KR20190058509A - 융합 단백질을 이용하는 t-세포 수용체 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

융합 단백질을 이용하는 t-세포 수용체 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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로버트 호프마이스터
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Abstract

T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP), 하나 이상의 TFP를 발현하도록 조작된 T-세포 및 암을 포함하는 질환의 치료를 위한 이의 사용 방법이 본 명세서에서 제공된다.

Description

융합 단백질을 이용하는 T-세포 수용체 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법
상호-참조
본 출원은 미국 가출원 제62/405,551호(출원일: 2016년 10월 7일) 및 미국 가출원 제62/510,108호(출원일: 2017년 5월 23일)의 유익을 주장하며, 이들 기초출원의 각각은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입된다.
말기 고형 종양을 가진 대부분의 환자는 표준 요법으로 치유될 수 없다. 게다가, 전통적 치료 선택은 종종 심각한 부작용을 갖는다. 집합적으로 암 면역요법으로 불리는 접근법인, 암성 세포 거부를 위한 환자의 면역 시스템에 관여하기 위한 수많은 시도가 있어 왔다. 그러나, 몇 가지 장애물은 임상 유효성을 달성하기 오히려 어렵게 만든다. 수백의 소위 종양 항원이 확인되었어도, 이들은 그 자체로부터 종종 유래되고 따라서 건강한 조직에 대해 암 면역요법을 유도할 수 있거나, 또는 저조하게 면역원성이다. 더욱이, 암세포는 암 면역요법에 의한 면역 공격의 개시 및 전파에 대해 적대적이거나 그들 자체를 보이지 않게 하는 다수의 기전을 이용한다.
암세포에서 적합한 세포-표면 분자에 유전자 조작된 T-세포의 재유도에 의존하는, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR) 변형된 자가 T-세포 요법을 이용한 최근 개발은 B 세포 악성종양을 치료하기 위한 면역 시스템의 활용에서 유망한 결과를 보여준다(예컨대, 문헌[Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)] 참조). (CTL019로 불리는) CD-19-특이적 CAR T-세포를 이용한 임상 결과는 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓고 있는 환자에서뿐만 아니라 소아기 급성 림프아구성 백혈병(ALL)에서 완전한 차도를 나타내었다(예컨대, 문헌[Kalos et al., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)] 참조). 대안적인 접근법은 자가 T-세포를 유전자 조작하기 위하여 종양-관련된 펩타이드 항원으로 선택된 T-세포 수용체(T-cell receptor: TCR) 알파쇄 및 베타쇄의 이용이다. 이들 TCR쇄는 완전한 TCR 복합체를 형성할 것이고 제2 한정된 특이성을 위하여 TCR을 가진 T-세포를 제공할 것이다. 고무적인 결과는 활액 암종을 가진 환자에서 조작된 자가 T-세포 발현 NY-ESO-1-특이적 TCR 알파 및 베타쇄로 수득되었다.
시험관내/생체외에서 각각의 표적 세포를 인식하고 파괴하기 위해 CAR 및 제2 TCR을 발현하는 유전자 변형 T-세포에 대한 능력 이외에, 조작된 T-세포를 이용한 성공적인 환자 요법은 강한 활성화, 확장, 경시적으로 지속성을 가능하게 하기 위해, 그리고 재발 질환의 경우에, '기억' 반응을 가능하게 하기 위해 T-세포를 필요로 한다. CAR T-세포의 높은 및 감당할 수 있는 임상 효능은 BCMA- 및 CD-19 양성 B 세포 악성종양 및 HLA-A2를 발현하는 NY-ESO-1-펩타이드 발현 활액 육종 환자로 현재 제한된다. 다양한 인간 악성종양에 대해 더욱 광범위하게 작용하기 위해 유전자 조작된 T-세포를 개선하는 것이 명백하게 필요하다. CD3 엡실론, CD3 감마 및 CD3 델타를 포함하는, TCR 서브유닛, 및 존재하는 접근법의 제한을 극복하기 위한 잠재력을 갖는 세포 표면 항원에 특이적인 결합 도메인을 가진 TCR 알파 및 TCR 베타쇄의 신규한 융합 단백질이 본 명세서에서 기재된다. CAR보다 더욱 효율적으로 표적 세포를 사멸하지만, 전-염증성 사이토카인의 비교할 만한 그리고 더 낮은 수준을 방출하는 신규한 융합 단백질이 본 명세서에서 기재된다. 이들 융합 단백질 및 그들의 이용 방법은 이들 사이토카인의 상승된 수준이 입양 CAR-T 요법에 대하여 용량-제한 독성과 연관되어 왔기 때문에 CAR에 비해서 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)에 대하여 이점을 나타낸다.
T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP), 하나 이상의 TFP를 발현하기 위해 조작된 T-세포, 및 질환의 치료를 위한 이의 이용 방법이 본 명세서에서 제공된다.
일 양상에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인(anti-mesothelin binding domain)을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인 및 TCR 서브유닛을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 암호화하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본 명세서에서 제공된다.
일 양상에 있어서, TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및 CD3 엡실론의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 암호화하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본 명세서에서 제공되되, 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입된다.
일 양상에 있어서, TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및 CD3 감마의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 암호화하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본 명세서에서 제공되되, 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입된다.
일 양상에 있어서, TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 암호화하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본 명세서에서 제공되되, 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입된다.
일 양상에 있어서, TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및 TCR 알파의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 암호화하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본 명세서에서 제공되되, 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입된다.
일 양상에 있어서, TCR 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및 TCR 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는 TCR 서브유닛; 및 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 암호화하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본 명세서에서 제공되되, 여기서 TCR 서브유닛 및 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입된다.
일 양상에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인 및 TCR 서브유닛을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 암호화하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본 명세서에서 제공된다.
몇몇 경우에 있어서, TCR 서브유닛과 항체 도메인은 작동 가능하게 연결된다. 몇몇 경우에 있어서, TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입된다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 항원 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인에 연결된다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, TCR 서브유닛은 TCR 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, TCR 서브유닛은 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, TCR 서브유닛은 (i) TCR 세포외 도메인, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하고, 여기서 (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 두 가지는 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된다. 몇몇 경우에 있어서, TCR 서브유닛은 CD3 엡실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖는 아미노산 서열로부터 선택된 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, TCR 서브유닛은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인, 또는 이에 대한 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열로부터 선택된 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 항체 단편을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 scFv 또는 VH 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 핵산 분자는, (i) 각각 본 명세서에 제공된 항-메소텔린 경쇄 결합 도메인의 경쇄(LC) CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3과 70 내지 100% 서열 동일성을 갖는 항-메소텔린 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄(LC) CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3, 및/또는 (ii) 각각 본 명세서에 제공된 항-메소텔린 중쇄 결합 도메인의 중쇄(HC) CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3과 70 내지 100% 서열 동일성을 갖는 항-메소텔린 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄(HC) CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 암호화한다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 핵산 분자는 경쇄 가변 영역을 암호화하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 본 명세서에 제공된 경쇄 가변 영역의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본 명세서에 제공된 경쇄 가변 영역의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 핵산 분자는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역은 본 명세서에 제공된 중쇄 가변 영역의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본 명세서에 제공된 중쇄 가변 영역의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, TFP는 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편, 및 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 TCR 서브유닛의 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 TFP는 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편, 및 적어도 하나 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 TFP는 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, TCR 제타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, CD45, CD2, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이의 기능성 단편, 및 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 핵산 분자는 추가로 공자극 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 공자극 도메인은 DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137), 및 이에 대한 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이들의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 얻어진 기능성 신호전달 도메인이다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 핵산 분자는 추가로 리더 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 핵산 분자는 mRNA이다.
몇몇 경우에 있어서, TFP는 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, TCR 제타쇄, Fc 엡실론 수용체 1쇄, Fc 엡실론 수용체 2쇄, Fc 감마 수용체 1쇄, Fc 감마 수용체 2a쇄, Fc 감마 수용체 2b1쇄, Fc 감마 수용체 2b2쇄, Fc 감마 수용체 3a쇄, Fc 감마 수용체 3b쇄, Fc 베타 수용체 1쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이의 기능성 단편, 및 이에 대한 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 면역수용체 티로신-기반된 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) 또는 이의 일부를 포함하는 TCR 서브유닛의 ITAM를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, ITAM은 CD3 감마, CD3 델타 또는 CD3 엡실론의 ITAM을 대체한다. 몇몇 경우에 있어서, ITAM은 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그리고 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 ITAM을 대체한다.
몇몇 경우에 있어서, 핵산은 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 뉴클레오타이드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-다이메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-다이메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-다이메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩타이드 핵산(PNA), 1',5'-안하이드로헥시톨 핵산(HNA), 몰폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드, 티올포스포네이트 뉴클레오타이드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에서 제공된 핵산 분자에 의해 암호화된 단리된 폴리펩타이드 분자가 본 명세서에서 제공된다.
일 양상에 있어서, 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 단리된 TFP 분자가 본 명세서에서 제공된다.
일 양상에 있어서, 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단리된 TFP 분자가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 핵산에 의해 암호화된 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인, 또는 항-메소텔린 결합 도메인을 포함하는 항체, 또는 핵산에 의해 암호화된 항-메소텔린 결합 도메인을 발현하는 세포를 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 최대 약 200nM, 100nM, 75nM, a 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM 또는 0.01nM; 및/또는 적어도 약 100nM, 75nM, a 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM 또는 0.01nM; 및 또는 약 200nM, 100nM, 75nM, 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM 또는 0.01nM의 친화도값을 갖는다.
일 양상에 있어서, 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단리된 TFP 분자가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체에 기능적으로 통합될 수 있다.
몇몇 경우에 있어서, 단리된 TFP 분자는 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 scFv, VH 도메인 또는 카멜리드 VHH 도메인이다. 몇몇 경우에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 제공된 중쇄의 아미노산 서열과 95 내지 100% 동일성을 가진 중쇄, 이의 기능성 단편, 또는 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 제공된 중쇄의 아미노산 서열과 95 내지 100% 동일성을 가진 경쇄, 이의 기능성 단편, 또는 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 TFP 분자는 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편, 및 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 TCR 세포외 도메인을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인에 연결된다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 4이다.
몇몇 경우에 있어서, 단리된 TFP 분자는 공자극 도메인을 암호화하는 서열을 더 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 TFP 분자는 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 서열을 더 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 단리된 TFP 분자는 리더 서열을 더 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에서 제공된 TFP를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 본 명세서에서 제공된다. 몇몇 경우에 있어서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스성(Rous sarcoma viral: RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 경우에 있어서, 벡터는 개똥벌레를 더 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 벡터는 시험관내 전사된 벡터이다. 몇몇 경우에 있어서, 벡터에서 핵산 서열은 폴리(A) 꼬리를 더 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 벡터에서 핵산 서열은 3'UTR을 더 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에서 제공된 벡터를 포함하는 세포가 본 명세서에서 제공된다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 인간 T-세포이다. 몇몇 경우에 있어서, T-세포는 CD8+ 또는 CD4+ T-세포이다. 몇몇 경우에 있어서, T 세포는 감마 델타 T-세포이다. 몇몇 경우에 있어서, T 세포는 NK-T 세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 세포내 신호전달 도메인으로부터 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩타이드와 연관된, 저해 분자의 적어도 일부분을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함하는 저해 분자를 암호화하는 핵산을 더 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 저해 분자는 PD1의 적어도 일부분을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다.
일 양상에 있어서, TFP 분자가 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는, 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
일 양상에 있어서, 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및 적어도 하나의 내인성 TCR 복합체를 포함하는 단백질 복합체가 본 명세서에서 제공된다.
몇몇 경우에 있어서, TCR은 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인에 연결된다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 4이다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에서 제공된 단백질 복합체당 적어도 2개의 상이한 TFP 단백질을 포함하는 인간 CD 8+ 또는 CD4+ T-세포가 본 명세서에서 제공된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에서 제공된 벡터로 T-세포를 형질도입하는(transducing) 단계를 포함하는 세포의 제조 방법이 본 명세서에서 제공된다.
일 양상에 있어서, RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에서 제공되되, 해당 방법은 세포에 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 RNA는 본 명세서에서 제공된 TFP 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다.
일 양상에 있어서, 포유동물에 항-종양 면역력을 제공하는 방법이 본 명세서에서 제공되되, 해당 방법은 포유동물에게 본 명세서에서 제공된 TFP 분자를 발현하거나 또는 본 명세서에서 제공된 폴리펩타이드 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
몇몇 경우에 있어서, 세포는 자가 T-세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 세포는 동종이계 T-세포이다. 몇몇 경우에 있어서, 포유동물은 인간이다.
일 양상에 있어서, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지니는 포유동물을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공되되, 해당 방법은 포유동물에 본 명세서에서 제공된 TFP 분자, 본 명세서에서 제공된 세포, 또는 본 명세서에서 제공된 폴리펩타이드 분자의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 메소텔린 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 암, 악성종양, 및 메소텔린의 발현과 연관된 비-암 관련된 징후로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 경우에 있어서, 질환은 중피종, 신장 세포 암종, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 방광암, 요관암, 신장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 흉선 암종, 단관암종 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다.
몇몇 경우에 있어서, 질환은 암이다. 몇몇 경우에, 질환은 중피종, 유두상 장액성 난소 선암종, 투명 세포 난소 암종, 혼합 뮐러 난소 암종, 자궁내막양 점액성 난소 암종, 악성 늑막 질환, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁 장액성 암종, 폐 선암종, 간외 담관 암종, 위 선암종, 식도 선암종, 결장직장 선암종, 유방 선암종, 메소텔린 발현과 연관된 질환, 메소텔린 발현과 연관된 질환, 비-점액성 난소 암종, 침윤성 유관 선암종, 폐 선암종, 위/식도 선암종, 결장직장 선암종, 백혈병, 소아 급성 골수성 백혈병, 침윤성 췌관내 유도상 점액성 신생물(IPMN), 자궁내막 선암종, 위/식도 선암종, 폐 선암종, 유방 선암종, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 제제와 조합으로 투여된다. 몇몇 경우에 있어서, 항-메소텔린 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유동물에 비해서 더 적은 사이토카인이 포유동물에서 방출된다. 몇몇 경우에 있어서, TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 완화시키는 제제와 조합(혹은 병용)하여 투여된다. 몇몇 경우에 있어서, TFP 분자를 발현하는 세포는 메소텔린와 연관된 질환을 치료하는 제제와 조합하여 투여된다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에서 제공된 단리된 핵산 분자, 본 명세서에서 제공된 단리된 폴리펩타이드 분자, 본 명세서에서 제공된 단리된 TFP, 본 명세서에서 제공된 복합체, 본 명세서에서 제공된 벡터, 또는 본 명세서에서 제공된 세포는 약제로서 사용하기 위한 것이다.
일 양상에 있어서, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물의 치료 방법이 본 명세서에서 제공되되, 해당 방법은, 포유동물에 본 명세서에서 제공된 TFP 분자, 본 명세서에서 제공된 세포, 또는 본 명세서에서 제공된 폴리펩타이드 분자의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 포유동물에서는 항-메소텔린 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유동물에 비해서 더 적은 사이토카인이 방출된다.
참조에 의한 편입
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 마치 각각의 개별적인 공보, 특허, 또는 특허 출원이 참고로 편입되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로 편입된다.
본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 청구범위에서 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시형태로 제시되는 하기 상세한 설명 및 이의 수반되는 도면을 참고하여 얻어질 것이며, 수반되는 도면은 다음과 같다:
도 1은 본 발명의 T-세포 수용체 융합 폴리펩타이드(TFP)의 용도를 증명하는 개략적 실례이다. 예시적인 TFP는 (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 scFv 및 전장 CD3 엡실론 폴리펩타이드를 함유한다. T-세포에 의해 생산되고 그 세포에 도입되는 경우, TFP는, 내인성 CD3 엡실론 폴리펩타이드의 한쪽 또는 양쪽이 TFP로 치환되는 리프로그래밍된(reprogrammed) TCR을 형성하기 위해 (수평 회색 세그먼트가 원형질막을 나타내는, 2개의 CD3 엡실론 폴리펩타이드, 1개의 CD3 감마 폴리펩타이드, 1개의 CD3 델타 폴리펩타이드, 2개의 CD3 제타 폴리펩타이드, 1개의 TCR 알파 서브유닛 및 1개의 TCR 베타 서브유닛을 포함하도록 도시된) 내인성 T-세포 수용체(TCR)의 다른 폴리펩타이드와 회합된다.
도 2는 본 발명의 리프로그래밍된 T-세포 수용체 융합 폴리펩타이드(TFP)의 예시적인 변형을 입증하는 개략적 실례를 나타낸다. scFv:TCR-Vα로 표시된 실례는 (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 scFv 및 전장 TCR Vα 폴리펩타이드를 함유하는 TFP를 함유하는 예시적인 리프로그래밍된 TCR을 예시한다. scFv:TCR-Vα:TCR-Vβ로 예시된 실례는 i) (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 scFv 및 전장 TCR Vα 폴리펩타이드 및 ii) (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 scFv 및 전장 TCR Vβ 폴리펩타이드를 포함하는 다중 TFP를 함유하는 일련의 예시적인 리프로그래밍된 TCR를 예시한다. scFv:ΔTCR-Vα:CD3ε로 예시된 실례는 i) (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 scFv 및 절단된(Δ) TCR 폴리펩타이드 및 ii) (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 scFv 및 전장 CD3 엡실론 폴리펩타이드를 포함하는 다중 TFP를 함유하는 예시적인 리프로그래밍된 TCR을 예시한다. 절단된(Δ) TCR 폴리펩타이드는 Vα의 결실에 의해 절단된다. scFv:ΔTCR-Vα:ΔTCR-Vβ로 예시된 실례는 i) (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 scFv 및 절단된(Δ) TCR Vα 폴리펩타이드 및 ii) (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 scFv 및 절단된(Δ) TCR Vβ 폴리펩타이드를 포함하는 다중 TFP를 함유하는 예시적인 리프로그래밍된 TCR을 예시한다. 절단된(Δ) TCR 폴리펩타이드는 Vβ의 결실에 의해 절단된다.
도 3은 본 발명의 T-세포 수용체 융합 폴리펩타이드(TFP)의 용도를 증명하는 개략적 실례이다. 예시적인 TFP는 (G4S)3 링커 서열을 통해 융합된 항-메소텔린 VH 도메인 및 전장 CD3 엡실론 폴리펩타이드를 함유한다. T-세포에 의해 생산되고 T-세포에 도입된 경우, TFP는 내인성 CD3 엡실론 폴리펩타이드의 한쪽 또는 양쪽이 TFP로 치환되는 리프로그래밍된 TCR을 형성하기 위해 (수평 회색 세그먼트가 원형질막을 나타내는, 2개의 CD3 엡실론 폴리펩타이드, 1개의 CD3 감마 폴리펩타이드, 1개의 CD3 델타 폴리펩타이드, 2개의 CD3 제타 폴리펩타이드, 1개의 TCR 알파 서브유닛 및 1개의 TCR 베타 서브유닛을 포함하도록 나타난) 내인성 T-세포 수용체(TCR)의 다른 폴리펩타이드와 연관된다.
도 4는 다양한 TFP를 암호화하는 DNA 작제물을 입증하는 일련의 개략적 실례이다.
도 5a는 활성화된 PBMC 세포 상에서의 TFP의 예시적인 표면 발현 분석을 나타내며 MSLN TFP로 활성화되고 CD8(항-CD8 APCCy7, y-축) 및 메소텔린("MSLN")(Zenon® R-피코에리트린-표지된 hMSLN IgG, x-축)에 대해서 염색된 CD3+ 세포(항-CD3 APC, 게이트)를 도시한다. 좌측으르부터 우측으로 비-형질도입 세포 또는 항-MSLN-CD3ε TFP, 항-MSLN-CD28ζ CAR, 및 항-MSLN-41BBζ CAR 작제물로 형질도입된 세포가 도시되어 있다.
도 5b(도 5ba 및 도 5bb)는 활성화된 PBMC 세포 상에서의 TFP의 예시적인 표면 발현 분석을 나타내며 인-하우스 단일 도메인 TFP로 활성화되고 MSLN Fc에 대해서 염색되고 GFP에 대해서 분석된 세포를 도시한다. 최상부 행은 (좌측에서 우측으로) 비-형질도입 세포, 및 대조군 항-MSLN-CD3ε TFP("SS1")으로 형질되입된 세포를 도시한다. 제2행 내지 제4행은, 각각, GFP-태그된 (좌측에서 우측으로) CD3ε TFP, CD3γTFP, TCRβ TFP 및 CD28ζ CAR 작제물로 형질도입된 세포에서의 항-MSLN 결합체 SD1, SD4 및 SD6을 도시한다.
