TW200931020A - Ligand binding domains of nuclear receptors in controllable form and methods involving the same - Google Patents

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TW200931020A
TW200931020A TW097136778A TW97136778A TW200931020A TW 200931020 A TW200931020 A TW 200931020A TW 097136778 A TW097136778 A TW 097136778A TW 97136778 A TW97136778 A TW 97136778A TW 200931020 A TW200931020 A TW 200931020A
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Uwe Schwahn
Thomas Langer
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Sanofi Aventis
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70567Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors

Description

200931020 六、發明說明: 【發明所屬之技術領域j 5
本發明係有關包含呈可控制形式之 =能部位之單黯白質、料之製法、其 二 3、包含該單離蛋白質之測試系統及使用制試系統筛 選用於核受體的配體之方法。 * 【先前技術】 10 核受體代表存在細胞内 素與維生素等配體之訊號。 化下’經促效劑活化之核受 之蛋白超級家族,誘發例如激 於回應一般連同其他蛋白被活 體通常增加特定基因之表現。
因此’核受體之作用為經促效劑,發之轉錄因子,呈 單體、同-二聚體或異二聚體直接與標乾基因UNA反應元 件以及經由傳訊途徑相互作用。對照於膜受體及膜關聯受 體,核受體存在細胞内,於細胞質或細胞核中。因此,核 焚體包含存在真核細胞中之一組細胞間、可溶、受配體調 控之因子。核受體具有與DNA直接結合及調控鄰近基因表 現之能力;因此彼等受體被歸類為轉錄因子。如上文所詳 述’核受體之基因表現調控作用係配體依賴性,其中核受 體通常僅於促效劑存在下方具活性。配體與核受體結合導 致受.體構形改變,從而活化受體,通常導使基因表現向上 調控。 由於具有直接與基因體DNA相互作用及控制其表現 20 ^3l〇2〇 之能力, 色。 固此核受逋在生物演化及體内平衡上扮演關鍵角 結樽I受體超級家族成員展現含四個模組功能部位之整體 、含有活化作用區1 (八卜^之可變胺基端功能部位 _ (亦稱為1^端調控功能部位),其作用與配體存在無 W ; AF-1之轉錄活化作用通常微弱,惟與aF-2協 同作用而向上調控基因表現;此功能部位之序列於 1〇 不同核受體間具高度可變性; 〜含有兩個鋅指蛋白及與激素反應元件(HREs)結合 之鬲度保守之DNA·結合功能部位(DBD); '低度保守之配體結合功能部位(LBD),不同核受體 間,於序列上雖僅適度保守,惟於結構上則高度保 寸,LBD之結構被稱為屬α_螺旋三明治摺疊;配體 衫 結合腔在LBD内部,正好位於形成《三明治填料” 三個反平行α·螺旋下方;LBD與DBD —起,促成 受體之二聚化界面,此外,與共活化子(c〇 activat〇r) 及共抑制子(co-repressor)蛋白結合,•附加地,還含 有活化作用區2 (AF-2),其活化依賴結合配體之存 20 在及與AF-1協同作用(見上文); -可變之幾基端功能部位,其序列於不同核受體間具 可變性。 200931020 舉例而言,R〇Ral之結構如圖1A所示。 根據其作用機制及配體不存在下之亞細胞分佈,核受 體(NRs)可分為四類。 第I型NRs為位於細胞溶質中之核受體。配體與第工 5 $勵結合導致熱休克蛋自質解離、同·二聚化、移位至細 胞核及與由兩個半結合位點[其被不同長度DNA分隔第 二個半結合位點具有第一個之反轉序列(反轉重複)]組成之 ® HREs結合。形成核受體/DNA複合體後,徵集將_下 游DNA轉錄成mRNA之其他蛋白質,最後,生成引致細 10 胞功能改變之蛋白質。 ,,π型NRs於配體存在及不存在下均留於細胞核中, 彼等,異二聚體(通常與RXR)與DNA結合。配體不存在 下’第11型NRs常與共抑制子蛋白形成複合體。與核受體 結合之配體引起共抑制子解離及徵集共活化子蛋白與進一 15 步之蛋白質(包括rna聚合酶),造成DNA轉錄為mRNA。 第ΠΙ型核受體與第I型NRs類似,惟與同向重複而 非反轉重複之HREs結合。 第IV坦NRs呈單體或二聚體結合,惟僅受體之單一 DNA結合功能部位與HRE之半結合位點結合。 20 如^文所詳述,結合配體後被活化並結合於HREs之 核父體徵集大量修飾相關標纪基因成為mRNA的轉錄作用 之其他蛋白質。彼等轉錄共調控子(co-regulators)之功能各 5 200931020 不相同’包括染色質構形重建俾使標靶基因多少有些容易 轉錄,或具有橋接功能以穩定其他共調控蛋白質之結合。 5 ❹ 10 15 ❹ 共調控蛋白質(亦稱為輔因子)可為共活化子,常具有減弱 組織蛋白與DNA結合之固有之組織蛋白乙醯基轉移酶 (HAT)活性,因此,促進轉錄。對照於此,與促效劑結合後 較佳為結合於NR之共抑制子,則徵集促進組織蛋白與 DNA結合之組織蛋白脫醯酶(HDacs),因此,抑制轉錄。 核受體超級豕族成貝包括受體例如糖化皮質類固醇 (GRs)、雄激素(ARs)、礦物皮質類固醇(MRs)、黃體素 (PRs)、雌激素(ERs)、甲狀腺激素(TRs)、維生素d(VDRs)、 類視黃(RARs與RXRS)、過氧化體(xpARs與ppARs)及不 飽和脂肪酸類(icosanoids)(IRs)等之受體。 、,由於在發育及體内平衡上扮演之角色,核受體乃為用 x研九其涉及之特定功能之關注標的。此外,有些核受體 =所謂“孤兒受體”’其天然配體仍為未知。因&,鑑定彼 =仍未知之天然配體特則人關注。此外,由於涉及身體 2理與生理功能,核受體為藥理科學上之關注標的。受 藥物^控子間魏相互仙之數據為寬廣範®疾病新穎 :^法之開發提供新契機。為涉及使用類輯受體的細 胞增殖之共活化子與共抑制子角多 例如癌症提供新療法。再者,涉 ' 傳㈣k㈣量代謝的共調控子與 會。 1代謝障礙疾病提供新機 6 20 200931020 辨/二!界尚不可能單離出含有呈可控制形式之核受 體的配體、纟.合功能部位之蛋白f (特別是R〇Ra)。 【發明内容】 5 ❹ 10 令人驚奇地,本發明人成功地提供含有呈可控制 之核受體的配體結合功能部位之單離蛋白質。該蛋白質可 利甩於適當條件下培養包含編補蛋自質的減之細胞及 自細胞培養物中單離該蛋白質予以製備。其後,使單離蛋 白質與恢復該單離蛋白可控制性之清潔劑[特別是硫 二烷酯鋰(LDS)]接觸。 因此,本發明之第一態樣係有關一種含有呈可控制形 式之核受體的配體結合功能部位之單離蛋白。 核受體之配體結合功能部位(亦見上文)係回應配體結 合而起作用之核受體功能部位,其引致核受體構形改變以 誘發回應,從而具有啓動轉錄活性之分子開關作用。配體 結合功能部位為撓性單元,其中配體之結合穩定其構形, 從而對輔因子結合有利而修飾受體活性。共活化子可結合 於配,體結合功能部位相同終端之活化子作用區2 (AF-2)。 不同配體之結可能改變配體結合功能部位之構形,最後影 響核受體DNA結合功能部位之DNA-結合專一性。各種核 受體之配體結合功能部位為此項技藝中悉知及摘述於,例 如,EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk)或 InterPro: IPR000536 (見 http ://srs. ebi. ac.uk/ srsbin/cgi-bin/wgetz? [interpro-AccNumbe r:IPR000536]+-e)。 7 20 200931020 適當配體結合功能部位之實例包括: —視黃酸受體相關孤兒受體al (R0Ral)之胺基酸27丨至 523 —視黃酸受體相關孤兒受體β (RORP)之胺基酸267至459 5 —視黃酸受體相關孤兒受體Y(R〇RY)之胺基酸325至318 —肝細胞核因子al (HNF4al)之胺基酸192至464 ❾ 一肝細胞核因子a2 (HNF4a2)之胺基酸192至474 —雌激素相關受體a (ERRa)之胺基酸233至423 —雌激素相關受體P(ERRp)之胺基酸248至500 10 —雌激素相關受體Y(ERRy)之胺基酸250至435 ' 核受體可為任何已知核受體;視其序列同質性而定, 可將核受體分成七個亞族(subfamilies)。 0 亞族1包含類甲狀腺激素受體,包括甲狀腺激素受體-α 與-β、視黃酸受體-α、-β與-γ、經過氧酶體增殖子活化之受 15 體、-β/δ、γ、Rev-ErbA-α 與-β、RAR 相關孤兒受體 α、β 與Y、類肝臟X受體-α與β、法尼g旨(farnesoid) X受體、維 生素D受體、孕烷X受體與組成性雄烷受體。 亞族2係有關類視黃酸X受體包括,例如,肝細胞核 受體-4 (α與γ)、視黃酸X受體(α、β與γ)、睪丸雄性激素 受體(2與4)、果蠅無尾基因人類同質物、光受體細胞專一 性核受體、雞卵白蛋白上游啓動子-轉錄因子(I與II)及 8 20 200931020 V-eri>A-相關者° 亞族3係有關類雌激素受體包括,例如,雌激素受體(α 與β)、雌激素相關受體(〇t、β與γ)、類皮質激素受體、礦 皮質激素受體、黃體酮受體與雄激素受體。 5
10
亞族4係有關類神經生長因子包括例如神經生長因 子IB、核受體相關1及神經元衍生之孤兒受體1等受體。 亞族5係有關似類脂酵生成因子包括,例如,類脂醇 生成因子1及肝受體同質物-1。 亞族6係有關類胚細胞核因子包括胚細胞核因子。 進一步之亞族,稱之為亞族〇,包含例如染色體χ上 腎上腺發育不全臨界區域之劑量敏感性別逆轉基因j (DAX1)、微異二聚體夥伴蛋白及具有兩個DNA結合功能 部位之核受體(2DBD-NR)等各式各樣受體。 .根據本發明,核受體之配體結合功能部位係於單離蛋 白質中組成。本發明說明書中之單離蛋白質係有關不在其 天然%境:之蛋白質。因此,“單離蛋白質,,與平常自然界 所見蛋白貝,或自—般存在之細财單離或自編碼其等之 核^已表現之細胞中單離或實質上不含得自相同細胞來源 Πί白質無關。該蛋白可為天然存在之蛋白質,較佳 1处二/在之核受體或其部分’其中該部分涵蓋配體結合 然而’該蛋白亦可因非天然、存在或因涵蓋天然 m合舰雜連狀—❹㈣段㈣人工蛋白 20 5 ❹ 10 15 200931020 質,例如,包含或由核受體的配體結合功能部位與其他蛋 白質(例如供純化或檢測用途之第二功能部位)構成之融合 蛋白質。 較佳為,“單離蛋白質,’一詞意指實質上與其天然環境 之其他細胞成分分離之蛋白質分子。然而,蛋白質單離後, 可再添加諸細胞成分,例如,供測定訊號傳遞(transduction) 途徑用。此外’熟習此項技藝人士將暸解單離蛋白質須保 持於提供單離蛋白質活性之適當條件下(例如,適當缓衝 劑、.pH值、離子等)。 含有核受體的配體結合功能部位之本發明單離蛋白質 隋況中之可控制形式係有關促效劑結合於配體結合功能 部位後仍可修正活化作用之蛋白質。如上文所詳述,LBD 於改變標靶基因基因表現之促效劑配體結合於其等後被活 化。