基６８８及び６８９；ペプチドＢの残基６８９及び６９０）のアミドと
水素結合する（図１Ａ）。同様に、Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基は前記ペプチド
ヘリックスのＣ末端ターンの残基（ペプチドＡの残基６９３；ペプチドＢの残基
６９３及び６９４）のカルボニルと水素結合する（図５）。前記結晶において観
察されたＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド／ＬＢＤの界面の重要性を試験す
るために、一連の部位指定突然変異をＥＲαＬＢＤに導入した。これらの変異は
、前記の結合している溝の底の構造的な完全性及び無極性の特徴を同時に乱すた
めか（Ｉｌｅ３５８−＞Ａｒｇ，Ｖａｌ３７６−＞Ａｒｇ及びＬｅｕ３５９−＞
Ａｒｇ）、前記のキャッピング相互作用の形成を阻害するためか（Ｌｙｓ３６２
−＞Ａｌａ及びＧｌｕ５４２−＞Ｌｙｓ）、そのいずれかのために設計された。
前記野生型及び変異体ＬＢＤへのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）の融合は、リガンドの不在あるいはＤＥＳ又はＯＨＴの存在下、35Ｓ標識し
たＧＲＩＰ１に結合するそれらの能力のために解析された。
記ペプチドヘリックスの両末端とのキャッピング相互作用を形成することによっ
て、ＮＲボックスIIペプチドの主鎖の立体配座を安定化する。Ｇｌｕ５４２及び
Ｌｙｓ３６２は前記ペプチドの結合部位の反対側の末端に位置する（図３Ａ）。
Ｇｌｕ５４２及びＬｙｓ３６２の側鎖は、前記ペプチドのヘリックスのＮ及びＣ
末端のターンそれぞれで、主鎖及び側鎖の原子とファンデルワールス接触を形成
する。これらの相互作用はＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドのヘリックスの
末端の近くの、Ｇｌｕ５４２のγ−カルボン酸及びＬｙｓ３６２のε−アミノ基
の安定している電荷に位置している（図３Ｃ）。Ｇｌｕ５４２の側鎖のカルボン
酸（γ−カルボン酸）は前記ペプチドヘリックスのＮ末端ターンの残基（ペプチ
ドＡの残基６８８及び６８９；ペプチドＢの残基６８９及び６９０）のアミドと
水素結合する（図１Ａ）。同様に、Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基は前記ペプチド
ヘリックスのＣ末端ターンの残基（ペプチドＡの残基６９３；ペプチドＢの残基
６９３及び６９４）のカルボニルと水素結合する（図５）。前記結晶において観
察されたＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド／ＬＢＤの界面の重要性を試験す
るために、一連の部位指定突然変異をＥＲαＬＢＤに導入した。これらの変異は
、前記の結合している溝の底の構造的な完全性及び無極性の特徴を同時に乱すた
めか（Ｉｌｅ３５８−＞Ａｒｇ，Ｖａｌ３７６−＞Ａｒｇ及びＬｅｕ３５９−＞
Ａｒｇ）、前記のキャッピング相互作用の形成を阻害するためか（Ｌｙｓ３６２
−＞Ａｌａ及びＧｌｕ５４２−＞Ｌｙｓ）、そのいずれかのために設計された。
前記野生型及び変異体ＬＢＤへのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）の融合は、リガンドの不在あるいはＤＥＳ又はＯＨＴの存在下、35Ｓ標識し
たＧＲＩＰ１に結合するそれらの能力のために解析された。
【０１１４】 35Ｓ標識したＧＲＩＰ１を、リガンドの不在あるいはＤＥＳ又はＯＨＴの存在
下、固定化ＧＳＴ、固定化野生型ＧＳＴ−ｈＥＲαＬＢＤ、又は固定化変異体Ｇ
ＳＴ−ＬＢＤのいずれかとインキュベートした。結合したＧＲＩＰ１をＳＤＳ−
ＰＡＧＥ後に定量した。Ｉ３５８Ｒ、残基３５８でのＩｌｅ−＞Ａｒｇの置換を
含む変異体ＬＢＤ；Ｋ３６２Ａ、残基３６２でのＬｙｓ−＞Ａｌａの置換を含む
変異体ＬＢＤ；Ｖ３７６Ｒ、残基３７６でのＶａｌ−＞Ａｒｇの置換を含むＬＢ
Ｄ変異体；Ｌ５３９Ｒ、残基５３９でＬｅｕ−＞Ａｒｇの置換を含むＬＢＤ変異
体；Ｅ５４２Ｋ、残基５４２でのＧｌｕ−＞Ｌｙｓの置換を含む変異体ＬＢＤ。
下、固定化ＧＳＴ、固定化野生型ＧＳＴ−ｈＥＲαＬＢＤ、又は固定化変異体Ｇ
ＳＴ−ＬＢＤのいずれかとインキュベートした。結合したＧＲＩＰ１をＳＤＳ−
ＰＡＧＥ後に定量した。Ｉ３５８Ｒ、残基３５８でのＩｌｅ−＞Ａｒｇの置換を
含む変異体ＬＢＤ；Ｋ３６２Ａ、残基３６２でのＬｙｓ−＞Ａｌａの置換を含む
変異体ＬＢＤ；Ｖ３７６Ｒ、残基３７６でのＶａｌ−＞Ａｒｇの置換を含むＬＢ
Ｄ変異体；Ｌ５３９Ｒ、残基５３９でＬｅｕ−＞Ａｒｇの置換を含むＬＢＤ変異
体；Ｅ５４２Ｋ、残基５４２でのＧｌｕ−＞Ｌｙｓの置換を含む変異体ＬＢＤ。
【０１１５】 リガンドの不在又はＯＨＴの存在下、前記野生型タンパク質及び前記変異体Ｌ
ＢＤの全てへの融合は、検出不可能なＧＲＩＰ１への結合を示した。Ｉｌｅ３５
８−＞Ａｒｇ，Ｖａｌ３７６−＞Ａｒｇ及びＬｅｕ５３９−＞Ａｒｇ変異体は、
全て作用薬の存在下コアクチベーターと相互作用することができず、これによっ
て前記結晶において観察されたパッキング相互作用の重要性が確認された。Ｎ又
はＣ末端のいずれかのキャッピング相互作用の崩壊もまた、作用薬の存在下のＧ
ＲＩＰ結合を危険にさらした。野生型のＧＳＴ−ＬＢＤのみが、ＤＥＳの存在下
、前記コアクチベーターを認識することができた。 例５作用薬の認識 その異なる形状及びより大きい分子の大きさにもかかわらず、ＤＥＳ（２７３
Å3）はＥ2（２５２Å3）を認識する同一の結合ポケット内に収容される。その
受容体複合体において、ヘリックス３，６，７，８，１１及び１２並びにＳ１／
Ｓ２ヘアピン由来の残基から成る支配的に疎水性の穴におけるＬＢＤの狭い方の
半分に、ＤＥＳは完全に覆われている（図２Ａ及び４Ａ）。
ＢＤの全てへの融合は、検出不可能なＧＲＩＰ１への結合を示した。Ｉｌｅ３５
８−＞Ａｒｇ，Ｖａｌ３７６−＞Ａｒｇ及びＬｅｕ５３９−＞Ａｒｇ変異体は、
全て作用薬の存在下コアクチベーターと相互作用することができず、これによっ
て前記結晶において観察されたパッキング相互作用の重要性が確認された。Ｎ又
はＣ末端のいずれかのキャッピング相互作用の崩壊もまた、作用薬の存在下のＧ
ＲＩＰ結合を危険にさらした。野生型のＧＳＴ−ＬＢＤのみが、ＤＥＳの存在下
、前記コアクチベーターを認識することができた。 例５作用薬の認識 その異なる形状及びより大きい分子の大きさにもかかわらず、ＤＥＳ（２７３
Å3）はＥ2（２５２Å3）を認識する同一の結合ポケット内に収容される。その
受容体複合体において、ヘリックス３，６，７，８，１１及び１２並びにＳ１／
Ｓ２ヘアピン由来の残基から成る支配的に疎水性の穴におけるＬＢＤの狭い方の
半分に、ＤＥＳは完全に覆われている（図２Ａ及び４Ａ）。
【０１１６】 ＥＲαとのＤＥＳの相互作用はＥ2のそれと類似している。ＤＥＳのフェノー
ル環の１つは、ヘリックス３及び６の近くのＥ2のＡ環と同じ位置に存在する。
Ｅ2の芳香環の様に、ＤＥＳのＡ環（図４Ａ）は、そのフェノールのヒドロキシ
ルを有するＰｈｅ４０４，Ａｌａ３５０，Ｌｅｕ３８７及びＬｅｕ３９１の側鎖
によって束縛され、Ｇｌｕ３５３のγ−カルボン酸、Ａｒｇ３９４のグアニジウ
ム基、及び構造的に保存される水分子と水素結合を形成する。ＤＥＳのＡ’環（
図４Ａ）はＥ2のＣ及びＤ環の配置に近接しているヘリックス７，８及び１１の
近くに結合している。この環は、Ｅ2のＤ環の様にＧｌｙ５２１及びＬｅｕ５２
５とだけでなく、Ｍｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６及びＭｅｔ４２１ともファンデル
ワールス接触を形成する（図４Ａ）。それはＤ環のヒドロキシルの位置から１．
７Åに位置するが、ＤＥＳのＡ’環のフェノールのヒドロキシルは、更にＨｉｓ
５２４のイミダゾール環と水素結合することができる（図４Ａ）。
ル環の１つは、ヘリックス３及び６の近くのＥ2のＡ環と同じ位置に存在する。
Ｅ2の芳香環の様に、ＤＥＳのＡ環（図４Ａ）は、そのフェノールのヒドロキシ
ルを有するＰｈｅ４０４，Ａｌａ３５０，Ｌｅｕ３８７及びＬｅｕ３９１の側鎖
によって束縛され、Ｇｌｕ３５３のγ−カルボン酸、Ａｒｇ３９４のグアニジウ
ム基、及び構造的に保存される水分子と水素結合を形成する。ＤＥＳのＡ’環（
図４Ａ）はＥ2のＣ及びＤ環の配置に近接しているヘリックス７，８及び１１の
近くに結合している。この環は、Ｅ2のＤ環の様にＧｌｙ５２１及びＬｅｕ５２
５とだけでなく、Ｍｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６及びＭｅｔ４２１ともファンデル
ワールス接触を形成する（図４Ａ）。それはＤ環のヒドロキシルの位置から１．
７Åに位置するが、ＤＥＳのＡ’環のフェノールのヒドロキシルは、更にＨｉｓ
５２４のイミダゾール環と水素結合することができる（図４Ａ）。
【０１１７】 ＤＥＳまたは、Ｅ2が形成しないＬＢＤとの接触を形成する。Ｅ2のＢ環のα面
及びＣ環のβ面の近くに、ふさがれていない穴が存在する（Brzozowski, et al.
, supra及びTanenbaum, et al., supra)。ＤＥＳのエチル基は、前記フェノール
環の平面から垂直に突き出ており、これらの空間内にきれいにはまる。Ａｌａ３
５０，Ｌｅｕ３８４，Ｐｈｅ４０４、及びＬｅｕ４２８の側鎖との、もたらされ
る非極性接触（図４Ａ）は、前記受容体のＤＥＳのより高い親和性に原因がある
と思われる（Kuiper, et al., EndoCrinology 138 : 863-70 (1997))。
及びＣ環のβ面の近くに、ふさがれていない穴が存在する（Brzozowski, et al.