도 6a는 시간 경과에 따른 항-MSLN-TFP 작제물에 의한 메소텔린(MSLN)-양성 HeLa(자궁경부 선암종, ATCC® CCL-2™) 표적 세포의 사멸을 도시한 예시적인 그래프이다. 활성화된 PBMC는 비처리되었거나(자취 #1), 비-형질도입되었거나(자취 #2), 또는 빈 벡터(자취 #3), 항-MSLN-CD3ε TFP(자취 #4), 항-MSLN-CD28ζ CAR, 또는 항-MSLN-41BBζ CAR로 형질도입되고, 1x104 MSLN-양성 HeLa 표적 세포와 항온처리하기 전에 8일 동안 확장되었다.
도 6b는 시간 경과에 따른 항-MSLN-TFP 작제물에 의한 MSLN-음성 HeLa(자궁경부 선암종, ATCC® CCL-2™) 표적 세포의 사멸을 도시한 예시적인 그래프이다. 활성화된 PBMC는 비처리되었거나(자취 #1), 비-형질도입되었거나(자취 #2), 또는 빈 벡터(자취 #3), 항-MSLN-CD3ε TFP(자취 #4), 항-MSLN-CD28ζ CAR, 또는 항-MSLN-41BBζ CAR로 형질되입되고, 1x104 MSLN-양성 HeLa 표적 세포와 항온처리하기 전에 8일 동안 확장되었다.
도 6c는 상이한 두 인간 공여체로부터 T 세포를 사용한 높은 MSLN-발현 세포주(HeLa 세포)에서의 MSLN-양성 세포의 사멸을 도시한다(상부 및 하부). 인-하우스 항-MSLN 결합체 SD1(도 7a), SD4(중앙), 및 SD6(우측)에 의한 TFP T 세포에 대한 세포 사멸 자취가 도시되어 있다. 활성화된 PBMC는 비형질도입되었거나(자취 #1), 또는 CD3ε TFP(자취 #2), CD3γ TFP(자취 #3), TCRβ TFP(자취#4), 또는 CD28ζ CAR로 형질도입되었다. 세포독성을 나타내는 정규화된 세포 지수는, 실시간 세포 분석기(real time cell analyzer: RTCA) 검정에서 결정되었다.
도 7은 높은 수준의 메소텔린(HeLa-Luc(MSLN하이 (high)))을 발현하는 표적 세포주에 대한 항-MSLN CAR T 세포 및 TFP T 세포의 결합 활성도를 도시하는 일련의 그래프이다. 인-하우스 항-메소텔린 결합체 SD1(도 7a), SD4(도 7b), 및 SD6(도 7c)에 의한 T 세포가 없거나("표적 단독"), 빈 벡터 형질도입되거나("NT"), 항-MSLN(양성 대조군), 또는 항-메소텔린 TFP T 세포로 형질도입된 샘플에서의 세포 사멸%가 도시되어 있으며, 각각은 CD3ε TFP, CD3γ TFP, TCRβ TFP 및 CD28ζ CAR의 포맷이다. 각 그래프에서, 흑색 막대는 1:1비의 T 세포 대 표적 세포를 나타내고, 회색 막대는 1:5비의 T 세포 대 표적 세포를 나타낸다. 마찬가지 결과가 두 번째 T 세포 공여체에 대해서 도시되어 있다.
도 8은 낮은 수준의 메소텔린(PC3-MSLN(-/로(low)))을 발현하는 표적 세포주에 대한 항-MSLN CAR T 세포 및 TFP T 세포의 활성도를 도시하는 일련의 그래프이다. TFP 형태 CD3ε(도 8a), CD3γ(도 8b), TCRβ(도 8c) 및 CD28ζ CAR(도 8d)에서의 T 세포가 없거나("표적 단독"), 빈 벡터 형질도입되거나("NT"), 항-MSLN(양성 대조군, "SS1"), 또는 인-하우스 항-메소텔린 작제물 SD1, SD4, 및 SD6로 형질도입된 샘플에서의 세포 사멸%가 도시되어 있다. 각 그래프에서, 흑색 막대는 1:1비의 T 세포 대 표적 세포를 나타내고, 회색 막대는 1:5비의 T 세포 대 표적 세포를 나타낸다. 마찬가지 결과가 두 번째 T 세포 공여체에 대해서 도시되어 있다.
도 9는 MSLN+ 세포와 공-배양된 경우 항-MSLN CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 T-세포의 활성화를 입증하는 FACS 분석의 결과를 도시한다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 좌측으로부터 우측으로, T 세포는 비-형질도입되었거나, 빈 벡터로 형질도입되었거나, 또는 항-MSLN-CD3ε TFP, 항-MSLN-28ζ CAR, 또는 항-MSLN-41BBζ CAR로 형질도입되었다. MSLN-세포와 공-배양된 세포는 위쪽 열에 도시되어 있고, MSLN+ 표적 세포와 공-배양된 세포는 아래쪽 열에 도시되어 있다. 세포는 이어서 표면 활성화 마커 CD69 및 CD25 또는 세포용해 과립 성분 그랜자임 B(granzyme B: GrB)에 대해서 특이적인 항체로 염색되었다. 항-CD69로 염색된 세포의 수는 x-축에 대응하고, 항-CD25로 염색된 것은 y-축에 대응한다. 도시된 바와 같이, 항-메소텔린 CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 T-세포는, MSLN-세포와 공-배양된 것에 비해서 상승된 수준의 CD69 및 CD25 발현으로 입증되는 바와 같이 MSLN+ 세포와 배양함으로써 활성화되었다(도 9b). MSLN-(흰색 막대) 및 MSLN+(흑색 막대) 세포에서의 각 작제물에 대한 CD25+ 세포의 퍼센트가 도시되어 있다. 유사한 실험은 비-형질도입 T 세포, 또는 항-MSLN 양성 대조군 결합체("510-SS1-CD3ε)로 형질도입된 T 세포에서 K562 MSLN- 세포(원) 및 K562-MSLN+ 세포(사각형)를 사용해서 행하였다(도 9c). 데이터는 CD25+, CD69+ 및 CD25+/CD69+ 세포의 합계를 나타낸다. 도 9d에서, 데이터는 TFP 포맷 CD3ε, CD3γ, TCRβ 및 CD28ζ CAR를 갖는 공여체 T 세포와 조합된 K562 MSLN- 표적 세포(좌측 패널) 및 K562 MSLN+ 세포(우측 패널)에서의 인-하우스 항-MSLN 결합체 SD1(사각형), SD4(원) 및 SD6(삼각형)에 대해서 도시되어 있다. 마찬가지 결과는 두 번째 T 세포 공여체로부터의 세포를 사용해서 나타내었다.
도 10은 MSLN+ 세포와 공-배양된 경우 항-MSLN CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 T-세포의 활성화를 입증하는 FACS 분석의 결과를 도시한다. 세포는 항-그랜자임 B Alexafluor700(x-축)으로 고정, 침투 및 염색하기 전에 항-CD3 APC(게이트) 및 항-CD8 APCcy7(y-축)로 표면 항원에 대해서 염색되었다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 좌측으로부터 우측으로, T 세포는 비-형질도입되었거나, 빈 벡터로 형질도입되었거나, 항-MSLN-CD3ε TFP, 항-MSLN-28ζ CAR, 또는 항-MSLN-41BBζ CAR로 형질도입된 것이었다. MSLN- 세포와 공-배양된 세포는 위쪽 행에 도시되어 있고, MSLN+ 표적 세포와 공-배양된 것은 아래쪽 행에 도시되어 있다. 항-메소텔린 CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 CD8 T-세포는, MSLN- 세포와 공-배양된 것에 비해서, 상승된 수준의 세포내 GrB로 표시된 바와 같이, MSLN+ 세포와 배양함으로써 활성화되었다(도 10b). MSLN-(흰색 막대) 또는 MSLN+(흑색 막대) 세포 없이 배양된 경우, 각 작제물에 대한 그랜자임 B("GrB+") 세포의 퍼센트가 도시되어 있다.
도 11은 MSLN을 과발현하는 K562 세포와 공-배양된 경우 항-MSLN CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 활성화된 T-세포에서의 사이토카인 생산의 ELISA 분석의 결과를 도시한다. BCMA를 과발현하는 K562 세포가 음성 대조군으로서 사용되었다. 24시간 후에, 세포는 ELISA에 의해 IFN-γ(도 11a) 및 IL-2(도 11b) 발현에 대해서 분석되었다. 각 도면에 있어서, 좌측으로부터 우측으로, T 세포는 비-형질도입되었거나, 빈 벡터로 형질도입되었거나, 항-MSLN-CD3ε TFP, 항-MSLN-28ζ CAR, 또는 항-MSLN-41BBζ CAR로 형질도입되었다. MSLN- 세포와 공-배양된 세포는 흰색 막대로 표시되고, MSLN+ 표적 세포와 공-배양된 것은 흑색 막대로 표시된다.
도 12는 중피종 이종이식 마우스 모델에서 생체내 MSLN-특이적 sdAb TFP T 세포를 도시한 일련의 그래프이다. 마우스를 마우스당 1x106개 세포로 루시퍼라제-표지된 MSTO-211H-FL-MSLN-Luc로 접종하고 종양을 종양 용적이 대략 300㎣가 될 때까지 증식시키고, 각 동물에게 1x107개 T 세포를 정맥내 주사하였다. 도 12a는 좌측으로부터 우측으로, T 세포가 없는 대조군, SD1 CD3ε-TFP, 및 SD4 CD3ε-TFP를 포함하는 T 세포로 주입 후에 종양 용적을 도시한다. 도 12b는 SD1 및 SD4 결합체 및 SD1 CD28ζ CAR를 가진 CD3γ- TFP를 도시한다. 도 12c 내지 도 12d는, 두 번째 T 세포 주입 없이 마우스가 그들의 항-MSLN 면역력을 유지하는지의 여부를 결정하기 위하여 종양 세포로 재차 시험감염시킨, 도 12a 내지 도 12b로부터 생존하는 마우스로부터의 결과를 도시한다. SD1 CD3ε-TFP T 세포(12c) 및 SD1 CD3γ-TFP T 세포(12d)가 투여되었고 이미 그들의 종양을 제거한 마우스는 MSLN+(MSTO) 또는 MSLN-(Raji) 종양 세포주로 재접종하였다. 종양 용적을 측정하고 x-축에 나타내었다.
도 13은 난소암 환자로부터의 MSLN-TFP T 세포의 생산 및 기능적 분석을 도시한다. 도 13a는 실험 설계의 개략도이다. 도 13b 내지 도 13c는 환자의 SD1ε-TFP T 세포에 의한 MSTO-MSLN-Luc 종양 세포의 시험관내 사멸을 도시한다. MSTO-MSLN-Luc 종양 세포(표적 세포)는 메소텔린 발현이 확인되었고(13b); SD1-TFP T 세포(효과기 세포) 및 매칭된 비-형질도입된 대조군은 24시간 동안 5-대-1, 1-대-1, 또는 1-대-5의 E-대-T(효과기 대 표적)비로 첨가하였다. 표적 세포의 발광은 SpectraMax® M5 플레이트 리더(plate reader)(Molecular devices)에 의해 상대 발광 단위(RLU)로 측정하였다. 도면에서의 각 라인은 3회 반복의 평균을 나타낸다(13c). 도 13d 내지 도 13l은, IFNγ(13d), GM-CSF(13e), 그랜자임 A(13f), 그랜자임 B(13g), IL-2(13h), MIP-1α(13i), MIP-1β(13j), TNFα(13k) 및 퍼포린(perforin)(13l)을 포함하는, 난소암 환자로부터의 SD1ε-TFP T 세포의 사이토카인 프로파일의 측정치를 도시한다. MSTO-MSLN-Luc 종양 세포(표적 세포)는 96 평탄한 바닥 플레이트에서 10000개 세포/웰로 평판배양하였다. SD1ε-TFP T 세포(효과기 세포) 및 매칭되는 비-형질도입된 대조군은 24시간 동안 1-대-1 비로 첨가하였다. 세포 상청액을 수집하고 Luminex® 검정을 사용해서 사이토카인을 측정하였다.
도 14는, MSLN-하이 이종이식 종양 마우스 모델에서 환자-유래 SD1 CD3ε-TFP T 세포의 생체내 효능을 도시한다. MSTO-211H-FL MSLN-Luc 세포를 마우스당 1 x 106개 세포로 피하 접촉하였다. 종양 주입(종양 용적 대략 200 내지 300㎣) 후 10일째에, 각 동물에게 5 x 106개 T 세포를 정맥내 주사하였다. 도면에서의 각 라인은 단일 동물을 나타낸다. 데이터는 ND12(14a), 환자 1(14b), 환자 2(14c), 환자 3(14d), 및 환자 4(14e)로부터의 T 세포에 대해서 나타낸다. 원은 비형질도입 T 세포로 접촉된 마우스에서의 종양 크기를 나타내고; 사각형은 TFP T 세포로 접종된 것을 나타낸다.
일 양상에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인 및 TCR 서브유닛을 포함하는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)을 암호화하는 단리된 핵산 분자가 본 명세서에서 기재된다. 몇몇 실시형태에 있어서, TCR 서브유닛은 TCR 세포외 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 포함한다. 더욱 다른 실시형태에 있어서, TCR 서브유닛은 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 추가 실시형태에서, TCR 서브유닛은 (i) TCR 세포외 도메인, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하고, 여기서 (i), (ii) 및 (iii) 중 적어도 2개는 동일한 TCR 서브유닛 유래이다. 더욱 추가 실시형태에서, TCR 서브유닛은 CD3 엡실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인, 또는 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖는 아미노산 서열로부터 선택된 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 더욱 추가 실시형태에서, TCR 서브유닛은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인, 및 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형을 갖는 아미노산 서열로부터 선택된 자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단리된 핵산 분자는 (i) 본 명세서에서 제공된 임의의 항-메소텔린 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄(LC) CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3, 및/또는 (ii) 본 명세서에서 제공된 임의의 항-메소텔린 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄(HC) CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 경쇄 가변 영역은 본 명세서에서 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 그러나 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 영역은 본 명세서에서 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 그러나 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, TFP는 T-세포 수용체, CD3 델타, CD3 엡실론, 또는 CD3 감마의 알파 또는 베타쇄, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 그러나 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 TCR 서브유닛의 세포외 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 암호화된 TFP는 TCR 또는 TCR 서브유닛 CD3 엡실론, CD3 감마 및 CD3 델타의 알파, 베타쇄, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 그러나 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 암호화된 TFP는 TCR 또는 CD3 엡실론, CD3 감마 및 CD3 델타 CD45, CD2, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 알파, 베타 또는 제타쇄, 또는 이의 기능성 단편, 또는 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 그러나 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 암호화된 항-메소텔린 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인에 연결된다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 2 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 암호화된 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 3이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단리된 핵산 분자는 추가로 공자극 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 공자극 도메인은 DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137), 또는 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 그러나 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능성 신호전달 도메인이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단리된 핵산 분자는 리더 서열을 더 포함한다.
임의의 이전에 기재된 핵산 분자에 의해 암호화된 단리된 폴리펩타이드 분자가 또한 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 양상에 있어서, 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 단리된 T-세포 수용체 융합 단백질(TFP) 분자가 또한 본 명세서에서 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단리된 TFP 분자는 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 항체 단편을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 scFv 또는 VH 도메인을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 scFv 또는 VH 도메인이다. 다른 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열, 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 명세서에서 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 그러나 30, 20 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단리된 TFP 분자는 T-세포 수용체, CD3 델타, CD3 엡실론, 또는 CD3 감마의 알파 또는 베타쇄, 또는 이에 대해 적어도 1, 2 또는 3개의 변형 그러나 20, 10 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 TCR 세포외 도메인을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인에 연결된다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 2 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 3이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단리된 TFP 분자는 추가로 공자극 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 단리된 TFP 분자는 추가로 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다. 더욱 다른 실시형태에 있어서, 단리된 TFP 분자는 추가로 리더 서열을 포함한다.
임의의 이전에 기재된 TFP 분자를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터가 또한 본 명세서에서 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 벡터는 추가로 프로모터를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 벡터는 시험관내 전사된 벡터이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 벡터에서 핵산 서열은 추가로 폴리(A) 꼬리를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 벡터에서 핵산 서열은 추가로 3'UTR을 포함한다.
임의의 기재된 벡터를 포함하는 세포가 또한 본 명세서에서 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 인간 T-세포이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T-세포이다. 다른 실시형태에 있어서, 세포는 추가로, 세포내 신호전달 도메인으로부터 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩타이드와 연관된, 저해 분자의 적어도 일부분을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함하는 저해 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 저해 분자는 PD1의 적어도 일부분을 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 양상에 있어서, 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단리된 TFP 분자가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
또 다른 양상에 있어서, 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단리된 TFP 분자가 본 명세서에서 제공되고, 여기서 TFP 분자는 내인성 TCR 복합체에 기능적으로 통합될 수 있다.
또 다른 양상에 있어서, 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포가 본 명세서에서 제공되되, 여기서 TFP 분자가 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고, TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
또 다른 양상에 있어서, i) 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인; 및 ii) 적어도 하나의 내인성 TCR 복합체를 포함하는 TFP 분자를 포함하는 단백질 복합체가 본 명세서에서 제공된다.
몇몇 실시형태에 있어서, TCR은 T-세포 수용체, CD3 델타, CD3 엡실론, 또는 CD3 감마의 알파 또는 베타쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 링커 서열에 의해 TCR 세포외 도메인에 연결된다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 영역은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 2 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 3이다.
임의의 기재된 단백질 복합체당 적어도 2개의 상이한 TFP 단백질을 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포가 또한 본 명세서에서 제공된다.
또 다른 양상에 있어서, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 집단의 T-세포는 개별적으로 또는 집합적으로, TFP 분자가 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는, 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하고, TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에, 표면에서 및/또는 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
또 다른 양상에 있어서, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단이 본 명세서에서 제공되고, 여기서 집단의 T-세포는 개별적으로 또는 집합적으로 본 명세서에서 제공된 단리된 핵산 분자에 의해 암호화된 적어도 2개의 TFP 분자를 포함한다.
또 다른 양상에 있어서, 세포를 제조하는 방법이 본 명세서에서 제공되되, 해당 방법은, 임의의 기재된 벡터로 T-세포를 형질도입하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에 있어서, RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법이 본 명세서에서 제공되되, 해당 방법은 세포에 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 RNA는 임의의 기재된 TFP 분자를 암호화하는 핵산을 포함한다.
또 다른 양상에 있어서, 포유동물에 항-종양 면역력을 제공하는 방법이 본 명세서에서 제공되되, 해당 방법은 포유동물에게 임의의 기재된 TFP 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 자가 T-세포이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포는 동종이계 T-세포이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 포유동물은 인간이다.
또 다른 양상에 있어서, 메소텔린 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물의 치료 방법이 본 명세서에서 제공되되, 해당 방법은 포유동물에게 임의의 기재된 TFP 분자의 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 메소텔린 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 예컨대, 암 또는 악성종양 또는 전암성 병태, 예컨대, 췌장암, 난소암, 위암, 폐암, 또는 자궁내막암으로부터 선택되거나, 또는 메소텔린의 발현과 연관된 비-암 관련 징후이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 임의의 기재된 TFP 분자를 발현하는 세포는 TFP 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 완화시키는 제제와 조합으로 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 임의의 기재된 TFP 분자를 발현하는 세포는 메소텔린과 연관된 질환을 치료하는 제제와 조합으로 투여된다.