然而,迄今尚不可能製造含有可控制或調控的核受體 LBD之R〇Ra蛋白質或許多其他單離蛋白質,亦即,於用 於各別LBD之促效劑配體存在或不存在下,無顯著活性差 異或僅有少許活性差異。 因此,呈可控制形式之本發明單離蛋白質可藉由比較 用於各別LBD之促效劑配體存在或不存在下之活性進行 檢測。LBD活性可利用任何適當方式測定,舉例而言,藉 由測疋對各別訊號傳遞途控下游元件之影響,例如與各別 訊號傳遞途徑任何下游成分(例如共調控子及/或標靶'DNA) 結合。此等作業之實例敘述於實例2並於圖1C中說明。 20 200931020 較佳為3有呈可控制形式之服的lbd之單離 質’於用/各別LBD之促致劑配體存在下之活性相較於^ 效劑配财縣下之師,她為相纽至少丨2 至少1.5,又更佳為$小, ^ 5 ❹ 10 15 ❹ 〃 2、3、4或5,及最佳為至少1〇 〇 本發明之單離蛋白質特別係有關包含呈可控制形式之 NR的配體結合功能部位之單離蛋白質,其中該蛋白質並非 組成性地具有雜’意即該蛋自質於用於各別lbd之促效 劑配體不存在下不具活性。 於本發明之-具體實例中,單離蛋白質可包含天然存 在的核受體之完整胺基酸序列或係由其構成。替代地,單 離蛋白質可包含天然存在之部分核受體或係由其構成,惟 LBD仍存在該部分核受體中。 .單離蛋白質可包含如上文界定之任何核受體或係由其 構成。核受體可為單離蛋白質或可融合於進一步之功能部 位,舉例而言,俾使容易純化該蛋白質、檢測該蛋白質或 測定該蛋白質之活性。 如上文所詳述,單離蛋白質亦可包含部分核受體或係 由其構成,只要核受體之LBD為該蛋白質之一部分即<。 因此’單離蛋白質亦可包含核受體之胺基端調控功能部 位、DNA結合功能部位、連接DNA結合功能部位與配體 結合功能部位之较鏈區、及/或叛基端功能部位。附加之功 能部位與區域可能彼此不相關、可能衍生自與LBD相同之 11 20 200931020 核受體或衍生自一或多個其他核受體。 於本發明之一較佳具體實例中,核受體為視黃酸受體 相關孤兒受體(ROR) ’特別是RORa、R0Rp或R〇h,尤 其是RORa。 5 ‘孤兒受體R〇R,亦稱為腿,構絲初無配體被鏗定 出之核受體亞族。目前,有三個R0R受體亞型被鑑定出_ RORa、RORp與R〇RY。彼等R0R受體呈單體或二聚體形 ❹ 式結合’各自結合於由在PuGGTCA型序列前富含Α/τ之 序列構成之專一性反應元件’及調節標乾基因之轉錄作用。 10 經選擇性剪接後’ RORa基因導使產生al、a2、a3與 a4 RZRA四種同功型,其N端功能部位不同並顯示DNA 辨識及有區別之交替活化性質。 至於核受體’任何哺乳類ROR受體均佳,人類R〇R 受體又更佳。 _ RORa (亦稱為RAR相關孤兒受體a、RZRA、R〇R1、 ROR2、ROR3、皿1F1)已被定序,其序列可自Ncm (National Center for Biotechnology Information)基因庫取 得,存取編號no. U04897,其提供人類mRNA及蛋白質序 列。RORa之已知促效劑配體包括膽固醇、其衍生物及或 20 許是视黑激素。 RORp (亦稱為RAR相關孤兒受體B、RZRB、NR1F2) 已被定序,其序列可自 NCBI (National Center for 12 200931020
Biotechnology Information)基因庫取得,存取編號 n〇. Y08639 ’其提供人類mRNA及蛋白質序列。用於R〇Rp 之已知促效劑配體為視黃酸。 RORy (亦稱為RAR相關孤兒受體c、RZRG、RORG、 5 NR1F3、T0R)已被定序’其序列可自 NCBI (National Center for Biotechnology Information)基因庫取得,存取編號 n〇 U16997,其提供人類mRNA及蛋白質序列。 0 此三型ROR執行若干關鍵任任務包括: —RORa :小腦發育、骨路維修、淋巴節發育、免疫反應、 10 骨骼肌發育、平滑肌細胞分化、脂質代謝(疾病:例如 小腦退化、骨質疏鬆、局部缺血誘發之血管新生、動脈 硬化、炎性疾病) 一 RORp :中樞神經系 —RORy :免疫反應、骨骼肌、脂肪細胞分化 @ 特佳者為含有呈可控制形式之R〇Ra的配體結合功能 部位之單離蛋白質。RORa之全長蛋白由523個胺基酸構 成’,其中胺基酸271 - 523編碼配體結合功能部位。特佳者 為SEQ ID NO. 1所示之蛋白質: 60 120 180 240
AELEHLAQNI SKSHLETCQY LREELQQITW QTFLQEEIEN YQNKQREVMW QLCAIKITEA
20 IQYVVEFAKR IDGFMELCQN DQIVLLKAGS LEVVFIRMCR AFDSQNNTVY FDGKYASPDV
FKSLGCEDFI SFVFEFGKSL CSMHLTEDEI ALFSAPVLMS ADRSWLQEKV KIEKLQQKIQ
LALQHVLQKN HREDGILTKL ICKVSTLRAL CGRHTEKLMA FKAIYPDIVR LHFPPLYKEL FTSEFEPAMQ IDG (SEQ IDN〇:l) 13 200931020 包含上述功能部位以及標籤(t a g)與切割位點之例示序 列如下文所示: FLQEEIENYQ 60 VVFIRMCRAF 120 FSAFVLMSAD 180 RHTEKLMAFK 240 271 (SEQ ID NO:2)
MGSSHHHHHH LEVLFQGPAE LEHLAQN工SK SHIiETCQYLR EELQQITWQT NKQREVMWQL CAIKITEAIQ YVVEFAKRID GFMELCQNDQ IVLLKAGSLE DSQNNTVYFD GKYASPDVFK SLGCEDFISF VFEFGKSLCS MHLTEDEIAL RSWLQEKVKI EKLQQKIQLA LQHVLQKNHR EDGILTKLIC KVSTLRALCG AIYPDIVRLH FPPLYKELFT SEPEPAMQID G ^ 單離蛋白質包含帶有His-標籤(HHHHHH;SEQ ID NO: 3)及插入RORal胺基酸270的PreScission切割位點 (LEVLFQGP ; SEQ ID NO: 4)之 SEQ ID NO: 1 功能部位。 然而,His-標籤可被例如本文所述之另一適當標籤取代以 及具有例如下文所述之適當切割位點;彼等之實例如圖1B 15 所示。 於本發明之一具體實例中,本發明之單離蛋白質含有 標記物(marker),特別是標籤。 © •本發明說明書中之標記物可為易於檢測之任何種類之 分子。於本發明中,該分子係與单離蛋白結合,因此,標 20 έ己物之存在為早離蛋白質存在之4曰標。標記物(亦稱為 labels)為熟習此項技藝人士已知及包括,例如,輻射標記(例 如3H、32P、35S或14〇、螢光標記物(例如螢光黃、綠螢光 蛋白、或DyLight 488)、酵素(例如山葵氧化酶、β_乙内醯 胺酶、鹼性磷酸酶或β_葡萄糖苷酶)或可利用適當抗體或抗 25 體片段檢測之抗原。 200931020 指示劑用^_記物為標籤;標籤通常係作為生物化學 等蛋白質巾f。彼等可納人㈣4組體、表現蛋白質 5
10 15 ❹ 籤之標準停件多f用途。較佳為,於制於特定標 標籤亦彼等純化與其連接之蛋白質。然而, 户馬私私用,以檢測特定蛋白質之存在。 八A 3 親和性)標籤為目前已知;彼等通常根據其大小 G多Ϊ右小標籤類最多具有12個胺基酸,中等大小標籤 、有60個胺基酸及大標籤類具有6〇個以上胺某 酸。小々標籤類包括Arg__標籤、His•標藏、3卿_標籤、旗標、 T7_標籤、V5-肽-標籤與c-Myc-標籤;中等大小標籤類包括 S_標籤、HAT·標籤、攜舞素_結合狀、幾丁質_結合狀與_ 些纖維素-結合功能部位;大標籤類可含至多達189個胺基 酸’如GST-(麩胱甘肽-S-轉移酶)與MBP-標籤(麥芽糖結合 蛋白-標籤)均被視為大親和性標籤。 為了製造特別純之蛋白質’乃開發所謂雙標籤或串疊 型標籤(tandem tags)。於此情形下,以兩個分開之層析步驟 純化蛋白質,各利用第一然後第二標籤之親和性。此等雙 標籤或串疊型標籤之實例為GST-His-標籤(麩胱甘肽_s_轉 移酶融合於多組胺酸-標籤)、6xHis-Strep-標籤(6個組胺酸 殘基融合於Strep-標籤)、6xHis-標籤100-標蕺(6個組胺酸 殘基融合於哺乳類MAP-激酶2之12個胺基酸蛋白質)、 8xHis-HA-標籤(8個組胺酸殘基融合於血球凝集素-抗原決 定部位-標籤)、His-MBP(His-標籤融合於麥芽糖-結合蛋白 15 20 200931020 質)、‘FLAG-HA-標籤(FLAG-標籤融合於血球凝集素-抗原決 定部位·標籤)、與FLAG-Strep-標籤。 、 較佳為,本發明之單離蛋白質含有選自下述組群之標 5 Ο ίο 15 ❹ 籤:His·標籤、Arg-標籤、Strep-標籤、Flag-標籤、T7-標 籤、V5·肽-標籤、c_Myc-標籤、S-標籤、HAT-標籤、攜鈣 素-結合肽·標籤、幾丁質-結合肽_標籤、GST_標籤與MBp_ 標籤。然而,亦可使用任何其他標籤,惟以若干標籤例如
His-標籤、Arg-標籤、Strep-標籤、Flag-標籤或GST-標籤較 佳。 於本發明之具體實例中,單離蛋白質含有標記物或標 籤,其中該標記物或標籤可於特定切割位點(例如酵素切割 位點)利用蛋白水解切割方式從蛋白質中移除。切割位點可 位於LBD與標記物或標籤之間;舉例而言,切割位點可為 蛋白酶切割位點。蛋白酶之實例為胰凝乳蛋白酶、胰蛋白 酶、彈性蛋白酶、與纖維蛋白分解酶;對應之切割位點熟 習此項技藝人士已知。由於欲純化之分子為蛋白質,因此 以專一性蛋白酶,尤其是平常侵襲植物之得自病毒之蛋白 酶較佳。適當專一性蛋白酶之實例為凝血酶、因子Xa、 Igase、得自”Tobacco Etch Virus(终草蝕刻病毒),,之TEV蛋 白酶、蛋白酶PreScission (人類鼻病毒3C蛋白酶)、腸激酶 或Kex2,以TEV-蛋白酶與preseissi〇n尤其較佳。 包含LBD、His-標籤與精確切割位點之蛋白質之實例 揭示於SEQ ID NO. 2。編石馬該蛋白質之適當核酸與載體分 20 200931020 別如SEQ ID NO: 5與SEQ ID NO: 6所示。此外,本發明 單離蛋白之實例於圖1B中圖解闡明。 SEQ ID NO: 6載體之核苷醢4021黾5040 : —上核酸序列:編碼股(SEQ ID NO: 5) 5 _下核酸序列:模板股 —胺基酸序列:帶有His-標籤及PreScission切割位點(SEQ 〇 ID NO: 2)之 LBD (如 SEQ ID NO: 1 中所界定) —ΖΖΖΖ]:選殖位點(如具體指明) —drG與Γ儿4 :起始/終止(各鄰接選殖位點) 10 — CATCATCATCATCATCATCTQGAAQTTCTGTTCCAGGGGCCC:
His-標籤與PreScission切割位點
GATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAA 4021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4080
20 25
CTATTGGTAGAGCGTTTATTTATTCATAAAATGACAAAAGCATTGTCAAAACATTATTTT
BamHI
AAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGC|GGATCgArQGGA 4081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4140