, supra及びTanenbaum, et al., supra)。ＤＥＳのエチル基は、前記フェノール
環の平面から垂直に突き出ており、これらの空間内にきれいにはまる。Ａｌａ３
５０，Ｌｅｕ３８４，Ｐｈｅ４０４、及びＬｅｕ４２８の側鎖との、もたらされ
る非極性接触（図４Ａ）は、前記受容体のＤＥＳのより高い親和性に原因がある
と思われる（Kuiper, et al., EndoCrinology 138 : 863-70 (1997))。
【０１１８】 Ｍｅｔ４２１及びＭｅｔ５２８（共にＤＥＳのみと接触）並びにＭｅｔ３８８
及びＩｌｅ４２４（共にＥ2のみと接触）を除いて、前記ＥＲは、観察される両
方の作用薬との水素結合及びファンデルワールス接触の全てを形成する同一の残
基を使用することができる（図４Ａ、Brzozowski, et al., supra、及びTanenba
nm, et al., supra)。この注目すべき適応性はおそらく、前記結合ポケットの比
較的大きい分子の大きさ（両複合体において５００Å以下）及びその見かけの構
造的な可塑性、その両方の結果である。特に、前記結合ポケットのＤＥＳのＡ’
環／ステロイドのＤ環末端で、Ｍｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４及び
Ｍｅｔ５２８は、各リガンドに応じて異なるパッキング配置を採用する（データ
は示さない）。この可塑性は前記受容体に内因性のエストロゲン、例えばエスト
ロン及びエストリオールを認識させることが必要であると思われ、これはＤ環で
Ｅ2と構造的に異なる。 例６ＯＨＴ−ＬＢＤ複合体の構造 ＯＨＴの結合は、ＤＥＳによって動かされるものに由来する二次的及び三次的
な構造の構成、その両方において異なるＬＢＤの立体配座を導入する。ＤＥＳ複
合体において、残基３３９〜３４１，４２１〜４２３、及び５２７〜５３０由来
の主鎖は、ヘリックス３，８及び１１の一部をそれぞれ形成する。対照的に、こ
れらの領域はＯＨＴ複合体において伸長した立体配座を採用する（図２Ａ，２Ｂ
及び６Ａ）。更に、ヘリックス１２の組成及び配向は前記の２つの構造と異なる
。ＤＥＳ複合体におけるヘリックス１２は残基５３８〜５４６から成るが、ＯＨ
Ｔ複合体のヘリックス１２は残基５３６〜５４４から成る。最も劇的なことに、
ＤＥＳ複合体において行われる様なリガンド結合ポケットを覆うことよりもむし
ろ、ＯＨＴ複合体のヘリックス１２は、前記コアクチベーターが結合する溝の一
部を占め、これはヘリックス３，４、及び５、並びにヘリックス３及び４と連結
しているターンによって形成する（図２Ａ，２Ｂ及び３Ｂ）。ヘリックス１２の
この別の立体配座は、ＲＡＬ複合体において観察されるものと類似の様である（
Brzozowski, et al., supra)。 例７ヘリックス１２−ＬＢＤの界面 ヘリックス１２の配向を除いて、前記のペプチドが結合している溝の構造は、
ＤＥＳ及びＯＨＴ結合体においてほぼ同一である（図３Ａ及び３Ｂ）。ヘリック
ス１２のこの溝の外側の領域は、本明細書でＮＲボックス結合部位の“静電的領
域”として言及される。ＯＨＴ複合体のヘリックス１２及びＤＥＳ複合体のＮＲ
ボックスペプチドのヘリックスは、著しく同一の挙動においてコアクチベーター
が認識する溝の静電的領域と相互作用する。
及びＩｌｅ４２４（共にＥ2のみと接触）を除いて、前記ＥＲは、観察される両
方の作用薬との水素結合及びファンデルワールス接触の全てを形成する同一の残
基を使用することができる（図４Ａ、Brzozowski, et al., supra、及びTanenba
nm, et al., supra)。この注目すべき適応性はおそらく、前記結合ポケットの比
較的大きい分子の大きさ（両複合体において５００Å以下）及びその見かけの構
造的な可塑性、その両方の結果である。特に、前記結合ポケットのＤＥＳのＡ’
環／ステロイドのＤ環末端で、Ｍｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４及び
Ｍｅｔ５２８は、各リガンドに応じて異なるパッキング配置を採用する（データ
は示さない）。この可塑性は前記受容体に内因性のエストロゲン、例えばエスト
ロン及びエストリオールを認識させることが必要であると思われ、これはＤ環で
Ｅ2と構造的に異なる。 例６ＯＨＴ−ＬＢＤ複合体の構造 ＯＨＴの結合は、ＤＥＳによって動かされるものに由来する二次的及び三次的
な構造の構成、その両方において異なるＬＢＤの立体配座を導入する。ＤＥＳ複
合体において、残基３３９〜３４１，４２１〜４２３、及び５２７〜５３０由来
の主鎖は、ヘリックス３，８及び１１の一部をそれぞれ形成する。対照的に、こ
れらの領域はＯＨＴ複合体において伸長した立体配座を採用する（図２Ａ，２Ｂ
及び６Ａ）。更に、ヘリックス１２の組成及び配向は前記の２つの構造と異なる
。ＤＥＳ複合体におけるヘリックス１２は残基５３８〜５４６から成るが、ＯＨ
Ｔ複合体のヘリックス１２は残基５３６〜５４４から成る。最も劇的なことに、
ＤＥＳ複合体において行われる様なリガンド結合ポケットを覆うことよりもむし
ろ、ＯＨＴ複合体のヘリックス１２は、前記コアクチベーターが結合する溝の一
部を占め、これはヘリックス３，４、及び５、並びにヘリックス３及び４と連結
しているターンによって形成する（図２Ａ，２Ｂ及び３Ｂ）。ヘリックス１２の
この別の立体配座は、ＲＡＬ複合体において観察されるものと類似の様である（
Brzozowski, et al., supra)。 例７ヘリックス１２−ＬＢＤの界面 ヘリックス１２の配向を除いて、前記のペプチドが結合している溝の構造は、
ＤＥＳ及びＯＨＴ結合体においてほぼ同一である（図３Ａ及び３Ｂ）。ヘリック
ス１２のこの溝の外側の領域は、本明細書でＮＲボックス結合部位の“静電的領
域”として言及される。ＯＨＴ複合体のヘリックス１２及びＤＥＳ複合体のＮＲ
ボックスペプチドのヘリックスは、著しく同一の挙動においてコアクチベーター
が認識する溝の静電的領域と相互作用する。
【０１１９】 ヘリックス１２は、ＮＲボックスと似ている残基（残基５４０〜５４４）の範
囲を有する溝の静的領域とのＮＲボックスペプチドの疎水性相互作用を擬態する
（ＬＸＸＬＬの代わりのＬＬＥＭＬ）（配列番号１代わりの配列番号３）。Ｌｅ
ｕ５４０及びＭｅｔ５４３の側鎖は、前記ペプチド複合体の第１及び第２のモチ
ーフのロイシン（Ｌｅｕ６９０及びＬｅｕ６９３）のそれとほぼ同一の配置にお
いて存在する（図５）。Ｌｅｕ５４０は前記の溝に挿入され、そしてＬｅｕ３５
４，Ｖａｌ３７６及びＧｌｕ３８０とのファンデルワールス接触を形成する（図
３Ｂ及び３Ｄ）。Ｎｅｔ５４３は前記の溝の縁に沿って存在し、そしてＬｅｕ３
５４、Ｖａｌ３５５及びＩｌｅ３５８の側鎖とファンデルワールス接触を形成す
る（図３Ｂ及び３Ｄ）。Ｌｅｕ５４４の側鎖の位置は、第３のＮＲボックスのロ
イシン、Ｌｅｕ６９４のそれを、ほぼ正確に覆う（図５）。前記溝の深いところ
で、Ｌｅｕ５４４の側鎖はＩｌｅ３５８，Ｌｙｓ３６２，Ｌｅｕ３７２，Ｇｌｎ
３７５，Ｖａｌ３７６及びＬｅｕ３７９の側鎖とのファンデルワールス接触を形
成する（図３Ｂ及び３Ｄ）。
囲を有する溝の静的領域とのＮＲボックスペプチドの疎水性相互作用を擬態する
（ＬＸＸＬＬの代わりのＬＬＥＭＬ）（配列番号１代わりの配列番号３）。Ｌｅ
ｕ５４０及びＭｅｔ５４３の側鎖は、前記ペプチド複合体の第１及び第２のモチ
ーフのロイシン（Ｌｅｕ６９０及びＬｅｕ６９３）のそれとほぼ同一の配置にお
いて存在する（図５）。Ｌｅｕ５４０は前記の溝に挿入され、そしてＬｅｕ３５
４，Ｖａｌ３７６及びＧｌｕ３８０とのファンデルワールス接触を形成する（図
３Ｂ及び３Ｄ）。Ｎｅｔ５４３は前記の溝の縁に沿って存在し、そしてＬｅｕ３
５４、Ｖａｌ３５５及びＩｌｅ３５８の側鎖とファンデルワールス接触を形成す
る（図３Ｂ及び３Ｄ）。Ｌｅｕ５４４の側鎖の位置は、第３のＮＲボックスのロ
イシン、Ｌｅｕ６９４のそれを、ほぼ正確に覆う（図５）。前記溝の深いところ
で、Ｌｅｕ５４４の側鎖はＩｌｅ３５８，Ｌｙｓ３６２，Ｌｅｕ３７２，Ｇｌｎ
３７５，Ｖａｌ３７６及びＬｅｕ３７９の側鎖とのファンデルワールス接触を形
成する（図３Ｂ及び３Ｄ）。
【０１２０】 ＯＨＴ複合体のヘリックス１２はまた、Ｎ及びＣ末端のキャッピング相互作用
によって安定化する。Ｌｙｓ３６２はヘリックス１２のＣ末端のターンと相互作
用するが、それは前記ペプチドのヘリックスの等価のターンと相互作用する（図
３Ａ及び３Ｂ）。Ｌｙｓ３６２の側鎖は、残基５４３及び５４４のカルボニルに
水素結合するそのε−アミノ基を有するヘリックス１２のＣ末端のターンに対し
てパックする（図５）。コアクチベーターヘリックスのＮ末端のターンにおける
キャッピング相互作用が、ヘリックス１２の残基（Ｇｌｕ５４２）によって形成
することで、前記拮抗薬複合体におけるヘリックス１２のＮ末端ターンは別の残
基、Ｇｌｕ３８０と相互作用をさせられる（図３Ｂ及び３Ｄ）。Ｇｌｕ３８０の
γ−カルボン酸は、Ｔｙｒ５３７とのファンデルワールス接触を形成し、そして
一連の水が介在する水素結合を通して、Ｔｙｒ５３７のアミドと相互作用する（
図１Ｂ）。
によって安定化する。Ｌｙｓ３６２はヘリックス１２のＣ末端のターンと相互作
用するが、それは前記ペプチドのヘリックスの等価のターンと相互作用する（図
３Ａ及び３Ｂ）。Ｌｙｓ３６２の側鎖は、残基５４３及び５４４のカルボニルに
水素結合するそのε−アミノ基を有するヘリックス１２のＣ末端のターンに対し
てパックする（図５）。コアクチベーターヘリックスのＮ末端のターンにおける
キャッピング相互作用が、ヘリックス１２の残基（Ｇｌｕ５４２）によって形成
することで、前記拮抗薬複合体におけるヘリックス１２のＮ末端ターンは別の残
基、Ｇｌｕ３８０と相互作用をさせられる（図３Ｂ及び３Ｄ）。Ｇｌｕ３８０の
γ−カルボン酸は、Ｔｙｒ５３７とのファンデルワールス接触を形成し、そして
一連の水が介在する水素結合を通して、Ｔｙｒ５３７のアミドと相互作用する（
図１Ｂ）。
【０１２１】 これらの“ＮＲボックス様”相互作用の形成に加えて、ヘリックス１２はまた
コアクチベーターの認識の溝のＬＢＤの外側の領域と、ファンデルワールス接触
を形成する。Ｌｅｕ５３６の側鎖は、Ｇｌｕ３８０及びＴｒｐ３８３とのファン
デルワールス接触を形成し、そしてＴｙｒ５３７のそれはＨｉｓ３７３，Ｖａｌ
３７６及びＧｌｕ３８０とのファンデルワールス接触を形成する（図１Ｂ，３Ｂ
及び３Ｄ）。これらの接触の結果として、ＯＨＴ複合体のヘリックス１２は、Ｄ
ＥＳ複合体のＮＲボックスペプチドよりも多くの溶媒が接近可能な表面（〜１２
００Å）に埋もれる。 例８ＯＨＴの認識 ＯＨＴは、ＤＥＳ，Ｅ2及びＲＡＬを認識する同一のポケット内で結合する。
前記結合ポケット内のＯＨＴの配向は、このリガンドの構造的な特徴、フェノー
ルのＡ環及び大きな側鎖の配置によって命令されるようである（図４Ｂ及び６Ｃ
）。ＯＨＴのＡ環は、構造的に保存された水、並びにＧｌｕ３５３及びＡｒｇ３
９４の側鎖と水素結合する、そのフェノールのヒドロキシルを有するヘリックス
３及び６の近くの、ＤＥＳのＡ環とほぼ同じ位置において結合する（図４Ｂ）。
ＲＡＬの大きい側鎖の様に、ＯＨＴの側鎖は、ヘリックス３と１１の間の結合ポ
ケットを出る（図２Ｂ及び４Ｂ）。ＯＨＴのＣ環（図４Ｂ）は、Ｍｅｔ３４３，
Ｌｅｕ３４６，Ｔｈｒ３４７，Ａｌａ３５０，Ｔｒｐ３８３，Ｌｅｕ３８４，Ｌ
ｅｕ３８７及びＬｅｕ５２５の側鎖とのファンデルワールス接触を形成する。前
記側鎖の自由なジメチルアミノエチル領域は、Ｔｈｒ３４７，Ａｌａ３５０及び
Ｔｒｐ３８３とのファンデルワールス接触並びに前記側鎖のジメチルアミノ基と
Ａｓｐ３５１のβ−カルボン酸との間の塩橋によって安定化され、これらは３．
８Å離れて存在する（図４Ｂ）。ＯＨＴの厳密なトリフェニルエチレン骨格の関
係において、Ａ環及び前記側鎖の位置は、ＯＨＴのエチレン基がＤＥＳのエチレ
ン基のそれにほぼ直交する配向において存在するこを必要とする（図４Ａ，４Ｂ
及び６Ｄ）。結果として、ＯＨＴのＢ環は、ＤＥＳのＡ’環よりも、前記結合ポ
ケット内に深く押しやられる（図６Ｂ及び６Ｃ）。
コアクチベーターの認識の溝のＬＢＤの外側の領域と、ファンデルワールス接触
を形成する。Ｌｅｕ５３６の側鎖は、Ｇｌｕ３８０及びＴｒｐ３８３とのファン
デルワールス接触を形成し、そしてＴｙｒ５３７のそれはＨｉｓ３７３，Ｖａｌ
３７６及びＧｌｕ３８０とのファンデルワールス接触を形成する（図１Ｂ，３Ｂ
及び３Ｄ）。これらの接触の結果として、ＯＨＴ複合体のヘリックス１２は、Ｄ
ＥＳ複合体のＮＲボックスペプチドよりも多くの溶媒が接近可能な表面（〜１２
００Å）に埋もれる。 例８ＯＨＴの認識 ＯＨＴは、ＤＥＳ，Ｅ2及びＲＡＬを認識する同一のポケット内で結合する。
前記結合ポケット内のＯＨＴの配向は、このリガンドの構造的な特徴、フェノー
ルのＡ環及び大きな側鎖の配置によって命令されるようである（図４Ｂ及び６Ｃ
）。ＯＨＴのＡ環は、構造的に保存された水、並びにＧｌｕ３５３及びＡｒｇ３
９４の側鎖と水素結合する、そのフェノールのヒドロキシルを有するヘリックス
３及び６の近くの、ＤＥＳのＡ環とほぼ同じ位置において結合する（図４Ｂ）。
ＲＡＬの大きい側鎖の様に、ＯＨＴの側鎖は、ヘリックス３と１１の間の結合ポ
ケットを出る（図２Ｂ及び４Ｂ）。ＯＨＴのＣ環（図４Ｂ）は、Ｍｅｔ３４３，
Ｌｅｕ３４６，Ｔｈｒ３４７，Ａｌａ３５０，Ｔｒｐ３８３，Ｌｅｕ３８４，Ｌ
ｅｕ３８７及びＬｅｕ５２５の側鎖とのファンデルワールス接触を形成する。前
記側鎖の自由なジメチルアミノエチル領域は、Ｔｈｒ３４７，Ａｌａ３５０及び
Ｔｒｐ３８３とのファンデルワールス接触並びに前記側鎖のジメチルアミノ基と