약제로서 사용하기 위한 임의의 기재된 단리된 핵산 분자, 임의의 기재된 단리된 폴리펩타이드 분자, 임의의 기재된 단리된 TFP, 임의의 기재된 단백질 복합체, 임의의 기재된 벡터 또는 임의의 기재된 세포가 또한 본 명세서에서 제공된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 단수 표현은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 하나 이상)를 지칭한다. 예로써, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약"은, 상황에 따라 그리고 당업자에 의해 공지되거나 공지될 수 있는, 플러스 또는 마이너스 1 미만 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 또는 30 초과를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대상체" 또는 "대상체들" 또는 "개체"는, 포유동물, 예컨대, 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어, 사육된, 농업용 또는 야생, 동물뿐만 아니라 새, 및 수생 동물을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. "환자"는 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 발병 위험이 있거나 달리 본 명세서에서 제공된 조성물 및 방법이 필요한 대상체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 치료 또는 완화에서 성공의 임의의 증상을 지칭한다. 치료는, 예를 들어, 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 중증도의 감소, 지연 또는 경감을 포함할 수 있거나, 질환, 결함, 장애, 또는 부정적인 병태, 기타 등등의 증상이 환자에 의해 경험되는 빈도의 감소를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료하다 또는 예방하다"는 질환 또는 병태의 치료 또는 완화의 일부 수준을 초래하는 방법을 지칭하는데 본 명세서에서 때때로 사용되고, 전적으로 병태의 예방을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는, 그 목적에 관한 결과의 범위를 고려한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방하는"은 환자에서 질환 또는 병태, 예를 들어, 종양 형성의 예방을 지칭한다. 예를 들어, 종양 또는 다른 형태의 암의 발병 위험에 있는 개체가 본 발명의 방법으로 치료받고 종양 또는 다른 형태의 암이 나중에 발병하지 않는다면, 질환은 그 개체에서 적어도 일정 기간에 걸쳐 예방되어 왔다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료적 유효량"은 유익한 효과를 제공하기에 또는 달리 조성물이 투여되는 개체에 해로운 비-유익한 이벤트를 감소시키기에 충분한 조성물 또는 이의 활성 성분의 양이다. "치료적으로 효과적인 용량"은 본 명세서에서 투여되는 하나 이상의 요망된 또는 바람직한(예컨대, 유익한) 효과를 생산하는 용량을 의미하고, 상기 투여는 소정의 기간에 걸쳐 1회 이상 실시한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 의존할 것이고, 공지된 기술(문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); 및 Pickar, Dosage Calculations (1999)] 참조)을 이용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질" 또는 "TFP"는 일반적으로 i) 표적 세포 상에서 표면 항원에 결합할 수 있고 ii) 전형적으로 T-세포의 표면 내에 또는 표면 상에서 공-위치된 경우, 온전한 TCR 복합체의 다른 폴리펩타이드 성분과 상호작용할 수 있는 TCR을 포함하는 다양한 폴리펩타이드로부터 유래된 재조합 폴리펩타이드를 포함한다. "TFP T 세포"는 (예컨대, 본 명세서에 개시된 방법에 따라서) 형질도입되었고 TFP를 발현하는, 예컨대, 자연 TCR에 편입된 T 세포이다. 몇몇 실시형태에 있어서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+/CD8+ T 세포이다. 몇몇 실시형태에 있어서, TFP T 세포는 NK 세포이다. 몇몇 실시형태에 있어서, TFP T 세포는 감마-델타 T 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, MSLN 또는 CAK1 항원 또는 프레-프로-거핵구-강화 인자라고도 공지된 용어 "메소텔린"은, 인간에서 MSLN(또는 거핵구-강화 인자(MPF)) 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. 메소텔린은 정상 중피 세포 상에 존재하고 중피종 및 난소 및 췌장 선암종을 비롯한 몇 가지 인간 종양에서 과발현되는 40 kDa 단백질이다. 메소텔린 유전자는 글리코포스파티딜이노시톨 연결에 의해 세포막에 부착된 메소텔린 및 거핵구-강화 인자(MPF)라 일컫는 31-kDa 쉐드 단편(shed fragment)을 수득하도록 가공된 전구체 단백질을 암호화한다. 메소텔린은 세포 유착과 연루될 수 있지만, 이의 생물학적 기능은 알려져 있지 않다. 메소텔린은 흉막, 복막 및 심막을 라이닝하는 중막 세포 상에 통상 존재하는 종양 분화 항원이다. 메소텔린은 중피종 세포, 난소암 세포, 췌장 선암종 세포 및 몇몇 편평세포 암종에서 검출 가능한 항원 결정자이다(예컨대, 문헌[Kojima et al., J. Biol. Chem. 270:21984-21990(1995) 및 Onda et al., Clin. Cancer Res. 12:4225-4231(2006)] 참조. 메소텔린은 CA125/MUC16과 상호작용한다(예컨대, 문헌[Rump et al., J. Biol. Chem. 279:9190-9198(2004) 및 Ma et al., J. Biol. Chem. 287:33123-33131(2012)] 참조).
인간 및 쥣과 아미노산 및 핵산 서열은 공공 데이터베이스, 예컨대, GenBank, UniProt 및 Swiss-Prot에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 인간 메소텔린 폴리펩타이드 표준적 서열은 UniProt/Swiss-Prot 수탁 번호 Q13421로서 발견될 수 있다. 인간 메소텔린 폴리펩타이드 표준적 서열은 UniProt 수탁번호 Q13421(또는 Q13421-1)이다: MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRREVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQAPRRPLPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA (서열번호 15).
인간 메소텔린 잔사 변이체 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 수탁번호 NM005823에서 발견할 수 있다. 인간 메소텔린 잔사 변이체 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 수탁번호 NM013404에서 발견할 수 있다. 인간 메소텔린 잔사 변이체 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 수탁번호 NM001177355에서 발견할 수 있다. 메소텔린은 중피종 세포, 난소암 세포, 췌장 선암종 세포 및 편형세포 암종 상에서 발현된다(예컨대, 문헌[Kojima et al., J. Biol. Chem. 270:21984-21990(1995) 및 Onda et al., Clin. Cancer Res. 12:4225-4231(2006)] 참조). 메소텔린을 발현하는 다른 세포는 "메소텔린의 발현과 연관된 질환"의 정의에서 이하에 제공된다. 메소텔린은 또한 CA125/MUC16과 상호작용한다(예컨대, 문헌[Rump et al., J. Biol. Chem. 279:9190-9198(2004) 및 Ma et al., J. Biol. Chem. 287:33123-33131(2012)] 참조). 일례에 있어서, TFP의 항원-결합부는 정상 또는 악성 중피종 세포, 난소암 세포, 췌장 선암종 세포, 또는 편평세포 암종 세포 상에서 발현되는 바와 같은 메소텔린 단백질의 세포외 도메인 내에서 에피토프를 인식하고 결합시킨다.
용어 "항체"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단백질, 또는 구체적으로 항원에 결합하는, 면역글로불린 분자로부터 유래된 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 항체는 다클론성 또는 단클론성 기원의 온전한 면역글로불린, 또는 이의 단편일 수 있고, 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
용어 "항체 단편" 또는 "항체 결합 도메인"은, 표적, 예컨대, 항원 및 이의 한정된 에피토프에 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하는데 충분한, 항원 결합 도메인, 즉, 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 함유하는, 항체의 적어도 하나의 부분, 또는 이의 재조합 변이체를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 단일-쇄(sc)Fv("scFv") 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체("sdAb"라 약칭됨)(VL 또는 VH 중 어느 한쪽), 낙타과 VHH 도메인, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 하나 이상의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하되, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 가요성 폴리펩타이드 링커를 통해 인접해서 연결되고, 단일 폴리펩타이드 쇄로서 발현될 수 있으며, scFv는 유래되는 온전한 항체의 특이성을 갖는다.
항체에 관하여 "중쇄 가변 영역" 또는 "VH"(또는, 단일 도메인 항체의 경우에, 예컨대, 나노바디, "VHH")는 프레임워크 영역으로서 공지된 측접하는 스트레치 사이 개재된 3개의 CDR을 함유하는 중쇄의 단편을 지칭하고, 이들 프레임워크 영역은 일반적으로 CDR보다 더욱 고도로 보존되고 CDR을 지지하기 위해 스캐폴드를 형성한다.
특정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 scFv는, 예를 들어, 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단에 관하여, 어느 한쪽으로 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 TFP 조성물의 부분은, 항원 결합 도메인이, 예를 들어, 쥣과, 인간화된 또는 인간 항체로부터 유래된 단일 도메인 항체 단편(sdAb), 중쇄 항체 HCAb, 단일 쇄 항체(scFv)를 포함하는 인접 폴리펩타이드 쇄의 일부로서 발현되는 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 일 양상에 있어서, 본 발명의 TFP 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 하나의 추가의 양상에 있어서, TFP는 scFv 또는 sdAb를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
용어 "항체 중쇄"는 이의 천연 발생 형태로 항체 분자에 존재하는 폴리펩타이드 쇄의 2가지 유형 중 더 큰 부분을 지칭하고, 이는 정상적으로 항체가 속하는 부류를 결정한다.
용어 "항체 경쇄"는 그의 천연 발생 형태로 항체 분자에 존재하는 폴리펩타이드 쇄의 2 유형의 더 작은 부분을 지칭한다. 카파("·") 및 람다("·") 경쇄는 2개의 주요한 항체 경쇄 아이소타입을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성되는 항체, 예컨대, 예를 들어, 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 그리고 DNA 분자가 항체 단백질, 또는 항체를 구체화하는 아미노산 서열을 발현하는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하고, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 이용 가능하고 당해 기술에서 잘 알려진 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 이용하여 수득되어 왔다.
용어 "항원" 또는 "Ag"는 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있거나, 달리 면역 반응을 유발시키는 분자를 지칭한다. 상기 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역학적으로-능숙한 세포의 활성화, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
당업자라면 사실상 모든 단백질 및 펩타이드를 포함하는 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자라면, 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 부분적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 임의의 DNA가 따라서 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 경우 "항원"을 암호화한다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 당업자라면 항원이 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해 단독으로 암호화될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 1개 초과의 유전자의 부분적인 뉴클레오타이드 서열의 이용을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니라는 것 및 이들 뉴클레오타이드 서열이 목적하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩타이드를 암호화하기 위해 다양한 조합으로 배열되는 것은 쉽게 명백하다. 또한, 당업자라면 항원이 "유전자"에 의해 전혀 암호화될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성 생성될 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 폴리펩타이드 이외의 거대분자일 수 있다는 것은 쉽게 명백하다. 그와 같은 생물학적 샘플은, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 가진 유체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "항-종양 효과"는, 예컨대, 종양 용적의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 종양 세포 증식의 감소, 종양 세포 생존의 감소, 또는 암성 병태와 연관된 다양한 생리적 증상의 완화를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, 다양한 수단에 의해 명시될 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항-종양 효과"는 또한 제1 장소에서 종양의 발생의 예방에서의 본 발명의 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 세포 및 항체의 능력에 의해 명시될 수 있다.
용어 "자가"는 개체에 나중에 재-도입되게 되는 동일한 개체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종이계"는 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물 또는 상이한 환자로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 2 이상의 개체는 하나 이상의 유전자좌에서 유전자가 동일하지 않은 경우 서로에 동종이계인 것으로 지칭된다. 몇몇 양상에 있어서, 동일한 종의 개체로부터 동종이계 물질은 항원성으로 상호작용하기 위해 유전자적으로 충분히 다를 수 있다.
용어 "이종계"는 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
용어 "암"은 비정상적인 세포의 급속 및 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암세포는 국소로 또는 혈류 및 림프 시스템을 통해 신체의 다른 부분에 확산할 수 있다. 다양한 암의 예는 본 명세서에서 기재되고, 그리고 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
어구 "메소텔린의 발현과 연관된 질환"은, 메소텔린의 발현과 연관된 질환 또는, 메소텔린을 발현하는 세포와 연관된 병태, 예컨대, 증식성 질환, 예를 들어, 암 또는 악성종양 또는 전암성 병태를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 양상에 있어서, 암은 중피종이다. 일 양상에 있어서, 암은 췌장암이다. 일 양상에 있어서, 암은 난소암이다. 일 양상에 있어서, 암은 위암이다. 일 양상에 있어서, 암은 폐암이다. 일 양상에 있어서, 암은 자궁내막암이다. 메소텔린의 발현과 연관된 비-암 관련 징후는, 예컨대, 자가면역 질환(예컨대, 루푸스, 류마티스 관절염, 결장염), 염증성 장애(알러지 및 천식) 및 이식을 포함한다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징을 변경하지 않거나 유의미하게 영향을 주지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 상기 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당해 기술에서 공지된 표준 기술, 예컨대, 부위 지향적 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 기술에서 정의되어 왔다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가진 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 TFP 이내 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 TFP는 본 명세서에서 기재된 기능성 검정을 이용하여 시험될 수 있다.
용어 "자극"은 그의 동족 리간드로 자극 도메인 또는 자극 분자(예컨대, TCR/CD3 복합체)의 결합 이로써 신호 형질도입 이벤트, 예컨대, 비제한적으로, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 형질도입의 매개에 의해 유도된 1차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현, 및/또는 세포골격 구조의 재구성, 기타 등등을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자" 또는 "자극 도메인"은 T-세포 신호전달 경로의 적어도 일부 양상에 대하여 자극 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 T-세포에 의해 발현된 분자 또는 이의 일부를 지칭한다. 일 양상에 있어서, 1차 신호는, 예를 들어, 펩타이드로 장입된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 T-세포 반응의 매개로 이어진다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열(또한 "1차 신호전달 도메인"으로도 지칭됨)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 "ITAM"으로서 공지되는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에서 특정 용도인 1차 세포질 신호전달 서열을 함유한 ITAM의 예는, TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278(또한 "ICOS"로서도 공지됨) 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 이의 표면에서 주조직 적합성 복합체(MHC)로 복합된 외래 항원을 나타내는 면역 시스템 세포, 예컨대, 부속 세포(예컨대, B-세포, 수지상 세포 등)를 지칭한다. T-세포는 이의 T-세포 수용체(TCR)를 이용해서 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 가공하고 이들을 T-세포에 제시한다.
용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 TFP 함유 세포, 예컨대, TFP-발현 T-세포의 면역 효과기 기능을 촉진시키는 신호를 생성한다. 예컨대, TFP-발현 T-세포에서, 면역 효과기 기능의 예는, 사이토카인의 분비를 포함하는, 세포용해 활성 및 T 헬퍼 세포 활성을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 1차 세포내 신호전달 도메인은 1차 자극, 또는 항원 의존적 시뮬레이션을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 신호, 또는 항원 독립적인 자극을 담당하는 분자로부터 유래된 것을 포함한다.
1차 세포내 신호전달 도메인은 ITAM("면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프")을 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는, CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "공자극 분자"는 구체적으로 공자극 리간드와 결합하고, 이로써 T-세포에 의한 공자극 반응, 예컨대, 비제한적으로, 증식을 매개하는 T-세포에서 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공자극 분자는 효율적인 면역 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공자극 분자는, MHC 부류 1 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체뿐만 아니라, DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB(CD137)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 공자극 세포내 신호전달 도메인은 공자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공자극 분자는 하기 단백질 계열에서 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 및 활성화 NK 세포 수용체. 상기 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 유래되는 분자의, 전체 세포내 부분, 또는 전체 원상태 세포내 신호전달 도메인, 또는 이의 기능성 단편을 포함할 수 있다. 용어 "4-1BB"는 유전자은행 수탁 번호 AAA62478.2, 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기로서 제공되는 아미노산 서열을 가진 TNFR 상과의 구성원으로서 지칭되고; "4-1BB 공자극 도메인"은 유전자은행 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214 내지 255, 또는 비-인간 종, 예를 들어, 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기로서 정의된다.
용어 "암호화"는 뉴클레오타이드(예컨대, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 한정된 서열 또는 아미노산의 한정된 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 폴리머 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하기 위해, 폴리뉴클레오타이드내 뉴클레오타이드, 예컨대, 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 특이적 서열의 고유한 특성 및 이로부터 비롯된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는, 그 유전자에 대응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하면 단백질을 암호화한다. mRNA 서열과 동일하고 서열 목록에 일반적으로 제공되는 뉴클레오타이드 서열인 암호화 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용된 비-코딩 가닥 둘 다는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물로서 지칭될 수 있다.
달리 특정되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 버전을 축퇴시키는 그리고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 암호화하는 어구 뉴클레오타이드 서열은 또한 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 일부 버전으로 하나 이상의 인트론을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용되고, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 특정한 생물학적 또는 치료적 결과를 달성하는데 효과적인, 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내부에서 생산된 또는 상기로부터의 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 외부에서 생산된 또는 상기로부터 도입된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 유도된 특정한 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포의 내부에 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 수많은 벡터가 당해 기술에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전달 벡터"는 자율적으로 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 용어는 세포에 핵산의 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대, 폴리라이신 화합물, 리포좀 등을 더 포함하는 것으로 또한 해석되어야 한다. 바이러스성 전달 벡터의 예는, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련된 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 대조군 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 그리고 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오타이드를 편입하는 코스미드, (예컨대, 노출된 또는 리포좀에 함유된) 플라스미드 및 바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련된 바이러스)를 포함하는 발현 벡터는 당해 기술에서 공지된 모든 것들을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 계열의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 중에서 독특하고; 이들은 숙주 세포의 DNA에 유전적 정보의 상당한 양을 전달할 수 있어서, 이들은 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는, 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에서 제공된 바와 같이 특히 자기-불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하는, 적어도 일부분의 렌티바이러스 게놈으로부터 유래된 벡터를 지칭한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는, 예컨대, Oxford BioMedica로부터 LENTIVECTORTM 유전자 전달 기술, Lentigen으로부터 LENTIMAXTM 벡터 시스템 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 비임상 유형의 렌티바이러스 벡터는 또한 입수 가능하고 당업자에게 공지될 것이다.
용어 "상동성" 및 "동일성"은 2개의 폴리머 분자 사이, 예를 들어, 2개의 핵산 분자, 예컨대, 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩타이드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자의 둘 다에서 서브유닛 위치가 동일한 모노머성 서브유닛에 의해 점유되는 경우; 예컨대, 각각의 2개의 DNA 분자 내 위치가 아데닌에 의해 점유되면, 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일성이다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭 또는 상동성 위치의 수의 직접 함수이고; 예컨대, 만일 2개의 서열 내 위치의 절반(예컨대, 길이로 폴리머 10개의 서브유닛에서 5개의 위치)가 상동성이면, 2개의 서열은 50% 상동성이고; 만일 위치의 90%(예컨대, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성이면, 2개의 서열은 90% 상동성이다.
비-인간(예컨대, 쥣과) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대개, 인간화된 항체 및 이의 항체 단편은 수령체의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터 잔기가 요망된 특이성, 친화도, 및 수용력을 갖는 비-인간 종(공여체 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린(수령체 항체 또는 항체 단편)이다. 몇몇 경우에 있어서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체/항체 단편은 수령체 항체에서도 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 찾지 못하는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 추가로 항체 또는 항체 단편 성능을 개량 및 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체 또는 이의 항체 단편은 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 대응하거나 모든 또는 상당한 부분의 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체 또는 항체 단편은 또한 적어도 일부분의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 추가 세부사항에 대하여, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992] 참고.
"인간" 또는 "완전 인간"은, 전체의 분자가 인간 기원이거나 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 구성되는, 면역글로불린, 예컨대, 항체 또는 항체 단편을 지칭한다.
용어 "단리된"은 천연 상태로부터 변경되거나 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리되지" 않지만, 그의 천연 상태의 공존 물질의 형태로부터 부분적으로 및 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된"다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 비-원상태 환경 예컨대, 예를 들어, 숙주 세포에서 존재할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 통상적으로 발생하는 핵산 염기에 대하여 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 사이토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 유리딘을 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "전사 대조군"은 조절 서열과 후자의 발현을 초래하는 이종성 핵산 서열 사이 기능성 연결을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능성 관계로 배치되는 경우 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 만일 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주면 프로모터는 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있고, 예를 들어, 2개의 단백질 암호화 영역을 결합하는데 필요한 경우, 동일한 해독틀에 있다.