TTTGGATATTTATAAGGCCTAATAAGTATGGCAGGGTGGTAGCCCGCGCCTAGGTACCCT a M G -
AGTAGCCATCATCATCATCATCATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGCAGAATTAGAA 4141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200
TCATCGGTAGTAGTAGTAGTAGTAGACCTTCAAGACAAGGTCCCCGGGCGTCTTAATCTT a S S Η Η Η Η Η H LEVLFQGP A E L E -
CACCTTGCACAGAATATATCTAAATCGCATCTGGAAACCTGCCAATACTTGAGAGAAGAG 4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4260
GTGGAACGTGTCTTATATAGATTTAGCGTAGACCTTTGGACGGTTATGAACTCTCTTCTC a HLAQNISKSHLETCQYLREE - 17 30 200931020
CTCCAGCAGATAACGTGGCAGACCTTTTTACAGGAAGAAATTGAGAACTATCAAAACAAG 4261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4320 5 10 15
25 30 35 ❹ 40 45 50
GAGGTCGTCTATTGCACCGTCTGGAAAAATGTCCTTCTTTAACTCTTGATAGTTTTGTTC a LQQITWQTFLQEEIENYQNK -
, CAGCGGGAGGTGATGTGGCAATTGTGTGCCATCAAAATTACAGAAGCTATACAGTATGTG 4321 ---------+---------+ ---------+---------+---------+---------+ 4380
GTCGCCCTCCACTACACCGTTAACACACGGTAGTTTTAATGTCTTCGATATGTCATACAC a QREVMWQLCAIKITEAIQYV -
GTGGAGTTTGCCAAACGCATTGATGGATTTATGGAACTGTGTCAAAATGATCAAATTGTG 4381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4440
CACCTCAAACGGTTTGCGTAACTACCTAAATACCTTGACACAGTTTTACTAGTTTAACAC a VEFAKRIDGFMELCQNDQIV -
CTTCTAAAAGCAGGTTCTCTAGAGGTGGTGTTTATCAGAATGTGCCGTGCCTTTGACTCT 4441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500
GAAGATTTTCGTCCAAGAGATCTCCACCACAAATAGTCTTACACGGCACGGAAACTGAGA a LLKAGSLEVVFIRMCRAFDS -
CAGAACAACACCGTGTACTTTGATGGGAAGTATGCCAGCCCCGACGTCTTCAAATCCTTA 4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4560
GTCTTGTTGTGGCACATGAAACTACCCTTCATACGGTCGGGGCTGCAGAAGTTTAGGAAT a QNNTVYFDGKYASPDVFKSL -
GGTTGTGAAGACTTTATTAGCTTTGTGTTTGAATTTGGAAAGAGTTTATGTTCTATGCAC 4561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4620
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CACGTCCTACAGAAGAATCACCGAGAAGATGGAATACTAACAAAGTTAATATGCAAGGTG 4741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800
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, AGATGTAATTCTCGGAATACACCTGCTGTATGTCTTTTCGATTACCGTAAATTTCGTTAT a STLRALCGRHTEKLMAFKAI - 5 10 15 25 30 ❹ 35 40 45
TACCCAGACATTGTGCGACTTCATTTTCCTCCATTATACAAGGAGTTGTTCACTTCAGAA 4861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4920
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• CCTTTCCTGGGACCCGGCAAGAACCAAAAACTCACTCTCTTCAAGGAAATCCGTAATGTT 4981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 5040
GGAAAGGACCCTGGGCCGTTCTTGGTTTTTGAGTGAGAGAAGTTCCTTTAGGCATTACAA 載體(見上文詳述)(SEOIDNO:6): _______:載體插入物
AAGCTTTACTCGTAAAGCGAGTTGAAGGATCATATTTAGTTGCGTTTATGAGATAAGATTGAAAGCACGTGTAAAATGTT
TCCCGCGCGTTGGCACAACTATTTACAATGCGGCCAAGTTATAAAAGATTCTAATCTGATATGTTTTAAAACACCTTTGC
GGCCCGAGTTGTTTGCGTACGTGACTAGCGAAGAAGATGTGTGGACCGCAGAACAGATAGTAAAACAAAACCCTAGTATT
GGAGCAATAATCGATTTAACCAACACGTCTAAATATTATGATGGTGTGCATTTTTTGCGGGCGGGCCTGTTATACAAAAA
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C6-C20烷基硫酸酯或碳酸酯之鹼鹽或與異戊二烯基鹽 接觸。 0 一般而言,本發明方法少棘a)與b)為熟習此項技藝人 士悉知;然而,下文中將利用實例簡單地摘述及說明。熟 習此項技藝人士將瞭解,所述方法可視欲單離之本發明各 10 別蛋白質、細胞培養所用細胞等予以修飾。 • .製造重組蛋白質,亦即,於活細胞中合成外來基因之 基因產物時,有多種表現系統可用’彼等包括熟知生物與 細胞株(細菌、昆蟲細胞、酵母、哺乳類細胞等)系列以及 具有不同啓動子、選擇標記物及視需要之融合伴體 歧 (partners)的各種表現載體。重組蛋白質之製造通常包括將 編碼基因引入質體或任何其他適當載體中。一般而言,適 當載體或質體之選擇取決於擬用之宿主細胞。然後將此载 體引入選定之標的細胞中(轉形或轉染),及培養標的細 胞。視啓動子而定,基因之表現f能於整個培養期間發生 20 或可由外部訊號誘發。 如上文所詳述,可能需要製造編碼本發明蛋白質之適 當梭酸或含其等之載體。 編碼本發明蛋白質之核酸町為天然存在之編碼核受體 5 〇 ίο 15 ❹ 200931020 天缺存在^ 文界k雜核㈣之部分。編喝 人f或其部分之核酸之單離為熟習此項技藝 人士 Ά ’可包括使㈣#探針及分離方 面上之供應商。若係使用非由二基Ϊ =3=如’編碼包含全部或部分NR與標籤之融合 '編碼該融合蛋白質之各別核酸可根據包 括退傳工程悉知方法之標準程序製造。通常,係使用適庵 限二,内切酶於特定位點切割疆。由限制内切酶形: 之诸片&可使用接合酶連接在—起。其後,可將dna引入 適用.於將遺傳物質轉移入細胞之載體中。載體可為病毒载 體或質體载體。適當載體包括腺病毒、腺相關病毒、巨细 胞病毒等。市售可得載體之實例為pBR322、pUc系列、 pBluescript、PTZ、PSP與pGEM。替代地,亦可將未經處 理之DNA引人_中。若係使用不含賴之核酸,亦即 DNA或RNA,則進行轉染時可使其與陽離子性脂質混合 產生微知粒,微脂粒與細胞膜融合而將核酸沉積於細胞 内。轉染亦可利用磷酸鈣進行,其中,舉例而言,係使含 填酸根離子之HEPES-緩衝鹽液與含欲轉染的Dna之氯化 鈣溶液結合。此二溶液結合時,形成磷酸鈣微細沉澱,將 欲轉染之DNA結合於其表面。然後將沉澱懸浮液添加於欲 轉染之細胞中(通常為呈單層生長之細胞培養物)。其他轉 染方法包括電穿孔、熱休克、磁性轉染、轉殖基因技術 (nucleofection)及使用轉染劑例如脂質體轉染劑 (Lipofectamine)、Fugene等。進一步之方法為“基因搶”, 23 20 200931020 其中係使DNA偶合於惰性固體(通常為黃金)之奈米微粒, 然後直接射入標的細胞中。 5 ❹ 10 15 ❿ 、、’田胞之轉*可為暫時性或穩定性。若轉染過程中引入 細胞中之核酸未插人核基因體,料來核酸於後來階段該 細胞進行有4刀裂時可能喪失:此稱為暫時性轉染。更佳 之轉染為穩定性轉染,其中核㈣於細胞基因射。為了 達成較㈣’通常❹選擇技術,其巾使減與另一基 因共轉染’提供選擇性之選擇。附加之基因可針對特定條 件或物質授予抗性例如抗生素或代謝缺^適#基因之實 例包括新黴素抗性基因、潮黴素磷酸轉移酶基因等。 將本發明蛋白質編碼核酸引入宿主中後,於適當條件 下使細胞生長。祕製造蛋自質之^同宿主細麟列為熟 習此項技藝人士已知’包括細菌、昆蟲細胞、酵母與哺乳 類細胞。此等細胞之實例為:Sf9、Sf21、HEK293細胞、 CHO細胞、HeLa細胞、CaCo細胞或NIH 3T3細胞。 宿主細胞可為初級細胞或為細胞株,其中以細胞株較 佳。 於促成製造包含本發明核酸的細胞之條件下,使細胞 生長;該等條件包括適當溫度及氣體混合物(典型地為 37°C,5% C〇2) ’視需要於細胞培養器中。培養條件視各 細胞類型可於廣泛範圍内有所不同,及為熟習之從事者已 知。以適當桿狀病毒載體系統轉形後’可於例如昆蟲細胞 中進行表現。於此情形下,溫度維持於260C而不需要控制 24 20 200931020 C〇2 〇 5 ❹ 10 15 Ο 除了溫度與氣體混合物外’細胞培養系統中最常見之 可變因子為生長培養基。生長培養基之配方可隨pH、葡萄 糖濃度、生長因子及其他營養成分等而不同。補充培養基 所用生長因子常係衍生自動物jk液例如小牛血清。 熟習此項技藝人士知道如何從蛋白序列慮及基因密碼 得到核酸序列(可為DNA或RNA);亦知如何使用分子生物 學標準技術製造此等核酸序列;其達成舉例而言可藉由利 用限制切割酶使用及組合現有序列。核酸亦適當地含有進 一步元件例如啓動子、轉錄起始與終止訊號及轉譯起始與 終止訊號。 步驟a)之後’以熟習技藝人士已知之任何適當分離或 純化方法從細胞培養物中單離蛋白質。若已有足量標的蛋 白質分泌至培養基中,則可持續進行單離。否則,可能需 要使細胞破裂;此可,舉例而言,藉由溶解細胞達成;例 如二利用超音波或高張處理培養基或利用剪切力。欲移除 不溶成分時,舉例而言,可離^試樣(尤其是於1G,_ x g 至15,000 Xg),所得上澄液可供步驟幻使用或可進一步 化或濃縮。 、 步驟單離可#代地或附加地包括悉知之純化濃縮 二驟例如卒取、沉澱、電料方法、層析料; 、離子交換層析法、分級排除層析法、 層析法、或親和性層析法特別是固定化金屬離 25 20 200931020 子親和性層析法(IMAC)。 