Ａｓｐ３５１のβ−カルボン酸との間の塩橋によって安定化され、これらは３．
８Å離れて存在する（図４Ｂ）。ＯＨＴの厳密なトリフェニルエチレン骨格の関
係において、Ａ環及び前記側鎖の位置は、ＯＨＴのエチレン基がＤＥＳのエチレ
ン基のそれにほぼ直交する配向において存在するこを必要とする（図４Ａ，４Ｂ
及び６Ｄ）。結果として、ＯＨＴのＢ環は、ＤＥＳのＡ’環よりも、前記結合ポ
ケット内に深く押しやられる（図６Ｂ及び６Ｃ）。
【０１２２】 ＯＨＴのＢ環のこの位置は、前記結合ポケットのＤＥＳのＡ’環／Ｅ2のＤ環
の末端にＤＥＳ及びＥ2の異なる構造的特徴を採用させる同一の機構によって適
応させられない様である。その代わりに、Ｂ環と接触する残基（Ｍｅｔ３４３，
Ｌｅｕ３４６，Ｍｅｔ４２１，Ｉｌｅ４２４，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４及び
Ｌｅｕ５２５）の多くかまたＤＥＳのＡ’環と相互作用し、それらがＤＥＳ構造
において採用するものと異なる立体配座を採用する（図６Ｄ）。事実、Ｂ環の位
置は、それがＤＥＳ構造において採用する同一の立体配座の採用から、１つの残
基、Ｍｅｔ４２１の側鎖を正確に排除する（図６Ｂ及び６Ｃ）。これらのＢ環が
誘導した側鎖の立体配座の結果として、ＤＥＳ複合体に存在する多くの分子間フ
ァンデルワールス接触はＯＨＴ複合体には存在しない。例えばＭｅｔ４２１は、
前記作用薬においてヘリックス１１由来のＨｉｓ５２４と接して及びヘリックス
３由来のＭｅｔ３４３と接して集合するが、拮抗薬複合体において、それはこれ
らの残基のいずれかとの相互作用から、ＯＨＴのＢ環の位置によって排除される
（図６Ｄ）。
の末端にＤＥＳ及びＥ2の異なる構造的特徴を採用させる同一の機構によって適
応させられない様である。その代わりに、Ｂ環と接触する残基（Ｍｅｔ３４３，
Ｌｅｕ３４６，Ｍｅｔ４２１，Ｉｌｅ４２４，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４及び
Ｌｅｕ５２５）の多くかまたＤＥＳのＡ’環と相互作用し、それらがＤＥＳ構造
において採用するものと異なる立体配座を採用する（図６Ｄ）。事実、Ｂ環の位
置は、それがＤＥＳ構造において採用する同一の立体配座の採用から、１つの残
基、Ｍｅｔ４２１の側鎖を正確に排除する（図６Ｂ及び６Ｃ）。これらのＢ環が
誘導した側鎖の立体配座の結果として、ＤＥＳ複合体に存在する多くの分子間フ
ァンデルワールス接触はＯＨＴ複合体には存在しない。例えばＭｅｔ４２１は、
前記作用薬においてヘリックス１１由来のＨｉｓ５２４と接して及びヘリックス
３由来のＭｅｔ３４３と接して集合するが、拮抗薬複合体において、それはこれ
らの残基のいずれかとの相互作用から、ＯＨＴのＢ環の位置によって排除される
（図６Ｄ）。
【０１２３】 Ｂ環の位置の構造的な作用は、Ｂ環と接触する残基に限定されず；これらの残
基の立体配座は、前記結合ポケットを通して他の残基に別の立体配座を順番に採
用される。例えば、ＯＨＴ複合体のＭｅｔ４２１によって採用される立体配座は
、Ｐｈｅ４０４及びＰｈｅ４２５の側鎖に、それらがＤＥＳ複合体において取る
位置を占めさせない（図６Ｂ及び６Ｃ）。結果として、Ｐｈｅ４０４は、それが
ＤＥＳ又はＥ2のＡ環で行う様な、ＯＨＴのＡ環とのファンデルワールス接触の
形成をしない（図６Ｃ）。事実、Ｐｈｅ４０４はＯＨＴのエチル基と接触だけを
行う（図６Ｃ及び６Ｄ）。Ｂ環と直接接触する残基及びそれによって間接的に影
響を受けるもの、その両方の側鎖の別の立体配座は、結合ポケットを通して主鎖
に異なる立体配座も採用させる（図６Ｄ）。
基の立体配座は、前記結合ポケットを通して他の残基に別の立体配座を順番に採
用される。例えば、ＯＨＴ複合体のＭｅｔ４２１によって採用される立体配座は
、Ｐｈｅ４０４及びＰｈｅ４２５の側鎖に、それらがＤＥＳ複合体において取る
位置を占めさせない（図６Ｂ及び６Ｃ）。結果として、Ｐｈｅ４０４は、それが
ＤＥＳ又はＥ2のＡ環で行う様な、ＯＨＴのＡ環とのファンデルワールス接触の
形成をしない（図６Ｃ）。事実、Ｐｈｅ４０４はＯＨＴのエチル基と接触だけを
行う（図６Ｃ及び６Ｄ）。Ｂ環と直接接触する残基及びそれによって間接的に影
響を受けるもの、その両方の側鎖の別の立体配座は、結合ポケットを通して主鎖
に異なる立体配座も採用させる（図６Ｄ）。
【０１２４】 ＥＲαのリガンド結合ドメイン内の鍵となる残基の同定及び特徴づけ並びに他
の核受容体へのこの情報の拡大は、これらの残基が現在までに同定された全ての
核受容体にとって一般的であることを示す。従って、本明細書に存在する例は、
ＥＲαのリガンド結合ドメインの構造及び機能に由来する情報を、核受容体ファ
ミリーの全メンバーのための、核受容体との化合物の結合を調節する化合物の設
計及び選択に適用することができることを証明する。
の核受容体へのこの情報の拡大は、これらの残基が現在までに同定された全ての
核受容体にとって一般的であることを示す。従って、本明細書に存在する例は、
ＥＲαのリガンド結合ドメインの構造及び機能に由来する情報を、核受容体ファ
ミリーの全メンバーのための、核受容体との化合物の結合を調節する化合物の設
計及び選択に適用することができることを証明する。
【０１２５】 この明細書において述べた全ての出版物及び特許出願は、それぞれの個々の出
版物又は特許出願が引用によって組入れられることが具体的に及び個々に指され
るならば、同一の範囲まで引用によって本明細書に組入れられる。 現在、完全に記述された本発明は、当業者にとって、多くの変化及び修飾が、
添付の請求項の精神又は範囲を外れること無しに行われることがあることは明ら
かであろう。
版物又は特許出願が引用によって組入れられることが具体的に及び個々に指され
るならば、同一の範囲まで引用によって本明細書に組入れられる。 現在、完全に記述された本発明は、当業者にとって、多くの変化及び修飾が、
添付の請求項の精神又は範囲を外れること無しに行われることがあることは明ら
かであろう。
【０１２６】
【表３】
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
【表５】
【０１２９】
【表６】
【０１３０】
【表７】
【０１３１】
【表８】
【０１３２】
【表９】
【０１３３】
【表１０】
【０１３４】
【表１１】
【０１３５】
【表１２】
【０１３６】
【表１３】
【０１３７】
【表１４】
【０１３８】
【表１５】
【０１３９】
【表１６】
【０１４０】
【表１７】
【０１４１】
【表１８】
【０１４２】
【表１９】
【０１４３】
【表２０】
【０１４４】
【表２１】
【０１４５】
【表２２】
【０１４６】
【表２３】
【０１４７】
【表２４】
【０１４８】
【表２５】
【０１４９】
【表２６】
【０１５０】
【表２７】
【０１５１】
【表２８】
【０１５２】
【表２９】
【０１５３】
【表３０】
【０１５４】
【表３１】
【０１５５】
【表３２】
【０１５６】
【表３３】
【０１５７】
【表３４】
【０１５８】
【表３５】
【０１５９】
【表３６】
【０１６０】
【表３７】
【０１６１】
【表３８】
【０１６２】
【表３９】
【０１６３】
【表４０】
【０１６４】
【表４１】
【０１６５】
【表４２】
【０１６６】
【表４３】
【０１６７】
【表４４】
【０１６８】
【表４５】
【０１６９】
【表４６】
【０１７０】
【表４７】
【０１７１】
【表４８】
【０１７２】
【表４９】
【０１７３】
【表５０】
【０１７４】
【表５１】
【０１７５】
【表５２】
【０１７６】
【表５３】
【０１７７】
【表５４】
【０１７８】
【表５５】
【０１７９】
【表５６】
【０１８０】
【表５７】
【０１８１】
【表５８】
【０１８２】
【表５９】
【０１８３】
【表６０】
【０１８４】
【表６１】
【０１８５】
【表６２】
【０１８６】
【表６３】
【０１８７】
【表６４】
【０１８８】
【表６５】
【０１８９】
【表６６】
【０１９０】
【表６７】
【０１９１】
【表６８】
【０１９２】
【表６９】
【０１９３】
【表７０】
【０１９４】
【表７１】
【０１９５】
【表７２】
【０１９６】
【表７３】
【０１９７】
【表７４】
【０１９８】
【表７５】
【０１９９】
【表７６】
【０２００】
【表７７】
【０２０１】
【表７８】
【０２０２】
【表７９】
【０２０３】
【表８０】
【０２０４】
【表８１】
【０２０５】
【表８２】
【０２０６】
【表８３】
【０２０７】
【表８４】
【０２０８】
【表８５】
【０２０９】
【表８６】
【０２１０】
【表８７】
【０２１１】
【表８８】
【０２１２】
【表８９】
【０２１３】
【表９０】
【０２１４】
【表９１】
【０２１５】
【表９２】
【０２１６】
【表９３】
【０２１７】
【表９４】
【０２１８】
【表９５】
【０２１９】
【表９６】
【０２２０】
【表９７】
【０２２１】
【表９８】
【０２２２】
【表９９】
【０２２３】
【表１００】
【０２２４】
【表１０１】
【０２２５】
【表１０２】
【０２２６】
【表１０３】
【０２２７】
【表１０４】
【０２２８】
【表１０５】
【０２２９】
【表１０６】
【０２３０】
【表１０７】
【０２３１】
【表１０８】
【０２３２】
【表１０９】
【０２３３】
【表１１０】
【０２３４】
【表１１１】
【０２３５】
【表１１２】
【０２３６】
【表１１３】
【０２３７】
【表１１４】
【０２３８】
【表１１５】
【０２３９】
【表１１６】
【０２４０】
【表１１７】
【０２４１】
【表１１８】
【０２４２】
【表１１９】
【０２４３】
【表１２０】
【０２４４】
【表１２１】
【０２４５】
【表１２２】
【０２４６】
【表１２３】
【０２４７】
【表１２４】
【０２４８】
【表１２５】
【０２４９】
【表１２６】
【０２５０】
【表１２７】
【０２５１】
【表１２８】
【０２５２】
【表１２９】
【０２５３】
【表１３０】
【０２５４】
【表１３１】
【０２５５】
【表１３２】
【０２５６】
【表１３３】
【０２５７】
【表１３４】
【配列表】
【図１Ａ】 図１は、前記複合体の電子密度の立体図を提供し、ここで図１ＡはＤＥＳ−Ｅ
ＲαＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体の電子密度の立体図で
ある。
ＲαＬＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチド複合体の電子密度の立体図で
ある。
【図１Ｂ】 図１ＢはＯＨＴ−ＥＲαＬＢＤ複合体の電子密度の立体図である。図１はＢＯ
ＢＳＣＲＩＰＴ（Esnouf, J. Mol. Graph. Model. 15, 132-4, 112-3 (1997)）
を用いて作製され、そしてＲａｓｔｅｒ３Ｄ（Merritt, et al., Acta Crystall
ogr. D 50 : 869-873 (1994)）を用いて与えられた白黒の図である。
ＢＳＣＲＩＰＴ（Esnouf, J. Mol. Graph. Model. 15, 132-4, 112-3 (1997)）
を用いて作製され、そしてＲａｓｔｅｒ３Ｄ（Merritt, et al., Acta Crystall
ogr. D 50 : 869-873 (1994)）を用いて与えられた白黒の図である。
【図２Ａ−１】 図２は上述の様にＢＯＢＳＣＲＩＰＴを用いて作製され、そしてＲａｓｔｅｒ
３Ｄを用いて与えられた。図２Ａは２つの直交した図におけるＤＥＳ−ＥＲαＬ
ＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの全体構造を示す。
３Ｄを用いて与えられた。図２Ａは２つの直交した図におけるＤＥＳ−ＥＲαＬ
ＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの全体構造を示す。
【図２Ａ−２】 図２は上述の様にＢＯＢＳＣＲＩＰＴを用いて作製され、そしてＲａｓｔｅｒ
３Ｄを用いて与えられた。図２Ａは２つの直交した図におけるＤＥＳ−ＥＲαＬ
ＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの全体構造を示す。
３Ｄを用いて与えられた。図２Ａは２つの直交した図におけるＤＥＳ−ＥＲαＬ
ＢＤ−ＧＲＩＰ１ ＮＲボックスIIペプチドの全体構造を示す。
【図２Ｂ−１】 図２Ｂは、図２Ａの作用薬複合体のものに類似している２つの直交図における
ＯＨＴ−ＥＲαＬＢＤの全体構造を示す。
ＯＨＴ−ＥＲαＬＢＤの全体構造を示す。
【図２Ｂ−２】 図２Ｂは、図２Ａの作用薬複合体のものに類似している２つの直交図における
ＯＨＴ−ＥＲαＬＢＤの全体構造を示す。
ＯＨＴ−ＥＲαＬＢＤの全体構造を示す。
【図３Ａ】 図３Ａ及び３Ｂは、上述の様にＢＯＢＳＣＲＩＰＴを用いて作製され、そして
Ｒａｓｔｅｒ３Ｄを用いて与えられた。図３ＡはＬＢＤに結合したコアクチベー
ターペプチド、すなわちＮＲボックスIIペプチド／ＬＢＤの界面の拡大図を示す
。前記ペプチドと相互作用しないＬＢＤの領域は、明快にするために削除された
。ヘリックス３，４及び５は、それぞれＨ３，Ｈ４及びＨ５と名付けられた。前
記ペプチドと相互作用する受容体残基の側鎖を、Ｌｙｓ３６２（青）及びＧｌｕ
５４２（赤）を除いて表わし、前記側鎖は原子型によって着色した（炭素及び硫
黄原子は緑色であり、酸素原子は赤色であり、そして窒素原子は青色である）。
ヘリックス１２はマゼンタ色である。金色の前記ペプチドをＣαのらせんとして
表わし；Ｉｌｅ６８９及び３つのモチーフのロイシン（Ｌｅｕ６９０，Ｌｅｕ６
９３及びＬｅｕ６９４）のみを表す（図３Ｃ）。
Ｒａｓｔｅｒ３Ｄを用いて与えられた。図３ＡはＬＢＤに結合したコアクチベー
