CN110819589B - 一种增强免疫效应细胞功能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，包括通过免疫调节因子增强免疫效应细胞功能。本发明提供了增强免疫效应细胞功能的方法以及该方法所获得的药物组合物，使用该方法，可以使得免疫效应细胞分泌更多细胞因子、使免疫效应细胞具有更强的细胞杀死能力、以及使免疫效应细胞具有更高的细胞扩增倍数。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地属于肿瘤的免疫治疗领域，涉及利用嵌合抗原受体T细胞治疗肿瘤。
背景技术
过继细胞疗法(adoptive cell transfer therapy,ACT)是指通过向肿瘤患者输注在体外培养扩增或激活后,有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。目前主要由T细胞受体(TCR)T和嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗构成。
CAR T细胞免疫疗法是一种使用基因修饰后表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞清除肿瘤细胞的免疫疗法。CAR是CAR-T的核心部件，它由构成抗体的抗原结合域的scFv、铰链和跨膜区、T细胞受体的胞内信号和共刺激信号组成，单链抗体scFv能够特异性结合肿瘤相关抗原，跨膜区和胞内信号结构域可以帮助T细胞激活，而共刺激信号可以维持T细胞的增殖。
目前的研究和临床试验表明CAR-T在血液恶性肿瘤的治疗中取得了优异的成绩,但是未能在实体瘤治疗中有所进展[PMID:27162934],CAR T免疫疗法在实体肿瘤的治疗应用中主要遇到三个障碍:首先难以获得适当的肿瘤特异性或相关抗原；其次过继输注的CAR-T细胞难以向肿瘤位点转移；最后肿瘤位点存在免疫抑制作用的肿瘤微环境又会对进入肿瘤微环境中的T细胞造成免疫抑制,因此CAR-T治疗在实体瘤中仅体现出有限的治疗效果[PMID:28331617]。近年来随着CAR T在实体瘤治疗中的尝试,肿瘤微环境逐渐成为重要的靶点。肿瘤微环境主要由间质成纤维细胞,浸润的免疫细胞,血液和淋巴管网络和细胞外基质组成,此外在肿瘤微环境中还充斥着各种肽因子(例如酶,趋化因子和细胞因子)和由肿瘤细胞和基质细胞产生的代谢物[PMID:23666510]。有研究表明在肿瘤微环境中因缺氧环境致使细胞外腺苷(adenosine,Ado)大量积累,其与各种免疫细胞表面的腺苷受体结合后,会抑制免疫细胞的炎症反应,同时腺苷受体的信号传导上调了许多抗炎分子并招募免疫调节细胞,从而建立了持久的免疫抑制环境[PMID:28331617,PMID:28165340，PMID:16784779，PMID:16518376，PMID:27066002，PMID:25035124]。
Adenosine是ATP的水解代谢产物,胞外adenosine通常来源于位于细胞表面或以可溶形式存在于间质培养基或体液中的ecto-enzyme(如CD39和CD73)分解代谢胞外ATP或直接来源于细胞裂解后释放,胞外adenosine水平的调节还与腺苷脱氨酶(ADA)和腺苷激酶相关,前者不可逆地将adenosine代谢生成inosine,而后者可以重新磷酸化腺苷产生AMP[PMID:16784779,PMID:25035124]。
Adenosine依靠其与adenosine receptor的结合和启动下游信号通路来介导肿瘤逃逸和其他细胞反应[PMID:28165340,PMID:16518376，PMID:27066002，PMID:25035124，PMID:18758473，PMID:24990240]。Adenosine receptor被划分为四个亚型,分别为A1、A2A、A2B、A3,四种亚型都是G-蛋白偶联受体(GPCR)的超家族的成员,每种亚型具有独特的药理学特征,组织分布和偶联效应物[PMID:16518376]。通常adenosine receptor的信号被认为是通过抑制或刺激腺苷酸环化酶来进行传递地,A1和A3腺苷受体的激活通过激活Gi蛋白来抑制腺苷酸环化酶活性；A2A和A2B受体的激活则通过激活Gs蛋白增加腺苷酸环化酶活性,所有四种亚型的adenosine receptor可以偶联到丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),使其在细胞生长,存活,死亡和分化中起作用[PMID:16518376]。
近期研究表明在快速增殖的肿瘤组织中缺乏血管系统支持从而导致实体瘤组织中发展成为缺氧区域,在此缺氧环境下低氧诱导因子(HIF)启动应对缺氧条件的差异转录调节,影响细胞代谢和血管生成以减轻氧气需求,而依靠识别HIF1α驱动的CD73和CD39在上皮细胞被激活从而导致了缺氧环境介导的adenosine生产[PMID:25035124],而adenosine通过激活adenosine receptor(主要为A2A和A2B)及其下游信号通路。1.阻断NK和CD8+ T细胞的细胞毒性功能,使肿瘤免疫逃逸；2.通过A2A腺苷受体的信号转导抑制Th1CD4+ T细胞应答,限制这些效应细胞所需的细胞因子环境；3.adenosine促使骨髓细胞分化为免疫抑制表型并增强Treg的增殖,进一步影响T效应细胞增殖和功能。4.通过这些抑制细胞类型释放细胞因子和免疫调节因子,通过促进血管发生增强肿瘤的存活并抑制免疫监视[PMID:28165340,PMID:16518376，PMID:27066002，PMID:25035124，PMID:18758473，PMID:24990240]。
靶向腺苷代谢通路的免疫佐剂包括低氧-HIF-1α信号通路抑制剂,CD39/CD73胞外酶抑制剂,细胞外腺苷降解药,腺苷受体拮抗药或激动剂。已有的研究表明针对低氧-HIF-1α等早期阶段的抑制剂(如HIF-1α抑制剂)能够减少低氧发生和促进抗肿瘤T细胞和NK细胞中HIF-1α的降解。针对CD39或CD73的抗体或者抑制剂可以阻止肿瘤微环境中胞外腺苷的聚集,进而降低A2A或A2B介导的免疫抑制信号强度。腺苷脱氨酶已有上市药物,为我们提供了一种降解胞外腺苷的策略。类似地,腺苷激酶可以重新磷酸化腺苷,从而降低胞外腺苷浓度。
针对腺苷代谢通路的调控来增强和抑制CAR T细胞功能的研究目前还鲜有报道。最近Phillip K.Darcy团队发现CAR T细胞受到抗原刺激后会上调A2A受体[PMID:28165340]。他们进而尝试采用A2A受体缺陷的CAR T细胞,或者将靶向A2A受体的小分子化合物药物与CAR T细胞联用治疗肿瘤。结果表明靶向A2A受体介导的免疫抑制,可以增强CART细胞抗肿瘤功能。作用的机制包括提高IFN-γ分泌量,增强CAR T细胞激活程度等。另外,Steven M.Albelda团队在CAR T细胞中表达一段小分子多肽RIAD可以抑制蛋白激酶PKA结合免疫突触,从而阻断腺苷受体的下游信号,同样显示增强了CAR T细胞的功能[PMID:27045023]。
发明内容
本发明的目的在于提供一种增强免疫效应细胞功能的方法以及该方法所获得的药物组合物。
为了达到上述目的，本发明提供了一种增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，包括通过免疫调节因子增强免疫效应细胞功能。