5 :明單離蛋白質含有如上文界定之適當標記物或 ‘戴’則特別可慮及親和性純化。親和性純化為特殊形式 之吸附純化’其中於載劑上具有高親和性之群組(結合伴 體)’因此對兩個功能部位之-者具有高結合強度俾使彼等 可優先被吸附因而與其他物質分離。純化可使用第一及第 Ο 二標籤(例如His-標籤及GST-標籤)進行。純化利用與適當 結合伴體之專一性結合進行。結合伴體較佳為結合於固 ίο 相;該固相可為一般載劑物質,例如,Sephar〇se、 Superflow、Macroprep、POROS 20 或 P〇R〇s 5〇。然後利 15 ❿ 用例如重力、HPLC或FPLC等層析法進行分離。所關注蛋 白質可利用改變條件,俾使改變後之條件不再容許親和性 標記物或標戴與結合伴體間之結合(例如改變pH值或離子 強度),或利用使分子從結合於結合伴體之功能部位分離, 而自該固相溶洗出。分離可如上文所詳述,利用切割分子 與結合伴體間之鍵結,例如利用化學方法或使用專一性酵 素進行。替代地’亦得以利用添加過量專一性競爭劑。替 代地,結合伴體亦可結合於珠粒’尤其是磁性珠粒。添加 珠粒於試樣中後’結合發生於特定功能部位與對應結合伴 體之間。然後舉例而言可離心懸浮液’俾使標記分子與珠 粒一起沉積’而其他成分殘留於懸浮液中,從而可予以移 除。替代地,該懸浮液可利用珠粒之磁性進行分離。於— 具體實例中,施加懸浮液至位於磁場之管柱中。由於磁性 珠粒和與其結合之分子留在磁場中,因此試樣中之其他組 26 20 200931020 成可經數個洗務操作被洗出;然後舉例而言可使用適卷办 洗緩衝液將所關注分子與珠粒洗滌分離,或可利用酵 割法(例如於LBD與標籤或標記物間之切割位點)與珠粒= 離。 、 5 步驟b)之後,使單離蛋白質與清潔劑接觸,以提供呈 可控.制形式之LBD。清潔劑於生物學上之意義為常見用於 破壞細胞之雙極性脂質膜以游離及溶解膜結合蛋白質之膜 ❹ 活性物質。清潔劑之值係衍生自其兩性性質。各清潔劑分 子之特徵為親水性“頭,,區域及疏水性“尾”區域。此特徵之 1〇 效果為於水性介質中形成具有疏水性途徑(C〇urse)之熱力 學上穩定之膠粒(micelle);疏水性核心提供得以溶解蛋白 - 質疏水性分子或功能部位之環境。清潔劑可為陰離子性、 陽離子性、兩性離子性或非離子性。陰離子性及陽離子性 15 清潔劑典型地較其他兩類更大程度地修飾蛋白質結構。修 5 飾程度隨各別蛋白質及特定清潔劑而不同。離子性清潔劑 © 對PH離子強度與抗衡離子性質亦較為敏感,會干預以電 何為基礎之分析方法。替代地,最非離子性之清潔劑係非 變性(norwienaturating),惟於破壞蛋白質凝集上較不具效 2〇 力。兩性離子性清潔劑獨特地提供優於其他三清潔劑類型 之些居中組群性質,於一些應用上提供非離子性清潔劑 之低變性及淨零電荷特性。兩性離子性亦有效地破壞蛋白 質凝集。 較佳為,清潔劑係飽和直鏈C6_C2〇烷基硫酸酯或碳 酸酯之鹼鹽或係異戊二烯基鹽《較佳之為鋰、鈉與鉀鹽, 27 200931020 尤其是鋰鹽。 5 Ο ίο 15 φ 2〇 飽和直鏈C6-C20烷基硫酸酯可為硫酸正己酯、正庚 酯、·正辛酯、正壬酯、正癸酯、正十一烷酯、正十二烷酯、 正十二烷酯、正十四烷酯、正十五烷酯、正十六烷酯、正 十七烷酯、正十八烷酯、正十九烷酯、正廿烷酯。飽和直 鏈C6-C20烷基碳酸酯可為碳酸正己酯、正庚醋、正辛酯、 正壬Sa、正癸Sa、正十一烷酯、正十二燒酯、正十三烷酯、 正十四烷酯、正十五烷酯、正十六烷酯、正十七烷酯、正 十八炫酯、正十九烧酯、正廿燒醋。 於本發明之進-步較佳具體實例中,驗鹽為裡鹽,較 传為硫酸正己S旨、正庚!旨、正辛g|、正壬醋、正癸醋、正 十-錢、正十二錢、正十三如旨、正十四舰、正十 五炫酿、正十六㈣、正十七絲、正十八㈣、正十九 如旨、正廿錢之㈣’或碳酸正己§旨、正庚醋、正辛醋、 疋壬醋、正癸S旨、正十-_、正十二錢、正十三烧醋、 疋十四如旨、正十錢自旨、正十六絲、正十述醋、正 十八舰、正十九烧醋、正廿燒S旨之鐘睡。 ::發明之-較佳具體實例中,本發明單離蛋白質之 製造ί := 一 於步驟b)或步驟c)後移除標記物或標 言,利用切割除去標記物進 U除去標記物。切割割,白質=當酵素 間之間隔物(spacer)中之蛋白酶切位纖與LBD 賊凝乳蛋白酶、_、彈性蛋白酶及=酶 28 5 10 15 200931020 點為熟習此項技藝人士已知。由於欲純化之分子為蛋 白質,因此以專一性蛋白酶,尤其是平常侵襲植物之得自 病毒之蛋白酶較佳。適當專一性蛋白酶之實例為凝血酶、 ,子Xa、igase、得自菸草蝕刻病毒之TEV_蛋白酶、蛋白 酶PreScission (人類鼻病毒3C蛋白酶)、腸激酶或; 以TEV-蛋白酶與PreScission尤其較佳。 ’ _於本發明進一步較佳具體實例中,飽和直鏈C6-C20 基硫酸®旨或碳_之㈣絲和直鏈C9-C15烧基硫醆 酉曰之驗鹽’較佳為硫酸十二如旨之驗鹽,更佳為硫酸 ==據此,飽和直鏈C9·基硫酸醋可為: r、=讀正癸醋、硫酸正十一烧醋、硫酸正十二烷 ^之二、硫酸正十四_、或硫酸正十五燒 二正十是硫酸正壬_、硫酸正癸醋鐘、 鋰、护酸硫酸正十二烷酯鋰、硫酸正十三烷酯 別是硫酸十二貌酿鐘十—編曰納、硫酸十二烧醋鉀,特 於本發明另一且體會4丨+ * 異戊二烯基鹽可為異戊二烯壬2劑為異戊二烯基鹽。 酸鹽、異戊二婦基二磷酸ΐ^皿:如異戍二稀基乙 發明另-具體實例中,清;一婦基焦填酸鹽。於本 經基基圈組成H =劑為由Μ異戊二烯基單元與 磷酸醋[特別是香I醇、i碳酸醋、硫酸酿、磷酸醋或焦 ^ 呢醇(farneS〇l)、香葉草基焦磷酸 29 20 200931020 酯、法呢基焦磷酸酯或香葉草基香葉草基焦磷酸酯]之鹼或 銨鹽。 於本發明進一步具體實例中,步驟b)及/或C)可於LBD 之促效劑存在下進行。促效劑可為天然存在之促致劑或其 5 功能活性衍生物,或可為與天然存在促效劑不同之促效 劑。·結合及缚化核受體之天然存在之促效劑配體包括親脂 性物質例如内生激素、維生素A與B及生體異物内分泌擾 ❺ 亂物質。舉例而言,曱狀腺激素受體由於甲狀腺激素,特 別是曱狀腺素(T4)之結合而被活化。視黃酸受體天然存在 10 之配體為所有·反式視黃酸及9-順式視黃酸。過氧酶體增殖 子-活化受體之配體為游離脂肪酸與不飽和脂肪酸類; PPARy被PGJ2 (—種前列腺素)活化及PPARa被白三稀素 B4活化。肝臟X受體a與β與義務伴體rxr形成異二聚 體。該異二聚體亦可被LXR促效劑(例如氧基固醇類)或 15 RXR促效劑(例如9-順式視黃酸)活化。氧基固醇類膽固醇 ❹ 之氧合衍生物,例如22 (R)-羥基膽固醇、24 (S)·羥基固醇、 27-羥基固醇與膽烯酸。其他促效劑可為維生素〇 (維生素 D受體)、類固醇類(雌激素受體、黃體酮受體、雄激素受 體)、皮質醇(糖皮質激素受體)、醛固酮(礦物類皮質激素受 20 體)或脂肪酸類(肝細胞核因子4)。非天然存在之促效劑配 體包括糖皮質激素受體之地米塞松(dexamethasone)或雌激 素受體二乙基己烯雌酚(DES”R〇R家族成員之適當促效 劑配體包括膽固醇及其衍生物,例如膽固醇硫酸鹽、或褪 黑激素。 30 200931020 如上文所詳述,本發明單離蛋白質係於促成製造蛋白 質之適虽條件下,培養含有編碼該蛋白質的核酸之細胞予 以製造。於本發明之一具體實例中,該細胞係選自下述組 5 Ο ίο 15 Ο 20 群:動物細胞、植物細胞、酵母細胞。適當動物細胞包括 哺乳類細胞,特別是人類細胞;彼等細胞之實例如上述。 替代地,該細胞可為酵母細胞例如大腸桿菌㈣、或昆蟲 細胞。 .本發明單離蛋白f之例示製造方法敘述於實例i。 本發明之進一步態樣係有關根據本發明方法製造之含 有呈可控卿式之核受㈣配體結合功能雜之單 質。 热習此項技藝人士將瞭解,單離蛋白質可如上文本發 明任何具體實例,特別是本發明較佳具體實财所界定。' 、本發明之進一步態樣係有關使用單離蛋白質鑑定用於 核受體之配體結合功能部位之配體,特別是促效劑或拮抗 劑’,尤其是促效劑之用途。根據本發明,本發明單離蛋= 質可利用例如開啓或關閉下游訊號傳遞而鑑定用於核受體 LBD之配體,特別是促效劑或拮抗劑。據此,可檢測^評 估任何下游訊號以檢測配體之結合。若係搜尋促效劑,則 可利用下游訊號途徑之活化鑑定該促效劑。另一方面,則 可利用關閉下游訊號傳遞鑑定拮抗劑。於拮抗劑之情形 下’可能需要使用促效劑與潛在拮抗劑之組合,以檢測# 抗劑對促效劑誘發的訊號傳遞之失活作用。如上文所^ 述,核受體之訊號傳遞通常包括形成多聚體(特別是二聚 31 200931020 體)、共活化子及/或共抑制子之結合、或改變基因轉錄作 用(常為誘發基因轉錄),於是,製造mRNA及蛋白質,因 此,改變細胞功能。 5 ❹ 10 根據上述訊號傳遞,改變之訊號傳遞可於訊號傳遞之 各層次予以評估,包括使所關注蛋白質與第二個蛋白質(例 如共活化子或共抑制子)結合、結合於標起基因、測定 mRNA或蛋白質量、或改變之細胞功能。蛋白與另一蛋白 或標靶基因結合之測定方法為熟習此項技藝人士悉知,及 包括本文中界定者。mRNA或蛋白質量之測定方法亦為熟 I此項技藝人士悉知。觀察改變的細胞功能之方法主要取 決於細胞功能類型,亦為熟習之從事者所悉知。 本發明之又進一步態樣係有關一種測試系統,該系統 含有 一本發明之單離蛋白質; —輔因子;及 吊以檢測配體(尤其是促效劑)結合於核受體之配體結 合功能部位時該蛋白質與辅因子間之相互作用之工具 (means) 〇 根據本發明,本發明之單離蛋白質可為如上述態樣及 〃體實例(特佳為具體實例)中詳述之任何蛋白質。此外, 輔,子(亦稱為共調控子、共健蛋白f、或觀共調控子 亦包括共活化子或共抑制子;亦見上文)係被經促效劑配體 32 20 200931020 5 〇 ίο
結合活化之核受體結合,而共抑制子係被拮抗劑配體結合 後之核受體結合。核受體共活化子之常見特徵為彼等含有 被稱為NR (核受體)盒之一或多個LXXLL結合基元(五個 胺基酸之連續序列’其t L =白胺酸及X =任何胺基酸)。 LXXLL結合基元已被證實結合於核受體LBt)表面之結 構。彼等之實例包括: -NCOA-1 (核受體共活化子1)/SRC-1 (類固醇受體共活 化子-1) '、 —NCOA-2 (核受體共活化子2)/GRIP-l (與蛋白i相互作 用之糖皮質激素受體) NCOA-3 (核受體共活化子3) / AIB-1 (於乳房中擴增) NCOA-4 (核受體共活化子4) / ARA 70 (雄激素受體才目關 蛋白70) ^ —NCOA-5 (核受體共活化子5) —NCOA-6 (核受體共活化子6) —NCOA-7 (核受體共活化子7) —PGC-1 (經增殖子,活化之受體γ共活化子!) CBP (cAMP反應元件-結合(CREB)蛋白-結合蛋白) —PCAF (p300/CBP 相關因子) ~ARA54(雄激素受體相關蛋白54) 33 20 200931020 —ARA55(雄激素受體相關蛋白55) 5 Ο ίο Ο 15 共抑制子蛋白質亦結合於核受體之配體結合功能部位 表面’惟係經由胺基酸之LXXXIXXX (I/L)基元(其中L = 白胺酸,1=異白胺酸及χ=任何胺基酸)。此外,共抑制子 較佳為呈失活型、無促效劑或可能呈拮抗劑_結合型結合於 核受體。共受體之實例包括: 、NC0R-i(核受體共抑制子) NCOR-2 (核受體共抑制子)/ SMRT (用於類視黃及甲狀 腺激素受體之靜默傳介子(共抑制子)) LCoR (配體依賴性共抑制子) 、RCOR(REST共抑制子) -CtBP 602618 〜Rb (視網膜母細胞瘤蛋白) -SIN3 (SIN3a ' SIN3b) 具有雙功能活化子/抑制子之輔因子包括:
〜肌IM (富含脯胺酸、_酸與白胺酸之蛋白D -NSD-1 〜RIP-14(與RXR相互作用之蛋白14) ,共活化子可視包含於根據本發明單離蛋白質 而選擇。熟f此項技#人均瞭解,_子取決於核= 34 20 200931020 LBD訊號傳遞之衍生處’而能選擇供本發明測試系統用之 適當輔因子以檢測配體結合後輔因子與含LBD的單離蛋 白質間之相互作用。 於本發明之一較佳具體實例中,辅因子為視需要以標 5 記物(較佳為標藏)標記之使糖皮質激素受體失活之蛋白-1 (GRIP-1)或類固醇受體共活化子-1 (SRC-1)。 GRIP-1為轉錄共調控蛋白質,含有數個與核受體相互 ® 作用之功能部位及固有之組織蛋白乙醯基轉移酶活性。 GRIP-1由於經配體活化之核受體(例如R〇R,特別是R〇Ra) 10 而被徵集至DNA啓動位點;接著,GRjpq使組織蛋白乙 醯基化,促成DNA轉錄。GRIP-1亦稱為SRC-2 (類固醇受 體共活化子-2)或轉錄傳介子/媒介因子2 (TIF-2)或核受體 共活化子2 (NCOA2)。 SCR-1亦為轉錄共調控蛋白質,其亦含有數個受體相 g 互作用功能部位及固有之組織蛋白乙醯基轉移酶活性。 SCR 1由於經配體活化之核受體而被徵集至啓動位 點,接著,使組織蛋白乙醯基化,促成下游dna轉錄。 SCR_1亦稱為核受體共活化子-1 (NCOA-η。 於本發明之—具體實射,_子可以標記物(較佳為 -〇 域)標記;該標絲或類可如上文所界定。標記物可供 辅因子純化之用或可用以檢測單離蛋白質與輔因子間之相 互作用適當標記物包括抗體、抗原、酵素、輻射標記等。 然而’須瞭解的是,標記辅因子之方式須仍容許與測試系 35 200931020 統其他成分相互作用俾使得以檢測指示單離蛋白質與輔因 子間,相互作用之訊號。 於本發明之一較佳具體實例中,測試系統係以使該蛋 白質接近辅因子而誘發可檢測訊號之方式進行設計。 5 ❹ 10 15 ❹ 單離蛋白質與輔因子之接近可利用使單離蛋白質與輔 因子結合而達成。訊號之誘發可藉由標記各個成分進行, 其中諸標記接近而誘發可檢測之訊號。所誘發之可檢測訊 號可為化學發光訊號、顏色變化、輻射或任何其他適當訊 號。.該訊號可經由兩個標記相互作用而誘發,其中各標記 結合於測試系統之一成分’亦即單離蛋白質及輔因子。此 等訊號包括一方面為韓射標記,例如1251,另一方面為適當 遏止劑(quencher) ’以於檢測閃爍計數器中檢測接近性(閃 爍接近測定法)。成分可涵蓋抗原,其可接近以檢測fret (螢光共振能量轉移,見下文)方式標記之抗體。於另一替 代法中,一個蛋白質於其表面已結合能被激酶磷酸化之生 物分子,其他成分於其表面具有三價金屬離子複合體,例 如’.經由適當連接子例如氮基三乙酸、亞胺基二乙酸或經 適當取代之含N-雜環如三偶氮雜環例如三偶氮環壬烷,例 如’卜丙胺基-乙酸配位基-1,4,7-三吖環壬烧。蛋白質與輔 因子結合後’即發生供體與接受體(acceptor)粒子很接近, 而產生化學發光訊號(發光接近測定法)。 於本發明之較佳具體實例中,用以檢測蛋白質與輔因 子間之相互作用之工具包括對該蛋白質或輔因子具專一性 36 20 5 ❹ 10 15 ❹ 200931020 之至少一種抗體。如上文所詳述,單離蛋白質可包含用於 專一性抗體之抗原及檢測抗體。於本發明之又更佳具體實 例中,測試系統包含兩個抗體,其中第一個抗體對該蛋白 質具專一性及第二個抗體對該辅因子具專一性。抗體可以 適當標記物標兄’該標s己物為各別成分存在之指標。替代 地,上述一次抗體可利用被引導對抗該一次抗體之適當一 次抗體進行檢測。可使用二次抗體(例如當結合於二次抗體 時)以檢測一次抗體之存在。該一次或二次抗體可使用如上 文界定之標記物例如酵素、輻射標記、螢光標記物、化學 發光標記物等予以標記。替代地,諸成分(蛋白質及/嘎輔 因子)可涵蓋使用適當抗體可檢測之標籤。 測試系統可呈使用分離複合體之至少一成分用之純 系統及檢測複合體或蛋白質與辅因子複合體各成分之存在 之方式使用。舉例而言,複合體之純化可顧凝膠電泳法、 管柱層析法、親和性純化法等;及謂由表示職合體之 成刀或該複合體之二成分之—個訊號或兩個訊號之存在 檢測複合體。舉例而言,若係成分之—複合體具 fi 刀離技術’則該檢測方法對其他成分可能有所限 制。.替代地’純化方法可能對諸成分之—者不具專一性, 電冰法’複合體之形成可利用兩個訊號檢測,例 二二SI螢光標記物標記的兩個抗體,其中兩個螢光 =己物之存在(例如於凝膠之相同區域)為該複合體之指 可示〇 37 20 200931020 於本發明之又進一步具體實例中,本發明測試系統之 特徵為 5 ❹ 10 a) 第一個抗體以用於螢光共振能量轉移(FRET)之供體部 分標記’第二個抗體以用於FRET之接受體部分標記或 反之亦然;或 b) 第一個抗體以用於時差式螢光共振能量轉移(TR-FRET) 之供體部分標記,第二個抗體以用於TR-FRET之接受 體部分標記或反之亦然;或 c) 第一個抗體以用於擴增發光接近均質性測定法(alpha) 之供體部分標記,第二個抗體以用於alpha之接受體 部分標記或反之亦然。 螢光共振能量轉移(FRET)敘述兩個發色團間之輻射-自由能量轉移。呈其激發狀態之供體發色團可利用非輻射 遠程偶極-偶極偶合機制轉移能量至密切接近(典型地<1〇 nm)之接受體螢光團。由於兩個分子均發螢光’因此儘管能 量實際上並非以螢光轉移,其能量轉移仍常被稱為“螢光共 振能量轉移”。FRET為檢測及定量蛋白質_蛋白質相互作 用、蛋白質-DNA相互作用、及蛋白-構形改變之有用工具。 欲偵測一蛋白質與另一蛋白質或一蛋白質與DNA之結合 時,將其中一分子以供體標記,另一分子以接受體標記, 及將彼等螢光團-標記分子混合。當彼等呈未結合狀態存在 時’激發供體後檢測到供體放射。兩分子結合後,供體及 接受.體互相接近,由於從供體至接受體之分子間FRET, 38 20 200931020 5 〇 10 15 ❹ 因此明顯觀察到接受體放射。FRET之適當夥伴(neighbors) 為此項技藝中已知,熟習之從事者得以為兩個抗體選擇適 當之標記組合。本文中所用有關供體及對應接受體,“對應” 係指具有與供體之激發光譜部分相同(overlapped)的放射 光譜之接受體螢光部分。然而,兩個訊號必須彼此分離。 因此,接受體放射光譜之最大波長較佳為必須大於供體激 發光譜最大波長至少30 nm,更佳為至少50 nm,例如至少 80 nm、至少 1〇〇 nm 或至少 150 nm。 FRET技術中,可與各種接受體螢光部分一起使用之 代表性供體螢光部分包括螢光黃、Lucifer Yellow、B-藻紅 蛋白、9-吖唆異硫氰酸鹽、Lucifer Yellow VS、4-乙酿胺基 -4’-異硫氰基二苯乙烯_2,2f-二磺酸、7·二乙胺基-3-(4,-異硫 氰基苯基)_4-曱基香豆素、1-芘丁酸琥珀醯亞胺酯、與4-乙醯胺基-4’-異硫氰基二苯乙烯-2,2'-二磺酸衍生物。代表性 接受體螢光部分,視所用供體螢光部分而定,包括LC-Red 610、LC-Red 640、LC-Red 670、LC -Red 705、Cy5、Cy5.5、 Lisspnine若丹明(rhodamine) B磺醯氯、四曱基若丹明異硫 氰酸鹽、若丹明χ異硫氰酸鹽、赤蘚紅異硫氰酸鹽、螢光 黃、伸二乙基三胺五乙酸鹽或鑭系元素離子(例如,銪、或 铽)之其他螯合物。供體及接受體螢光部分,舉例而言,可 自 Molecular Probes (Junction City,OR)或 Sigma Chemical Co· (St. Louis,MO)獲得。 替代地,本發明測試系統可使用時差式螢光共振能量 39 20 200931020 轉移(TR-FRET)。TR-FRET係組合TRF (時差式螢光)及 FRET原理。此組合結合TRF之低背景優勢及FRET均質 性測定版式。FRET已如上文敘述,TRF充分利用鑭系元 素或具有長半衰期的任何其他供體之獨特性質TR-FRET 5 之適當供體包括’例如’網系元素螯合物[穴合物(cryptates)] 及一些其他金屬配體錯合物,彼等具有微秒至毫秒時間範 圍之螢光半衰期,因此,亦容許呈微秒至毫秒測定發生之 ❹能量轉移。1970年代末期螢光鑭系元素螯合物已作為能量 供體之用。常見使用之鑭系元素包括釤(Sm)、銪(Eu)、铽 10 (Tb)與鏑(Dy)。由於其特定之光物理及光譜性質,鑭系元 素之錯合物於生物學之螢光應用上引起重大關注。詳言 之,相較於更傳統之螢光團,彼等具有大的衝程位移 (stroke’s shift)與極長之放射半衰期(從微秒至毫秒)。 通常,係使用有機發色68作為接受體;彼等包括別藻 15 藍素(APC)。有關TR-FRET以及接受艟之適當細節見述於 P W0 98/15830。 於本發明之進一步具«實例中,本發明測試系統經改 造以適應擴增發光接近均質性測定法(ALPHA)。ALPHA係
原先由Packard BioScience開發之溶液系測定法。ALPHA 20 為發光系接近測定法,其中一相互作用伴體附著於供體珠 粒,而另一者連接於接受體珠粒,二者具有僅約25〇nm之 直徑》將光敏劑化合物嵌進供體珠粒中。由於此化合物於 以波長約680mn之雷射光照射後,周遭之氧氣即轉化為高 40 200931020 能量、不耐久之單態氧(singlet oxygen”當無接受體珠粒 接近時,該單態氧衰退而未產生訊號。若利用附著生物分 子之生物性相互作用使供體與接受體珠粒聚集(大約250 nm),則由供體珠粒釋出之單態氧於鄰近之接受體珠粒中引 5 發發光/螢光級聯反應,導致於520-62G nm範圍之高度擴 增訊號’於適當計讀器中檢測該發光訊號。有關alpha 之更多細節,參見 Ullman et al.,1994, Proc. Natl. Acad. Sci., ❹ USA 91,5426-5430 〇 例示之測試系統及其使用見述於實例2及於圖ic中 10 圖解«明》 本發明之又進一步態樣係有關篩選用於核受體之配體 結合功能部位的配體之方法,該方法包括下述步麻: a) 使根據本發明之測試系統舆物質接觸及 b) 使該物質結合於配體結合功能部位後即檢測可測量訊 ^ 號’從而鑑定該物質為用於該配體結合功能部位之配 體。 根據本發明’測試系統可如本發明說明書中所詳述(特 別是如較佳具艘實例中所詳述)具體說明。測試系統可包含 於細胞中或可為無麵胞系統;以無細胞系統較佳。測試系 20 統可在適於檢測可測量訊號之條件下與測試物質接觸;該 等條件包括適當溫度、化學環境(緩衝劑、pH值等)以及適 當物質濃度與適當接觸時間。 200931020 接觸之後或同時,觀察訊號,訊號之檢測為用於lbd 之配體之指標。該訊號可為如本發明測試系統與本發明單 離蛋白及其用途之說明書中所詳述之任何訊號。 於本發明方法之較佳具體實例中,測試系統包括第一 5 個抗體以用於FRET或见咖τ之供體標記及第二個抗體 以用於FRET《T-FRET之接受體部分標記或反之亦然。 此外,FRET之存在為促效劑之指標。 於本發明之一較佳具體實例中,篩選方法係用以篩選 用於預防及/或治療冠狀動脈疾病(CAD)、動脈硬化、血脂 10 異常、神經退化性疾病、睡眠失調、晝夜節律性疾病或骨 質疏鬆之醫藥劑。 - 前述疾病涉及ROR,特別是RORa。因此,一般設想 ROR (特別是R〇Ra LBD)之促效劑或拮抗劑對於彼等疾病 具有有利影響,因而可用以預防或治療彼等疾病。 趁 下文中,利用圖式及實例說明本發明,惟彼等不擬對 本發明範圍構成侷限。 【實施方式】 實例:
實例1: R〇Ra _表現、純化及AD 根據 Kallen et al.· 2002, Structure,1〇 (1697)進行 RORa 蛋白.質之表現與純化。 42 20 200931020