ターペプチド、すなわちＮＲボックスIIペプチド／ＬＢＤの界面の拡大図を示す
。前記ペプチドと相互作用しないＬＢＤの領域は、明快にするために削除された
。ヘリックス３，４及び５は、それぞれＨ３，Ｈ４及びＨ５と名付けられた。前
記ペプチドと相互作用する受容体残基の側鎖を、Ｌｙｓ３６２（青）及びＧｌｕ
５４２（赤）を除いて表わし、前記側鎖は原子型によって着色した（炭素及び硫
黄原子は緑色であり、酸素原子は赤色であり、そして窒素原子は青色である）。
ヘリックス１２はマゼンタ色である。金色の前記ペプチドをＣαのらせんとして
表わし；Ｉｌｅ６８９及び３つのモチーフのロイシン（Ｌｅｕ６９０，Ｌｅｕ６
９３及びＬｅｕ６９４）のみを表す（図３Ｃ）。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、コアクチベーター結合部位の一部に結合したヘリックス１２を示す
ＯＨＴ−ＬＢＤ複合体の拡大図としてヘリックス１２／ＬＢＤを示す。ヘリック
ス１２と相互作用する残基の側鎖のみを示す（明快にするために削除するＨｉｓ
３７３の側鎖を除く）。Ｌｙｓ３６２（青）及びＧｌｕ３８０（赤）を除き、前
記側鎖は図３Ａに示した様に、原子型によって着色される。残基５３０〜５５１
はＣαのらせんとして表され；残基５３６〜５４４はマゼンタで着色される。Ｌ
ｅｕ５３６，Ｔｙｒ５３７，Ｌｅｕ５４０，Ｍｅｔ５４３及びＬｅｕ５４４を示
す。
ＯＨＴ−ＬＢＤ複合体の拡大図としてヘリックス１２／ＬＢＤを示す。ヘリック
ス１２と相互作用する残基の側鎖のみを示す（明快にするために削除するＨｉｓ
３７３の側鎖を除く）。Ｌｙｓ３６２（青）及びＧｌｕ３８０（赤）を除き、前
記側鎖は図３Ａに示した様に、原子型によって着色される。残基５３０〜５５１
はＣαのらせんとして表され；残基５３６〜５４４はマゼンタで着色される。Ｌ
ｅｕ５３６，Ｔｙｒ５３７，Ｌｅｕ５４０，Ｍｅｔ５４３及びＬｅｕ５４４を示
す。
【図３Ｃ】 図３ＣはＧＲＡＳＰにおいて計算した様な、正（青）及び負（赤）の領域とし
てＮＲボックスIIペプチドに結合したＥＲαＬＢＤの静電的な表面を示す分子表
面の図である。前記コアクチベーターペプチドは図３Ａの様に表わされ、そして
この図は図３Ａのそれに等しい。Ｌｅｕ６９０及びＬｅｕ６９４の側鎖は、疎水
性の溝に結合し、そしてＩｌｅ６８９及びＬｅｕ６９３のそれらはこの溝の縁に
もたれる。
てＮＲボックスIIペプチドに結合したＥＲαＬＢＤの静電的な表面を示す分子表
面の図である。前記コアクチベーターペプチドは図３Ａの様に表わされ、そして
この図は図３Ａのそれに等しい。Ｌｅｕ６９０及びＬｅｕ６９４の側鎖は、疎水
性の溝に結合し、そしてＩｌｅ６８９及びＬｅｕ６９３のそれらはこの溝の縁に
もたれる。
【図３Ｄ】 図３ＤはＯＨＴと複合したＥＲαＬＢＤの静電的表面を示し；図３Ｃの様に正
（青）及び負（赤）の領域を示す。残基５３０〜５１１は図３Ｂの様に表わされ
、そしてこの図は図３Ｂのそれと等しい。Ｌｅｕ５４０及びＬｅｕ５４４の側鎖
は前記の疎水性の溝に埋められているが、Ｍｅｔ５４３のそれはこの溝の縁に沿
って存在する。
（青）及び負（赤）の領域を示す。残基５３０〜５１１は図３Ｂの様に表わされ
、そしてこの図は図３Ｂのそれと等しい。Ｌｅｕ５４０及びＬｅｕ５４４の側鎖
は前記の疎水性の溝に埋められているが、Ｍｅｔ５４３のそれはこの溝の縁に沿
って存在する。
【図４Ａ】 図４ＡはＬＩＧＰＬＯＴ（Wallace, et al., Protein Eng. 8 : 127-34 (1995
)）を用いて作製され、そしてＬＢＤとのＤＥＳの相互作用を図示する概略の線
図を提供する。前記リガンドと相互作用する残基は、ほとんどそれらの実際の位
置で示される。リガンドとのファンデルワールス接触を形成する残基は、それら
が相互作用するリガンドの原子に対して面するラジカルのスポークで標識された
アークとして表わされる。リガンドと水素結合する残基を球及び棒の図で示す。
水素結合は藍色の点線として表わされ、各結合の距離が与えられる。前記リガン
ド及び個々のリガンドの原子を表す。
)）を用いて作製され、そしてＬＢＤとのＤＥＳの相互作用を図示する概略の線
図を提供する。前記リガンドと相互作用する残基は、ほとんどそれらの実際の位
置で示される。リガンドとのファンデルワールス接触を形成する残基は、それら
が相互作用するリガンドの原子に対して面するラジカルのスポークで標識された
アークとして表わされる。リガンドと水素結合する残基を球及び棒の図で示す。
水素結合は藍色の点線として表わされ、各結合の距離が与えられる。前記リガン
ド及び個々のリガンドの原子を表す。
【図４Ｂ】 図４はＬＩＧＰＬＯＴ（Wallace, et al., Protein Eng. 8 : 127-34 (1995)
）を用いて作製され、そしてリガンド結合ポケットとのＯＨＴの相互作用を図示
する概略の線図を提供する。前記リガンドと相互作用する残基は、ほとんどそれ
らの実際の位置で示される。リガンドとのファンデルワールス接触を形成する残
基は、それらが相互作用するリガンドの原子に対して面するラジカルのスポーク
で標識されたアークとして表わされる。リガンドと水素結合する残基を球及び棒
の図で示す。水素結合は藍色の点線として表わされ、各結合の距離が与えられる
。前記リガンド及び個々のリガンドの原子を表す。
）を用いて作製され、そしてリガンド結合ポケットとのＯＨＴの相互作用を図示
する概略の線図を提供する。前記リガンドと相互作用する残基は、ほとんどそれ
らの実際の位置で示される。リガンドとのファンデルワールス接触を形成する残
基は、それらが相互作用するリガンドの原子に対して面するラジカルのスポーク
で標識されたアークとして表わされる。リガンドと水素結合する残基を球及び棒
の図で示す。水素結合は藍色の点線として表わされ、各結合の距離が与えられる
。前記リガンド及び個々のリガンドの原子を表す。
【図５Ａ】 図５は上述の様にＢＯＢＳＣＲＩＰＴを用いて作製され、そしてＲａｓｔｅｒ
３Ｄを用いて与えられ、そしてＯＨＴ複合体及びＮＲボックスIIペプチド由来の
ヘリックス１２の比較を示す。図５Ａは立体図である。ＯＨＴ−ＬＢＤ複合体及
びＤＥＳ−ＬＢＤ−ＮＲボックスIIペプチド複合体は、ＬＢＤの残基３０６〜５
２６のＣα配位を用いて覆われた。ＤＥＳ−ＬＢＤ−コアクチベーターペプチド
複合体由来のヘリックス１２を明快にするために削除した。ＯＨＴ複合体由来の
残基５３６〜５５１（ヘリックス１２＝残基５３６〜５４４）はマゼンタ色であ
り、そして前記ペプチドは金色である。Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基とヘリック
ス１２の残基５４３及び５４４の主鎖のカルボニルとの間の水素結合をマゼンタ
色の点線で図示する。Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基とコアクチベーターペプチド
の残基６９３及び６９６の主鎖のカルボニルとの間の水素結合は、オレンジ色の
点線として表される。以下の略語をヘリックス１２上で用いる：Ｌ５４０＝Ｌｅ
ｕ５４０，Ｍ５４３＝Ｍｅｔ５４３、及びＬ５４４＝Ｌｅｕ５４４。以下の略語
を前記ペプチド上で使用する：Ｌ６９０＝Ｌｅｕ６９０，Ｌ６９３＝Ｌｅｕ６９
３及びＬ６９４＝Ｌｅｕ６９４。
３Ｄを用いて与えられ、そしてＯＨＴ複合体及びＮＲボックスIIペプチド由来の
ヘリックス１２の比較を示す。図５Ａは立体図である。ＯＨＴ−ＬＢＤ複合体及
びＤＥＳ−ＬＢＤ−ＮＲボックスIIペプチド複合体は、ＬＢＤの残基３０６〜５
２６のＣα配位を用いて覆われた。ＤＥＳ−ＬＢＤ−コアクチベーターペプチド
複合体由来のヘリックス１２を明快にするために削除した。ＯＨＴ複合体由来の
残基５３６〜５５１（ヘリックス１２＝残基５３６〜５４４）はマゼンタ色であ
り、そして前記ペプチドは金色である。Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基とヘリック
ス１２の残基５４３及び５４４の主鎖のカルボニルとの間の水素結合をマゼンタ
色の点線で図示する。Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基とコアクチベーターペプチド
の残基６９３及び６９６の主鎖のカルボニルとの間の水素結合は、オレンジ色の
点線として表される。以下の略語をヘリックス１２上で用いる：Ｌ５４０＝Ｌｅ
ｕ５４０，Ｍ５４３＝Ｍｅｔ５４３、及びＬ５４４＝Ｌｅｕ５４４。以下の略語
を前記ペプチド上で使用する：Ｌ６９０＝Ｌｅｕ６９０，Ｌ６９３＝Ｌｅｕ６９
３及びＬ６９４＝Ｌｅｕ６９４。
【図５Ｂ】 図５は上述の様にＢＯＢＳＣＲＩＰＴを用いて作製され、そしてＲａｓｔｅｒ
３Ｄを用いて与えられ、そしてＯＨＴ複合体及びＮＲボックスIIペプチド由来の
ヘリックス１２の比較を示す。図５Ｂは立体図である。ＯＨＴ−ＬＢＤ複合体及
びＤＥＳ−ＬＢＤ−ＮＲボックスIIペプチド複合体は、ＬＢＤの残基３０６〜５
２６のＣα配位を用いて覆われた。ＤＥＳ−ＬＢＤ−コアクチベーターペプチド
複合体由来のヘリックス１２を明快にするために削除した。ＯＨＴ複合体由来の
残基５３６〜５５１（ヘリックス１２＝残基５３６〜５４４）はマゼンタ色であ
り、そして前記ペプチドは金色である。Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基とヘリック
ス１２の残基５４３及び５４４の主鎖のカルボニルとの間の水素結合をマゼンタ
色の点線で図示する。Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基とコアクチベーターペプチド
の残基６９３及び６９６の主鎖のカルボニルとの間の水素結合は、オレンジ色の
点線として表される。以下の略語をヘリックス１２上で用いる：Ｌ５４０＝Ｌｅ
ｕ５４０，Ｍ５４３＝Ｍｅｔ５４３、及びＬ５４４＝Ｌｅｕ５４４。以下の略語
を前記ペプチド上で使用する：Ｌ６９０＝Ｌｅｕ６９０，Ｌ６９３＝Ｌｅｕ６９
３及びＬ６９４＝Ｌｅｕ６９４。
３Ｄを用いて与えられ、そしてＯＨＴ複合体及びＮＲボックスIIペプチド由来の
ヘリックス１２の比較を示す。図５Ｂは立体図である。ＯＨＴ−ＬＢＤ複合体及
びＤＥＳ−ＬＢＤ−ＮＲボックスIIペプチド複合体は、ＬＢＤの残基３０６〜５
２６のＣα配位を用いて覆われた。ＤＥＳ−ＬＢＤ−コアクチベーターペプチド
複合体由来のヘリックス１２を明快にするために削除した。ＯＨＴ複合体由来の
残基５３６〜５５１（ヘリックス１２＝残基５３６〜５４４）はマゼンタ色であ
り、そして前記ペプチドは金色である。Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基とヘリック
ス１２の残基５４３及び５４４の主鎖のカルボニルとの間の水素結合をマゼンタ
色の点線で図示する。Ｌｙｓ３６２のε−アミノ基とコアクチベーターペプチド
の残基６９３及び６９６の主鎖のカルボニルとの間の水素結合は、オレンジ色の
点線として表される。以下の略語をヘリックス１２上で用いる：Ｌ５４０＝Ｌｅ
ｕ５４０，Ｍ５４３＝Ｍｅｔ５４３、及びＬ５４４＝Ｌｅｕ５４４。以下の略語
を前記ペプチド上で使用する：Ｌ６９０＝Ｌｅｕ６９０，Ｌ６９３＝Ｌｅｕ６９
３及びＬ６９４＝Ｌｅｕ６９４。
【図６Ａ】 図６Ａは、上述の様にＢＯＢＳＣＲＩＰＴを用いて作製され、そしてＲａｓｔ
ｅｒ３Ｄを用いて提供された。図６ＡはＤＥＳ複合体（コアクチベーターペプチ
ド無し）のリボン図として、異なるＬＢＤ立体配座を促進する作用薬及び拮抗薬
を示し、ＯＨＴ複合体及びＥ2複合体、それ自身はTanenbaum, et al., supraに
記載されている。前記ホルモンを充間モデルにおいて示す。各複合体において、
ヘリックス１２はマゼンタ色であり、そして残基３３９〜３４１、４２１〜４２
３、及び５２７〜５３０は赤で示される。ヘリックス３，８及び１１（それぞれ
Ｈ３，Ｈ８及びＨ１１）は、ＤＥＳ複合体において示される。
ｅｒ３Ｄを用いて提供された。図６ＡはＤＥＳ複合体（コアクチベーターペプチ
ド無し）のリボン図として、異なるＬＢＤ立体配座を促進する作用薬及び拮抗薬
を示し、ＯＨＴ複合体及びＥ2複合体、それ自身はTanenbaum, et al., supraに
記載されている。前記ホルモンを充間モデルにおいて示す。各複合体において、
ヘリックス１２はマゼンタ色であり、そして残基３３９〜３４１、４２１〜４２
３、及び５２７〜５３０は赤で示される。ヘリックス３，８及び１１（それぞれ
Ｈ３，Ｈ８及びＨ１１）は、ＤＥＳ複合体において示される。
【図６Ｂ】 図６ＢはＭｉｄａｓ Ｐｌｕｓ（Huang, et al., J. Mol. Graph. 9 : 230-6, 2
42 (1991)）で作製された。図６Ｂはリガンドが結合する穴において結合したＤ
ＥＳを示す。前記リガンドを示すＤＥＳ（緑）に結合したＬＢＤの充間モデルの
断面図は前記のリガンドが結合している穴に完全に埋まる。ＤＥＳのＡ´環（Ａ
´）、Ｐｈｅ４０４（４０４）、Ｍｅｔ４２１（４２１）及びＰｈｅ４２５（４
２５）を示す。Ｍｅｔ４２１の側鎖の炭素原子はマゼンタ色であり、そして窒素
原子は黄色である。
42 (1991)）で作製された。図６Ｂはリガンドが結合する穴において結合したＤ
ＥＳを示す。前記リガンドを示すＤＥＳ（緑）に結合したＬＢＤの充間モデルの
断面図は前記のリガンドが結合している穴に完全に埋まる。ＤＥＳのＡ´環（Ａ
´）、Ｐｈｅ４０４（４０４）、Ｍｅｔ４２１（４２１）及びＰｈｅ４２５（４
２５）を示す。Ｍｅｔ４２１の側鎖の炭素原子はマゼンタ色であり、そして窒素
原子は黄色である。
【図６Ｃ】 図６ＣはＭｉｄａｓＰｌｕｓを用いて作製された。図６Ｃは前記のリガンド結