在一个优选例中，所述的免疫调节因子包括(但不限于)：BAY60-6583(分子式C19H17N5O2S)、BAY 60-6583结构类似物或其盐形式。
在另一优选例中，所述的BAY 60-6583通过与免疫效应细胞在体外或者/和体内接触来增强免疫效应细胞功能。
在另一优选例中，所述的BAY 60-6583在培养免疫效应细胞时加入。
在另一优选例中，所述的BAY 60-6583在免疫效应细胞结合靶细胞时加入。
在另一优选例中，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
在另一优选例中，所述的免疫效应细胞为被激活的免疫效应细胞。
在另一优选例中，所述的免疫效应细胞表达嵌合抗原受体(CAR)分子。
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区中的至少一种。
在另一优选例中，所述的胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤抗原的抗体。
在另一优选例中，所述的肿瘤抗原包括(但不限于)：CD133、CD19和HER2中的至少一种。
在另一优选例中，所述的增强免疫效应细胞功能包括(但不限于)：分泌更多细胞因子、使免疫效应细胞具有更强的细胞杀死能力、以及使免疫效应细胞具有更高的细胞扩增倍数中的至少一种。
在本发明的另一方面，提供一种制备增强型免疫效应细胞的方法，包括在培养免疫效应细胞时加入所述的免疫调节因子。
在本发明的另一方面，提供一种用于疾病治疗的药物组合物，其包括：所述的免疫效应细胞和所述的免疫调节因子。
在一个优选例中，所述的疾病为肿瘤或者癌症。
在本发明的另一方面，提供一种治疗方法，包括给病人所述的药物组合物。
在一个优选例中，所述的药物组合物中免疫效应细胞和免疫调节因子按照以下顺序提供给病人：先提供免疫调节因子，再提供免疫效应细胞；先提供免疫效应细胞，再提供免疫调节因子；同时提供免疫效应细胞和免疫调节因子；以上形式的任何组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物通过静脉注射或者原位给药提供给病人。
在另一优选例中，所述的药物组合物按照能够增强治疗效果的量提供。
在本发明的另一方面，提供一种提高免疫治疗效果的方法，包括使用所述的增强免疫效应细胞功能的方法或者给病人所述的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供所述的制备增强型免疫效应细胞的方法用于制备药物。
在本发明的另一方面，提供所述的药物组合物的用途，用于治疗疾病。
在一个优选例中，所述的疾病为肿瘤或者癌症。
在另一优选例中，所述的疾病具备难治或者复发的特征。
在另一优选例中，经过所述的药物组合物治疗，可以延长病人的生存期。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了增强免疫效应细胞功能的方法以及该方法所获得的药物组合物，使用该方法，可以使得免疫效应细胞分泌更多细胞因子、使免疫效应细胞具有更强的细胞杀死能力、以及使免疫效应细胞具有更高的细胞扩增倍数。
附图说明
图1为在CD133过表达的脑胶质瘤细胞U251(U251-OE)和靶向CD133的CAR T细胞(CD133-CAR T)的共培养体系中加入不同浓度的八种的小分子药物和药物溶剂DMSO，24小时后加入药物的上清中IFN-γ(图1a)和GM-CSF(图1b)的分泌量与加入DMSO的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。
图2a至图2c为在CD133过表达的脑胶质瘤细胞U251(U251-OE)刺激靶向CD133的CAR T细胞(CD133-CAR T)条件下加入药物BAY60-6583和药物溶剂DMSO，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(GM-CSF(图2a)，IFN-γ(图2b)和TNF-α(图2c))的分泌量与加入DMSO的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。
图2d至图2f为在抗CD3/CD28磁珠刺激靶向CD133的CAR T细胞(CD133-CAR T)条件下加入药物BAY60-6583和药物溶剂DMSO，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(GM-CSF(图2d)，IFN-γ(图2e)和TNF-α(图2f))的分泌量与加入DMSO的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。
图2g至图2i为在未刺激的靶向CD133的CAR T细胞(CD133-CAR T)中加入药物BAY60-6583和药物溶剂DMSO，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(GM-CSF(图2g)，IFN-γ(图2h)和TNF-α(图2f))的分泌量与加入DMSO的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。
图3为在CD133过表达表达萤火虫荧光素酶的脑胶质瘤细胞U251(U251-OE Fluc)和靶向CD133的CAR T细胞(CD133-CAR T)的共培养体系中加入BAY60-6583和药物溶剂DMSO，48小时后根据加入萤火虫荧光素酶底物后产生的生物发光信号计算得到的加入药物BAY60-6583时肿瘤细胞裂解率和加入DMSO时肿瘤细胞裂解率(设为1.0)的比值。
图4为在CD133过表达表达萤火虫荧光素酶的脑胶质瘤细胞U251(U251-OE Fluc)和靶向CD133的CAR T细胞(CD133-CAR T)的共培养体系中加入药物BAY60-6583和NECA，48小时后根据加入萤火虫荧光素酶底物后产生的生物发光信号计算得到的肿瘤细胞裂解率。
图5a至图5c为在表达CD19的肿瘤细胞Raji刺激靶向CD19的CAR T细胞(CD19-CART)条件下加入药物BAY60-6583和药物溶剂DMSO，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(GM-CSF(图5a)，IFN-γ(图5b)和TNF-α(图5c))的分泌量与加入DMSO的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。
图5d至图5f为在CD19阴性的肿瘤细胞k562刺激靶向CD19的CAR T细胞(CD19-CART)条件下加入药物BAY60-6583和药物溶剂DMSO，24小时后加入药物的上清中三种细胞因子(GM-CSF(图5d)，IFN-γ(图5e)和TNF-α(图5f))的分泌量与加入DMSO的上清中对应细胞因子分泌量(设为1.0)的比值。
图6为在快速扩增CD133-CAR T细胞时加入药物BAY60-6583。分别在不同天计数，分析不同条件下的细胞扩增倍数(图6a)。图6b-6g为扩增得到的CD133-CAR T细胞表型分析，其中图6b-6d为同型对照抗体染色结果，而图6e-6g为抗CD45RO和抗CD62L抗体的染色结果.