면역원성 조성물의 용어 "비경구" 투여는, 예를 들어, 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.), 및 흉골내 주사, 종양내, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태로 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 폴리머를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사작용되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 전적으로 보존적으로 변형된 그의 변이체(예컨대, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 오쏘로그, SNP, 및 상보성 서열뿐만 아니라 명백하게 표시된 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 상호호환적으로 사용되고, 펩타이드 결합에 의해 공유결합된 아미노산 잔기가 포함된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질의 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한을 두지 않는다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어는, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로서, 예를 들어, 당해 기술에서 또한 통상적으로 지칭되는, 단쇄, 및 많은 유형이 있는, 단백질로서 당해 기술에서 일반적으로 지칭되는, 장쇄 모두를 지칭한다. "폴리펩타이드"는, 그 중에서도, 예를 들어, 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터"는 세포의 전사 기계, 또는 도입된 합성 기계에 의해 기술적으로 인식된, 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 특이적 전사를 개시하도록 요구된 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 생성물의 발현에 요구되는 핵산 서열을 지칭한다. 몇몇 경우에 있어서, 상기 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고 다른 경우에서, 상기 서열은 또한 유전자 생성물의 발현에 요구되는 다른 조절 요소 및 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어, 조직 특이적 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 암호화하거나 지정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 경우, 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건하에 세포에서 유전자 생성물이 생산되도록 하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는, 유전자 생성물을 암호화하거나 지정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 경우, 프로모터에 대응하는 유발제가 세포에서 존재하는 경우에만 실질적으로 세포에서 유전자 생성물이 생산되도록 하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
용어 "조직-특이적" 프로모터는, 유전자를 암호화하거나 지정되는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 경우, 세포가 프로모터에 대응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 실질적으로 세포에서 유전자 생성물이 생산되도록 하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
용어 "링커" 및 "가요성 폴리펩타이드 링커"는 scFv의 문맥에서 사용된 바와 같이 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합으로 사용된 아미노산, 예컨대, 글리신 및/또는 세린 잔기로 구성되는 펩타이드 링커를 지칭한다. 하나의 실시형태에 있어서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 Gly/Ser 링커이고 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하고, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n = 1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 및 n = 10. 하나의 실시형태에 있어서, 가요성 폴리펩타이드 링커는, (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시형태에 있어서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser)의 다중 반복부위를 포함한다. (본 명세서에서 참고로 편입된) WO2012/138475에 기재된 링커는 본 발명의 범위 내에 또한 포함된다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 2 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 3이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 5' 캡(cap)(또한 일명 RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡)은 전사의 시작 직후 진핵 메신저 RNA의 '선두' 또는 5' 말단에 부가되어 온 변형된 구아닌 뉴클레오타이드이다. 5' 캡은 제1 전사된 뉴클레오타이드에 연결되는 말단기로 구성될 수 있다. 그의 존재는 리보솜에 의한 인식 및 RNAse로부터 보호에 임계적이다. 캡 부가는 전사에 커플링되고, 공-전사적으로 발생하여 각각이 다른 것에 영향을 미친다. 전사의 시작 직후, 합성되는 mRNA의 5' 말단은 RNA 폴리머라제와 관련된 복합체의 캡-합성에 의해 결합된다. 상기 효소 복합체는 mRNA 캡핑에 요구되는 화학 반응을 촉매화한다. 합성은 다단계 생화학적 반응으로서 진행한다. 캡핑 모이어티는 mRNA의 작용성, 예컨대, 이의 안정성 또는 번역의 효율을 조정하기 위해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "시험관내 전사된 RNA"는, 시험관내 합성된, RNA, 바람직하게는 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 시험관내 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하는데 사용되는 주형을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리(A)"는 mRNA에 폴리아데닐화에 의해 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 작제물의 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리A는 50 내지 5000개, 바람직하게는 64개 초과, 더 바람직하게는 100개 초과, 가장 바람직하게는 300 또는 400개 초과이다. 폴리(A) 서열은 mRNA 작용성, 예컨대, 국재화, 안정성 또는 번역의 효율을 조정하기 위해 화학적으로 또는 효소적으로 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리아데닐화"는 메신저 RNA 분자에 폴리아데닐릴 모이어티, 또는 이의 변형된 변이체의 공유결합을 지칭한다. 진핵 유기체에서, 대부분의 메신저 RNA(mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 꼬리는 효소, 폴리아데닐레이트 폴리머라제의 작용을 통해 사전-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오타이드(종종 몇 백)의 긴 서열이다. 더 높은 진핵생물에서, 폴리(A) 꼬리는 특이적 서열, 폴리아데닐화 신호를 함유하는 전사체 상에 부가된다. 폴리(A) 꼬리 및 그에 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의해 분해로부터 mRNA 보호를 돕는다. 폴리아데닐화는 전사 종료, 핵으로부터 mRNA의 도출, 및 번역에 또한 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA의 RNA로의 전사 직후 핵에서 발생하지만, 추가적으로 또한 세포질에서 나중에 발생한다. 전사가 종료된 이후, mRNA쇄는 RNA 폴리머라제와 관련된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통해 절단된다. 절단 부위는 절단 부위 근처 염기 서열 AAUAAA의 존재를 일반적으로 특징으로 한다. mRNA가 절단된 이후, 아데노신 잔기는 절단 부위에서 유리 3' 말단에 부가된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "일시적"은 시간, 일 또는 주의 일정 기간 동안 비-통합된 이식유전자의 발현을 지칭하고, 여기서 발현의 기간은 숙주 세포에서 안정적인 플라스미드 레플리콘 내에 함유되면 또는 게놈에 통합되면 유전자의 발현에 대한 기간 미만이다.
용어 "신호 형질도입 경로"는 세포의 한 부분에서 세포의 또 다른 부분까지 신호의 전송에서 역할을 하는 다양한 신호 형질도입 분자 사이 생화학적 관계를 지칭한다. 어구 "세포 표면 수용체"는 신호를 수신 그리고 세포의 막을 통해 신호를 전송할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체(예컨대, 포유동물, 인간)을 포함하도록 의도된다.
용어, "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형이 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 이의 천연 발생 상태에서 정상적으로 관련되는 다른 세포 유형으로부터 분리되어 온 세포를 지칭한다. 몇몇 경우에 있어서, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 세포의 균질한 집단을 지칭한다. 다른 경우에서, 상기 용어는 천연 상태에서 천연적으로 관련되는 세포로부터 분리된 세포를 단순히 지칭한다. 일부 양상에 있어서, 세포는 시험관내 배양된다. 다른 양상에 있어서, 세포는 시험관내 배양되지 않는다.
용어 "치료적"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 치료를 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 감소, 억제, 차도 또는 박멸에 의해 수득된다.
용어 "예방"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 질환 또는 질환 상태의 예방 또는 보호성 치료를 의미한다.
본 발명의 문맥에서, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 관련된 항원"은 특이적 과증식성 장애에 흔한 항원을 지칭한다. 특정 양상에 있어서, 본 발명의 과증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 중피종, 신장 세포 암종, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 신장암, 자궁내막암 및 위암을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 암으로부터 유래된다.
몇몇 경우에 있어서, 질환은 중피종, 유두상 장액성 난소 선암종, 투명 세포 난소 암종, 혼합 뮐러 난소 암종, 자궁내막양 점액성 난소 암종, 악성 늑막 질환, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁 장액성 암종, 폐 선암종, 간외 담관 암종, 위 선암종, 식도 선암종, 결장직장 선암종, 유방 선암종, 메소텔린 발현과 연관된 질환, 및 이들의 조합, 메소텔린 발현과 연관된 질환, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 속으로 전달 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염된, 형질전환된 또는 형질도입된 것이다. 세포는 1차 대상체 세포 및 이의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합하다"는, 샘플에 존재하지만 반드시 그리고 실질적으로 샘플에서 다른 분자를 인식 또는 결합하지 않는 동족 결합 파트너(예컨대, 메소텔린)를 인식하고 결합하는 항체, 항체 단편 또는 특이적 리간드를 지칭한다.
범위: 본 개시내용 전체를 통해서, 본 발명의 다양한 양상은 범위 형식으로 나타낼 수 있다. 범위 형식으로 설명이 단지 편의상이고 간결화하기 위한 것임이 이해되어야 하고 본 발명의 범위에서 불변의 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 그 범위 이내 개별적인 수치를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 범위, 예컨대, 1 내지 6의 설명은 하위범위, 예컨대, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 그 범위 이내 개별적인 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 또 다른 예로서, 범위, 예컨대, 95 내지 99% 동일성은 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 하위범위, 예컨대, 96 내지 99%, 96 내지 98%, 96 내지 97%, 97 내지 99%, 97 내지 98% 및 98 내지 99% 동일성을 포함한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용한다.
설명
T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질을 이용하는, 질환, 예컨대, 암의 치료를 위한 용도의 방법 및 물질의 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질" 또는 "TFP"는 일반적으로 i) 표적 세포에서 표면 항원에 결합할 수 있고, ii) 전형적으로 T-세포의 표면 내에 또는 표면에서 공-위치된 경우, 온전한 TCR 복합체의 다른 폴리펩타이드 성분과 상호작용할 수 있는 TCR을 포함하는 다양한 폴리펩타이드로부터 유래된 재조합 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, TFP는 키메라 항원 수용체와 비교된 경우 실질적인 이점을 제공한다. 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 scFv의 형태로 세포외 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 아래에 정의된 바와 같이 자극 분자로부터 유래된 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인(또한 본 명세서에서 "세포내 신호전달 도메인"으로서 지칭됨)을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, CAR의 중심 세포내 신호전달 도메인은 TCR 복합체와 관련되어 정상적으로 발견되는 CD3 제타쇄로부터 유래된다. CD3 제타 신호전달 도메인은 하나 이상의 공-자극 분자, 예컨대, 4-1BB(즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 유래된 하나 이상의 기능성 신호전달 도메인과 융합될 수 있다.
T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP)
본 발명은 TFP를 암호화하는 재조합 DNA 작제물을 포함하고, 여기서 TFP는 구체적으로 메소텔린, 예를 들어, 인간 메소텔린에 결합하는 항체 단편을 포함하고, 항체 단편의 서열은 TCR 서브유닛 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열로서 동일한 해독틀과 인접하고 동일한 해독틀에 있다. 본 명세서에서 제공된 TFP는 기능성 TCR 복합체를 형성하기 위해 하나 이상의 내인성(또는 대안적으로, 하나 이상의 외인성, 또는 내인성 및 외인성의 조합) TCR 서브유닛과 회합될 수 있다.
일 양상에 있어서, 본 발명의 TFP는 달리 항원 결합 도메인으로서 지칭된 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 모이어티의 선택은 표적 세포의 표면을 명시하는 표적 항원의 유형 및 수에 의존한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특정한 질환 상태와 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로서 작용하는 표적 항원을 인식하기 위해 선택될 수 있다. 따라서 본 발명의 TFP에서 항원 결합 도메인에 대한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염; 자가면역 질환; 및 암성 질환(예컨대, 악성 질환)과 연관된 것을 포함한다.
일 양상에 있어서, TFP-매개된 T-세포 반응은 구체적으로 목적하는 항원에 결합하는 TFP에 항원-결합 도메인의 조작의 방식으로 관심 대상 항원에 유도될 수 있다.
일 양상에 있어서, 항원 결합 도메인을 포함하는 TFP의 부분은 메소텔린을 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 일 양상에 있어서, 항원 결합 도메인은 인간 메소텔린을 표적화한다.
항원 결합 도메인은, 단일-도메인 항체, 예컨대, 낙타과 유래된 나노바디의 중쇄 가변 도메인(VH), 경쇄 가변 도메인(VL) 및 가변 도메인(VHH), 및 항원 결합 도메인, 예컨대, 재조합 파이브로넥틴 도메인, 안티칼린, DARPIN 기타 등등으로서 기능하기 위해 당해 기술에서 공지된 대안적인 스캐폴드를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 및 이의 기능성 단편을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다. 마찬가지로 표적 항원을 구체적으로 인식 및 결합하는 천연 또는 합성 리간드는 TFP용 항원 결합 도메인으로서 사용될 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, TFP가 궁극적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래되는 것이 항원 결합 도메인에 유익하다. 예를 들어, 인간에서 사용을 위하여, 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대하여 인간 또는 인간화된 잔기를 포함하는 것이 TFP의 항원 결합 도메인에 유익할 수 있다.
따라서, 일 양상에 있어서, 항원-결합 도메인은 인간화된 또는 인간 항체 또는 항체 단편, 또는 쥣과 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 기재된 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인의 1개 이상의(예컨대, 모두 3개의) 경쇄 상보성 결정 영역 1(LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2(LC CDR2), 및 경쇄 상보성 결정 영역 3(LC CDR3), 및/또는 본 명세서에서 기재된 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인의 하나 이상의(예컨대, 모두 3개의) 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3), 예를 들어, 하나 이상의, 예를 들어, 모두 3개의 LC CDR 및 하나 이상의, 예를 들어, 모두 3개의 HC CDR을 포함하는 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 기재된 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인의 하나 이상의(예컨대, 모두 3개의) 중쇄 상보성 결정 영역 1(HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2(HC CDR2), 및 중쇄 상보성 결정 영역 3(HC CDR3)을 포함하고, 예를 들어, 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인은 각각 본 명세서에서 기재된 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는, 2개의 가변 중쇄 영역을 갖는다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 기재된 인간화된 또는 인간 경쇄 가변 영역 및/또는 본 명세서에서 기재된 인간화된 또는 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 기재된 인간화된 중쇄 가변 영역, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 적어도 2개의 인간화된 또는 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 scFv이다. 일 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인(예컨대, scFv)는 하기를 포함한다: 본 명세서에서 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(예컨대, 치환) 그러나 30, 20 또는 10개 이하의 변형(예컨대, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 및 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 본 명세서에서 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 적어도 1, 2 또는 3개의 변형(예컨대, 치환) 그러나 30, 20 또는 10개 이하의 변형(예컨대, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 및 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역. 하나의 실시형태에 있어서, 인간화된 또는 인간 항-메소텔린 결합 도메인은 scFv이고, 본 명세서에서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 링커를 통해 본 명세서에서 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커를 포함하되, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 3 또는 4이다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 임의의 하기 배향일 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 2 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 3이다.
일부 양상에 있어서, 비-인간 항체는 인간화되고, 여기서 항체의 특이적 서열 또는 영역은 인간 또는 이의 단편에서 천연적으로 생산된 항체와 유사성을 증가시키도록 변형된다. 일 양상에 있어서, 항원 결합 도메인은 인간화된다.
인간화된 항체는, CDR-그라프팅(예컨대, 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089 참조, 이들 각각은 본 명세서에서 그 전문이 참고로 편입됨), 베니어링(veneering) 또는 재표면화(예컨대, 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91 :969-973 (1994)] 참조, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에서 편입됨), 쇄 셔플링(예컨대, 미국 특허 번호 5,565,332 참조, 그 전문이 참고로 본 명세서에서 편입됨), 및 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호 WO 9317105, 문헌[Tan et al., J. Immunol., 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), 및 Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)](이들 각각은 그 전문이 참고로 본 명세서에서 편입됨)에 개시된 기술을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, 당해 기술에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역에서 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경하기 위해, 예를 들어, 개선하기 위해 CDR 공여체 항체로부터 대응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서 흔치 않은 프레임워크 잔기의 서열 비교에 의해 당해 기술에서 공지된 방법에 의해 확인된다(예컨대, Queen 등의 미국 특허 번호 5,585,089; 및 문헌[Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323](전문이 참고로 본 명세서에서 편입됨) 참조).
인간화된 항체 또는 항체 단편은 비인간인 공급원으로부터 남아있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는, 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 입수되는, 종종 "도입" 잔기로 지칭된다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 인간화된 항체 또는 항체 단편은 비인간 면역글로불린 분자 및 프레임워크 영역으로부터 1개 이상의 CDR를 포함하고 여기서 프레임워크를 포함하는 아미노산 잔기는 인간 생식계열로부터 완전히 또는 주로 유래된다. 항체 또는 항체 단편의 인간화를 위한 다중 기술은, 당해 기술에서 공지되고, 그리고 인간 항체의 대응하는 서열로 설치류 CDR 또는 CDR 서열의 치환, 즉, CDR-그라프팅(EP 239,400; PCT 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640, 이들의 내용은 전문이 본 명세서에서 참고로 편입됨)에 의해, Winter 및 동료의 방법(Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라 본질적으로 수행될 수 있다. 상기 인간화된 항체 및 항체 단편에서, 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적게 비인간 종으로부터 대응하는 서열에 의해 치환되어 왔다. 인간화된 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크(FR) 잔기가 설치류 항체내 유사한 부위로부터 잔기에 의해 치환되는 종종 인간 항체이다. 항체 및 항체 단편의 인간화는 또한 베니어링 또는 재표면화(EP 592,106; EP 519,596; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91 :969-973 (1994)]) 및 쇄 셔플링(미국 특허 번호 5,565,332)(이들의 내용은 전문이 본 명세서에서 참고로 편입됨)에 의해 달성될 수 있다.
인간화된 항체 제조에서 사용되는, 경 및 중 모두인, 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는 것이다. 소위 "최적화" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별된다. 설치류 것과 가장 근접한 인간 서열은 그 다음 인간화된 항체를 위한 인간 프레임워크(FR)로서 허용된다(문헌[Sims et al., J. Immunol., 151 :2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)], 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 본 명세서에서 그들의 전문이 편입됨). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크는 몇 개의 상이한 인간화된 항체에 사용될 수 있다(예컨대, 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151 :2623 (1993)] 참조, 이들의 내용은 본 명세서에서 참고로 본 명세서에서 그들의 전문이 편입됨). 몇몇 실시형태에 있어서, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어, 모두 4개의 프레임워크 영역은 VH4-4-59 생식계열 서열로부터 유래된다. 하나의 실시형태에 있어서, 프레임워크 영역은 대응하는 쥣과 서열에서, 예를 들어, 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어, 치환을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역, 예를 들어, 모두 4개의 프레임워크 영역은 VK3-1.25 생식계열 서열로부터 유래된다. 하나의 실시형태에 있어서, 프레임워크 영역은 대응하는 쥣과 서열에서, 예를 들어, 아미노산으로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 변형, 예를 들어, 치환을 포함할 수 있다.
일부 양상에 있어서, 항체 단편을 포함하는 본 발명의 TFP 조성물의 부분은 표적 항원에 대한 고친화도의 체류 및 다른 양호한 생물학적 특성으로 인간화된다. 본 발명의 일 양상에 따르면, 인간화된 항체 및 항체 단편은 친계 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용한 다양한 개념의 인간화된 생성물 및 친계 서열의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수 가능하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보자 면역글로불린 서열의 정황적 3차원 형태적 구조를 예시하고 표시하는 컴퓨터 프로그램은 입수 가능하다. 이들 표시의 점검은 후보자 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 예를 들어, 표적 항원을 결합하기 위한 후보자 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이런 식으로, FR 잔기는 수령체 및 도입 서열로부터 선택 및 조합될 수 있어서 요망된 항체 또는 항체 단편 특징, 예컨대, 표적 항원에 대한 증가된 친화도가 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합의 영향에 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관여된다.
인간화된 항체 또는 항체 단편은 최초 항체와 유사한 항원 특이성, 예를 들어, 본 발명에서, 인간 메소텔린을 결합하는 능력을 유지할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 인간화된 항체 또는 항체 단편은 개선된 친화도 및/또는 인간 메소텔린에 결합의 특이성을 가질 수 있다.
일 양상에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편의 특정한 기능성 특질 또는 특성을 특징으로 한다. 예를 들어, 일 양상에 있어서, 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 TFP 조성물의 부분은 인간 메소텔린을 특이적으로 결합한다. 일 양상에 있어서, 항원 결합 도메인은 문헌[Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)]에 기재된 FMC63 scFv로서 인간 메소텔린과 동일한 또는 유사한 결합 특이성을 갖는다. 일 양상에 있어서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항원 결합 도메인에 관한 것이고, 여기서 항체 결합 도메인은 메소텔린 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하고, 여기서 항체 또는 항체 단편은 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함한다. 특정 양상에 있어서, scFv는 리더 서열로서 동일한 해독틀과 인접하고 동일한 해독틀에 있다.
일 양상에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 단편, 예를 들어, 단일 쇄 가변 단편(scFv)이다. 일 양상에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인은 Fv, Fab, (Fab')2, 또는 2-기능성(예를 들어 2-특이적) 혼성 항체이다(예컨대, 문헌[Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 일 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 항체 및 이의 단편은 야생형 또는 향상된 친화도로 메소텔린 단백질을 결합시킨다.
표적 항원(예컨대, 메소텔린 또는 융합 모이어티 결합 도메인의 표적에 대하여 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 임의의 표적 항원)에 특이적인 항체 항원 결합 도메인의 수득 방법이 본 명세서에서 또한 제공되고, 상기 방법은 본 명세서에서 기술된 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입의 방식으로 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인의 제공, 하나 이상의 VL 도메인과 상기 제공된 VH 도메인의 선택적으로 조합, 및 관심의 표적 항원(예컨대, 메소텔린)(및 선택적으로 하나 이상의 요망된 특성을 가짐)에 대하여 특이적인 항체 항원 결합 도메인 및 특이적 결합 구성원을 확인하기 위해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 및 조합들의 시험을 포함한다.
몇몇 경우에 있어서, VH 도메인 및 scFvs는 당해 기술에서 공지된 방법(예컨대, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426 및 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883] 참조)에 따라 제조될 수 있다. scFv 분자는 가요성 폴리펩타이드 링커를 이용하여 VH 및 VL 영역을 함께 연결함으로써 생산될 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 가진 링커(예컨대, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 얼마나 폴딩하고 상호작용하는지에 크게 영향을 미칠 수 있다. 사실상, 만일 짧은 폴리펩타이드 링커(예컨대, 5 내지 10 아미노산)가 이용되면 쇄내 폴딩은 예방된다. 쇄간 폴딩은 2개의 가변 영역을 함께 기능성 에피토프 결합 부위를 형성하도록 또한 요구된다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 2 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 3이다. 링커 배향 및 크기의 예로서는, 예컨대, 문헌[Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448], 미국 특허 번호 7,695,936, 미국 특허 출원 공개 번호 20050100543 및 20050175606, 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715(이들 모두 본 명세서에서 참고로 편입됨)를 참조하면 된다.
scFv는 그의 VL과 VH 영역 사이에 약 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 15개 초과 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 링커 서열은 임의의 천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복부위의 세트, 예컨대, (Gly4Ser)n을 포함하되, 여기서 n은 1 이상의 양의 정수이다. 하나의 실시형태에 있어서, 링커는 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3일 수 있다. 링커 길이에서 변동은 유지될 수 있고 활성을 향상시켜, 활성 연구에서 우월한 효능을 일으킬 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 긴 링커(LL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 긴 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 2 내지 4이다. 몇몇 경우에 있어서, 링커 서열은 짧은 링커(SL) 서열을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 짧은 링커 서열은 (G4S)n을 포함하되, 여기서 n은 1 내지 3이다.