合ポケットにおいて結合したＯＨＴ（赤）の充間モデルの断面図である。この図
は図６Ｂのそれに等しい。ＯＨＴのＢ環（Ｂ）、Ｐｈｅ４０４（４０４）、Ｍｅ
ｔ４２１（４２１）及びＰｈｅ４２５（４２５）を表わす。Ｍｅｔ４２１の側鎖
の色は図６Ｂと同じである。Ｂ環の立体配座はＭｅｔ４２１に、それがＤＥＳ複
合体において採用するものと異なる立体配座を採用させる（図６Ｂとの比較）。
合ポケットにおいて結合したＯＨＴ（赤）の充間モデルの断面図である。この図
は図６Ｂのそれに等しい。ＯＨＴのＢ環（Ｂ）、Ｐｈｅ４０４（４０４）、Ｍｅ
ｔ４２１（４２１）及びＰｈｅ４２５（４２５）を表わす。Ｍｅｔ４２１の側鎖
の色は図６Ｂと同じである。Ｂ環の立体配座はＭｅｔ４２１に、それがＤＥＳ複
合体において採用するものと異なる立体配座を採用させる（図６Ｂとの比較）。
【図６Ｄ−１】 図６Ｄは、上述のＢＯＢＳＣＲＩＰＴを用いて作製され、そしてＲａｓｔｅｒ
３Ｄを用いて提供される。図６Ｄは、ＤＥＳ（緑）及びＯＨＴ（赤）に結合した
リガンド結合ポケットの比較を提供する。ＯＨＴ複合体及びＤＥＳ複合体の構造
は、図５と重複した。両リガンドのＡ環はそのページの外側を向き；ＯＨＴのＢ
環及びＤＥＳのＡ環はそのページの内側を向いている。ＯＨＴに結合したＬＢＤ
は青色であり、そしてＤＥＳに結合したＬＢＤはライトブルー−グレイである。
立体配座が前記の２つの複合体間で劇的に異なる残基のいくつかの側鎖を表わす
；Ｍｅｔ３４２（３４２），Ｍｅｔ３４３（３４３），Ｐｈｅ４０４（４０４）
，Ｍｅｔ４２１（４２１），Ｉｌｅ４２４（４２４），Ｐｈｅ４２５（４２５）
，Ｈｉｓ５２４（５２４），Ｌｅｕ５２５（５２５），Ｍｅｔ５２８（５２８）
。Ｍｅｔ４２１の窒素原子は両方の構造において黄色である。
３Ｄを用いて提供される。図６Ｄは、ＤＥＳ（緑）及びＯＨＴ（赤）に結合した
リガンド結合ポケットの比較を提供する。ＯＨＴ複合体及びＤＥＳ複合体の構造
は、図５と重複した。両リガンドのＡ環はそのページの外側を向き；ＯＨＴのＢ
環及びＤＥＳのＡ環はそのページの内側を向いている。ＯＨＴに結合したＬＢＤ
は青色であり、そしてＤＥＳに結合したＬＢＤはライトブルー−グレイである。
立体配座が前記の２つの複合体間で劇的に異なる残基のいくつかの側鎖を表わす
；Ｍｅｔ３４２（３４２），Ｍｅｔ３４３（３４３），Ｐｈｅ４０４（４０４）
，Ｍｅｔ４２１（４２１），Ｉｌｅ４２４（４２４），Ｐｈｅ４２５（４２５）
，Ｈｉｓ５２４（５２４），Ｌｅｕ５２５（５２５），Ｍｅｔ５２８（５２８）
。Ｍｅｔ４２１の窒素原子は両方の構造において黄色である。
【図６Ｄ−２】 図６Ｄは、上述のＢＯＢＳＣＲＩＰＴを用いて作製され、そしてＲａｓｔｅｒ
３Ｄを用いて提供される。図６Ｄは、ＤＥＳ（緑）及びＯＨＴ（赤）に結合した
リガンド結合ポケットの比較を提供する。ＯＨＴ複合体及びＤＥＳ複合体の構造
は、図５と重複した。両リガンドのＡ環はそのページの外側を向き；ＯＨＴのＢ
環及びＤＥＳのＡ環はそのページの内側を向いている。ＯＨＴに結合したＬＢＤ
は青色であり、そしてＤＥＳに結合したＬＢＤはライトブルー−グレイである。
立体配座が前記の２つの複合体間で劇的に異なる残基のいくつかの側鎖を表わす
；Ｍｅｔ３４２（３４２），Ｍｅｔ３４３（３４３），Ｐｈｅ４０４（４０４）
，Ｍｅｔ４２１（４２１），Ｉｌｅ４２４（４２４），Ｐｈｅ４２５（４２５）
，Ｈｉｓ５２４（５２４），Ｌｅｕ５２５（５２５），Ｍｅｔ５２８（５２８）
。Ｍｅｔ４２１の窒素原子は両方の構造において黄色である。
３Ｄを用いて提供される。図６Ｄは、ＤＥＳ（緑）及びＯＨＴ（赤）に結合した
リガンド結合ポケットの比較を提供する。ＯＨＴ複合体及びＤＥＳ複合体の構造
は、図５と重複した。両リガンドのＡ環はそのページの外側を向き；ＯＨＴのＢ
環及びＤＥＳのＡ環はそのページの内側を向いている。ＯＨＴに結合したＬＢＤ
は青色であり、そしてＤＥＳに結合したＬＢＤはライトブルー−グレイである。
立体配座が前記の２つの複合体間で劇的に異なる残基のいくつかの側鎖を表わす
；Ｍｅｔ３４２（３４２），Ｍｅｔ３４３（３４３），Ｐｈｅ４０４（４０４）
，Ｍｅｔ４２１（４２１），Ｉｌｅ４２４（４２４），Ｐｈｅ４２５（４２５）
，Ｈｉｓ５２４（５２４），Ｌｅｕ５２５（５２５），Ｍｅｔ５２８（５２８）
。Ｍｅｔ４２１の窒素原子は両方の構造において黄色である。
【図７】 図７は拮抗薬の働きのモデルを図解する。作用薬（白三角）の結合はコアクチ
ベーター（黄色）の結合を促進するＬＢＤの立体配座を安定化する。残基５２７
〜５３０（赤）はヘリックス１１（青）の一部であり、ヘリックス間のループの
長さは、ヘリックス１２（マゼンタ）が転写活性に関与する表面の静電的領域へ
結合するのを妨害する。拮抗薬（白十字）の側鎖はリガンド結合ポケットの外の
位置からヘリックスを除く。残基５２７〜５３０（赤）はリガンド結合ポケット
の内側及び周囲の拮抗薬がもたらす構造的な変化の結果として、伸長した立体配
座を採用する。ヘリックス１１と１２の間のループの長さは、この表面の静電的
領域への結合及びコアクチベーター認識の阻害をヘリックス１２にさせる。
ベーター（黄色）の結合を促進するＬＢＤの立体配座を安定化する。残基５２７
〜５３０（赤）はヘリックス１１（青）の一部であり、ヘリックス間のループの
長さは、ヘリックス１２（マゼンタ）が転写活性に関与する表面の静電的領域へ
結合するのを妨害する。拮抗薬（白十字）の側鎖はリガンド結合ポケットの外の
位置からヘリックスを除く。残基５２７〜５３０（赤）はリガンド結合ポケット
の内側及び周囲の拮抗薬がもたらす構造的な変化の結果として、伸長した立体配
座を採用する。ヘリックス１１と１２の間のループの長さは、この表面の静電的
領域への結合及びコアクチベーター認識の阻害をヘリックス１２にさせる。
【図８Ａ】 図８はアミノ酸配列（一文字アミノ酸表記）のアラインメントを示し、これは
いくつかの核受容体のコアクチベーター結合部位を形成する残基を含み：ヒト及
び組換え甲状腺ホルモン（ｈＴＲβ及びｒＴＲα）（配列番号５及び６並びに配
列番号７及び８）、レチノイド（ｈＲＡＲγ及びｈＲＸＲα）（配列番号９及び
１０並びに配列番号１１及び１２）、ペルオキシソーム（ｈＰＰＡＲγ）配列番
号１３及び１４）、ビタミンＤ（ｈＶＤＲ）（配列番号１５及び１６）、エスト
ロゲン（ｈＥＲα）（配列番号１７及び１８）、糖質コルチコイド（ｈＧＲ）（
配列番号１９及び２０）、プロゲスチン（ｈＰＲ）（配列番号２１及び２２）、
鉱質コルチコイド（ｈＭＲ）（配列番号２３及び２４）並びにアンドロゲン（ｈ
ＡＲ）（配列番号２５及び２６）。ボックスはアルファヘリックス（Ｈ３，Ｈ４
，Ｈ５，Ｈ６及びＨ１２）；小文字の“ｈ”及び“ｑ”は、それぞれ疎水性及び
極性の残基を表わす。表の上に番号を付けた位置、２８０，２８１などはｈＴＲ
βの残基に担当する。
いくつかの核受容体のコアクチベーター結合部位を形成する残基を含み：ヒト及
び組換え甲状腺ホルモン（ｈＴＲβ及びｒＴＲα）（配列番号５及び６並びに配
列番号７及び８）、レチノイド（ｈＲＡＲγ及びｈＲＸＲα）（配列番号９及び
１０並びに配列番号１１及び１２）、ペルオキシソーム（ｈＰＰＡＲγ）配列番
号１３及び１４）、ビタミンＤ（ｈＶＤＲ）（配列番号１５及び１６）、エスト
ロゲン（ｈＥＲα）（配列番号１７及び１８）、糖質コルチコイド（ｈＧＲ）（
配列番号１９及び２０）、プロゲスチン（ｈＰＲ）（配列番号２１及び２２）、
鉱質コルチコイド（ｈＭＲ）（配列番号２３及び２４）並びにアンドロゲン（ｈ
ＡＲ）（配列番号２５及び２６）。ボックスはアルファヘリックス（Ｈ３，Ｈ４
，Ｈ５，Ｈ６及びＨ１２）；小文字の“ｈ”及び“ｑ”は、それぞれ疎水性及び
極性の残基を表わす。表の上に番号を付けた位置、２８０，２８１などはｈＴＲ
βの残基に担当する。
【図８Ｂ】 図８はアミノ酸配列（一文字アミノ酸表記）のアラインメントを示し、これは
いくつかの核受容体のコアクチベーター結合部位を形成する残基を含み：ヒト及
び組換え甲状腺ホルモン（ｈＴＲβ及びｒＴＲα）（配列番号５及び６並びに配
列番号７及び８）、レチノイド（ｈＲＡＲγ及びｈＲＸＲα）（配列番号９及び
１０並びに配列番号１１及び１２）、ペルオキシソーム（ｈＰＰＡＲγ）配列番
号１３及び１４）、ビタミンＤ（ｈＶＤＲ）（配列番号１５及び１６）、エスト
ロゲン（ｈＥＲα）（配列番号１７及び１８）、糖質コルチコイド（ｈＧＲ）（
配列番号１９及び２０）、プロゲスチン（ｈＰＲ）（配列番号２１及び２２）、
鉱質コルチコイド（ｈＭＲ）（配列番号２３及び２４）並びにアンドロゲン（ｈ
ＡＲ）（配列番号２５及び２６）。ボックスはアルファヘリックス（Ｈ３，Ｈ４
，Ｈ５，Ｈ６及びＨ１２）；小文字の“ｈ”及び“ｑ”は、それぞれ疎水性及び
極性の残基を表わす。表の上に番号を付けた位置、２８０，２８１などはｈＴＲ
βの残基に担当する。
いくつかの核受容体のコアクチベーター結合部位を形成する残基を含み：ヒト及
び組換え甲状腺ホルモン（ｈＴＲβ及びｒＴＲα）（配列番号５及び６並びに配
列番号７及び８）、レチノイド（ｈＲＡＲγ及びｈＲＸＲα）（配列番号９及び
１０並びに配列番号１１及び１２）、ペルオキシソーム（ｈＰＰＡＲγ）配列番
号１３及び１４）、ビタミンＤ（ｈＶＤＲ）（配列番号１５及び１６）、エスト
ロゲン（ｈＥＲα）（配列番号１７及び１８）、糖質コルチコイド（ｈＧＲ）（
配列番号１９及び２０）、プロゲスチン（ｈＰＲ）（配列番号２１及び２２）、
鉱質コルチコイド（ｈＭＲ）（配列番号２３及び２４）並びにアンドロゲン（ｈ
ＡＲ）（配列番号２５及び２６）。ボックスはアルファヘリックス（Ｈ３，Ｈ４
，Ｈ５，Ｈ６及びＨ１２）；小文字の“ｈ”及び“ｑ”は、それぞれ疎水性及び
極性の残基を表わす。表の上に番号を付けた位置、２８０，２８１などはｈＴＲ
βの残基に担当する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/06 Ａ６１Ｐ 15/08 15/08 19/10 19/10 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/566 Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｆ // Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１１３，０１４ (32)優先日 平成10年12月16日(1998．12．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＵＳ (72)発明者 シオー，アンドリュー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122， サン フランシスコ，ヒューゴ ストリー ト 34，アパートメント ＃13 (72)発明者 クシュナー，ピーター ジェイ． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122， サン フランシスコ，シックスス アベニ ュ 1362 (72)発明者 アガード，デイビッド エー． アメリカ合衆国，カリフォルニア 94127， サン フランシスコ，ジュアニタ ウェイ 238 (72)発明者 グリーン，ジェフリー エル． アメリカ合衆国，イリノイ 60614，シカ ゴ，リンカーン パーク ウエスト 2020，アパートメント 25エフ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4C084 AA01 AA02 AA07 BA02 NA14 ZA38 ZA70 ZA81 ZA97 ZB26 ZC33 4H045 AA10 AA30 BA10 BA42 CA40 DA30 DA50 EA20 EA50 5B075 ND20 QM10 UU18 UU40
Claims (71)
- 【請求項１】 核受容体活性を調節する化合物の同定方法であって： エストロゲン受容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部の原子構造モデル
を用いて、注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的にはまる試験化合物
をモデリングし、前記リガンド結合ドメインに試験化合物を結合させることを特
徴とするアッセイにおいて、前記試験化合物をスクリーニングし、そして 核受容体活性を調節する試験化合物を同定することを含んで成る方法（ここで
前記原子構造モデルがヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６
，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，
Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈ
ｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基に相当するアミノ酸残基の原
子配位を含んで成る）。 - 【請求項２】 前記アミノ酸残基が残基Ｍｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈｉ
ｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記試験化合物が作用薬であり、そして核受容体活性がコア
クチベーター結合部位へのコアクチベーターの結合によって測定される、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記試験化合物が拮抗薬であり、そして核受容体活性がヘリ