图7为在含有药物BAY60-6583条件下扩增得到的CD133-CAR T细胞的细胞裂解能力(图7a)和细胞因子分泌能力分析(图7b-d)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供制备CAR T细胞和靶细胞的详细方案:
1.将PBMC(ALLCELLS，PB005F)用T细胞培养基[含10％FBS(ThermoFisher,10091148)的RPMI 1640(ThermoFisher,11875093)培养基]稍加培养1至2个小时后用于电转。
将10μg AC133-CAR piggyBac transposon(或10μg CD19-CAR piggyBactransposon)和5μg Super piggyBac transposase与人T细胞核转染试剂盒(Lonza，VPA-1002)中的电转缓冲液混合，获得包含该2种质粒的大约110μl电转混合液；
质粒AC133-CAR piggyBac transposon和Super piggyBac transposase的制备方法参见文献Zhu,X.,et al.,Patient-derived glioblastoma stem cells are killed byCD133-specific CAR T cells but induce the T cell aging markerCD57.Oncotarget,2015.6(1):p.171-84。在质粒AC133-CAR piggyBac transposon的基础上，通过基因合成和常规分子克隆的方法，将AC133-CAR中的scFv序列替换为抗CD19的scFv序列，获得CD19-CAR piggyBac transposon质粒载体。具体地，抗CD19的scFv序列来自克隆FMC63，由苏州金唯智生物科技有限公司采用常规方法合成相应的DNA。进一步设计上游PCR引物5’-GCtctagaGCCACCATGCTGCTGCTGGTCACTTCTCTGCTGCTGTGCGAACTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATTCCCGACATCCAGATGACACAG-3’(SEQ ID NO:1)和下游引物5’-GAagatctTCCTCGGAAATCAGTTTCTGTTCTGAGGAGACGGTGACTGA-3’(SEQ ID NO:2)，包含限制性内切酶XbaI和BglII识别位点、部分载体序列和scFv序列，然后通过XbaI和BglII将scFv基因克隆至转座子载体中。本实施例中未注明具体条件的分子生物学实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。质粒AC133-CAR piggyBac transposon和CD19-CAR piggyBac transposon的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
2.参考人T细胞核转染试剂盒(Lonza，VPA-1002)的说明书，用所述电转混合液悬起1-2×107个PBMC细胞进行电转，电转结束后立刻将细胞转入预热的T细胞培养基；2个小时后再次更换一次培养基；
3.16-18小时后加入含100IU/ml的IL-2的T细胞培养基，用偶联有CD3/CD28抗体的磁珠(ThermoFisher SCIENTIFIC,11141D)刺激激活CD3阳性T细胞；
4.每2至3天更换新的含100IU/ml的IL-2的T细胞培养基，同时观察细胞扩增状况。根据其增殖状况决定其刺激时长，但刺激时间不超过一周；
5.分离去除磁珠后，加入1μg/ml嘌呤霉素继续培养5至7天。收取少量细胞用于检测，其余细胞可继续使用快速扩增法进一步大量扩增，得到靶向CD133的CAR T细胞(CD133-CAR T细胞)或靶向CD19的CAR-T细胞(CD19-CAR T)。
6.本发明以过表达CD133的人胶质瘤细胞系U251(U251CD133-OE)和CD19阳性的Raji作为靶细胞，U251CD133-OE的构建方法参考文献Prasad,S.,et al.,EffectiveEradication of Glioblastoma Stem Cells by Local Application of an AC133/CD133-Specific T-cell-Engaging Antibody and CD8 T Cells.Cancer Res,2015.75(11):p.2166-76。U251和Raji均购自中国科学院细胞库。进一步参考以上文献构建稳定表达荧光素酶的靶细胞(U251CD133-OE-luc)。
实施例2
本实施例表明作用在不同腺苷受体上的八种药物对于CD133-CAR T细胞分泌细胞因子的影响。
为了测定药物对于细胞因子分泌的影响，使用CD133过表达的脑胶质瘤细胞系U251(U251CD133-OE)(来自实施例1)作为靶细胞，靶向CD133的CAR-T细胞(CD133-CAR T)(来自实施例1)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例共培养在96孔板(Corning，3599)中，共200μl培养体积(T细胞培养基，见实施例1)，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，CAR-T细胞20000个/孔，同时在培养体系中分别加入作用在不同腺苷受体上的八种药物：A1受体激动剂N6-CPA(Sigma-Aldrich，C8031，药物浓度50mM，使用浓度1μM、5μM、10μM)，拮抗剂kw3902(TOCRIS，4167，药物浓度10mM，使用浓度1μM、5μM、10μM)；A2a受体激动剂CGS21680(abcam，ab120453，药物浓度10mM，使用浓度1μM、5μM、10μM)，拮抗剂SCH58261(abcam，ab120439，药物浓度10mM，使用浓度1μM、5μM、10μM)；A2b受体激动剂BAY60-6583(Cayman，17127，药物浓度20mM，使用浓度1μM、5μM、10μM)，拮抗剂PSB603(TOCRIS，3198，药物浓度10mM，使用浓度1μM、5μM、10μM)；A3受体激动剂IB-MECA(abcam，ab120438，药物浓度10mM，使用浓度1μM、5μM、10μM)，拮抗剂MRE3008F20(TOCRIS，4041，药物浓度50mM，使用浓度1μM、5μM、10μM))和药物溶剂DMSO(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。24小时后使用ALPHA-LISA试剂盒检测培养上清中IFN-γ和GM-CSF的分泌量，并计算药物处理时与DMSO处理时(设为1.0)细胞因子分泌量的比值。结果示于图1a和图1b。
如图1所示，在八种不同药物中腺苷A2b受体激动剂BAY60-6583能显著促进CD133-CAR T细胞分泌细胞因子，且该促进作用随着药物用量的增加而增强。
实施例3
本实施例表明A2b受体激动剂BAY60-6583对使用不同激活方式激活的CD133-CART细胞的细胞因子分泌都有影响。
除单独培养的CD133-CAR T细胞(来自实施例1)之外，还分别使用CD133过表达的脑胶质瘤细胞系U251(U251-OE)(来自实施例1)和包被了抗CD3/CD28的磁珠(ThermoFisherSCIENTIFIC,11141D)来刺激(刺激过程按照产品说明书进行，磁珠数量与细胞数量之比为3:1；U251-OE的数量为CD133-CAR T细胞的1/4)CD133-CAR T细胞(来自实施例1)。磁珠刺激在96孔板(Corning公司，3599)中进行，共200μl培养体积(T细胞培养基，见实施例1)，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中进行，CAR-T细胞200000个/孔，在以上三种培养体系中分别加入药物BAY60-6583(Cayman，17127，浓度20mM，药物使用浓度5μM、10μM)和药物溶剂DMSO(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。24小时后使用ALPHA-LISA试剂盒检测培养上清中GM-CSF，IFN-γ和TNF-α的分泌量，并计算药物处理时与DMSO处理时(设为1.0)细胞因子分泌量的比值。结果示于图2a至图2i。
如图2a至图2c所示，在CD133过表达的脑胶质瘤细胞系U251(U251-OE)的刺激下，A2b受体激动剂BAY60-6583能显著促进CD133-CAR T细胞分泌更多的GM-CSF，IFN-γ和TNF-α。
如图2d至图2f所示，在包被了抗CD3/CD28的磁珠的刺激下，A2b受体激动剂BAY60-6583能显著促进CD133-CAR T细胞分泌更多的GM-CSF，IFN-γ和TNF-α。同时也表明该药物作用于CD133-CAR T细胞上。
如图2g至图2i所示，在没有被刺激激活的情况下，A2b受体激动剂BAY60-6583对于CD133-CAR T细胞GM-CSF，IFN-γ和TNF-α的分泌没有明显作用，表明该药物不能直接激活CD133-CAR T细胞。
实施例4
本实施例表明A2b受体激动剂BAY60-6583对CD133-CAR T细胞的细胞裂解功能有促进作用。
为了测定CD133-CAR T细胞的细胞裂解功能，使用表达萤火虫荧光素酶的CD133过表达的脑胶质瘤细胞U251(U251CD133-OE-luc)(来自实施例1)作为靶细胞，靶向CD133的CAR-T细胞(CD133-CAR T)(来自实施例1)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例在白底96孔板(CORNING，3917)中共培养，共200μl培养体积(T细胞培养基，见实施例1)，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，CAR-T细胞20000个/孔，同时在培养体系中分别加入药物BAY60-6583(Cayman，17127，浓度20mM，药物使用1μM、5μM、10μM)和药物溶剂DMSO(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。48小时后去除全部培养上清，在加入150ug/ml的萤火虫荧光素酶底物(PerkinElmer，货号122799)后使用enspire酶标仪检测生物发光信号，在连续检测6-10分钟之后使用稳定下来信号值按照公式((单独肿瘤细胞信号值-共培养测得信号值)/单独肿瘤细胞信号值)计算出肿瘤细胞的裂解率，并计算药物处理时与DMSO处理时(设为1.0)肿瘤细胞裂解率的比值。结果示于图3。
如图3所示，腺苷A2b受体激动剂BAY60-6583能显著促进CD133-CAR T细胞的裂解肿瘤细胞的能力，且该促进作用随着药物用量的增加而增强。
实施例5
本实施例表明在腺苷类似物NECA模拟的高浓度腺苷带来的免疫抑制环境下，A2b受体激动剂BAY60-6583仍然能促进CD133-CAR T细胞的细胞裂解功能。