欲表現及純化時’將包含配體結合功能部位(lbd,胺 基酸271-523)的RORal之DNA選殖入具有6個連續組胺 酸殘基N端延伸與用於HRV 3C蛋白酶的識別序列之 PVL1393載體中。根據標準程序完成Sf9昆蟲細胞中之病 5 毒產,生及表現。感染72小時後,獲取感染細胞,於_8〇°C 貯存細胞沉澱物。 使凍結之細胞沉澱物再懸浮於500 mM NaCl、50 mM ❹ Tris、pH 8.0、5 ιηΜβ-酼基乙醇中。添加蛋白酶抑制劑 (Complete EDTA-free,Roche Diagnostics)以及 Benzonase 10 (Novagen)。於冰上攪拌溶胞物30分鐘,最後進行超音波
處理使細胞破裂。離心後,將澄清之溶胞物裝載於以500 mM NaC卜 50 mM Tris、pH 8.0 平衡之填充 Ni2+之 HisTrap FF (GE Healthcare)管柱上。以30倍管柱容積完成500 mM NaCl、500 mM咪唑、pH 8.0之線性梯度溶洗。利用 15 SDS-PAGE分析溶離份,集合對應溶離份,以30 mM ❿ Hepes、pH7.0、20mMNaC卜 2mMDTT、5%甘油進行透 析。 欲進一步純化,將蛋白質裝載於HiTrap Q FF陰離子 交換管柱(GE Healthcare)上,以 30 mM Hepes、pH 7.0、20 20 mM.NaCl、2 mMDTT平衡。以20管柱容積溶洗蛋白質,
梯度至 30 mM Hepes、pH 7.0、1 M NaC卜 2 mM DTT。集 合對應溶離份,進一步於Superdex 200 26/60凝膠過濾、管 柱上(GE Healthcare)(於 150 mM NaCl、5 mM DTT、50 mM 43 200931020
Tris、pH 7.5中平衡)進行純化。集合含R〇RgLBD之溶離 份’予以濃縮。利用SDS-PAGE及毛細管電泳法(Agilent 2100 Bioanalyzer)斷定該等蛋白質溶離份純度至少95%。 取部分蛋白(2.3毫克/毫升),貯存於_8〇。〇供試管内 5 測定法用之前’於室溫以20 mM Tris,pH 7.5使蛋白質透析 8小時。添加硫酸十二烷醋鋰(LDS)至最終濃度為3 mM, 輕輕振盪下’於室溫進一步培育該混合物隔夜。取部分蛋 ❹ 白質,貯存於-80°C。 於輔因子徵集螢光共振能量轉移測定法(FRET)中,純 10 化及經LDS處理之RORa LBD蛋白質被證實和與糖皮質 激素受體相互作用之蛋白1 (GRIP1)及類固醇受體共活化 子1 (SRC1)相互作用。具體而言,肽類GRIP1-NR1、 GRIP1-NR2與SRC1-NR1+2 -衍生自兩種輔因子之核受體 盒(NR)-被發現與RORa相互作用。 g 於所有三種情形下,膽固醇硫酸鹽能以22 μΜ之EC5〇 劑量依賴性地誘發輔因子結合。使以等莫耳量螢光抗 -6xHis抗體標記之20 nM RORa LBD蛋白質與400 nM各 別以生物素標記之肽及等莫耳量抗生物素鏈菌素_標籤螢 光團於含 50 mM Tris、100 mM NaCl、1 mM DTT 與 0.1 % 20 BSA之緩衝液中培育2小時。於665 nm與612 nm之螢光 比率時差式測量顯示利用已知促效劑如膽固醇硫酸鹽及膽 固醇之劑量依賴性之輔因子徵集。 實例 2:測量 RORaLBD 與 LXXLL 肽,SRC1-NR1+2, 44 200931020 相互作用之TR-FRET測定法 TR-FTET測定法中使用下述物皙: 蛋白: —6xHis-RORa: 5 ❹ 10 來源:Protein Production (Lab. Thomas Langer) 以3 mM LDS處理,貯液濃度1.5毫克/毫升,貯存 於-20°C,於室溫以滴管移取,相當於47,5 μΜ (MW ,31,6 kD),測定法中之濃度=20 ηΜ -SRC 1-NR 1+2: 來源:JPT Peptide Technologies,貯液濃度 250 μΜ, 貯存於-20°C ’測定法中之濃度=4〇〇ηΜ 螢光團/標記: — 抗-6xHis抗體:
來源:Perkin Elmer #AD0110,各批次貯液濃度不同, 貯存於-20°C,測定法中之濃度=20nM —strep-APC: 來源:Perkin Elmer #AD0201,各批次貯液漢度不同, 再組成後貯存於+4。(: ’測定法中之濃度=200 ηΜ (以 •抗生物素鏈菌素計) 促效劑: —膽固醇硫酸鹽: 來源:SIGMA#C9523,於 DMSO 中之貯液(3〇mM), 45 20 200931020 貯存於-20°C 緩衝劑: —50 mM Tris、100 mM NaCl、1 DTT、0,1 %牛血清 白蛋白(每天添加新鮮BSA) ’調pH至7,4 5 ❹ 10
15 G 盤: —測試盤:CORNING Costar # 3639 (96 槽半面積) 測定法如下進行: 於測定法就序之前,以緩衝液稀釋所有蛋白質、標記 及化合物。此測定法於96槽半面積盤中實行。最終測試容 積為20微升;將其分成2個滴管移取步驟: 首先,於冰上製備下述濃度之含6xHis_R〇RaLBD蛋
白質、生物素-SRC1-NR1+2肽、抗_6xHis抗體與strep-APC 之混合物: 測試濃度(最終):
20 nM 400 nM 20 nM 200 nM
6xHis-RORaLBD 27 nM
生物素 SRC1-NR1+2 533 nM 抗-6xHis 抗體 27 nM
strep-APC 267 nM Θ以滴管移取15微升此混合物至白色%槽盤中 於第二步驟中,添加呈4倍濃度溶液之5微升促效劑 化合物。膽固醇硫酸鹽典型地從遍_最終化合物濃度 以2倍稀釋步驟進行向下稀釋,獲得約10 μΜ之EC50。密 封諸盤以避免蒸發。 ^ 46 20 200931020 室溫下,於微弱光線中培育諸盤2小時;室溫下,於 Tecan ULTRA上進行計讀,於340 nm激發’ 612 nm為銪 參照組及665 nm為APC FRET訊號。此試驗結果示於圖2。 【圖式簡單說明】 圖1A顯示RORai之概要說明,其中指出此核受體之 各種功能部位。 圖1B顯示本發明之各種構築,其中R〇Rai之LBD 連接於切割位點(TEV或PreScission (PreSci))、His-標籤 (His)及視需要之麩胱甘肽_s_轉移酶-標籤(GST)。 圖1C顯示根據本發明fret測定法之例示說明。於此 測定法中,RORct係利用結合於FRET供體銪(Eu)之專一性 抗體進行檢測。共活化子(CA)經生物素標記;該生物素標 記正以抗生物素鏈菌素檢測,其中包含FRET接受體別藻 藍素(APC)標記物。若促效劑結合於R〇R(X,則NR被活化 而CA結合於NR。因此,Apc被帶至接近Eu,導使檢測 出FRET ail號(左圖)。於拮抗劑存在下,不與R〇Ra結 合’因此未產生FRET訊號(右圖)。 圓2顯示實例2測定法結果;如螢光共振能量轉移測 疋法中所測螢光強度比率增加,膽固醇與膽固醇硫酸鹽劑 量依賴性地誘發共活化子肽SRC1_NR1+2與R〇Ra之結 合。上線(+)代表於存在濃度增加之膽固醇硫酸鹽下進行之 測定法’而中線(〇)顯示於存在濃度增加之膽固醇下進行之 測定法。底線(□與△)代表只有溶劑存在下進行之實驗。 47

Claims (1)

  1. 200931020 七 申請專利範圍: 1. -種單離蛋白質,其包含呈可控制形式 功能部位。 敉又骽的配體結合 2·^請專利範圍第1項之單離蛋白f, 5 ^體㈣孤兒受體(),特別是峨α、舰P或R〇^ 尤其是 RORa。 μχκυκγ’ ❹ =範圍第1或2項之單離蛋白質,其中於促效劑與 該配體結合魏部位結合後,該_結合魏雜可被活化。 10 4.=申請專利範圍第4 3項之任—項之單離蛋㈣,其中該 蛋白質進-步包含標記物,特別是標籤。 ^申π專利範圍第4項之單離蛋白質,其中該標籤係選自下 二=群· Hls•標籤、Arg-標籤、StreP標 &、Flat標籤、Τ7_ 二鐵、V5-肽·標籤、c_Myc_標藏、s-標藏、ηατ_標藏、攜鈣 :、、’《合肽標籤、幾丁質-結合肽-標藏、GW標藏與ΜΒρ-標 鐵。 US,圍第4或5項之單離蛋白質,其中該標記物或 二」疋切割位點可利用蛋白水解作用切割方式自該蛋白 質中移除。 7. ΓΕ=Γ圍第1至6項之任-項之單離蛋白質,其包含 • 1或2序列或由SEQ ID NO : 1或2序列構成。 之如申喷專利範圍第1至7項之任-項之單離蛋白質 之方法,該方法包括下述步驟: 48 20 200931020 a) b) c) 於促成製造如申請專利目m 質之適當條件下,培養包含編碼該蛋m. 自細胞培養物中單離該蛋白質;及㈣核酸之細胞’ 5 e 10 使步驟b)之單離蛋白質與清潔劑接觸 鏈C6至C20烷基硫酸_ 寻別疋與飽和直 基鹽接觸。 ^曰或石厌酸醋之驗鹽或與異戊二稀 9.如申請專職圍第8項之方法,其中該方法進 驟b)後移除標記物或標籤。 1括於步 10.如 C20 申請^範㈣9或1G項之方法,其巾該 :〇烧基硫_或碳_之__和直㈣ 較佳為硫酸十™^ 11.如申請專利範圍第8至10項之任一項之方法, 及/或C)係於用於配體結合功能部位之促效劑存在下進Y行囉b) 12·如申請專利範項之任—項之方法 τ° 選自下述組群:動物細胞、植物細胞與酵母細胞中 中該細胞係昆蟲細胞或大腸桿菌細胞。 悄疋其 13.-種含有呈可控制形式之核受體的配體結合功能部位之 蛋=質’其係根據申請專利範圍第8至12項之任一項之方法 製造。 14二種使时請專利範圍第1至7項及/或第13項之任 單離蛋白質鐘定用於核受體之配體結合功能部位的配體(特 49 20 200931020 別是促效劑或拮抗劑,尤其是促效劑)之用途。 15. —種測試系統,其包含 -如申請專利範圍第1至7項及/或第13項之任一項之 蛋白質; 5 ❹ 10 -輔因子;及 -用以檢測配體(尤其是促效劑)結合於核受體之配發社八 能部位時該蛋白質與輔因子間之相互作用之工具。1 力 16. 如申請專利範圍第15項之測試系統,其中該輔因子為視 以標記物(較佳為標籤)標記之使糖皮質激素受體失活需要 -1 (GRIP-1)或類固醇受體共活化子1 (SRC1)。 白 17·如申請專利範圍第15或丨6項之測試系統,其中該蛋白 近該共活化子而誘發可檢測訊號。 18·如申請專利範圍第15至17項之任一項之測試系統其 以檢測該蛋白質與_子間之相互作用之工具包括對該 質或輔因子具專一性之至少一種抗體。 / 19如=專利範圍第18項之剛試系統,其中該測試 =因;中第一個抗體野該蛋白質具專-性及第二個抗: 對該輔因子具專一性。 20.如申請專利範圍第19項之測試系統,其中 ⑻1個彳讀以肖於勞光共振能量轉移(FRET)之供體部分 ‘。己,且第二個抗體以用於FRET之接受體部分標記或 反之亦然;或 50 20 200931020 (b)第一個抗體以用於時差式螢光共振能量轉移(TR_FRET) 之供體部分標記,且第二個抗體以用於TR-FRET之接受 體部分標記,或反之亦然;或 (C)第一個抗體以用於擴增發光接近均質性測定法(ALPHA) 5 之供體部分標記,且第二個抗體以用於ALPHA之接受 體部分標記,或反之亦然。 21’種用以篩選用於核受體之配體結合功能部位的配體之方 © 法’其包括下述步驟: a) 使根據申請專利範圍帛15jL2〇項之任一項之測試系統 10 與物質接觸及 b) ^該物質結合於配體結合功能部位時檢測可測量訊號, 從而鑑定該物質為用於該配體結合功能部位之配體。 22.=中請專利範圍第21項之方法,其中該測試系統如中請專利 範圍第2〇項中所界定,及其中FRET之存在為促效劑之指標。 ▲5 23.^申凊專利範圍第21及22項之方法,其中該方法係用以筛 選^於預防及7或治療冠狀動脈疾病(CAD)、動脈硬化、血脂 異系、神經退化性疾病、睡眠失調、晝夜節律性疾病或骨質 疏鬆之醫藥劑。 、 51 200931020 序爿表 <110>赛諾菲FT凡提斯公句 <120>呈可控制形式之核受«的配遁結合功嫵部位及涉及其等之方法 <130> 104SAN0704 <160> 6 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 253 <212> PRT <213>智人 ❹