ックス１２の巻き戻しによって測定される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記試験化合物が拮抗薬であり、そして核受容体活性がコア
クチベーターの結合の阻止によって測定される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記スクリーニングがｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項７】 前記スクリーニングが高処理量スクリーニングである、請求
項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記試験化合物が化合物のライブラリー由来である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記試験化合物が小さい有機分子、ペプチド、又はペプチド
擬似体である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記のモデリング段階前に、コンピューターを使用したモ
デリング系に前記コストロゲン受容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部の
原子配位を提供する段階を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記核受容体が、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、レ
チノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン受容体、鉱質コルチコ
イド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容体及びビタミンＤ受容
体から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記核受容体がエストロゲン受容体である、請求項１１に
記載の方法。 - 【請求項１３】 前記エストロゲン受容体が前記エストロゲン受容体αであ
る、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 核受容体に結合するリガンドを調節する化合物の同定方法
であって： 前記エストロゲン受容体αのリガンド結合ドメイン又はその一部の原子構造モ
デルを用いて、注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的にはまる試験化
合物をモデリングし、前記結合ドメインに試験化合物を結合させることを特徴と
するアッセイにおいて、前記試験化合物をスクリーニングし、そして 前記核受容体に結合するリガンドを調節する試験化合物を同定することを含ん
で成る方法（ここで前記原子構造モデルがヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３
４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８
７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８
，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８の残基に相当す
るアミノ酸残基の原子配位を含んで成る）。 - 【請求項１５】 前記アミノ酸残基が残基Ｍｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈ
ｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、請求項１４に記載の方
法。 - 【請求項１６】 前記核受容体が、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、レ
チノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン受容体、鉱質コルチコ
イド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容体及びビタミンＤ受容
体から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記核受容体がエストロゲン受容体である、請求項１６に
記載の方法。 - 【請求項１８】 前記エストロゲン受容体が前記エストロゲン受容体αであ
る、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記スクリーニングがｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項１
４に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記スクリーニングが高処理量スクリーニングである、請
求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記試験化合物が化合物のライブラリー由来である、請求
項１４に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記試験化合物がリガンド結合の作用薬又は拮抗薬である
、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記試験化合物が小さい有機分子、ペプチド、又はペプチ
ド擬似体である、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２４】 核受容体に結合するリンガンドの作用薬又は拮抗薬の同定
方法であって： コンピューターを用いたモデリング系に、前記エストロゲン受容体αのリガン
ド結合ドメイン又はその一部の原子配位を提供し（ここで前記原子配位がヒトエ
ストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５
３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４
，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及
びＭｅｔ５２８の残基に相当するアミノ酸残基から成る）、前記リガンド結合ド
メインに空間的にはまる化合物をモデリングし、核受容体のためのアッセイにお
いて前記核受容体のリガンド結合ドメインを結合させることによって前記核受容
体活性を増大又は減少させる化合物を固定し、それによってリガンド結合の作用
薬又は拮抗薬が固定される段階を含んで成る方法。 - 【請求項２５】 前記アミノ酸残基が残基Ｍｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈ
ｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、請求項２４に記載の方
法。 - 【請求項２６】 前記核受容体が、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、レ
チノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン受容体、鉱質コルチコ
イド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容体及びビタミンＤ受容
体から成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２７】 前記核受容体がエストロゲン受容体である、請求項２６に
記載の方法。 - 【請求項２８】 前記エストロゲン受容体が前記エストロゲン受容体αであ
る、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的に及び選
択的にはまる化合物の十分な量を、それを必要とする哺乳類に投与することによ
って、哺乳類の核受容体活性を調節する方法であって、前記化合物がヒトエスト
ロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，
Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍ
ｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭ
ｅｔ５２８の残基に相当する少なくとも１つのアミノ酸残基をゆがませるために
設計される方法。 - 【請求項３０】 少なくとも１つのアミノ酸残基が、残基Ｍｅｔ３４３，Ｍ
ｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、請求項
２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 前記核受容体が、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、レ
チノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン受容体、鉱質コルチコ
イド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容体及びビタミンＤ受容
体から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。 - 【請求項３２】 前記核受容体がエストロゲン受容体である、請求項３１に
記載の方法。 - 【請求項３３】 前記エストロゲン受容体が前記エストロゲン受容体αであ
る、請求項３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 機械可読のデータの記憶媒体であって、前記データを用い
るための命令でプログラムされた機械を用いるときに、ヒトエストロゲン受容体
αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４
，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，
Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に
相当するアミノ酸の構造配位を含んで成る、核受容体のリガンド結合ドメインに
結合する化合物の核複合体又は前記の分子複合体の相同体の図表による三次元構
造の図を表すことができる、機械可読のデータでコードされたデータの記憶資料
を含んで成る記憶媒体（ここで前記相同体は１．５Å以下の、前記アミノ酸の主
鎖の原子由来の根平均二乗偏差を有するリガンド結合ドメインを含んで成る）。 - 【請求項３５】 前記アミノ酸残基が残基Ｍｅｔ３４３，Ｍｅｔ４２１，Ｈ
ｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、請求項３４に記載の機
械可読のデータ記憶媒体。 - 【請求項３６】 前記核受容体が、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、レ
チノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン受容体、鉱質コルチコ
イド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容体及びビタミンＤ受容
体から成る群から選択される、請求項３４に記載の機械可読のデータ記憶媒体。 - 【請求項３７】 前記核受容体がエストロゲン受容体である、請求項３６に
記載の機械可読のデータ記憶媒体。 - 【請求項３８】 前記エストロゲン受容体が前記エストロゲン受容体αであ
る、請求項３７に記載の機械可読のデータ記憶媒体。 - 【請求項３９】 前記分子複合体が付表１又は付表２に表わされる構造配位
の集合、あるいは前記分子複合体の相同体によって定義され、前記相同体が１．
５Å以下の、前記アミノ酸の主鎖の原子に由来する根平均二乗偏差を有する、請
求項３４に記載の機械可読のデータ記憶媒体。 - 【請求項４０】 第１のデータの集合及び第２のデータの集合を用いるため
の命令でプログラムされた機械を用いて、第２の機械可読のデータの集合で組み
合わされたときに、前記の第２の機械可読のデータの集合に相当する構造配位の
少なくとも一部を決定することができる、第１の機械可読のデータの集合でコー
ドされたデータ記憶資料を含んで成る機械可読のデータ記憶媒体（ここで前記の
第１のデータの集合は、付表１又は付表２に表わされる配位から成る群から選択
される前記構造配位の少なくとも一部のフーリエ変換を含んで成り；そして前記
の第２のデータの集合は、分子又は分子複合体のＸ線回折パターンを含んで成る
）。 - 【請求項４１】 前記核受容体が、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、レ
チノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン受容体、鉱質コルチコ
イド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容体及びビタミンＤ受容
体から成る群から選択される、請求項４０に記載の機械可読のデータ記憶媒体。 - 【請求項４２】 前記核受容体がエストロゲン受容体である、請求項４１に
記載の機械可読のデータ記憶媒体。 - 【請求項４３】 前記エストロゲン受容体が前記エストロゲン受容体αであ