为了测定CD133-CAR T细胞的细胞裂解功能，使用表达萤火虫荧光素酶的CD133过表达的脑胶质瘤细胞U251(U251CD133-OE-luc)(来自实施例1)作为靶细胞，靶向CD133的CAR-T细胞(CD133-CAR T)(来自实施例1)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例在白底96孔板(CORNING，3917)中共培养，共200μl培养体积(T细胞培养基，见实施例1)，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，CAR-T细胞20000个/孔，先在培养体系中分别加入腺苷类似物NECA(abcam，ab120440，浓度50mM，药物使用浓度1μM)(模拟高浓度腺苷带来的免疫抑制环境)和药物溶剂DMSO(按照使用药物的最高浓度等体积加入)，在培养1小时后分别加入药物BAY60-6583(Cayman，17127，浓度20mM，药物使用1μM、5μM、10μM)和药物溶剂DMSO(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。48小时后去除全部培养上清，在加入150ug/ml的萤火虫荧光素酶底物后使用enspire酶标仪检测生物发光信号，在连续检测6-10分钟之后使用稳定下来信号值按照公式((单独肿瘤细胞信号值-共培养测得信号值)/单独肿瘤细胞信号值)计算出肿瘤细胞的裂解率，并计算药物处理时与DMSO处理时(设为1.0)肿瘤细胞裂解率的比值。结果示于图4a和图4b。
如图4a所示腺苷类似物NECA模拟的高浓度腺苷带来的免疫抑制环境会显著的抑制CD133-CAR T细胞裂解肿瘤细胞的能力。
如图4b所示腺苷A2b受体激动剂BAY60-6583在低浓度使用时能恢复由腺苷类似物NECA模拟的高浓度腺苷带来的免疫抑制环境造成的CD133-CAR T细胞的裂解能力下降，而随着使用浓度的增加，腺苷A2b受体激动剂BAY60-6583会显著提高CD133-CAR T细胞的裂解能力。
实施例6
本实施例表明A2b受体激动剂BAY60-6583对刺激活化的CD19-CAR T细胞的细胞因子分泌有促进作用。
为了测定药物对于细胞因子分泌的影响，分别使用CD19阳性的淋巴瘤细胞Raji(购自中国科学院细胞库)和CD19阴性的淋巴瘤细胞K562(购自中国科学院细胞库)作为靶细胞，靶向CD19的CAR-T细胞(CD19-CAR T)(来自实施例1)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例在96孔板(CORNING，3599)中共培养，共200μl培养体积(T细胞培养基，见实施例1)，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，CAR-T细胞20000个/孔，同时在培养体系中分别加入药物BAY60-6583(Cayman，17127，浓度20mM，药物使用1μM、5μM、10μM)和药物溶剂DMSO(按照使用药物的最高浓度等体积加入)。24小时后使用ALPHA-LISA试剂盒检测培养上清中GM-CSF，IFN-γ和TNF-α的分泌量，并计算药物处理时与DMSO处理时(设为1.0)细胞因子分泌量的比值。结果示于图5a至图5f。
如图5a至图5c所示，在CD19阳性的淋巴瘤细胞系Raji的刺激下，A2b受体激动剂BAY60-6583能显著促进CD19-CAR T细胞分泌更多的GM-CSF，IFN-γ和TNF-α。
如图5d至图5f所示，在CD19阴性的淋巴瘤细胞系K562的共培养过程中CD19-CAR T没有被刺激激活，A2b受体激动剂BAY60-6583对于CD19-CAR T细胞GM-CSF，IFN-γ和TNF-α的分泌没有促进作用，表明该药物不能作用于未激活的CD19-CAR T细胞
实施例7
本实施例表明在CD133-CAR T细胞的激活增殖过程中加入A2b受体激动剂BAY60-6583对于CD133-CAR T细胞的增殖和分化状态的影响。
CD133-CAR T细胞的刺激增殖过程(来自实施例1)中，按照1000000个细胞/组进行分组，放置在48孔板中(CORNING，3548)，每组1ml含300IU/ml IL-2和0.5μg/ml嘌呤霉素的培养体积(T细胞培养基，见实施例1)，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中进行扩增培养。在刺激当天分别加入药物BAY60-6583(Cayman，17127，浓度20mM，药物使用1μM、5μM)和药物溶剂DMSO(按照使用药物的最高浓度等体积加入)，每间隔2-3天更换新的含IL-2和嘌呤霉素以及对应药物的培养基(T细胞培养基，见实施例1)。在培养中的第六天(D6)和最后的第十天(D10)分别对不同处理条件下的细胞计数。结果示于图6a。并在第十天使用CD45RO(BDbiosciences，555493)和CD62L(BD biosciences，559772)的抗体及其对应的同型对照抗体(BD biosciences，555574和555751)对细胞进行染色，分析它们的分化情况。结果示于图6b至图6g。
如图6a所示，在CD133-CAR T细胞的激活增殖过程中加入A2b受体激动剂BAY60-6583对于CD133-CAR T细胞的增殖没有抑制作用。
如图6b至图6d所示，CD45RO和CD62L的同型对照抗体标记可以帮助区分四个细胞亚群：CD45RO-，CD62L+的记忆干细胞(T stem memory cells，Tscm)；CD45RO+，CD62L+的中央记忆细胞(central memory cells，Tcm)；CD45RO+，CD62L-的效应记忆细胞(effectmemory cells，Tem)；CD45RO-，CD62L-的效应细胞(effect cells，Te)。
如图6e至图6g所示，在含有A2b受体激动剂BAY60-6583条件下扩增得到的CD133-CAR T细胞中，分化程度较低的Tscm和Tcm比例更高。
实施例8
本实施例表明在CD133-CAR T细胞的激活增殖过程中加入A2b受体激动剂BAY60-6583对于CD133-CAR T细胞的功能的影响。
在含有A2b受体激动剂BAY60-6583的CD133-CAR T细胞的激活增殖(见实施例7)结束后，将细胞在不含IL-2和嘌呤霉素的培养基(T细胞培养基，见实施例1)中培养48h，48h后检测它们的功能：使用表达萤火虫荧光素酶的CD133过表达的脑胶质瘤细胞U251(U251CD133-OE-luc)(来自实施例1)作为靶细胞，不同条件下增殖得到的靶向CD133的CAR-T细胞(CD133-CAR T)(来自实施例7)作为效应细胞，按照效应细胞数与靶细胞之比等于4的比例共培养在96孔板(Corning，3599)中，共200μl培养体积(T细胞培养基，见实施例1)，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中进行，肿瘤细胞5000个/孔，CAR-T细胞20000个/孔。24小时后使用ALPHA-LISA试剂盒检测培养上清中IFN-γ，GM-CSF和TNF-α的分泌量，并计算药物处理时与DMSO处理时(设为1.0)细胞因子分泌量的比值。结果示于图7b至图7d。48小时后去除全部培养上清，在加入150ug/ml的萤火虫荧光素酶底物后使用enspire酶标仪检测生物发光信号，在连续检测6-10分钟之后使用稳定下来信号值按照公式((单独肿瘤细胞信号值-共培养测得信号值)/单独肿瘤细胞信号值)计算出肿瘤细胞的裂解率，并计算药物处理时与DMSO处理时(设为1.0)肿瘤细胞裂解率的比值。结果示于图7a。
如图7a所示，在含有A2b受体激动剂BAY60-6583条件下扩增得到的CD133-CAR T细胞的细胞裂解功能较弱，这与细胞拥有较低的分化程度相匹配。
如图7b至图7d所示，在含有A2b受体激动剂BAY60-6583条件下扩增得到的CD133-CAR T细胞IFN-γ，GM-CSF和TNF-α的分泌量较少，这与细胞拥有较低的分化程度相匹配。
以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQ ID NO:1:引物
GCTCTAGAGCCACCATGCTGCTGCTGGTCACTTCTCTGCTGCTGTGCGAACTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATTCCCGACATCCAGATGACACAG
SEQ ID NO:2:引物
GAAGATCTTCCTCGGAAATCAGTTTCTGTTCTGAGGAGACGGTGACTGA
SEQ ID NO:3:AC133-CAR piggyBac transposon
ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCCTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACgGCCAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACTCTAGAGCCACCATGCTGCTGCTGGTCACTTCTCTGCTGCTGTGCGAACTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATTCCCCAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTCAGACCCGGCGCATCAGTGAAACTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACTTTCTCCGACTTTGAGATGCACTGGGTCAAGCAGACCCCAGTGCATGGCCTGGAATGGATCGGGGACATTGATCCCGGCACTGGGGACACCGCCTATAACCTGAAGTTCAAAGGCAAGGCTACCCTGACCACAGATAAGAGCTCCTCTACAGCCTACATGGAGCTGAGGTCTCTGACTAGTGAAGATTCAGCAGTCTACTATTGCACACTGGGGGCCTTCGTGTACTGGGGACAGGGCACACTGGTCACCGTGAGCGCCGCTAAAACTACCCCCAAGCTGGAGGAAGGAGAGTTCAGCGAAGCAAGAGTGGACGTGGTCGTGACCCAGACACCCCTGTCTCTGCCTGTCAGTTTTGGCGATCAGGTGAGCATCTCCTGTAGGAGTTCACAGTCACTGGCCAACAGCTACGGGAATACATATCTGTCTTGGTACCTGCACAAGCCAGGACAGAGTCCCCAGCTGCTGATCTATGGGATTTCCAATCGCTTCTCTGGAGTGCCTGACCGATTTTCTGGGAGTGGATCAGGCACCGATTTCACACTGAAAATCAGCACCATTAAGCCCGAGGACCTGGGCATGTACTATTGTCTGCAGGGGACCCATCAGCCTTACACTTTTGGCGGGGGAACCAAACTGGAGATCAAGCGAGCAGACGCAGCGGCCGCAGGCAGCGAACAGAAACTGATTTCCGAGGAAGATCTGTTCGTCCCCGTGTTCCTGCCTGCCAAGCCAACAACTACCCCTGCTCCACGACCACCTACTCCAGCACCTACCATCGCAAGTCAGCCCCTGTCACTGCGACCTGAGGCTTGCCGGCCAGCAGCTGGAGGAGCAGTGCACACCCGAGGCCTGGACTTCGCATGCGATATCTACATTTGGGCACCACTGGCTGGAACCTGTGGGGTCCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTATTGTAACCACAGAAATAGGAGCAAACGCTCCCGACTGCTGCATTCCGACTACATGAACATGACACCTCGGAGACCAGGCCCCACTAGAAAGCATTACCAGCCATATGCCCCACCCAGGGATTTCGCAGCCTATCGGAGCCGGTTCAGCGTCGTGAAAAGGGGGCGCAAGAAACTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCTTTTATGCGCCCAGTGCAGACAACTCAGGAGGAAGACGGATGCTCTTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAATATGACGTGCTGGATAAGCGACGAGGACGGGACCCCGAAATGGGAGGAAAACCCAGAAGGAAGAACCCTCAGGAGGGGCTGTATAATGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCTGAGGCATACAGCGAAATTGGAATGAAAGGAGAGCGCCGACGGGGGAAGGGACACGATGGGCTGTACCAGGGACTGTCAACCGCCACTAAAGATACCTACGACGCACTGCACATGCAGGCTCTGCCCCCAAGAGAATTCGAAGGATCCGCGGCCGCTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTTCCGGGATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAATCTAGGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCGTTAACTAAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGAATTGACTCAAATGATGTCAATTAGTCTATCAGAAGCTCATCTGGTCTCCCTTCCGGGGGACAAGACATCCCTGTTTAATATTTAAACAGCAGTGTTCCCAAACTGGGTTCTTATATCCCTTGCTCTGGTCAACCAGGTTGCAGGGTTTCCTGTCCTCACAGGAACGAAGTCCCTAAAGAAACAGTGGCAGCCAGGTTTAGCCCCGGAATTGACTGGATTCCTTTTTTAGGGCCCATTGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAA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SEQ ID NO:4:CD19-CAR piggyBac transposon
ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCCTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACGGCCAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACTCTAGAGCCACCATGCTGCTGCTGGTCACTTCTCTGCTGCTGTGCGAACTGCCCCACCCCGCCTTTCTGCTGATTCCCGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAACAGAAACTGATTTCCGAGGAAGATCTGTTCGTCCCCGTGTTCCTGCCTGCCAAGCCAACAACTACCCCTGCTCCACGACCACCTACTCCAGCACCTACCATCGCAAGTCAGCCCCTGTCACTGCGACCTGAGGCTTGCCGGCCAGCAGCTGGAGGAGCAGTGCACACCCGAGGCCTGGACTTCGCATGCGATATCTACATTTGGGCACCACTGGCTGGAACCTGTGGGGTCCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTATTGTAACCACAGAAATAGGAGCAAACGCTCCCGACTGCTGCATTCCGACTACATGAACATGACACCTCGGAGACCAGGCCCCACTAGAAAGCATTACCAGCCATATGCCCCACCCAGGGATTTCGCAGCCTATCGGAGCCGGTTCAGCGTCGTGAAAAGGGGGCGCAAGAAACTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCTTTTATGCGCCCAGTGCAGACAACTCAGGAGGAAGACGGATGCTCTTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGAGGCTGCGAGCTGAGAGTGAAGTTCAGCCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAATATGACGTGCTGGATAAGCGACGAGGACGGGACCCCGAAATGGGAGGAAAACCCAGAAGGAAGAACCCTCAGGAGGGGCTGTATAATGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCTGAGGCATACAGCGAAATTGGAATGAAAGGAGAGCGCCGACGGGGGAAGGGACACGATGGGCTGTACCAGGGACTGTCAACCGCCACTAAAGATACCTACGACGCACTGCACATGCAGGCTCTGCCCCCAAGAGAATTCGAAGGATCCGCGGCCGCTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTTCCGGGATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGAATCTAGGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCGTTAACTAAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGAATTGACTCAAATGATGTCAATTAGTCTATCAGAAGCTCATCTGGTCTCCCTTCCGGGGGACAAGACATCCCTGTTTAATATTTAAACAGCAGTGTTCCCAAACTGGGTTCTTATATCCCTTGCTCTGGTCAACCAGGTTGCAGGGTTTCCTGTCCTCACAGGAACGAAGTCCCTAAAGAAACAGTGGCAGCCAGGTTTAGCCCCGGAATTGACTGGATTCCTTTTTTAGGGCCCATTGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGGGCTTTGGGGGGGGGCTGTCCCTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGTGTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATACCCCGTGAGTTACCCGGCGGGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT
SEQUENCE LISTING
<110> 上海科技大学
<120> 一种增强免疫效应细胞功能的方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<400> 2
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<211> 7857
<212> DNA
<213> 人工序列
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actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 720
cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780
gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840
ctcgacacgc tgcagaacac gcagctagat taaccctaga aagataatca tattgtgacg 900
tacgttaaag ataatcatgt gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960
gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020
ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaac aaaaactcaa 1080
aatttcttct ataaagtaac aaaactttta tgagggacag ccccccccca aagcccccag 1140
ggatgtaatt acgtccctcc cccgctaggg ggcagcagcg agccgcccgg ggctccgctc 1200
cggtccggcg ctccccccgc atccccgagc cggcagcgtg cggggacagc ccgggcacgg 1260
ggaaggtggc acgggatcgc tttcctctga acgcttctcg ctgctctttg agcctgcaga 1320
cacctggggg gatacgggga aaaggcctcc acggccaagg atctgcgatc gctccggtgc 1380
ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg 1440
caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta 1500
ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt 1560
gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg 1620
catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg 1680
cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt 1740
aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800
ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc 1860
tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct actctagagc caccatgctg 1920
ctgctggtca cttctctgct gctgtgcgaa ctgccccacc ccgcctttct gctgattccc 1980
caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtcagac ccggcgcatc agtgaaactg 2040
agctgcaagg cttccggcta tactttctcc gactttgaga tgcactgggt caagcagacc 2100