    <400> 1 Ala Glu Leu Glu His Leu Ala Gin Asn lie ser Lys Ser H*is Leu Glu 15 10 15 Thr cys Gin Leu Arg Glu Glu Leu Gin Gin lie Thr Trp Gin Thr Phe Leu Gin Glu Glu lie Glu Asn Tyr Gin Asn Lys Gin Arg Glu val 35 40 45 Met Trp Gin Leu cys Ala lie Lys lie Thr Glu Ala lie Gin Tyr val SO 55 60 val Glu Phe Ala Lys Arg lie Asp Gly Phe Met Glu Leu cys Gin Asn 65 70 75 80 Asp Gin lie val Leu Leu Lys Ala Gly ser Leu Glu val val Phe lie Arg Met cys Arg Ala Phe Asp ser Gin Asn Asn Thr val T^r phe Asp Gly Lys T^r Ala ser Pro Asp val Phe Lys ser Leu Gl^ Cys Glu Asp Phe lie ser Phe val Phe Glu Phe Gly Lys ser Leu Cys ser Met His 130 135 140 Leu Thr Glu Asp Glu lie Ala Leu Phe ser Ala Phe val Leu Met ser 145 150 155 160 Ala asp Arg ser Trp Leu Gin Glu tys val Lys He Glu Lys Leu Gin Gin Lys He Gin Leu Ala Leu 6ln His val Leu Gin Lys Asn His Arg 第1頁 200931020 Glu Asp Gl^ He Leu Thr Lys Leu Πβ Cys Lys Val Ser Thr Leu Arg Ala Leu cys Gly Arg His Thr Glu Lys Leu Met Ala Phe Lys Ala lie 210 215 220 Tvr Pro Asp lie val Arg Leu His Phe Pro Pro Leu Tyr Lys Glu Leu 225 2B0 235 240 Phe Thr ser Glu phe Glu Pro Ala Met Gin He Asp Gly 245 250 <210> 2 <211> 271 Ο ❹ <212> PRT <213>人工序列 <220> _ <223>具有His·標鐵典PreScfssion切«位》之R〇R*功艇部位 <400> 2 Met Gly Ser ser His His His His His His Leu <3lu val Leu phe Gin 15 10 15 Gly pro Ala Glu Leu Glu h1s Leu Ala Gin Asn lie Ser Lys ser His 20 25 30 Leu Glu Thr cys Gin Tyr Leu Arg Glu Glu Leu Gin Gin Πβ Thr Trp 35 40 45 Gin Thr phe Leu Gin Glu Glu He Glu Asn Tyr Gin Asn Lys Gin Arg 50 55 60 Glu val Met Trp Gin Leu cys Ala lie Lys He Thr Glu Ala lie Gin 65 70 75 80 Tyr val vaT Glu Phe Ala Lys Arg lie Asp Gly Phe Met Glu Leu cys Gin Asn Asp Gin lie val Leu Leu Lys Ala Gly ser Leu Glu val val 100 110 Phe lie αγ| Met cys Arg Ala Phe Asp ser Gin Asn Asn Thr val Tyr 120 125 Phe Asg Gly Lys Tyr Ala Ser pro Asp val Phe Lys Ser Leu Gly cys 135 140 Glu Asp Phe He Ser Phe val Phe Glu Phe Gly Lys Ser Leu cys ser 145 150 15S 160 Met His Leu Thr Glu Asp Glu He Ala Leu Phe ser Ala Phe val Leu 165 170 175 第2頁 200931020 Met: ser Ala Asp 180 Arg ser Trp Leu Gin 6lu Lys val Lys lie Glu Lys 185 190 Leu Gin Gin Lys He Gin Leu Ala Leu Gin His val Leu Gin Lys Asn 195 200 205 His 61u Asp Gly lle 2¾ Thr Lys Leu i1e % Lys val ser Thr
    Leu Arg Ala Leu cys Gl^ Arg His Thr Glu L^| Leu Met Ala Phe Lys Ala lie iyr pro Asp 245 lie va! Arg Leu His Phe Pro Pro Leu srys Glu Leu Phe Thr Ser Glu Phe Glu Pro Ala Met Gin lie 260 265 €ly <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> His-揉籤 <400> B His His His His His His
    <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> Prescission 切割位 ft <400> 4 Leu Glu Val Leu Phe Gin Gly Pro <210> 5 <211> 1020 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>其有Hi s-標栽舆Presci ssion切割位*之RORe功隹部位之編碘DNA C編磷致) <400> 5 60 120 gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atccatggga 第3頁 200931020 Ο agtagccatc atcatcatca tcatctggaa gttctgttcc aggggcccgc agaattagaa caccttgcac agaatatatc taaatcgcat ctggaaacct gccaatactt gagagaagag ctccagcaga taacgtggca gaccttttta caggaagaaa ttgagaacta tcaaaacaag cagcgggagg tgatgtggca attgtgtgcc atcaaaatta cagaagctat acagtatgtg gtggagtttg ccaaacgcat tgatggattt atggaactgt gtcaaaatga tcaaattgtg cttctaaaag caggttctct agaggtiggtg tttatcagaa tgtgccgtgc ctttgactct cagaacaaca ccgtgtactt tgatgggaag tatgccagcc ccgacgtctt caaatcctta ggttgtgaag actttattag ctttgtgttt gaatttggaa agagtttatg ttctatgcac ctgactgaag atgaaattgc attattttct gcatttgtac tgatgtcagc agatcgctca tggctgcaag aaaaggtaaa aattgaaaaa ctgcaacaga aaattcagct agctcttcaa cacgtcctac agaagaatca ccgagaagat ggaatactaa caaagttaat atgcaaggtg tctacattaa gagccttatg tggacgacat acagaaaagc taatggcatt taaagcaata tacccagaca ttgtgcgact tcattttcct ccattataca aggagttgtt cacttcagaa tttgagccag caatgcaaat tgatgggtaa gaattccgga gcggccgctg cagatctgat cctttcctgg gacccggcaa gaaccaaaaa ctcactctct tcaaggaaat ccgtaatgtt 180 240 300 360 420 480 540 720 780 840 900 960 1020 <210> 6 <211> 10435 <212> DNA <213>人工序蚵 載馥
    <400> 6 aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat tttaacaaat actttatcct atcttcaaat tgcttcgctt gctccgttta gcttgta$cc gattaggccg gatattctcc accacaatgt ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa catatttagt tgcgtttatg agataagatt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg accggttaca tggtgtgcag atatttaatg atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac ttattaattt aattaatatt atttgcattc tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 60 120 180 240 300 360 420 480 540 720 780 840 第4頁 200931020