안정성 및 돌연변이
항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv 분자(예컨대, 가용성 scFv)의 안정성은 종래 대조군 scFv 분자 또는 전장 항체의 생체물리학적 특성(예컨대, 열 안정성)을 참조하여 평가될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간화된 또는 인간 scFv는 기재된 검정에서 모 scFv보다 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10 섭씨 온도, 약 11 섭씨 온도, 약 12 섭씨 온도, 약 13 섭씨 온도, 약 14 섭씨 온도, 또는 약 15 섭씨 온도 초과인 열 안정성을 갖는다.
항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 개선된 열 안정성은 후속하여 전체 메소텔린-TFP 작제물에 부여되어, 항-메소텔린 TFP 작제물의 개선된 치료 특성을 초래한다. 항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 열 안정성은 종래 항체와 비교된 경우 적어도 약 2℃ 또는 3℃만큼 개선될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 종래 항체와 비교된 경우 1℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 종래 항체와 비교된 경우 2℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 또 다른 실시형태에 있어서, scFv는 종래 항체와 비교된 경우 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃ 또는 15℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에서 개시된 scFv 분자와 scFv VH 및 VL이 유래된 항체의 scFv 분자 또는 Fab 단편 사이 비교될 수 있다. 열 안정성은 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시형태에 있어서, TM는 측정될 수 있다. TM의 측정 방법 및 단백질 안정성의 다른 결정 방법은 아래에 기재된다.
(가용성 scFv의 인간화 또는 돌연변이유발을 통해 일어나는) scFv내 돌연변이는 scFv의 안정성을 변경하고 scFv 및 항-메소텔린 TFP 작제물의 전체 안정성을 개선한다. 인간화된 scFv의 안정성은 측정, 예컨대, TM, 온도 변성 및 온도 응집을 이용하여 쥣과 scFv에 대해 비교된다. 하나의 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 돌연변이된 scFv가 항-메소텔린 TFP 작제물에 개선된 안정성을 부여하도록 인간화 공정에서 발생하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv는 돌연변이된 scFv가 메소텔린-TFP 작제물에 개선된 안정성을 부여하도록 인간화 공정에서 발생하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 돌연변이를 포함한다.
일 양상에 있어서, TFP의 항원 결합 도메인은 본 명세서에서 기재된 항원 결합 도메인 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 항원 결합 도메인은 본 명세서에서 기재된 항-메소텔린 항체 단편의 요망된 기능성 특성을 유지한다. 하나의 특정한 양상에 있어서, 본 발명의 TFP 조성물은 항체 단편을 포함한다. 하나의 추가의 양상에 있어서, 그 항체 단편은 scFv를 포함한다.
다양한 양상에 있어서, TFP의 항원 결합 도메인은 하기 내에서 하나 이상의 아미노산 변형에 의해 조작된다: 한쪽 또는 양쪽 가변 영역 이내(예컨대, VH 및/또는 VL), 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 이내 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 이내. 하나의 특정한 양상에 있어서, 본 발명의 TFP 조성물은 항체 단편을 포함한다. 하나의 추가의 양상에 있어서, 그 항체 단편은 scFv를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편이 추가로 변형될 수 있어서 이들이 아미노산 서열에서(예컨대, 야생형으로부터) 다양하지만, 요망된 활성에서는 아니도록 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, "비-필수적인" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 초래하는 추가의 뉴클레오타이드 치환은 단백질로 제조될 수 있다. 예를 들어, 분자에서 비필수적인 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터 또 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 일련의 아미노산은 측쇄 계열 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 일련으로 대체될 수 있고, 예를 들어, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는, 보존적 치환이 실시될 수 있다.
유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은, 염기성 측쇄(예컨대, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 무극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 비롯하여, 당해 기술에서 한정되어 왔다.
2개 이상의 핵산 및 폴리펩타이드 서열의 문맥에서 퍼센트 동일성은 동일한 2개 이상의 서열을 지칭한다. 만일 2개의 서열이 하기의 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 지정된 백분율을 가지면, 비교 창, 또는 수동 정렬 및 시력 검사에 의해 또는 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하여 측정된 경우 지정된 영역에 비해서 최대 관련성으로 비교되고 정렬된 경우, 2개의 서열은 "실질적으로 동일하다"(예컨대, 지정된 영역에 비해서, 또는, 지정되지 않은 경우, 전체 서열에 비해서 60% 동일성, 선택적으로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성). 선택적으로, 동일성은 길이로 적어도 약 50개의 뉴클레오타이드(또는 10개의 아미노산)인 영역에 대해, 또는 더욱 바람직하게는 길이로 100 내지 500 또는 1000개 이상의 뉴클레오타이드(또는 20, 50, 200개 이상의 아미노산)인 영역에 대해 존재한다.
서열 비교에 대하여, 전형적으로 1개의 서열은 참조 서열로서 작용하고, 여기에 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 하위서열 배위는 지정되고, 필요하면, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터는 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 그 다음 프로그램 파라미터에 기반하여 참조 서열에 비하여 시험 서열에 대해 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 비교용 서열의 정렬 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 비교용 서열의 최적의 정렬은, 예를 들어, 문헌[Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법용 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브에 소재한 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics Software Package에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 시력 검사에 의해(예컨대, 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조) 수행될 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성의 결정에 적합한 알고리즘의 2개의 예는, 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 각각 기재되는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터를 통해 공공연하게 이용 가능하다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 기능적으로 동등한 분자를 생성하는 개시 항체 또는 단편(예컨대, scFv) 아미노산 서열의 변형을 고려한다. 예를 들어, TFP에서 포함된, 항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 VH 또는 VL은 항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, scFv의 개시 VH 또는 VL 프레임워크 영역의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 유지하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 전체 TFP 작제물의 변형, 예를 들어, 기능적으로 동등한 분자를 생성하기 위한 TFP 작제물의 다양한 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열에서 변형을 고려한다. TFP 작제물은 개시 TFP 작제물의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 유지하도록 변형될 수 있다.
세포외 도메인
세포외 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 단백질로부터, 그러나 특히 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 일 양상에서 세포외 도메인은 막관통 도메인과 연관될 수 있다. 본 발명에서 특정 용도의 세포외 도메인은 적어도 예를 들어, T-세포 수용체, 또는 CD3 엡실론, CD3 감마, 또는 CD3 델타의 알파, 베타 또는 제타쇄, 또는 대안적인 실시형태에서, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 세포외 영역(들)을 포함할 수 있다.
막관통 도메인
일반적으로, TFP 서열은 단일 게놈 서열에 의해 암호화된 막관통 도메인 및 세포외 도메인을 함유한다. 대안적인 실시형태에서, TFP는 TFP의 세포외 도메인에 이종성인 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가의 아미노산, 예를 들어, 막관통이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산(예컨대, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 최대 15개의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래되는 단백질의 세포내 영역과 관련된 하나 이상의 추가 아미노산(예컨대, 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 최대 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일 양상에 있어서, 막관통 도메인은 TFP의 다른 도메인 중 하나가 사용되는 것과 관련되는 것이다. 몇몇 경우에 있어서, 막관통 도메인은 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 상기 도메인의 결합을 피하기 위해, 예를 들어, 수용체 복합체의 다른 구성원과 상호작용을 최소화하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택 또는 변형될 수 있다. 일 양상에 있어서, 막관통 도메인은 TFP-T-세포 표면에서 또 다른 TFP와 호모다이머화될 수 있다. 상이한 양상에서 막관통 도메인의 아미노산 서열은 동일한 TFP에서 존재하는 원상태 결합 파트너의 결합 도메인과 상호작용을 최소화하기 위해 변형 또는 치환될 수 있다.
막관통 도메인은 천연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 일 양상에서 막관통 도메인은 TFP가 표적에 결합된 때마다 세포내 도메인(들)에 신호전달할 수 있다. 본 발명에서 특정 용도의 막관통 도메인은 적어도 예를 들어, T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다.
몇몇 경우에 있어서, 막관통 도메인은 TFP의 세포외 영역, 예를 들어, TFP의 항원 결합 도메인에 힌지, 예를 들어, 인간 단백질로부터 힌지를 통해 부착될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시형태에 있어서, 힌지는 인간 면역글로불린(Ig) 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지 또는 CD8a 힌지일 수 있다.
링커
선택적으로, 길이로 2 내지 10 아미노산인, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커는 막관통 도메인과 TFP의 세포질 영역 사이 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중항은 특히 적합한 링커를 제공한다. 예를 들어, 일 양상에 있어서, 링커는 GGGGSGGGGS(서열번호 53)의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(서열번호 54)의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다.
세포질 도메인
TFP의 세포질 도메인은, TFP가 CD3 감마, 델타 또는 엡실론 폴리펩타이드를 함유하면, 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있고; TCR 알파 및 TCR 베타 서브유닛은 일반적으로 신호전달 도메인이 부족하다. 세포내 신호전달 도메인은 일반적으로 TFP가 도입되어 온 면역 세포의 정상 효과기 기능의 하나 이상의 활성화를 책임진다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T-세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 형질도입하고 특화된 기능을 수행하기 위해 세포를 유도하는 단백질의 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있는 반면, 많은 사례에서 전체 쇄를 이용하는 것이 필요하지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도로, 상기 절단된 부분은 효과기 기능 신호를 형질도입하는 한 온전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 따라서 효과기 기능 신호를 형질도입하는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 의미이다.
본 발명의 TFP에서 사용을 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 참여 이후 신호 형질도입을 개시하기 위해 동시에 작용하는 T-세포 수용체(TCR) 및 공-수용체의 세포질 서열뿐만 아니라, 동일한 기능성 능력을 갖는 임의의 재조합 서열 및 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체를 포함한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호가 원상태 T-세포의 전체 활성화에 불충분하다는 것 및 2차 및/또는 공자극 신호가 요구되는 것이 공지된다. 따라서, 미경험 T-세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개 상이한 부류에 의해 매개된다고 언급될 수 있다: TCR(1차 세포내 신호전달 도메인)을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것 및 2차 및 공자극 신호(2차 세포질 도메인, 예를 들어, 공자극 도메인)을 제공하기 위해 항원-독립 방식으로 작용하는 것.
1차 신호전달 도메인은 자극식으로, 또는 저해식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)로서 공지되는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특정 용도인 1차 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d의 것을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 TFP는 CD3-엡실론의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 1차 신호전달 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어, 원상태 ITAM 도메인과 비교된 경우 변경된(예컨대, 증가된 또는 감소된) 활성을 갖는 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 최적화된 및/또는 절단된 ITAM-함유 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 1차 신호전달 도메인은 1, 2, 3, 4개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
TFP의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 신호전달 도메인 홀로 포함할 수 있고 본 발명의 TFP의 문맥에서 유용한 임의의 다른 요망된 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, TFP의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 엡실론 쇄 부분 및 공자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공자극 신호전달 도메인은 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 TFP의 부분을 지칭한다. 공자극 분자는 항원에 림프구의 효율적인 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 이의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 상기 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, DAP10, DAP12, CD30, CD40, PD1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어, CD27 상호자극은 확장, 효과기 기능, 및 시험관내 인간 TFP-T-세포의 생존을 향상시킨다고 실증되어 왔고 생체내 인간 T-세포 지속성 및 항종양 활성을 확대한다(Song et al. Blood. 2012; 119(3): 696-706).
본 발명의 TFP의 세포질 부분 이내 세포내 신호전달 서열은 랜덤 또는 지정된 순서로 서로에 연결될 수 있다. 선택적으로, 짧은 올리고- 및 폴리펩타이드 링커, 예를 들어, 2 내지 10개의 아미노산(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산) 길이는 세포내 신호전달 서열 사이 연결을 형성할 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 글리신-세린 이중항은 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 단일 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 글리신은 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에서 기재된 TFP-발현 세포는 추가로 제2 TFP, 예를 들어, 상이한 항원 결합 도메인을, 예를 들어, 동일한 표적(메소텔린) 또는 상이한 표적(예컨대, CD123)에 포함하는 제2 TFP를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, TFP-발현 세포가 2개 이상의 상이한 TFP를 포함하는 경우, 상이한 TFP의 항원 결합 도메인은 항원 결합 도메인이 서로 상호작용하지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 TFP를 발현하는 세포는 제1 TFP의 항원 결합 도메인을, 예를 들어, 단편, 예를 들어, 제2 TFP의 항원 결합 도메인과 회합되지 않는 scFv로서 가질 수 있고, 예를 들어, 제2 TFP의 항원 결합 도메인은 VHH이다.
또 다른 양상에 있어서, 본 명세서에서 기재된 TFP-발현 세포는 추가로 또 다른 제제, 예를 들어, TFP-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시형태에 있어서, 제제는 저해 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 저해 분자, 예를 들어, PD1은, 몇몇 실시형태에 있어서, 면역 효과기 반응을 탑재하기 위해 TFP-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 저해 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 저해 분자를 저해시키는 제제는 제1 폴리펩타이드, 예를 들어, 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩타이드, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 세포내 신호전달 도메인과 연관된, 저해 분자를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 제제는, 예를 들어, 저해 분자, 예컨대, PD1, LAG3, CTLA4, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4 및 TIGIT의 제1 폴리펩타이드, 또는 임의의 이들의 단편(예컨대, 임의의 이들의 적어도 일부분의 세포외 도메인), 및 본 명세서에서 기재된 세포내 신호전달 도메인(예컨대, 공자극 도메인(예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 예컨대, 4-1BB, CD27 또는 CD28) 및/또는 1차 신호전달 도메인(예컨대, 본 명세서에서 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)을 포함)인 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 제제는 PD1의 제1 폴리펩타이드 또는 이의 단편(예컨대, PD1의 적어도 일부분의 세포외 도메인), 및 본 명세서에서 기재된 세포내 신호전달 도메인(예컨대, 본 명세서에서 기재된 CD28 신호전달 도메인 및/또는 본 명세서에서 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인)의 제2 폴리펩타이드를 포함한다. PD1은 또한 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 포함하는 수용체의 CD28 계열의 억제 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T-세포 및 골수 세포에서 발현된다(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD1, PD-L1 및 PD-L2용 2개 리간드는 PD1에 결합 시 T-세포 활성화를 하향조절하는 것으로 나타났다(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간 암에서 풍부하다(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD-L1과 PD1의 국부 상호작용 억제에 의해 역전될 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 제제는 저해 분자의 세포외 도메인(ECD)을 포함하고, 예를 들어, 예정 세포사 1(Programmed Death 1: PD1)은 막관통 도메인 및 선택적으로 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, 41BB 및 CD3 제타(또한 본 명세서에서 PD1 TFP로서 지칭됨)에 융합될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, PD1 TFP는, 본 명세서에서 기재된 항-메소텔린 TFP와 조합으로 사용될 때, T-세포의 지속성을 개선시킨다. 하나의 실시형태에 있어서, TFP는 PD 1의 세포외 도메인을 포함하는 PD1 TFP이다. 대안적으로, 예정 세포사멸-리간드 1(Programmed Death-Ligand 1: PD-L1) 또는 예정 세포사멸-리간드 2(PD-L2)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예컨대, scFv를 함유하는 TFP가 제공된다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 TFP-발현 T-세포, 예를 들어, TFP-T-세포의 집단을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, TFP-발현 T-세포의 집단은 상이한 TFP를 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 하나의 실시형태에 있어서, TFP-T-세포의 집단은 본 명세서에서 기재된 항-메소텔린 결합 도메인을 갖는 TFP를 발현하는 제1 세포, 및 상이한 항-메소텔린 결합 도메인, 예를 들어, 제1 세포에 의해 발현된 TFP에서 항-메소텔린 결합 도메인과는 상이한 본 명세서에서 기재된 항-메소텔린 결합 도메인을 갖는 TFP를 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, TFP-발현 세포의 집단은, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 항-메소텔린 결합 도메인을 포함하는 TFP를 발현하는 제1 세포, 및 메소텔린 이외의 표적(예컨대, 또 다른 종양-연관 항원)에 항원 결합 도메인을 포함하는 TFP를 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 세포의 집단을 제공하고 여기서 집단에서 하나 이상의 세포가 본 명세서에서 기재된 항-메소텔린 도메인을 갖는 TFP를 발현하고, 제2 세포가 또 다른 제제, 예를 들어, TFP-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제를 발현한다. 예를 들어, 하나의 실시형태에 있어서, 제제는 저해 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 저해 분자는, 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 면역 효과기 반응을 탑재하기 위해 TFP-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 저해 분자의 예는 PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 저해 분자를 억제시키는 제제는 세포에 양성 신호를 제공하는 제2 폴리펩타이드, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 세포내 신호전달 도메인과 연관된, 제1 폴리펩타이드, 예를 들어, 저해 분자를 포함한다.
TFP를 암호화하는 시험관내 전사된 RNA의 생산 방법이 본 명세서에서 개시된다. 본 발명은 또한 세포에 직접적으로 형질감염될 수 있는 TFP 암호화 RNA 작제물을 포함한다. 형질감염에서 사용을 위한 mRNA의 생성 방법은, 3' 및 5' 미번역 서열("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 유입 부위(IRES), 발현되는 핵산, 및 전형적으로 50 내지 2000개 염기 길이의 폴리A 꼬리를 함유하는 작제물을 생산하기 위해, 특별히 설계된 프라이머를 가진 주형의 시험관내 전사(IVT), 그 다음 폴리A 부가를 포함할 수 있다. 상기 생산된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 일 양상에 있어서, 주형은 TFP용 서열을 포함한다.
일 양상에서 항-메소텔린 TFP는 메신저 RNA(mRNA)에 의해 암호화된다. 일 양상에서 항-메소텔린 TFP를 암호화하는 mRNA는 TFP-T-세포의 생산을 위하여 T-세포에 도입된다. 하나의 실시형태에 있어서, 시험관내 전사된 RNA TFP는 일시적 형질감염의 형태로서 세포에 도입될 수 있다. RNA는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)-생성된 주형을 이용하여 시험관내 전사에 의해 생산된다. 임의의 공급원으로부터 관심 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 이용하는 시험관내 mRNA 합성을 위하여 주형에서 PCR에 의해 직접적으로 전환될 수 있다. DNA의 공급원은, 예를 들어, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적절한 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위하여 요망된 주형은 본 발명의 TFP이다. 하나의 실시형태에 있어서, PCR에 사용되는 DNA는 열린 해독틀을 함유한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터 천연 발생 DNA 서열 유래일 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 핵산은 일부 또는 모든 5' 및/또는 3' 미번역 영역(UTR)을 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, PCR에 사용되는 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또 다른 실시형태에 있어서, PCR에 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 핵산 서열이다. DNA는 대안적으로 천연 발생 유기체에서 정상적으로 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 암호화하는 열린 해독틀을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자의 부분을 함유하는 것이다. 함께 결찰되는 DNA의 부분은 단일 유기체 또는 1개 초과 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR은 형질감염에 사용되는 mRNA의 시험관내 전사용 주형을 생성하는데 사용된다. PCR 수행 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. PCR에서 사용을 위한 프라이머는 PCR용 주형으로서 사용되는 DNA의 영역에 실질적으로 상보성인 영역을 갖도록 설계된다. "실질적으로 상보성"은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 프라이머 서열에서 다수 또는 모든 염기가 상보성이거나, 하나 이상의 염기가 비-상보성이거나, 불일치되는 뉴클레오타이드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보성 서열은 PCR에 사용된 어닐링 조건 하에 의도된 DNA 표적으로 어닐링 또는 하이브리드화할 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보성이도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는, 5' 및 3' UTR을 포함하는, 세포 (열린 해독틀)에서 정상적으로 전사되는 핵산의 부분을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 관심 대상 특정한 도메인을 암호화하는 핵산의 부분을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 프라이머는, 5' 및 3' UTR의 모두 또는 부분을 포함한, 인간 cDNA의 암호화 영역을 증폭시키도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 기술에 공지되어 있는 합성 방법에 의해 생성될 수 있다. "순방향 프라이머"는 증폭되는 DNA 서열의 업스트림인 DNA 주형에서 뉴클레오타이드에 실질적으로 상보성인 뉴클레오타이드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "업스트림"은 암호화 가닥에 비하여 증폭되는 DNA 서열에 대해 위치 5를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭되는 DNA 서열의 다운스트림인 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보성인 뉴클레오타이드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "다운스트림"은 암호화 가닥에 비하여 증폭되는 DNA 서열의 위치 3'에 대해 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 폴리머라제는 본 명세서에서 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 시약 및 폴리머라제는 수많은 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하다.