る、請求項４２に記載の機械可読のデータ記憶媒体。 - 【請求項４４】 前記リガンド結合ドメインに結合した作用薬及び前記核受
容体のコアクチベーター結合部位に結合した分子を含んで成る核受容体の共結晶
であって、少なくとも２．０３Åの分解能で偏光する（ｄｅｆｒａｃｔ）前記結
晶。 - 【請求項４５】 前記核受容体が前記エストロゲン受容体αである、請求項
４４に記載の共結晶。 - 【請求項４６】 前記エストロゲン受容体αがヒトである、請求項４５に記
載の共結晶。 - 【請求項４７】 前記分子がペプチドである、請求項４６に記載の共結晶。
- 【請求項４８】 前記ペプチドがＮＲボックスのアミノ酸配列又はその誘導
体を含んで成る、請求項４７に記載の共結晶。 - 【請求項４９】 前記リガンド結合ドメインに結合した拮抗薬を含んで成る
核受容体の共結晶であって、少なくとも１．９Åの分解能で偏光する前記結晶。 - 【請求項５０】 前記核受容体が前記エストロゲン受容体αである、請求項
４９に記載の共結晶。 - 【請求項５１】 前記エストロゲン受容体αがヒトである、請求項５０に記
載の共結晶。 - 【請求項５２】 核受容体のリガンドを設計するためにコンピューターを用
いる方法であって、ここでヒトエストロゲン受容体αのＭｅｔ３４３，Ｌｅｕ３
４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅｕ３８７，Ｌｅｕ３９
１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ４２８，Ｇｌｙ５２１
，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する核受容体ＬＢＤの少
なくとも１つのアミノ酸残基が、前記リガンドの少なくとも１つの第１の化学的
部分と相互作用し、前記の相互作用するアミノ酸と前記の第１の化学的部分との
間の相互作用と比較して、前記の相互作用するアミノ酸と第２の化学的部分との
間の相互作用を減少させるか又は増大させる、いずれかの構造を有する第２の化
学的部分を生成せしめる、第１の化学的部分の少なくとも１つの化学的部分を選
択する段階を含んで成る方法。 - 【請求項５３】 少なくとも１つのアミノ酸残基が、残基Ｍｅｔ３４３，Ｍ
ｅｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、請求項
５２に記載の方法。 - 【請求項５４】 前記の第１の化学的部分の化学的修飾の後、前記の相互作
用するアミノ酸と前記リガンドとの間の相互作用における変化の決定を更に含ん
で成る、請求項５２に記載の方法。 - 【請求項５５】 前記の化学的修飾が、前記の第１の化学的部分及び前記の
相互作用するアミノ酸と比較して、前記の第２の化学的部分と前記の相互作用す
るアミノ酸との間の、水素結合の相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、フ
ァンデルワールス相互作用又は双極子相互作用を増強する、請求項５２に記載の
方法。 - 【請求項５６】 前記の化学的修飾が、前記の第１の化学的部分及び前記の
相互作用するアミノ酸と比較して、前記の第２の化学的部分と前記の相互作用す
るアミノ酸との間の、水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファ
ンデルワールス相互作用又は双極子相互作用を減少させる、請求項５２に記載の
方法。 - 【請求項５７】 前記核受容体が、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、レ
チノイド受容体、糖質コルチコイド受容体、プロゲスチン受容体、鉱質コルチコ
イド受容体、アンドロゲン受容体、ペルオキシソーム受容体及びビタミンＤ受容
体から成る群から選択される、請求項５２に記載の方法。 - 【請求項５８】 前記核受容体がエストロゲン受容体である、請求項５７に
記載の方法。 - 【請求項５９】 前記エストロゲン受容体が前記エストロゲン受容体αであ
る、請求項５２に記載の方法。 - 【請求項６０】 前記リガンドが作用薬である、請求項５９に記載の方法。
- 【請求項６１】 前記リガンドが１７β−エストラジオール、ジエチルスチ
ルベストロール、モクセストロール（ｍｏｘｅｓｔｒｏｌ）、メソヘキセストロ
ール（ｍｅｓｏｈｅｘｅｓｔｒｏｌ）、クメストロール（ｃｏｕｍｅｓｔｒｏｌ
）、Δ9−ＴＨＣ，ｏ，ｐ−ＤＤＴ、ゼアラレノン（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ）
及びケポン（ｋｅｐｏｎｅ）から成る群から選択される、請求項６０に記載の方
法。 - 【請求項６２】 前記リガンドが１７β−エストラジオールであり、そして
前記の第１の化学的部分がＣ６α，Ｃ７α，Ｃ１２α，Ｃ１５α，Ｃ１６α及び
Ｃ１７αから成る群から選択される位置にあるＡ’環の遊離炭素である、請求項
６１に記載の方法。 - 【請求項６３】 前記リガンドが拮抗薬である、請求項５９に記載の方法。
- 【請求項６４】 前記リガンドがＩＣＩ１６４，３８４及びＥＭ８００から
成る群から選択される、請求項６３に記載の方法。 - 【請求項６５】 前記リガンドが選択的なエストロゲン受容体のモジュレー
ターである、請求項５９に記載の方法。 - 【請求項６６】 前記リガンドがタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、
ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）及びＧＷ５６３８から成る群から選択
される、請求項６５に記載の方法。 - 【請求項６７】 注目の核受容体のリガンド結合ドメインに空間的に及び選
択的にはまるリガンドの十分な量を、それを必要とする哺乳類への投与すること
によって哺乳類の核受容体活性を調節する方法であって（ここで前記リガンドは
コンピューターを用いる方法によって設計され、ヒトエストロゲン受容体αのＭ
ｅｔ３４３，Ｌｅｕ３４６，Ａｌａ３５０，Ｇｌｕ３５３，Ｌｅｕ３８４，Ｌｅ
ｕ３８７，Ｌｅｕ３９１，Ａｒｇ３９４，Ｐｈｅ４０４，Ｍｅｔ４２１，Ｌｅｕ
４２８，Ｇｌｙ５２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２４及びＭｅｔ５２８に相当す
る核受容体のリガンド結合ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基が前記リガ
ンドの少なくとも１つの第１の化学的部分と相互作用する）、前記の相互作用す
るアミノ酸と前記の第１の化学的部分との間の相互作用と比較して、前記の相互
作用するアミノ酸と前記の第２の化学的部分との間の相互作用を減少させるか又
は増大させる、いずれかの構造を有する第２の化学的部分を生成せしめる、前記
の第１の化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選択する段階を含んで成る
方法。 - 【請求項６８】 少なくとも１つのアミノ酸残基が残基Ｍｅｔ３４３，Ｍｅ
ｔ４２１，Ｈｉｓ５２４，Ｌｅｕ５２５及びＭｅｔ５２８に相当する、請求項６
７に記載の方法。 - 【請求項６９】 前記リガンドが拮抗薬である、請求項６７に記載の方法。
- 【請求項７０】 前記リガンドが作用薬である、請求項６７に記載の方法。
- 【請求項７１】 コンピューターを用いる方法によって設計されるコアクチ
ベーター擬似体を投与することを更に含んで成る、請求項７０に記載の方法であ
って（ここでヒトエストロゲン受容体αのヘリックス３の残基Ｌｅｕ３５４、Ｖ
ａｌ３５５、Ｍｅｔ３５７、Ｉｌｅ３５８，Ａｌａ３６１及びＬｙｓ３６２、ヘ
リックス４の残基Ｐｈｅ３６７、ヘリックス５の残基Ｇｌｕ３７５，Ｖａｌ３７
６，Ｌｅｕ３７９及びＧｌｕ３８０、ヘリックス６の残基Ｔｒｐ３８３、並びに
ヘリックス１２の残基Ａｓｐ５３８，Ｌｅｕ５３９，Ｇｌｕ５４２，Ｍｅｔ５４
３及びＬｅｕ５４４に相当する、核受容体のコアクチベーター結合部位の少なく
とも１つのアミノ酸残基が、前記コアクチベーター擬似体の少なくとも１つの化
学的部分と相互作用する）、前記の相互作用するアミノ酸と前記の第１の化学的
部分との間の相互作用と比較して、前記の相互作用するアミノ酸と前記の第２の
化学的部分との間の相互作用を減少させるか又は増大させる、いずれかの構造を
有する第２の化学的部分を生成せしめる、前記の第１の化学的部分の少なくとも
１つの化学的修飾を選択する段階を含んで成る前記方法。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7995698P | 1998-03-30 | 1998-03-30 | |
| US60/079,956 | 1998-03-30 | ||
| US11301498P | 1998-12-16 | 1998-12-16 | |
| US11314698P | 1998-12-16 | 1998-12-16 | |
| US60/113,014 | 1998-12-16 | ||
| US60/113,146 | 1998-12-16 | ||
| PCT/US1999/006937 WO1999050658A2 (en) | 1998-03-30 | 1999-03-30 | Methods and compounds for modulating nuclear receptor activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002516983A true JP2002516983A (ja) | 2002-06-11 |
Family
ID=27373576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000541516A Withdrawn JP2002516983A (ja) | 1998-03-30 | 1999-03-30 | 核受容体活性を調節するための方法及び化合物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1144997A3 (ja) |
| JP (1) | JP2002516983A (ja) |
| KR (1) | KR20010042373A (ja) |
| AU (1) | AU3457199A (ja) |
| CA (1) | CA2324060A1 (ja) |
| WO (1) | WO1999050658A2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005022436A1 (ja) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 蛋白質機能発現機構表示のための蛋白質構造三次元表示システム |
| WO2011122869A2 (ko) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | (주)아모레퍼시픽 | 쿠메스트롤 또는 쿠메스트롤을 포함하는 콩 추출물을 포함하는 피부 미용용 조성물 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1068529A4 (en) * | 1998-03-30 | 2004-08-04 | Univ California | METHODS AND COMPOUNDS FOR MODULATING THE BINDING OF A COACTIVATOR TO NUCLEAR RECEPTORS |
| WO2000052050A2 (en) * | 1999-03-01 | 2000-09-08 | Karo Bio Ab | Homology models of the glucocorticoid receptor |
| WO2001027622A1 (en) | 1999-10-14 | 2001-04-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Crystallographic structure of the androgen receptor ligand binding domain |
| FR2801311B1 (fr) * | 1999-11-22 | 2005-08-26 | Centre Nat Rech Scient | Polypeptides derives du recepteur nucleaire de la vitamine d, et leurs utilisations notamment dans le cadre du criblage d'analogues de la vitamine d |
| CA2415103A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-10 | The Regents Of The University Of California | Methods and compounds for modulating nuclear receptor coactivator binding |
| DE10036461A1 (de) * | 2000-07-25 | 2002-02-07 | Bayer Ag | Ligandenbindedomäne des Ultraspiracle (USP)-Proteins |
| JP4593754B2 (ja) * | 2000-10-13 | 2010-12-08 | 一般財団法人 化学物質評価研究機構 | 化学物質の５０％阻害濃度決定方法 |