    Ο cgcacaacac ccaccacttt tcttttgcat tgacctgcaa actcttgttt tgtgctcggt gtttgatcgc gccattcttg cggatttagt cgctgttaga tgtctacatg ccttggccac cttctccaaa tttgcaacaa tatgggggaa ggcgcaagcg tacagttttg atgacgccta cttcctccgt cgacgcacaa ggcaatactg cgttgggcat tagtgcgatt atcgagtcaa gcgcgtattt aataatatat acgactatga atctgtgcac tgacccccgt atgtcggtga tggtgcgaga agagcgtcat aaattgaccc ggactgcgat cggatgtttg ggcaactaaa ggtttcctgg atctttggcc tttaacaagt gaatgtcgca gggatcgtac taattctatg aatgagcact ggtagggccc aacacgtata gaaccggacc tttaaattct ctattgtttt catgcgccgc gctaaaacgt atttgcatat caactccccg gtggccgaac gtatctgtac gcaaattcga gtacgtccga aaaacgttgt gtgatcaaag taacaaacta tatgtatcgc tagagatcaa gcgttccggc agtgacaacg cgttaaaact agccgcgaag gtttagacaa taactccata tgtacatgct cgcttgtccg tcggtgacct aagccggtgt tcgatctgct tcctcggttt atcagcttag ttgccggtgc gcgtaaggca gtatgcggct ccattttgga gctttatcac tgttggtcgc ccaattttaa ttaacgcaaa tacaacactc gttgcgcgtt taacggcgat cccgcgttga acgtcgagcg accgaatgat aaatatatac acgttgattt acatcctcgc tgtggaataa gccatcttgt acgtcaagaa ataaagcgcg acgagctttg atcacgccca attaagccat targgcgaac gaaagctaca cacggtattc gttaacggct cggggtattg gcgcgtcttt acatgcggtt tgtccttgat tttgcgccac tcaccaactg agagcacttg atttggactt gcaaatacag tggtctgctc aaactgtata gctctagcac cgcgagccat ctaaacttat gtcgttatga caacgcggca tttttaaatt ctcgctgcac ggtggtcgat cgtcgggcga agttgggttg gcatgcaagc ttttaatcat tgttttcttt aagttagttt ttaacaatgc aattaaatag attgtaataa aaagaactgc ccaatcgacc gcatcgtata tatttaattg tacaatggcg ccgcccacta aaccgcgcga tttctgcatt tagatcagtc ggcaacgatg caccgcttgc tttgctctcc aggaattact cataatcagc cgggtcgccc aaataacgat ttttaaactg gtaccgcagg tttgatacac tgtggtaagc acgcagacgg aacatcgcaa atcttattta ctcgagcagt gaccagcggc aggcacgtcg tttgcgcata cgaaattaaa gccgtcgatt gtattcccga catttaatgc gcccgttgtc cttgcgacgc gtttttacga cgactacaaa gttagtcgaa acgtgtggag atcccgatga gggttttggt ttaatgaaat tccgacaaat atttcgtctt atgacgcgcg cgttcaataa agcgcgtttg tcctcccgtt tcttctaaaa. tgaatcacgc cttttcacga ttgtatttat ttagcgacgt ttgaacgtat gtgtgtcgat aataattaaa cgcc明tctc aagccaatag ataaatagtt tcgttgacgc gtgccgcacg gcctccaagt tctatcgtgg tcattgcgat aaatcgcgca gtcaagcgca aactttatcc gcatctcaac aacgtgcacg agcgatgaca attaccgagt tcaggaccgc tccgctcatt ttttattgat caaaatttcc taaaaattcc 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 第5頁 ❹ ❹ 200931020 aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata aaacaattat aaatgccaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa aactaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttrcc tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt acgcagcttc ttctagttca attecaccat tttttagcag caccggatta acataacttt ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atacilcattgt ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atccatggga agtagccatc atcatcatca tcatctggaa gttctgttcc aggggcccgc agaattagaa caccttgcac agaatatatc taaatcgcat ctggaaacct gccaatactt gagagaagag ctccagcaga taacgtggca gaccttttta caggaagaaa ttgagaacta tcaaaacaag cagcgggagg tgatgtggca attgtgtgcc atcaaaatta cagaagctat acagtatgtg gtggagtttg ccaaacgcat tgatggattt atggaactgt gccaaaatga tcaaattgtg cttctaaaag caggttctct agaggtggtg tttatcagaa tgtgccgtgc ctttgactct cagaacaaca ccgtgtactt tgatgggaag tatgccagcc ccgacgtctt caaatcctta ggttgtgaag actttattag ctttgtgttt gaatttggaa agagtttatg ttctatgcac ctgactgaag atgaaattgc attattttct gcatttgtac tgatgtcagc agatcgctca tggctgcaag aaaaggtaaa aattgaaaaa ctgcaacaga aaattcagct agctcttcaa cacgtcctac agaagaatca ccgagaagat ggaatactaa caaagttaat atgcaaggtg tctacattaa gagccttatg tggacgacat acagaaaagc taatggcatt taaagcaata tacccagaca ttgtgcgact tcattttcct ccattataca aggagttgtt cacttcagaa 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 200931020
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2181710A1 (en) * 2008-10-28 2010-05-05 Phenex Pharmaceuticals AG Ligands for modulation of orphan receptor-gamma (NR1F3) activity
US8574862B2 (en) * 2009-05-06 2013-11-05 Cytochrama Inc. Methods and composition for measuring the amount of Vitamin D derivatives
US8187871B2 (en) 2009-08-11 2012-05-29 Janssen Pharmaceutica N.V. Co-crystallization of ERR-α with a ligand that forms a reversible covalent bond
CN102262158A (zh) * 2010-05-27 2011-11-30 戴国祯 重组融合蛋白质在快速诊断检测中的直接应用
US20140017260A1 (en) * 2012-07-16 2014-01-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for reducing bone loss
US20220002353A1 (en) * 2018-10-29 2022-01-06 Agricultural Technology Research Institute Dextran affinity tag and use thereof
CN113461809A (zh) * 2020-07-17 2021-10-01 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 筛选结合抑制剂和/或结合区域的方法
CN115356320B (zh) * 2022-10-20 2023-01-17 上海诚益生物科技有限公司 基于均相时间分辨荧光技术的体外rig-i激活检测的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040265809A1 (en) * 2001-05-07 2004-12-30 Dino Moras Polypeptides derived from retinoic acid-related orphan receptor(ror) and their applications
EP1501867A1 (en) * 2002-04-29 2005-02-02 Novartis AG Crystal structure of the ligand binding domain of the retinoic acid-related orphan receptor alpha (ror-alpha)
US20050048539A1 (en) * 2003-06-13 2005-03-03 The General Hospital Corporation Methods to monitor molecule conformation and molecule/molecule proximity
WO2007071062A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-28 Krause Henry M Methods and compositions for the detection and isolation of ligands

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