안정성 및/또는 번역 효율을 촉진시키기 위한 능력을 가진 화학 구조가 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 하나의 실시형태에 있어서, 5' UTR은 1 내지 3,000개 뉴클레오타이드 길이이다. 암호화 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이는, UTR의 상이한 영역에 어닐링되는 PCR용 프라이머 설계를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌, 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 상기 접근법을 이용하여, 당업자라면 전사된 RNA의 형질감염 이후 최적의 번역 효율을 달성하기 위해 요구된 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR는 관심 핵산용 천연 발생, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열은 순방향 및 역방향 프라이머에 UTR 서열의 편입에 의해 또는 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가될 수 있다. 관심 핵산에 내인성이 아닌 UTR 서열의 이용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율 변형에 유용할 수 있다. 예를 들어, 3'UTR 서열내 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있다는 것이 공지된다. 따라서, 3' UTR은 당해 기술에 공지되어 있는 UTR의 특성에 기반하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택 또는 설계될 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 5' UTR은 내인성 핵산의 코자크(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 관심 핵산에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기에 기재된 바와 같이 PCR에 의해 부가되고 있는 경우, 공통 코자크 서열은 5' UTR 서열의 부가에 의해 재설계될 수 있다. 코자크 서열은 일부 RNA 전사체의 번역의 효율을 증가시킬 수 있지만, 모든 RNA가 효율적인 번역이 가능하도록 요구되는 것처럼 보이지 않는다. 많은 mRNA용 코자크 서열에 대한 요건은 당해 기술에서 공지되어 있다. 다른 실시형태에 있어서 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 RNA 바이러스의 5'UTR일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서 다양한 뉴클레오타이드 유사체는 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 지연시키기 위해 3' 또는 5' UTR에서 사용될 수 있다.
유전자 클로닝에 대하여 필요성 없이 DNA 주형로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해, 전사의 프로모터는 전사되는 서열의 DNA 주형 업스트림에 부착되어야 한다. RNA 폴리머라제용 프로모터로서 기능하는 서열이 순방향 프라이머의 5' 말단에 부가되는 경우, RNA 폴리머라제 프로모터는 전사되는 열린 해독틀의 PCR 생성물 업스트림에 편입된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 본 명세서에서 다른 곳에 기재된 바와 같이 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. T7, T3 및 SP6 프로모터용 공통 뉴클레오타이드 서열은 당해 기술에 공지되어 있다.
하나의 바람직한 실시형태에서, mRNA는 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포에서 안정성 mRNA를 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 꼬리에서 캡을 모두 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어, 플라스미드 DNA에서, RNA 폴리머라제는 진핵 세포내 발현에 적합하지 않은 긴 연쇄체 생성물을 생성한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 이후 폴리아데닐화될지라도 진핵 형질감염에서 효과적이지 않은 정상 크기의 mRNA를 초래한다.
선형 DNA 주형 상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 주형의 마지막 염기를 넘어 전사체의 3' 말단을 확장시킬 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13: 6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003)).
DNA 주형에 폴리A/T 스트레치의 통합의 종래 방법은 분자 클로닝이다. 그러나 플라스미드 DNA 속에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정을 유발시킬 수 있고, 이는 박테리아 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 결실 및 다른 이상으로 종종 고도로 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 절차를 힘들고 시간이 걸리게 할 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 만든다. 그렇기 때문에 클로닝 없이 폴리A/T 3' 스트레치로 DNA 주형의 작제를 허용하는 방법이 아주 바람직하다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 세그먼트는 폴리T 꼬리, 예컨대, 100 T 꼬리(크기는 50 내지 5000 T일 수 있음)를 함유하는 역 프라이머 이용에 의한 PCR 동안, 또는 DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌, 임의의 다른 방법에 의한 PCR 이후 생산될 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하고 그의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양성으로 상관관계를 갖는다. 하나의 실시형태에 있어서, 폴리(A) 꼬리는 100 내지 5000개 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 폴리(A) 폴리머라제, 예컨대, E. 콜리 폴리A 폴리머라제(E-PAP)의 이용과 함께 시험관내 전사 이후 추가로 확장될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 100개 뉴클레오타이드에서 300 내지 400개 뉴클레오타이드까지 폴리(A) 꼬리의 길이 증가는 RNA의 번역 효율에서 약 2-배수 증가를 초래한다. 추가로, 3' 말단에 상이한 화학기의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기 부착은 변형된/인공 뉴클레오타이드, 압타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 폴리머라제를 이용하여 폴리(A) 꼬리에 편입될 수 있다. ATP 유사체는 추가로 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다.
5' 캡스 온(caps on)은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당해 기술에서 공지된 그리고 본 명세서에서 기재된 기술을 이용하여 제공된다(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7: 1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본 명세서에서 개시된 방법에 의해 생산된 RNA는 또한 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 서열을 함유할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 캡-독립적인 리보솜을 개시하고 번역의 개시를 용이하게 하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 세포 투과도 및 생존력을 촉진시키는 인자, 예컨대, 당, 펩타이드, 지질, 단백질, 산화방지제 및 계면활성제를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질은 포함될 수 있다.
RNA는 임의의 수의 상이한 방법, 예를 들어, 전기천공(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, 독일 쾰른 소재)), (ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, 매사추세츠주 보스톤 소재) 또는 유전자 Pulser II(BioRad, 콜로라도주 덴버 소재), Multiporator(Eppendort, 독일 함부르크 소재), 리포펙션을 이용한 양이온성 리포좀 매개된 형질감염, 폴리머 캡슐화, 펩타이드 매개된 형질감염, 및 바이오리스틱 입자 전달 시스템, 예컨대, "유전자 총"(예컨대, 문헌[Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 상업적으로 입수 가능한 방법을 이용하여 표적 세포에 도입될 수 있다.
TFP를 암호화하는 핵산 작제물
본 발명은 또한 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 TFP 작제물을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일 양상에 있어서, 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 일 양상에 있어서, 핵산 분자는 DNA 작제물로서 제공된다.
요망된 분자용 핵산 서열 암호화는 당해 기술에서 공지된 재조합 방법을 이용하여, 예컨대, 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리의 선별에 의해, 동일한 것을 포함하도록 공지된 벡터로부터 유전자의 유래에 의해, 또는 표준 기술을 이용하여, 동일한 것을 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접적으로 단리에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 대상 유전자는 클로닝보다는 합성으로 생산될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA가 삽입되는 벡터를 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 이들이 이식유전자의 장기간, 안정적인 통합 및 딸 세포에서 그의 번식을 허용하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하기 위해 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 이들이 비-증식 세포, 예컨대, 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 온코(onco)-레트로바이러스, 예컨대, 쥣과 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 대하여 부가된 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 부가된 이점을 갖는다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 요망된 TFP를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 아데노바이러스 벡터(A5/35)이다. 또 다른 실시형태에 있어서, TFP를 암호화하는 핵산의 발현은 트랜스포존, 예컨대, 슬리핑 뷰티(sleeping beauty), 크리스퍼(crisper), CAS9, 및 아연 핑거 뉴클레아제의 이용으로 달성될 수 있다(참고로 본 명세서에 편입되는 문헌[June et al. 2009 Nature Reviews Immunol. 9.10: 704-716] 참조).
본 발명의 발현 작제물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 이용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당해 기술에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466 참조, 이들의 전체가 본 명세서에서 참고로 편입됨). 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 수많은 유형의 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은, 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 벡터에 클로닝될 수 있다. 특정한 관심의 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열분석 벡터를 포함한다.
추가로, 발현 벡터는 바이러스성 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스성 벡터 기술은 당해 기술에서 잘 알려지고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY] 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, 적합한 벡터는 하나 이상의 유기체, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별 마커에서 기능성인 복제의 기원을 함유한다(예컨대, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
수많은 바이러스성 기반 시스템이 포유동물 세포에 유전자 전달을 위하여 개발되어 왔다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템에 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터에 삽입될 수 있고 당해 기술에서 공지된 기술을 이용하여 레트로바이러스 입자에서 포장될 수 있다. 재조합 바이러스는 그 다음 단리될 수 있고 생체내 또는 생체외 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 수많은 레트로바이러스 시스템은 당해 기술에 공지되어 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 수많은 아데노바이러스 벡터는 당해 기술에 공지되어 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어, 인핸서가 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 수많은 프로모터가 또한 개시 부위의 다운스트림으로 기능성 요소를 함유하는 것으로 나타나고 있어도, 이들은 개시 부위의 업스트림으로 영역 30 내지 110 bp에서 위치한다. 프로모터 요소 사이 간격이 빈번하게 가요성이어서, 요소가 역전되고 서로에 대해 이동되는 경우 프로모터 기능은 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이 간격은 활성이 쇠퇴하기 시작하기 전에 별도로 50 bp까지 증가될 수 있다. 프로모터에 의존하여, 개별적인 요소가 전사를 활성화하기 위해 협력하여 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것처럼 보인다.
포유동물 T-세포에서 TFP 이식유전자를 발현할 수 있는 프로모터의 예는 EF1a 프로모터이다. 원상태 EF1a 프로모터는, 리보솜에 아미노아실 tRNA의 효소 전달을 담당하는, 연신 인자-1 복합체의 알파 서브유닛의 발현을 구동한다. EF1a 프로모터는 포유동물 발현 플라스미드에서 광범위하게 사용되고 있고 렌티바이러스 벡터에 클로닝된 이식유전자로부터 TFP 발현 구동에 효과적인 것으로 나타나고 있다(예컨대, 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조). 프로모터의 또 다른 예는 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 상기 프로모터 서열은 거기에 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현의 높은 수준을 구동할 수 있는 강한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 비제한적으로 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡슈타인-바르 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 연신 인자-1a 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌, 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 항시성 프로모터의 이용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 이용은 상기 발현이 요망되는 경우 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 개시, 또는 발현이 요망되지 않는 경우 발현을 중지시킬 수 있는 분자를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는, 비제한적으로 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린-조절된 프로모터를 포함한다.
TFP 폴리펩타이드 또는 이의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포에 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스성 벡터를 통해 형질감염되거나 감염되는 것을 추구한 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위해 선별 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 다른 양상에 있어서, 선별 가능한 마커는 DNA의 별개의 조각에서 계속될 수 있고 공-형질감염 절차에서 사용될 수 있다. 선별 가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두는 숙주 세포에서 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열과 측접될 수 있다. 유용한 선별 가능한 마커는, 예를 들어, 항생제-저항 유전자, 예컨대, 네오(neo) 기타 등등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포의 확인 및 조절 서열의 작용성 평가에 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수령체 유기체 또는 조직에서 존재하지 않고 상기에 의해 발현되지 않는 그리고 발현이 일부 쉽게 검출 가능한 특성, 예를 들어, 효소 활성에 의해 명시되는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수령체 세포에 도입되어 온 이후 적합한 시간에서 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로르암페니콜 아세틸 전달효소, 분비된 알칼리성 포스파타제를 암호화하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다(예컨대, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려지고 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있고 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 발현의 최고 수준을 보여주는 최소 5' 측접하는 영역을 가진 작제물은 프로모터로서 확인된다. 상기 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고 프로모터-유도된 전사를 조정하는 능력에 대하여 제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
세포에 유전자 도입 및 발현 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 발현 벡터의 문맥에서, 벡터는 당해 기술에서 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포에 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포에 이동될 수 있다.
숙주 세포에 폴리뉴클레오타이드 도입을 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격, 미세주입, 전기천공, 기타 등등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포의 생산 방법은 당해 기술에서 공지된다. (예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY] 참조). 숙주 세포에 폴리뉴클레오타이드의 바람직한 도입 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
숙주 세포에 관심 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 도입 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 이용을 포함한다. 바이러스성 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어, 인간 세포에 유전자의 가장 널리 사용된 삽입 방법이 되어 왔다. 다른 바이러스성 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련된 바이러스, 기타 등등으로부터 유래될 수 있다(예컨대, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362 참조).
숙주 세포에 폴리뉴클레오타이드의 화학적 도입 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구형체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 교질입자, 혼합된 교질입자 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용을 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포좀(예컨대, 인공 막 소포)이다. 핵산의 최신 기술 표적화된 전달의 다른 방법, 예컨대, 표적화된 나노입자 또는 다른 적합한 서브마이크론 크기의 전달 시스템으로 폴리뉴클레오타이드의 전달이 이용가능하다.
비-바이러스성 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 이용은 숙주 세포에 (시험관내, 생체외 또는 생체내) 핵산의 도입을 위하여 고려된다. 또 다른 양상에 있어서, 핵산은 지질과 연관될 수 있다. 지질과 연관된 핵산은 리포좀의 수성 내부에서 캡슐화될 수 있거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재될 수 있거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오타이드 둘 모두와 연관되는 연결 분자를 통해 리포좀에 부착될 수 있거나, 리포좀에서 포획될 수 있거나, 리포좀과 복합될 수 있거나, 지질을 함유한 용액에서 분산될 수 있거나, 지질과 혼합될 수 있거나, 지질과 조합될 수 있거나, 지질에서 현탁액으로서 함유될 수 있거나, 교질입자와 함유 또는 복합될 수 있거나, 달리 지질과 연관될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련된 조성물은 용액 내 임의의 특정한 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조에서, 교질입자로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집물을 형성하는, 용액에서 단순히 산재될 수 있다. 지질은 천연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 천연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체, 예컨대, 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 포함하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 다이미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma(미주리주 세인트루이스 소재)로부터 얻을 수 있고; 다이세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(뉴욕주 플레인뷰 소재)로부터 얻을 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 얻을 수 있고; 다이미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(앨라배마주 버밍햄 소재)로부터 얻을 수 있다. 클로로폼 또는 클로로폼/메탄올내 지질의 모액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로폼은 메탄올보다 더욱 쉽게 증발되기 때문에 용매로서만 사용된다. "리포좀"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집물의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포함하는 일반 용어이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 가진 소포성 구조를 갖는 것으로서 특성규명될 수 있다. 다중층 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은 인지질이 과잉의 수용액에서 현탁되는 경우 자발적으로 형성한다. 지질 성분은 폐쇄된 구조의 형성 이전 자기-재배열을 경험하고 지질 이중층 사이 물 및 용해된 용질을 포집한다(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상 소포성 구조보다 용액에서 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 지질은 교질입자 구조를 지닐 수 있거나 단지 지질 분자의 비균일 응집물로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.
숙주 세포에 외인성 핵산을 도입하는데 또는 달리 본 발명의 억제제에 세포를 노출시키는데 사용된 방법과 무관하게, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 상기 검정은, 예를 들어, 당업자에 잘 알려진 "분자 생물학적" 검정, 예컨대, 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예컨대, 예를 들어, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의한 또는 본 발명의 범위 내에 해당하는 제제를 확인하기 위해 본 명세서에서 기재된 검정에 의한 특정한 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
본 발명은 TFP 암호화 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다. 일 양상에 있어서, TFP 벡터는 세포, 예를 들어, T-세포에 직접적으로 형질도입될 수 있다. 일 양상에 있어서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 플라스미드(예컨대, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 미니서클, 미니벡터, 이중 미세 염색체)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 벡터, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물이다. 일 양상에 있어서, 벡터는 포유동물 T-세포에서 TFP 작제물을 발현할 수 있다. 일 양상에 있어서, 포유동물 T-세포는 인간 T-세포이다.
T-세포의 공급원
확장 및 유전적 변형에 앞서, T-세포의 공급원은 대상체로부터 수득된다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체(예컨대, 포유동물)을 포함하도록 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그들의 트랜스제닉 종을 포함한다. T-세포는, 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 가슴샘 조직, 감염, 복수, 늑막 삼출의 부위로부터 조직, 비장 조직, 및 종양을 포함하는, 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 양상에 있어서, 당해 기술에서 이용가능한 임의의 수의 T-세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 양상에 있어서, T-세포는 당업자에 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대, 피콜(Ficoll) TM 분리를 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 유닛으로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 양상에 있어서, 개체의 순환 혈액으로부터 세포는 분리반출법에 의해 수득된다. 분리반출법 생성물은 전형적으로 T-세포를 포함한, 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵의 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 일 양상에 있어서, 분리반출법에 의해 수집된 세포는 혈장 분획을 제거하기 위해 그리고 차후의 처리 단계를 위하여 적절한 완충액 또는 배지에서 세포를 배치하기 위해 세척될 수 있다. 본 발명의 일 양상에 있어서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 하나의 대안적인 양상에 있어서, 세척액은 칼슘이 부족하고 마그네슘이 부족할 수 있거나 모두 2가 양이온이 아니면 많이 부족할 수 있다. 칼슘의 부재하에 초기 활성화 단계는 확대된 활성화로 이어질 수 있다. 당업자가 쉽게 인지할 바와 같이 세척 단계는 당해 기술의 당업자에 공지된 방법, 예컨대, 제조사의 지침에 따라서 세미-자동화 "통과액" 원심분리기(예컨대, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 이용함으로써 달성될 수 있다. 세척 이후, 세포는 완충액과 무관하게 다양한 생체적합성 완충액, 예컨대, 예를 들어, Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 다른 염수 용액에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 분리반출법 샘플의 바람직하지 않은 성분은 제거될 수 있고 세포는 직접적으로 배양 배지에 재현탁될 수 있다.
일 양상에 있어서, T-세포는, 예를 들어, PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리에 의한 또는 역류 원심 세정에 의한, 적혈구의 용해 및 단핵구의 고갈에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T-세포의 특이적 하위집단, 예컨대, CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T-세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일 양상에 있어서, T-세포는 항-CD3/항-CD28(예컨대, 3x28)-접합된 비드, 예컨대, DYNABEADSTM M-450 CD3/CD28 T와 목적하는 T-세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항온처리에 의해 단리된다. 일 양상에 있어서, 기간은 약 30분이다. 하나의 추가의 양상에 있어서, 기간은 30분 내지 36시간 이상 및 그 사이에 있는 모든 정수값 범위이다. 하나의 추가의 양상에 있어서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 더욱 또 다른 바람직한 양상에 있어서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일 양상에 있어서, 항온처리 기간은 24시간이다. 더 긴 항온처리 시간은 다른 세포 유형에 비교된 경우 소수의 T-세포가 있는 임의의 상황에서 T-세포를 단리시키는데 사용될 수 있고, 종양 조직으로부터 또는 면역저하된 개체로부터 종양 침투 림프구(TIL) 단리에서도 그러하다. 추가로, 더 긴 항온처리 시간의 이용은 CD8+ T-세포의 포착 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 시간의 단순 단축 및 연장으로 T-세포는 CD3/CD28 비드에 결합하게 하였고/하였거나 (본 명세서에서 추가로 기재된 바와 같이), 비드 대 T-세포의 비의 증가 또는 감소에 의해, T-세포의 하위집단은 진행 동안 배양 개시 또는 다른 시점에서 향배에 ?라 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면에서 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비 증가 또는 감소에 의해, T-세포의 하위집단은 배양 개시 또는 다른 요망된 시점에서 향배에 우선적으로 선택될 수 있다. 당업자라면 다중 라운드의 선택이 또한 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 특정 양상에 있어서, 선택 절차를 수행하는 것 및 활성화 및 확장 과정에서 "미선택된" 세포를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. "미선택된" 세포는 또한 추가 라운드의 선택에 적용될 수 있다.
음성 선택에 의한 T-세포 집단의 농축은 음성으로 선택된 세포에 독특한 표면 마커에 관한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성으로 선택된 세포상에 존재한 세포 표면 마커에 관한 단클론성 항체의 칵테일을 이용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포분석(flow cytometry)을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의한 CD4+ 세포를 농축하기 위해, 단클론성 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 양상에 있어서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T-세포를 농축하거나 양성으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 특정 양상에 있어서, T 조절 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 감손된다.
하나의 실시형태에 있어서, 하나 이상의 IFN-γ, TNF-알파, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임 B, 및 퍼포린, 또는 다른 적절한 분자, 예를 들어, 다른 사이토카인을 발현하는 T-세포 집단이 선택될 수 있다. 세포 발현을 위한 선별 방법은, 예를 들어, PCT 공개 번호: WO 2013/126712에 기재된 방법에 의해 결정될 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의한 세포의 목적하는 집단의 단리를 위하여, 세포의 농도 및 표면(예컨대, 입자, 예컨대, 비드)은 다양할 수 있다. 특정 양상에 있어서, 비드 및 세포가 세포 및 비드의 최대 접촉을 확보하기 위해 함께 혼합되는 용적을 상당히 감소(예컨대, 세포의 농도를 증가)시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일 양상에 있어서, 20억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 일 양상에 있어서, 10억개 세포/㎖의 농도가 사용된다. 하나의 추가의 양상에 있어서, 1억개 초과 세포/㎖가 사용된다. 하나의 추가의 양상에 있어서, 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만, 또는 5천만개 세포/㎖의 세포의 농도가 사용된다. 또한 일 양상에 있어서, 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만, 또는 1억개 세포/㎖의 세포의 농도가 사용된다. 추가의 양상에 있어서, 1억2천5백만 또는 1억5천만개 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 고 농도 이용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 초래할 수 있다. 추가로, 고 세포 농도의 이용은 관심 표적 항원, 예컨대, CD28-음성 T-세포를, 또는 존재한 많은 종양 세포가 있는 샘플(예컨대, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)로부터 약하게 발현할 수 있는 세포의 더욱 효율적인 포착을 허용한다. 상기 세포의 집단은 치료 가치를 가질 수 있고 수득하기에 바람직할 것이다. 예를 들어, 세포의 고 농도 이용은 정상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T-세포의 더욱 효율적인 선택을 허용한다.