ccagtgcatg gcctggaatg gatcggggac attgatcccg gcactgggga caccgcctat 2160
aacctgaagt tcaaaggcaa ggctaccctg accacagata agagctcctc tacagcctac 2220
atggagctga ggtctctgac tagtgaagat tcagcagtct actattgcac actgggggcc 2280
ttcgtgtact ggggacaggg cacactggtc accgtgagcg ccgctaaaac tacccccaag 2340
ctggaggaag gagagttcag cgaagcaaga gtggacgtgg tcgtgaccca gacacccctg 2400
tctctgcctg tcagttttgg cgatcaggtg agcatctcct gtaggagttc acagtcactg 2460
gccaacagct acgggaatac atatctgtct tggtacctgc acaagccagg acagagtccc 2520
cagctgctga tctatgggat ttccaatcgc ttctctggag tgcctgaccg attttctggg 2580
agtggatcag gcaccgattt cacactgaaa atcagcacca ttaagcccga ggacctgggc 2640
atgtactatt gtctgcaggg gacccatcag ccttacactt ttggcggggg aaccaaactg 2700
gagatcaagc gagcagacgc agcggccgca ggcagcgaac agaaactgat ttccgaggaa 2760
gatctgttcg tccccgtgtt cctgcctgcc aagccaacaa ctacccctgc tccacgacca 2820
cctactccag cacctaccat cgcaagtcag cccctgtcac tgcgacctga ggcttgccgg 2880
ccagcagctg gaggagcagt gcacacccga ggcctggact tcgcatgcga tatctacatt 2940
tgggcaccac tggctggaac ctgtggggtc ctgctgctga gcctggtcat caccctgtat 3000
tgtaaccaca gaaataggag caaacgctcc cgactgctgc attccgacta catgaacatg 3060
acacctcgga gaccaggccc cactagaaag cattaccagc catatgcccc acccagggat 3120
ttcgcagcct atcggagccg gttcagcgtc gtgaaaaggg ggcgcaagaa actgctgtac 3180
atcttcaagc agccttttat gcgcccagtg cagacaactc aggaggaaga cggatgctct 3240
tgtcggttcc cagaggagga ggaaggaggc tgcgagctga gagtgaagtt cagccggagc 3300
gccgatgcac cagcatatca gcagggacag aatcagctgt acaacgagct gaatctgggc 3360
aggcgcgagg aatatgacgt gctggataag cgacgaggac gggaccccga aatgggagga 3420
aaacccagaa ggaagaaccc tcaggagggg ctgtataatg aactgcagaa agacaagatg 3480
gctgaggcat acagcgaaat tggaatgaaa ggagagcgcc gacgggggaa gggacacgat 3540
gggctgtacc agggactgtc aaccgccact aaagatacct acgacgcact gcacatgcag 3600
gctctgcccc caagagaatt cgaaggatcc gcggccgctg agggcagagg aagtcttcta 3660
acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc ccttccggga tgaccgagta caagcccacg 3720
gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc 3780
gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc 3840
gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg 3900
gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg 3960
ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa 4020
cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc 4080
gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga 4140
gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac 4200
ctccccttct acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga 4260
ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgaa tctaggtcga caatcaacct 4320
ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg 4380
ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcgt taactaaact tgtttattgc 4440
agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 4500
ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggaa 4560
ttgactcaaa tgatgtcaat tagtctatca gaagctcatc tggtctccct tccgggggac 4620
aagacatccc tgtttaatat ttaaacagca gtgttcccaa actgggttct tatatccctt 4680
gctctggtca accaggttgc agggtttcct gtcctcacag gaacgaagtc cctaaagaaa 4740
cagtggcagc caggtttagc cccggaattg actggattcc ttttttaggg cccattggta 4800
tggctttttc cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc 4860
agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc 4920
tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc 4980
ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct gggggctttg ggggggggct gtccctgata 5040
tctataacaa gaaaatatat atataataag ttatcacgta agtagaacat gaaataacaa 5100
tataattatc gtatgagtta aatcttaaaa gtcacgtaaa agataatcat gcgtcatttt 5160
gactcacgcg gtcgttatag ttcaaaatca gtgacactta ccgcattgac aagcacgcct 5220
cacgggagct ccaagcggcg actgagatgt cctaaatgca cagcgacgga ttcgcgctat 5280
ttagaaagag agagcaatat ttcaagaatg catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc 5340
tagggttaat ctagctgcat caggatcata tcgtcgggtc ttttttccgg ctcagtcatc 5400
gcccaagctg gcgctatctg ggcatcgggg aggaagaagc ccgtgccttt tcccgcgagg 5460
ttgaagcggc atggaaagag tttgccgagg atgactgctg ctgcattgac gttgagcgaa 5520
aacgcacgtt taccatgatg attcgggaag gtgtggccat gcacgccttt aacggtgaac 5580
tgttcgttca ggccacctgg gataccagtt cgtcgcggct tttccggaca cagttccgga 5640
tggtcagccc gaagcgcatc agcaacccga acaataccgg cgacagccgg aactgccgtg 5700
ccggtgtgca gattaatgac agcggtgcgg cgctgggata ttacgtcagc gaggacgggt 5760
atcctggctg gatgccgcag aaatggacat ggataccccg tgagttaccc ggcgggcgcg 5820
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 5880
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 5940
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 6000
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 6060
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 6120
tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 6180
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 6240
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 6300
aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 6360
tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 6420
ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 6480
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 6540