| JP2002296282A (ja) * | 2001-04-02 | 2002-10-09 | Enbiotec Laboratories:Kk | 外因性内分泌攪乱物質の検出方法 |
| WO2003004458A1 (en) * | 2001-07-03 | 2003-01-16 | Biovitrum Ab | New compounds |
| GB0209507D0 (en) * | 2002-04-25 | 2002-06-05 | Karobio Ab | Nuclear receptor structure |
| US7302347B2 (en) * | 2002-12-10 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Method for creating specific, high affinity nuclear receptor pharmaceuticals |
| US7264813B2 (en) | 2003-09-24 | 2007-09-04 | Nikken Sohonsha Corporation | Therapeutic uses of Dunaliella powder |
| WO2005040212A2 (en) * | 2003-10-24 | 2005-05-06 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Orthogonal gene switches |
| CA2800673A1 (en) | 2010-06-10 | 2011-12-15 | Aragon Pharmaceuticals, Inc. | Estrogen receptor modulators and uses thereof |
| US9187460B2 (en) | 2011-12-14 | 2015-11-17 | Seragon Pharmaceuticals, Inc. | Estrogen receptor modulators and uses thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5650489A (en) * | 1990-07-02 | 1997-07-22 | The Arizona Board Of Regents | Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof |
| AU669489B2 (en) * | 1991-09-18 | 1996-06-13 | Affymax Technologies N.V. | Method of synthesizing diverse collections of oligomers |
| NZ267843A (en) * | 1993-05-27 | 1997-10-24 | Selectide Corp | Libraries of synthetic test compound attached to separate phase synthesis supports |
| IL106106A0 (en) * | 1993-06-22 | 1993-10-20 | Interpharm Lab Ltd | Library of polymeric molecules and its preparation |
| US6236946B1 (en) * | 1995-12-13 | 2001-05-22 | Thomas S. Scanlan | Nuclear receptor ligands and ligand binding domains |
-
1999
- 1999-03-30 CA CA002324060A patent/CA2324060A1/en not_active Abandoned
- 1999-03-30 JP JP2000541516A patent/JP2002516983A/ja not_active Withdrawn
- 1999-03-30 EP EP99916206A patent/EP1144997A3/en not_active Withdrawn
- 1999-03-30 KR KR1020007010940A patent/KR20010042373A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-03-30 AU AU34571/99A patent/AU3457199A/en not_active Abandoned
- 1999-03-30 WO PCT/US1999/006937 patent/WO1999050658A2/en not_active Application Discontinuation
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005022436A1 (ja) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | 蛋白質機能発現機構表示のための蛋白質構造三次元表示システム |
| JPWO2005022436A1 (ja) * | 2003-08-29 | 2006-10-26 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 蛋白質機能発現機構表示のための蛋白質構造三次元表示システム |
| WO2011122869A2 (ko) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | (주)아모레퍼시픽 | 쿠메스트롤 또는 쿠메스트롤을 포함하는 콩 추출물을 포함하는 피부 미용용 조성물 |
| WO2011122869A3 (ko) * | 2010-03-31 | 2012-02-02 | (주)아모레퍼시픽 | 쿠메스트롤 또는 쿠메스트롤을 포함하는 콩 추출물을 포함하는 피부 미용용 조성물 |
| CN102905685A (zh) * | 2010-03-31 | 2013-01-30 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 含有香豆雌酚或包含香豆雌酚的豆提取物的、用于皮肤护理的化妆品组合物 |
| US9265707B2 (en) | 2010-03-31 | 2016-02-23 | Amorepacific Corporation | Cosmetic composition comprising coumestrol or a bean extract containing coumestrol for skin care |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2324060A1 (en) | 1999-10-07 |
| AU3457199A (en) | 1999-10-18 |
| EP1144997A3 (en) | 2002-08-28 |
| KR20010042373A (ko) | 2001-05-25 |
| EP1144997A2 (en) | 2001-10-17 |
| WO1999050658A2 (en) | 1999-10-07 |
| WO1999050658A3 (en) | 2001-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shiau et al. | The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen | |
| Yu et al. | Structural insights of transcriptionally active, full-length androgen receptor coactivator complexes | |
| US6795776B1 (en) | Crystallographic structure of the androgen receptor ligand binding domain | |
| JP2002516983A (ja) | 核受容体活性を調節するための方法及び化合物 | |
| Darimont et al. | Structure and specificity of nuclear receptor–coactivator interactions | |
| Wu et al. | Structural basis for an unexpected mode of SERM-mediated ER antagonism | |
| US20060149521A1 (en) | Modulating nuclear receptor coactivator binding | |
| US6266622B1 (en) | Nuclear receptor ligands and ligand binding domains | |
| US20070020684A1 (en) | Structure of a glucocorticoid receptor ligand binding domain comprising an expanded binding pocket and methods employing same | |
| Yu et al. | Spatial definition of the human progesterone receptor-B transcriptional complex | |
| US20050202440A1 (en) | Inhibitors for androgen antagonist refractory prostate cancer | |
| EP1385885B1 (en) | Fragments of the retinoic acid-related orphan receptor (ror) comprising the ligand binding domain (lbd), crystal structure of the lbd of ror-beta and their applications | |
| Jaber et al. | Estrogen receptor-alpha interaction with the CREB binding protein coactivator is regulated by the cellular environment | |
| US7223548B2 (en) | Method of screening a chemical for binding to a proline-rich nuclear receptor co-regulatory protein/nuclear receptor complex | |
| EP1265927B1 (en) | Crystal | |
| Yudt et al. | Preventing estrogen receptor action with dimer-interface peptides | |
| EP1470158B1 (en) | The ligand binding pocket peptide fragment of estrogen-related receptor 3 (err3), its crystal structure, and uses thereof | |
| US7199219B1 (en) | Polypeptides derived from vitamin D nuclear receptor, and their uses in particular for screening vitamin D analogues | |
| Kushnert et al. | The Structural Basis of Estrogen Receptor/Coactivator Recognition and the Antagonism of This Interaction by Tamoxifen | |
| Greene et al. | Comparative Structural Analysis of ERa and ERb Bound to Selective Estrogen Agonists and Antagonists | |
| JP2003514579A5 (ja) | ||
| Katzenellenbogens et al. | Structural Studies of an Estrogen Receptor O. Agonist/Estrogen Receptor 3 Antagonist | |
| Wagner III | Structural mechanisms in the regulation of the thyroid hormone receptor | |
| Yudt | The role of tyrosine 537 in estrogen receptor function and the development of rationally designed peptide antiestrogens | |
| Ting | The cloning and characterization of androgen receptor coregulators, supervillin and gelsolin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20060606 |