관련된 양상에 있어서, 세포의 더 낮은 농도를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. T-세포 및 표면(예컨대, 입자, 예컨대, 비드)의 혼합물의 상당한 희석으로, 입자와 세포 사이 상호작용은 최소화된다. 이는 입자에 결합되는 다량의 요망된 항원을 발현하는 세포를 위하여 선택한다. 예를 들어, CD4+ T-세포는 CD28의 더 높은 수준을 발현하고 희석 농도에서 CD8+ T-세포보다 더욱 효율적으로 포착된다. 일 양상에 있어서, 사용된 세포의 농도는 5x106/㎖이다. 다른 양상에 있어서, 사용된 농도는 약 1x105/㎖ 내지 1x106/㎖, 및 그 사이의 임의의 정수값일 수 있다. 다른 양상에 있어서, 세포는 2 내지 10℃에서 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간의 길이 동안 회전자에서 항온처리될 수 있다.
자극용 T-세포는 또한 세척 단계 이후 냉동될 수 있다. 이론에 의해 구속됨의 바람 없이, 냉동 및 차후의 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도까지 단핵구를 제거함으로써 더욱 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 이후, 세포는 냉동 용액에서 현탁될 수 있다. 많은 냉동 용액 및 파라미터가 당해 기술에 공지되어 있고 상기 맥락에서 유용할 반면, 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 및 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 함유하는 다른 적합한 세포 냉동 배지의 이용을 포함하고, 세포는 그 다음 분당 1의 속도로 -80℃로 냉동되고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에서 저장된다. 제어된 냉동의 다른 방법뿐만 아니라 -20℃에서 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않는 냉동이 이용될 수 있다. 특정 양상에 있어서, 동결보존된 세포는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 해동되고 세척되고 본 발명의 방법을 이용한 활성화에 앞서 실온에서 1시간 동안 둔다.
또한 본 발명의 문맥에서 본 명세서에서 기재된 바와 같이 확장된 세포가 필요할 경우에 앞서 일정 기간에서 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출법 생성물의 수집이 고려된다. 이와 같이, 확장되는 세포의 공급원은 필요한 임의의 시점에서 수집될 수 있고, 목적하는 세포, 예컨대, T-세포는 T-세포 요법, 예컨대, 본 명세서에서 기재된 것으로부터 유익할 임의의 수의 질환 또는 병태를 위한 T-세포 요법에서 나중 사용을 위하여 단리 및 냉동될 수 있다. 일 양상에서 혈액 샘플 또는 분리반출법은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채집된다. 특정 양상에 있어서, 혈액 샘플 또는 분리반출법은 질환 발생의 위험이 있지만, 아직 질환을 발생하지 않은 일반적으로 건강한 대상체로부터 채집되고, 관심 세포는 나중 사용을 위하여 단리 및 냉동된다. 특정 양상에 있어서, T-세포는 확장될 수 있고, 냉동될 수 있고, 나중 시간에 사용될 수 있다. 특정 양상에 있어서, 샘플은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 특정한 질환의 진단 직후 그러나 임의의 치료에 앞서 환자로부터 수집된다. 하나의 추가의 양상에 있어서, 세포는 제제, 예컨대, 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제성 제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제 제제, 예컨대, 알렘투주맙, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 조사에 의한 치료를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, 임의의 수의 관련된 치료 양식에 앞서 대상체로부터 혈액 샘플 또는 분리반출법으로 단리된다.
본 발명의 하나의 추가의 양상에 있어서, T-세포는 기능성 T-세포를 가진 대상체를 이탈하는 치료 이후 직접적으로 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 하기 특정 암 치료, 특히 면역 시스템을 손상시키는 약물로 치료 이후, 환자가 그 치료로부터 정상적으로 회복되고 있는 경우의 기간 동안 치료 직후, 수득된 T-세포의 품질이 최적일 수 있거나 생체외 확장하는 그의 능력에 대하여 개선될 수 있다는 것이 관측되고 있다. 마찬가지로, 본 명세서에서 기재된 방법을 이용한 생체외 조작 이후, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 확장에 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 상기 회복기 동안, T-세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는, 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 문맥 내에 고려된다. 추가로, 특정 양상에 있어서, 동원(mobilization)(예컨대, GM-CSF로 동원) 및 컨디셔닝 요법은 대상체에서 병태를 창출하는데 사용될 수 있고 여기서 특정한 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생, 및/또는 확장은, 특히 시간을 따르는 요법의 한정된 윈도우 동안 양호하다. 예시적인 세포 유형은 T-세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역 시스템의 다른 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
T-세포는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041 및 7,572,631에 기재된 바와 같은 방법을 일반적으로 이용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T-세포는 CD3/TCR 복합체 관련된 신호를 자극하는 제제 및 T-세포의 표면에서 공자극 분자를 자극하는 리간드를 거기에 부착된 표면과 접촉시킴으로써 확장될 수 있다. 특히, T-세포 집단은 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 예컨대, 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면에서 고정된 항-CD2 항체와 접촉시킴으로써, 또는 칼슘 아이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성제(예컨대, 브리오스타틴)와 접촉시킴으로써 자극될 수 있다. T-세포의 표면에서 부속 분자의 공-자극에 대하여, 부속 분자를 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T-세포의 집단은 T-세포의 증식 자극에 적절한 조건하에, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T-세포 또는 CD8+ T-세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 당해 기술에서 통상적으로 공지된 다른 방법이 할 수 있는 것처럼 사용될 수 있는 9.3, B-T3, XR-CD28(Diaclone, 프랑스 브장송 소재)을 포함한다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
다양한 자극 시간에 노출되고 있는 T-세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 분리반출된 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제제 T-세포 집단(TC, CD8+) 초과인 헬퍼 T-세포 집단(TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체 자극에 의한 T-세포의 생체외 확장은 약 8 내지 9일에 앞서 두드러지게 TH 세포로 구성되는 T-세포의 집단을 생산하고, 반면에, 약 8 내지 9일 후, T-세포의 집단은 TC 세포의 점점 더 큰 집단을 포함한다. 따라서, 치료의 목적에 의존하여, 두드러지게 TH 세포를 포함하는 T-세포 집단으로 대상체 주입은 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브셋이 단리되고 있으면 상기 서브셋을 더 큰 정도로 확장되는 것이 유익할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커에 더하여, 다른 표현형 마커는 상당히, 그러나 큰 부분에서, 세포 확장 과정 도중에 재생 가능하게 다양하다. 따라서, 상기 재현성은 특별한 목적으로 활성화된 T-세포 생성물을 조정하는 능력을 가능하게 한다.
일단 항-메소텔린 TFP가 작제되면, 다양한 검정은 분자의 활성, 예컨대, 비제한적으로, 항원 자극 이후 T-세포를 확장시키는 능력, 재-자극의 부재 하에 T-세포 확장 유지, 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서 항-암 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 항-메소텔린 TFP의 효과를 평가하는 검정은 이하에 더욱 상세히 기재된다.
1차 T-세포내 TFP 발현의 웨스턴 블롯 분석은 모노머 및 다이머의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다(예컨대, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]). 매우 간단히, TFP를 발현하는 T-세포(CD4+ 및 CD8+ T-세포의 1: 1 혼합물)는 10일 초과 동안 시험관내 확장되고 그 다음 용해 및 환원 조건하에 SDS-PAGE 적용된다. TFP는 TCR 쇄에 항체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다. 동일한 T-세포 서브셋은 공유 다이머 형성의 평가를 허용하는 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE 분석에 사용된다.
항원 자극 이후 TFP+ T-세포의 시험관내 확장은 유세포분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T-세포의 혼합물은 알파CD3/알파CD28 및 APC로 자극되고 그 다음 분석되는 프로모터의 제어하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된다. 예시적인 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1알파, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제(PGK) 프로모터를 포함한다. GFP 형광은 유세포분석에 의해 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포 서브셋에서 배양의 6일째에 평가된다(예컨대, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조). 대안적으로, CD4+ 및 CD8+ T-세포의 혼합물은 0일째에 알파CD3/알파CD28 코팅된 자기 비드로 자극되고, 2A 리보솜 스키핑 서열을 이용하여 eGFP와 함께 TFP를 발현하는 비시스트론성 렌티바이러스 벡터를 이용하여 1일째에 TFP로 형질도입된다. 배양액은 세척 이후 항CD3 및 항-CD28 항체(K562-BBL-3/28)의 존재 하에 hCD32 및 4-1BBL을 발현하는 메소텔린+ K562 세포(K562-메소텔린), 야생형 K562 세포(K562 야생형) 또는 K562 세포로 재-자극된다. 외인성 IL-2는 100 IU/㎖로 격일로 배양액에 첨가된다. GFP+ T-세포는 비드-기반 계수를 이용한 유세포분석에 의해 열거된다(예컨대, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조).
재-자극의 부재하에 지속된 TFP+ T-세포 확장은 또한 측정될 수 있다(예컨대, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조). 간단히, 평균 T-세포 용적(fl)은 0일째에 알파CD3/알파CD28 코팅된 자기 비드로 자극, 및 1일째에 표시된 TFP로 형질도입 이후 Coulter Multisizer III 입자 카운터를 이용하여 배양의 8일째에 측정된다.
동물 모델은 또한 TFP-T 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 암을 치료하기 위해 인간 메소텔린-특이적 TFP+ T-세포를 이용하는 이종이식 모델이 사용될 수 있다(예컨대, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조). 매우 간단히, 암의 확립 이후, 마우스는 처리 그룹에 관하여 무작위화된다. 상이한 수의 조작된 T-세포는 암을 보유하는 NOD/SCID/γ-/- 마우스에게 1:1 비로 공주사된다. 마우스로부터 비장 DNA내 각각의 벡터의 카피 수는 T-세포 주사 이후 다양한 시점에서 평가된다. 동물은 매주 간격으로 백혈병에 대하여 평가된다. 말초 혈액 메소텔린+ 암세포 계수치는 알파메소텔린-제타 TFP+ T-세포 또는 모의-형질도입된 T-세포로 주사되는 마우스에서 측정된다. 그룹에 대한 생존 곡선은 로그-순위 시험을 이용하여 비교된다. 게다가, NOD/SCID/γ-/- 마우스내 T-세포 주사 4주 이후 절대적인 말초 혈액 CD4+ 및 CD8+ T-세포 계수치는 또한 분석될 수 있다. 마우스는 암세포로 주사되고 3주 후에 eGFP에 연결된 TFP를 암호화하는 비시스트론성 렌티바이러스 벡터에 의해 TFP를 발현하도록 조작된 T-세포로 주사된다. T-세포는 주사에 앞서 모의-형질도입된 세포와 혼합에 의해 45 내지 50% 투입 GFP+ T-세포로 정규화되고, 유세포분석에 의해 확인된다. 동물은 1-주 간격으로 암에 대하여 평가된다. TFP+ T-세포 그룹에 대하여 생존 곡선은 로그-순위 시험을 이용하여 비교된다.
용량 의존적 TFP 치료 반응은 평가될 수 있다(예컨대, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조). 예를 들어, 말초 혈액은 21일째에 TFP T-세포, 동일한 수의 모의-형질도입된 T-세포, 또는 무 T-세포로 주사된 마우스내 백혈병 확립 35 내지 70일 이후 수득된다. 각각의 그룹으로부터 마우스는 말초 혈액 메소텔린+ 암세포 계수치의 결정을 위하여 무작위로 채혈되고 그 다음 35 및 49일째에 사망한다. 나머지 동물은 일 57 및 70일째에 평가된다.
세포 증식 및 사이토카인 생산의 평가는, 예를 들어, 문헌[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]에 이전에 기재되어 있다. 간단히, TFP-매개된 증식의 평가는 2:1의 최종 T-세포:메소텔린 발현 세포비에 대해서 메소텔린 또는 CD32 및 CD137(KT32-BBL)을 발현하는 세포와 세척된 T-세포의 혼합에 의해 미세적정 플레이트에서 수행된다. 메소텔린 세포를 발현하는 세포는 사용에 앞서 감마-방사선으로 조사된다. 항-CD3(클론 OKT3) 및 항-CD28(클론 9.3) 단클론성 항체는 이들 신호가 생체외 장기간 CD8+ T-세포 확장을 지지하기 때문에 T-세포 증식 자극에 대하여 양성 대조군으로서 작용하기 위해 KT32-BBL 세포를 가진 배양액에 부가된다. T-세포는 제조사에 의해 기재된 CountBrightTM 형광 비드(Invitrogen) 및 유세포분석을 이용하여 배양액에서 늘어놓는다. TFP+ T-세포는 eGFP-2A 연결된 TFP-발현 렌티바이러스 벡터로 조작되는 T-세포를 이용하여 GFP 발현에 의해 확인된다. GFP를 발현하지 않는 TFP+ T-세포에 대하여, TFP+ T-세포는 바이오티닐화된 재조합 메소텔린 단백질 및 2차 아비딘-PE 접합체로 검출된다. T-세포에서 CD4+ 및 CD8+ 발현은 특이적 단클론성 항체(BD Biosciences)로 또한 동시에 검출된다. 사이토카인 측정은 제조사의 지침에 따른 인간 TH1/TH2 사이토카인 혈구계산 비드 어레이 키트(BD Biosciences)를 이용하여 재-자극 24시간 이후 수집된 상청액에서 수행된다. 형광은 FACScalibur 유세포분석기를 이용하여 평가되고, 데이터는 제조사의 지침에 따라 분석된다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정(예컨대, 문헌[Milone et al, Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조)에 의해 평가될 수 있다. 간단히, 표적 세포는 빈번한 진탕과 함께 2시간 동안 37℃에서 51Cr(NaCrO4로서, New England Nuclear)로 장입되고, 완전한 RPMI 배지에서 2회 세척되고 미세적정 플레이트에 플레이팅된다. 효과기 T-세포는 효과기 세포:표적 세포(E:T)의 다양한 비로 완전한 RPMI 배지 내 웰에서 표적 세포와 혼합된다. 배지 단독(자발적인 방출, SR) 또는 트리톤-X 100 세제의 1% 용액(총 방출, TR)을 함유한 추가의 웰들이 또한 제조된다. 37℃에서 4시간의 항온처리 이후 각각의 웰들로부터 상청액은 수확된다. 방출된 51Cr은 그 다음 하기를 이용하여 측정된다: 감마 입자 카운터(Packard Instrument Co., 매사추세츠주 월섬 소재). 각각의 조건은 적어도 삼중으로 수행되고, 용해의 백분율은 하기 식을 이용하여 계산된다: % 용해=(ER-SR)/(TR-SR), 여기서 ER은 각각의 실험 조건으로 방출된 평균 51Cr을 나타낸다.
이미지형성 기술은 종양-보유 동물 모델내 TFP의 특이적 이동조절 및 증식을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 검정은, 예를 들어, 문헌[Barrett et al., Human Gene Therapy 22: 1575-1586 (2011)]에 기재되어 있다. 간단히, NOD/SCID/γc-/-(NSG) 마우스는 암세포로 그 다음 7일 뒤에 TFP 작제물로 전기천공 4시간 후 T-세포로 IV 주사된다. T-세포는 음성 대조군벌레 루시퍼라제를 발현하기 위해 렌티바이러스 작제물로 안정적으로 형질감염되고, 마우스는 생물발광으로 화상형성된다. 대안적으로, 암 이종이식 모델에서 TFP+ T-세포의 단일 주사의 치료 효능 및 특이성은 하기와 같이 측정될 수 있다: NSG 마우스는 개똥벌레 루시퍼라제를 안정적으로 발현하기 위해 형질도입된 암으로, 그 다음 7일 뒤에 메소텔린 TFP로 전기천공된 T-세포의 단일 꼬리-정맥 주사로 주사된다. 동물은 주사 후 다양한 시점에서 화상형성된다. 예를 들어, 5일(치료 2일 전) 및 8일(TFP+ PBL 24시간 후)에 대표적인 마우스내 개똥벌레 루시퍼라제 양성 암의 광자-밀도 열 지도는 생성될 수 있다.
본 명세서에서 실시예 부문에서 기재된 것뿐만 아니라 당해 기술에 공지되어 있는 것을 포함하는, 다른 검정은 또한 본 발명의 항-메소텔린 TFP 작제물을 평가하는데 사용될 수 있다.
치료 적용
메소텔린 연관된 질환 및/또는 장애
일 양상에 있어서, 본 발명은 메소텔린 발현과 연관된 질환의 치료 방법을 제공한다. 일 양상에 있어서, 본 발명은 종양의 일부가 메소텔린에 음성이고 종양의 일부가 메소텔린에 양성인 질환의 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 TFP는 메소텔린의 상승된 발현과 연관된 질환에 대하여 치료를 경험한 대상체의 치료에 유용하고, 여기서 메소텔린의 상승된 수준에 대하여 치료를 경험한 대상체는 메소텔린의 상승된 수준과 연관된 질환을 나타낸다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 포유동물 T-세포내 발현용 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항-메소텔린 TFP를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일 양상에 있어서, 본 발명은 메소텔린- 발현 종양의 치료에서 사용하기 위해 메소텔린 TFP를 발현하는 재조합 T-세포를 제공하고, 여기서 메소텔린 TFP를 발현하는 재조합 T-세포는 메소텔린 TFP-T로 지칭된다. 일 양상에 있어서, 본 발명의 메소텔린 TFP-T는 그의 표면에서 발현된 본 발명의 적어도 하나의 메소텔린 TFP와 종양 세포를 접촉할 수 있어서 TFP-T가 종양 세포를 표적화하고 종양의 성장이 억제된다.
일 양상에 있어서, 본 발명은, 메소텔린-발현 종양 세포의 성장 저해 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 TFP-T가 항원에 응답하여 활성화되고 암세포를 표적화하도록 종양 세포를 본 발명의 메소텔린 TFP T-세포와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 종양의 성장이 저해된다.
일 양상에 있어서, 본 발명은 대상체에서 암의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 암이 대상체에서 치료되도록 본 발명의 메소텔린 TFP T-세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 메소텔린 TFP T-세포에 의해 치료 가능한 암의 예는 메소텔린의 발현과 관련된 암이다. 일 양상에 있어서, 암은 중피종이다. 일 양상에 있어서, 암은 췌장암이다. 일 양상에 있어서, 암은 난소암이다. 일 양상에 있어서, 암은 위암이다. 일 양상에 있어서, 암은 폐암이다. 일 양상에 있어서, 암은 자궁내막암이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 메소텔린 TFP 요법은 1종 이상의 추가의 요법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명은 T-세포가 TFP를 발현하기 위해 유전자 변형되고 TFP-발현 T-세포가 필요로 하는 수령체에 주입되는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수령체에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 요법과 달리, TFP-발현 T-세포는 생체내 복제할 수 있어서 지속된 종양 대조군으로 이어질 수 있는 장기 지속성을 초래한다. 다양한 양상에 있어서, 환자에게 투여된 T-세포, 또는 이의 자손은 환자에게 T-세포의 투여 이후 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 환자에서 지속된다.
본 발명은 또한, T-세포가 TFP를 일시적으로 발현하기 위해, 예를 들어, 시험관내 전사된 RNA에 의해 변형되고 TFP-발현 T-세포가 필요로 하는 수령체에 주입되는 세포 요법의 한 유형을 포함한다. 주입된 세포는 수령체에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서, 다양한 양상에 있어서, 환자에게 투여된 T-세포는 환자에게 T-세포의 투여 이후, 1개월 미만, 예를 들어, 3주, 2주, 또는 1주 동안 존재한다.
임의의 특정한 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, TFP-발현 T-세포에 의해 유발된 항-종양 면역력 반응은 능동적 또는 수동적 면역 반응일 수 있거나, 대안적으로 직접적 대 간접적 면역 반응에 기인될 수 있다. 일 양상에 있어서, TFP 형질도입된 T-세포는 메소텔린 항원을 발현하는 인간 암세포에 대응하여 특이적 전염증성 사이토카인 분비 및 강력한 세포용해 활성을 나타내고, 가용성 메소텔린 억제를 대항하고, 방관자 사멸을 매개하고 그리고/또는 확립된 인간 종양의 퇴행을 매개한다. 예를 들어, 메소텔린-발현 종양의 불균일 영역 이내 항원이 없는 종양 세포는 인접한 항원-양성 암세포에 대해 이전에 반응된 메소텔린-재유도된 T-세포에 의한 간접적인 파괴에 민감할 수 있다.