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 6600
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 6660
ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 6720
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 6780
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 6840
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 6900
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 6960
aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 7020
acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 7080
gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 7140
cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 7200
cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 7260
tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 7320
cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 7380
gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 7440
cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 7500
ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 7560
gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 7620
taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 7680
gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 7740
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 7800
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcat 7857
<210> 4
<211> 7827
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 720
cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780
gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840
ctcgacacgc tgcagaacac gcagctagat taaccctaga aagataatca tattgtgacg 900
tacgttaaag ataatcatgt gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960
gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020
ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaac aaaaactcaa 1080
aatttcttct ataaagtaac aaaactttta tgagggacag ccccccccca aagcccccag 1140
ggatgtaatt acgtccctcc cccgctaggg ggcagcagcg agccgcccgg ggctccgctc 1200
cggtccggcg ctccccccgc atccccgagc cggcagcgtg cggggacagc ccgggcacgg 1260
ggaaggtggc acgggatcgc tttcctctga acgcttctcg ctgctctttg agcctgcaga 1320
cacctggggg gatacgggga aaaggcctcc acggccaagg atctgcgatc gctccggtgc 1380
ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg 1440
caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta 1500
ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt 1560
gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg 1620
catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg 1680
cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt 1740
aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800
ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc 1860
tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct actctagagc caccatgctg 1920
ctgctggtca cttctctgct gctgtgcgaa ctgccccacc ccgcctttct gctgattccc 1980
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 2040
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 2100
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 2160
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 2220
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 2280
gggaccaagc tggagatcac aggtggcggt ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc 2340
ggatctgagg tgaaactgca ggagtcagga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg 2400
tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc 2460
cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac 2520
tataattcag ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt 2580
ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat 2640
tattactacg gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc 2700
tcctcagaac agaaactgat ttccgaggaa gatctgttcg tccccgtgtt cctgcctgcc 2760
aagccaacaa ctacccctgc tccacgacca cctactccag cacctaccat cgcaagtcag 2820
cccctgtcac tgcgacctga ggcttgccgg ccagcagctg gaggagcagt gcacacccga 2880
ggcctggact tcgcatgcga tatctacatt tgggcaccac tggctggaac ctgtggggtc 2940
ctgctgctga gcctggtcat caccctgtat tgtaaccaca gaaataggag caaacgctcc 3000
cgactgctgc attccgacta catgaacatg acacctcgga gaccaggccc cactagaaag 3060
cattaccagc catatgcccc acccagggat ttcgcagcct atcggagccg gttcagcgtc 3120
gtgaaaaggg ggcgcaagaa actgctgtac atcttcaagc agccttttat gcgcccagtg 3180
cagacaactc aggaggaaga cggatgctct tgtcggttcc cagaggagga ggaaggaggc 3240
tgcgagctga gagtgaagtt cagccggagc gccgatgcac cagcatatca gcagggacag 3300
aatcagctgt acaacgagct gaatctgggc aggcgcgagg aatatgacgt gctggataag 3360
cgacgaggac gggaccccga aatgggagga aaacccagaa ggaagaaccc tcaggagggg 3420
ctgtataatg aactgcagaa agacaagatg gctgaggcat acagcgaaat tggaatgaaa 3480
ggagagcgcc gacgggggaa gggacacgat gggctgtacc agggactgtc aaccgccact 3540
aaagatacct acgacgcact gcacatgcag gctctgcccc caagagaatt cgaaggatcc 3600
gcggccgctg agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 3660
ccttccggga tgaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc 3720
agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc 3780
gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc 3840
gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc 3900
acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag 3960
ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg 4020
cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag 4080
ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc 4140
gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct cggcttcacc 4200
gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc 4260
ggtgcctgaa tctaggtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact 4320
ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg 4380
tatcatgcgt taactaaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 4440
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 4500
actcatcaat gtatcttatc atgtctggaa ttgactcaaa tgatgtcaat tagtctatca 4560
gaagctcatc tggtctccct tccgggggac aagacatccc tgtttaatat ttaaacagca 4620
gtgttcccaa actgggttct tatatccctt gctctggtca accaggttgc agggtttcct 4680
gtcctcacag gaacgaagtc cctaaagaaa cagtggcagc caggtttagc cccggaattg 4740
actggattcc ttttttaggg cccattggta tggctttttc cccgtatccc cccaggtgtc 4800
tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc 4860
gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga 4920
gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct 4980
gggggctttg ggggggggct gtccctgata tctataacaa gaaaatatat atataataag 5040
ttatcacgta agtagaacat gaaataacaa tataattatc gtatgagtta aatcttaaaa 5100
gtcacgtaaa agataatcat gcgtcatttt gactcacgcg gtcgttatag ttcaaaatca 5160
gtgacactta ccgcattgac aagcacgcct cacgggagct ccaagcggcg actgagatgt 5220
cctaaatgca cagcgacgga ttcgcgctat ttagaaagag agagcaatat ttcaagaatg 5280
catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc tagggttaat ctagctgcat caggatcata 5340
tcgtcgggtc ttttttccgg ctcagtcatc gcccaagctg gcgctatctg ggcatcgggg 5400
aggaagaagc ccgtgccttt tcccgcgagg ttgaagcggc atggaaagag tttgccgagg 5460
atgactgctg ctgcattgac gttgagcgaa aacgcacgtt taccatgatg attcgggaag 5520
gtgtggccat gcacgccttt aacggtgaac tgttcgttca ggccacctgg gataccagtt 5580
cgtcgcggct tttccggaca cagttccgga tggtcagccc gaagcgcatc agcaacccga 5640
acaataccgg cgacagccgg aactgccgtg ccggtgtgca gattaatgac agcggtgcgg 5700
cgctgggata ttacgtcagc gaggacgggt atcctggctg gatgccgcag aaatggacat 5760
ggataccccg tgagttaccc ggcgggcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 5820
tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 5880
taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 5940
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 6000
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 6060
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 6120
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 6180
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 6240
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 6300
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 6360
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 6420
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 6480
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 6540
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 6600
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 6660
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 6720
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 6780
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 6840
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 6900
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 6960
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 7020
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 7080
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 7140
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 7200
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 7260
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 7320
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 7380
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 7440
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 7500
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 7560
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 7620
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 7680
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 7740
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 7800
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcat 7827
Claims (8)
1.一种非诊断和治疗目的的增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，包括通过免疫调节因子增强免疫效应细胞功能，所述的免疫调节因子包括：BAY60-6583或其盐形式，所述的免疫效应细胞为被激活的免疫效应细胞，所述的增强免疫效应细胞功能包括：分泌细胞因子增多、使免疫效应细胞的细胞杀死能力增强、以及使免疫效应细胞的细胞扩增倍数增加中的至少一种。
2.如权利要求1所述的增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，所述的BAY 60-6583通过与免疫效应细胞在体外接触来增强免疫效应细胞功能。
3.如权利要求1所述的增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，所述的BAY 60-6583在培养免疫效应细胞时加入或在免疫效应细胞结合靶细胞时加入。
4.如权利要求1所述的增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，所述的免疫效应细胞包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
5.如权利要求1所述的增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，所述的免疫效应细胞表达嵌合抗原受体分子。
6.如权利要求5所述的增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。
7.如权利要求6所述的增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，所述的胞外抗原结合区是特异性结合肿瘤抗原的抗体。
8.如权利要求7所述的增强免疫效应细胞功能的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原包括：CD133、CD19和HER2中的至少一种。
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