일 양상에 있어서, 본 발명의 인간 TFP-변형된 T-세포는 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신의 한 유형일 수 있다. 일 양상에 있어서, 포유동물은 인간이다.
생체외 면역화에 관하여, i) 세포의 확장, ii) 세포에 TFP를 암호화하는 핵산의 도입 또는 iii) 세포의 동결보존 중 하나 이상이 포유동물 속에 세포 투여에 앞서 시험관내 발생한다.
생체외 절차는 당해 기술에서 잘 알려지고 아래 더욱 충분히 논의된다. 간단히, 세포는 포유동물(예컨대, 인간)로부터 단리되고 본 명세서에서 개시된 TFP를 발현하는 벡터로 유전자 변형된다(즉, 시험관내 형질도입 또는 형질감염된다). TFP-변형된 세포는 치료 이점을 제공하기 위해 포유동물 수령체에 투여될 수 있다. 포유동물 수령체는 인간일 수 있고 TFP-변형된 세포는 수령체에 관하여 자가적일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수령체에 관하여 동종이계, 동계 또는 이종계일 수 있다.
조혈 모세포 및 조상 세포의 생체외 확장에 대한 절차는 미국 특허 번호 5,199,942(본 명세서에서 참고로 편입됨)에 기재되고, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법은 당해 기술에 공지되어 있고, 따라서 본 발명은 비제한적으로 세포의 생체외 확장의 임의의 특정한 방법이다. 간단히, T-세포의 생체외 배양 및 확장은, (1) 말초 혈액 채집 또는 골수 외식편으로부터 포유동물에서 CD34+ 조혈 모세포 및 조상 세포 수집; 및 (2) 생체외 상기 세포 확장을 포함한다. 미국 특허 번호 5,199,942에 기재된 세포 성장 인자에 부가해서, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-키트 리간드와 같은 다른 인자는, 세포의 배양 및 확장에 사용될 수 있다.
생체외 면역화의 관점에서의 세포-기반 백신 이용에 더하여, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 관한 면역 반응을 유도하기 위한 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 활성화된 및 확장된 세포는 면역저하되는 개체에서 일어나는 질환의 치료 및 예방에서 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 TFP-변형된 T-세포는 메소텔린의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료에서 사용된다. 특정 양상에 있어서, 본 발명의 세포는 메소텔린의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 발생 위험이 있는 환자의 치료에서 사용된다. 따라서, 본 발명은 필요로 하는 대상체에 본 발명의 TFP-변형된 T-세포의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 메소텔린의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
일 양상에 있어서, 본 발명의 TFP-T-세포는 증식성 질환, 예컨대, 암 또는 악성종양, 또는 전암성 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 양상에 있어서, 암은 중피종이다. 일 양상에 있어서, 암은 췌장암이다. 일 양상에 있어서, 암은 난소암이다. 일 양상에 있어서, 암은 위암이다. 일 양상에 있어서, 암은 폐암이다. 일 양상에 있어서, 암은 자궁내막암이다. 추가의 메소텔린 발현과 연관된 질환은, 예컨대, 비정형 및/또는 비-고전적 암, 악성종양, 전암성 병태 또는 메소텔린을 발현하는 증식성 질환을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 메소텔린의 발현과 연관된 비-암 관련 징후는 메소텔린의 발현과 연관된 비-암 관련 징후는, 예컨대, 자가면역 질환(예컨대, 루푸스), 염증성 장애(알러지 및 천식) 및 이식을 포함한다.
본 발명의 TFP-변형 T-세포는 단독으로, 또는 희석제와 그리고/또는 IL-2 또는 기타 사이토카인 또는 세포 집단과 같은 기타 성분과 병용하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 메소텔린-발현 세포 집단의 증식을 저해시키거나 또는 감소시키는 방법을 제공하되, 해당 방법은 메소텔린-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-메소텔린 TFP-T-세포와 메소텔린-발현 세포를 포함하는 세포 집단을 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 양상에 있어서, 본 발명은 메소텔린을 발현하는 암세포의 집단의 증식을 저해시키거나 또는 감소시키는 방법을 제공하되, 상기 방법은 메소텔린-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-메소텔린 TFP-T-세포와 메소텔린-발현 암세포 집단을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 양상에 있어서, 본 발명은 메소텔린을 발현하는 암세포의 집단의 증식을 저해시키거나 또는 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 메소텔린-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-메소텔린 TFP-T-세포와 메소텔린-발현 암세포 집단을 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 양상에 있어서, 본 발명의 항-메소텔린 TFP-T-세포는 음성 대조군에 비하여 메소텔린-발현 세포와 연관된 암을 가진 대상체 또는 동물 모델에서 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 및 적어도 99%만큼 세포 및/또는 암세포의 수량, 수, 양 또는 백분율을 감소시킨다. 일 양상에 있어서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 메소텔린-발현 세포와 연관된 질환(예컨대, 메소텔린을 발현하는 암)의 예방, 치료 및/또는 관리 방법을 제공하되, 상기 방법은 필요한 대상체에게 메소텔린-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-메소텔린 TFP-T-세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일 양상에 있어서, 대상체는 인간이다. 메소텔린-발현 세포와 연관된 장애의 비-제한 예는 자가면역 장애(예컨대, 루푸스), 염증성 장애(예컨대, 알러지 및 천식) 및 암(예컨대, 췌장암, 난소암, 위암, 폐암, 또는 자궁내막암, 또는 메소텔린을 발현하는 비정형 암)을 포함한다.
본 발명은 또한 메소텔린-발현 세포와 연관된 질환의 예방, 치료 및/또는 관리 방법을 제공하되, 상기 방법은 필요한 대상체에게 메소텔린-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-메소텔린 TFP-T-세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일 양상에 있어서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 메소텔린-발현 세포와 관련된 암의 재발 예방 방법을 제공하고, 상기 방법은 필요로 하는 대상체에 메소텔린-발현 세포에 결합하는 본 발명의 항-메소텔린 TFP-T-세포의 투여를 포함한다. 일 양상에 있어서, 상기 방법은 필요로 하는 대상체에게 또 다른 요법의 유효량과 병용하여 메소텔린-발현 세포에 결합하는 본 명세서에서 기재된 항-메소텔린 TFP-T-세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
병용 요법
본 명세서에서 기재된 TFP-발현 세포는 다른 공지된 제제 및 요법과 병용하여 사용될 수 있다. "병용하여" 투여된다는 것은, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 2가지(또는 이상) 상이한 치료가 장애를 가진 대상체의 고통 과정 동안 대상체에게 전달되는 것, 예를 들어, 대상체가 장애를 가진 것으로 진단된 이후 그리고 장애가 치유되거나 제거되기 이전 또는 치료가 다른 이유로 중단되기 이전 2가지 이상의 치료가 전달되는 것을 의미한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 하나의 치료의 전달은 제2 치료의 전달이 시작하는 때 여전히 발생하고, 따라서 투여에 관하여 중복이 있다. 이는 때때로 본 명세서에서 "동시" 또는 "동반 전달"로서 지칭된다. 다른 실시형태에 있어서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작하기 전에 끝난다. 어느 한 경우의 몇몇 실시형태에 있어서, 치료는 조합된 투여 때문에 더욱 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료는 더욱 효과적이고, 예를 들어, 동등 효과는 더 적은 제2 치료로 나타나거나, 제2 치료는, 제2 치료가 제1 치료의 부재하에 투여된 경우 나타나는 것보다, 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 또는 유사한 상황은 제1 치료로 나타난다. 몇몇 실시형태에 있어서, 전달은 증상, 또는 장애와 관련된 다른 파라미터에서의 감소가 다른 것의 부재하에 전달된 하나의 치료로 관측된 것 초과인 정도이다. 2개 치료의 효과는 부분적으로 부가적, 전체적으로 부가적, 또는 부가적 초과일 수 있다. 전달은 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달되는 경우 여전히 검출 가능한 정도일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, "적어도 하나의 추가의 치료제"는 TFP-발현 세포를 포함한다. 동일한 또는 상이한 표적 항원, 또는 동일한 표적 항원에서 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하는, 다중 TFP를 발현하는 T-세포가 또한 제공된다. T-세포의 제1 서브셋이 제1 TFP를 발현하고 T-세포의 제2 서브셋이 제2 TFP를 발현하는 T-세포의 집단이 또한 제공된다.
본 명세서에서 기재된 TFP-발현 세포 및 적어도 하나의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 또는 별개의 조성물에서, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여를 위하여, 본 명세서에서 기재된 TFP-발현 세포가 첫 번째로 투여될 수 있고, 추가의 제제가 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여의 순서는 역전될 수 있다.
추가의 양상에 있어서, 본 명세서에서 기재된 TFP-발현 세포는 수술, 화학요법, 방사선, 면역억제성 제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역절제 제제, 예컨대, 알렘투주맙, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 조사와 병용하여 치료 요법에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 TFP-발현 세포는 또한 문헌[Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기재된 것과 같이 펩타이드 백신과 병용하여 사용될 수 있다. 추가의 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 TFP-발현 세포는 또한 골수성 세포분화의 촉진제(예컨대, 모든-트랜스 레티노산), 골수-유래 억제세포(MDSC) 확장의 저해제(예컨대, c-키트 수용체의 저해제 또는 VEGF 저해제), MDSC 기능의 저해(예컨대, COX2 저해제 또는 포스포다이에스테라제-5 저해제), 또는 MDSC의 치료적 제거(예컨대, 독소루비신 및 사이클로포스파마이드에 의한 치료와 같은 화학치료 요법에 의함)와 병용하여 사용될 수 있다. MDSC의 확장을 예방할 수 있는 기타 치료제는 아미노-바이포스포네이트, 바이포스페이트, 실데나필 및 타다라필, 나이트로아스피린, 비타민 D3 및 겜시타빈을 포함한다. (예컨대, 문헌[Gabrilovich and Nagaraj, Nat. Rev. Immunol, (2009) v9(3): 162-174] 참조).
하나의 실시형태에 있어서, 대상체는 TFP-발현 세포의 투여와 관련된 부작용 감소 또는 완화시키는 제제가 투여될 수 있다. TFP-발현 세포의 투여와 관련된 부작용은, 비제한적으로 사이토카인 방출 증후군(CRS), 및 혈구탐식성림프조직구증(HLH), 또한 일명 대식세포 활성화 증후군(MAS)을 포함한다. CRS의 증상은 고열, 메스꺼움, 일시적 저혈압, 저산소증 등을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 기재된 방법은 대상체에 본 명세서에서 기재된 TFP-발현 세포 투여 및 TFP-발현 세포로 치료에서 비롯한 가용성 인자의 상승된 수준을 관리하기 위한 제제의 추가 투여를 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상체에서 상승된 가용성 인자는 하나 이상의 IFN-γ, TNFα, IL-2, IL-6 및 IL-8이다. 따라서, 상기 부작용을 치료하기 위해 투여된 제제는 하나 이상의 이들 가용성 인자를 중화시키는 제제일 수 있다. 상기 제제는, 스테로이드, TNFα의 저해제, 및 IL-6의 저해제를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. TNFα 저해제의 예는 엔타네르셉트(entanercept)이다. IL-6 저해제의 예는 토실리주맙(toc)이다.
하나의 실시형태에 있어서, 대상체는 TFP-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제가 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시형태에 있어서, 제제는 저해 분자를 억제하는 제제일 수 있다. 저해 분자, 예를 들어, 예정 세포사 1(PD1)은, 몇몇 실시형태에 있어서, 면역 효과기 반응을 탑재하기 위해 TFP-발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 저해 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 억제에 의한, 저해 분자의 억제는 TFP-발현 세포 성능을 최적화시킬 수 있다. 실시형태에서, 억제 핵산, 예를 들어, 억제 핵산, 예를 들어, dsRNA, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA는 TFP-발현 세포에서 저해 분자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 실시형태에서 억제제는 shRNA이다. 일 실시형태에 있어서, 저해 분자는 TFP-발현 세포 이내 억제된다. 이들 실시형태에서, 저해 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 성분, 예를 들어, TFP의 모든 성분을 암호화하는 핵산에 연결된다. 하나의 실시형태에 있어서, 억제 신호의 억제제는, 예를 들어, 저해 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 제제는 PD1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4(예컨대, 이필리무맙(또한 MDX-010 및 MDX-101로도 지칭되고, 예르보이(Yervoy)TM(Bristol-Myers Squibb); 트레멜리무맙(tremelimumab)(틸실리무맙, CP-675,206으로서 예전에 공지된, Pfizer로부터 입수 가능한 IgG2 단클론성 항체)로서 시판됨)에 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 제제는 TIM3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다. 일 실시형태에 있어서, 제제는 LAG3에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
몇몇 실시형태에 있어서, T 세포는 렌티바이러스, 예컨대, CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 특이적으로 표적화하는 렌티바이러스를 통해서 생체내에서 (예컨대, 유전자 전달에 의해) 변형될 수 있다(예컨대, 문헌[Zhou et al., J. Immunol. (2015) 195:2493-2501] 참조).
몇몇 실시형태에 있어서, TFP-발현 세포의 활성을 향상시키는 제제는, 예컨대, 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 제1 도메인은 저해 분자, 또는 이의 단편이고, 제2 도메인은 양성 신호와 관련되는 폴리펩타이드, 예컨대, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 폴리펩타이드이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 양성 신호와 관련되는 폴리펩타이드는 CD28, CD27, ICOS의 공자극 도메인, 예컨대, CD28, CD27 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 본 명세서에서 기재된, 예컨대, CD3 제타의, 예컨대, 1차 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 융합 단백질은 TFP를 발현한 동일한 세포에 의해 발현된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 융합 단백질은 세포, 예컨대, 항-메소텔린 TFP를 발현하지 않는 T-세포에 의해 발현된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 핵산에 의해 암호화된 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인, 또는 항-메소텔린 결합 도메인을 포함하는 항체, 또는 핵산에 의해 암호화된 항-메소텔린 결합 도메인을 발현하는 세포는 최대 약 200nM, 100nM, 75nM, a 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM, 또는 0.01nM; 및/또는 적어도 약 100nM, 75nM, a 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM, 또는 0.01nM; 및 또는 약 200nM, 100nM, 75nM, 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM, 또는 0.01nM의 친화도값을 갖는다.
약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물은 TFP-발현 세포, 예컨대, 복수의 TFP-발현 세포를, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리적으로 허용가능한 캐리어, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 완충액, 예컨대, 중성 완충된 염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 산화방지제; 킬레이트제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 애주번트(예컨대, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 일 양상에서 정맥내 투여를 위하여 제형화된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료되는(또는 예방되는) 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 용량이 임상시험에 의해 결정될 수 있어도, 투여의 수량 및 빈도는 환자의 병태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
하나의 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 오염물질이 실질적으로 없고, 예를 들어, 내독소, 마이코플라스마, 복제 가능 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 예를 들어, 오염물질의 검출 가능한 수준이 없다. 하나의 실시형태에 있어서, 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 나이세리아 메닝자이티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 연쇄상구균 폐렴(Streptococcus pneumonia), 및 연쇄상구균 파이오제네스 그룹 A(Streptococcus pyogenes group A)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
"면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "종양-저해 유효량", 또는 "치료량"이 표시되는 경우, 투여되는 본 발명의 조성물의 정밀량은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자(대상체)의 병태에서 개별적인 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 T-세포를 포함하는 약제학적 조성물이, 그 범위 이내 모든 정수값을 포함하는, 104 내지 109개 세포/㎏ 체중의 용량, 일부 경우에서 105 내지 106개 세포/㎏ 체중으로 투여될 수 있다는 것이 일반적으로 언급될 수 있다. T-세포 조성물은 또한 이들 용량으로 다중 횟수로 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 통상적으로 공지된 주입 기술을 이용함으로써 투여될 수 있다(예컨대, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988] 참조).
특정 양상에 있어서, 대상체에 활성화된 T-세포를 투여하고 그 다음 이어서 채혈하고(또는 분리반출법 수행하고), 본 발명에 따라 거기로부터 T-세포를 활성화하고, 이들 활성화된 및 확장된 T-세포로 환자에게 재주입하는 것이 바람직할 수도 있다. 상기 과정은 몇 주마다 다회 수행될 수 있다. 특정 양상에 있어서, T-세포는 10㏄ 내지 400㏄의 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 양상에 있어서, T-세포는 20㏄, 30㏄, 40㏄, 50㏄, 60㏄, 70㏄, 80㏄, 90㏄ 또는 100㏄의 채혈로부터 활성화된다.
주제 조성물의 투여는, 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)을 포함하는, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 조성물은 환자에게 경동맥으로, 피하로, 진피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내, 근육내로, 정맥내(i.v.) 주사로, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일 양상에 있어서, 본 발명의 T-세포 조성물은 환자에게 진피내 및 피하 주사로 투여된다. 일 양상에 있어서, 본 발명의 T-세포 조성물은 i.v. 주사로 투여된다. T-세포의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염의 부위에 직접적으로 주사될 수 있다.
특정한 예시적인 양상에 있어서, 대상체는 백혈구분리반출법을 경험할 수 있고, 여기서 백혈구는 관심 대상 세포, 예를 들어, T-세포를 선택 및/또는 단리시키기 위해 생체외 수집, 농축 또는 감손된다. 이들 T-세포는 당해 기술에 공지된 방법에 의해 확장될 수 있고 본 발명의 하나 이상의 TFP 작제물이 도입될 수 있고, 이로써 본 발명의 TFP-발현 T-세포를 창출하도록 치료될 수 있다. 필요로 하는 대상체는 이어서 고용량 화학요법으로 표준 치료 그 다음 말초 혈액 줄기세포 이식을 경험할 수 있다. 특정 양상에 있어서, 이식 이후 또는 이식과 동반하여, 대상체는 본 발명의 확장된 TFP T-세포의 주입을 받는다. 추가의 양상에 있어서, 확장된 세포는 수술 이전 또는 이후 투여된다.
환자에게 투여되는 상기 치료의 용량은 치료 중인 정확한 병태의 본성 및 치료의 수령체에 의해 다양할 것이다. 인간 투여를 위한 용량의 스케일링은 기술-허용된 실시에 따라 수행될 수 있다. 알렘투주맙용 용량은, 예를 들어, 1 내지 30일 기간 동안 일반적으로 매일 투여된, 성인 환자에 대하여 일반적으로 1 내지 약 100㎎ 범위일 것이다. 몇몇 경우에 (미국 특허 번호 6,120,766에 기재된 바와 같이) 최대 40㎎/일의 더 큰 용량이 사용될 수 있더라도, 바람직한 1일 용량은 1 내지 10㎎/일이다.
하나의 실시형태에 있어서, TFP는, 예를 들어, 시험관내 전사를 이용하여, T-세포에 도입되고, 대상체(예컨대, 인간)는 본 발명의 TFP T-세포의 초기 투여, 및 본 발명의 TFP T-세포의 하나 이상의 차후의 투여를 받고, 여기서 하나 이상의 차후의 투여는, 이전의 투여 이후 15일 미만, 예를 들어, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일 투여된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 TFP T-세포의 1회 초과 투여는 주마다 대상체(예컨대, 인간)에게 투여되고, 예를 들어, 본 발명의 TFP T-세포의 2, 3 또는 4회 투여가 주마다 투여된다. 하나의 실시형태에 있어서, 대상체(예컨대, 인간 대상체)는 주당 1회 초과의 TFP T-세포의 투여(예컨대, 주당 2, 3, 4회 투여)(또한 여기서는 1사이클이라 지칭됨)를 받고, 이어서 1주간 TFP T-세포 투여 없이 지내고, 이어서 1회 이상 추가의 TFP T-세포의 투여(예컨대, 주당 1회 초과의 TFP T-세포의 투여)가 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 대상체(예컨대, 인간 대상체)는 TFP T-세포의 1 초과 사이클을 받고 각각의 사이클 사이 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3일 미만이다. 하나의 실시형태에 있어서, TFP T-세포는 주마다 3회 투여로 격일로 투여된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 TFP T-세포는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 초과 동안 투여된다.
일 양상에 있어서, 메소텔린 TFP T-세포는 렌티바이러스 바이러스성 벡터, 예컨대, 렌티바이러스를 이용하여 생성된다. 그 방식으로 생성된 TFP-T-세포는 안정적인 TFP 발현을 가질 것이다.
일 양상에 있어서, TFP T-세포는 형질도입 이후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15일 동안 TFP 벡터를 일시적으로 발현한다. TFP의 일시적 발현은 RNA TFP 벡터 전달에 의해 영향받을 수 있다. 일 양상에 있어서, TFP RNA는 전기천공에 의해 T-세포에 형질도입된다.
일시적으로 발현하는 TFP T-세포를 이용하여 (특히 쥣과 scFv 보유 TFP T-세포로) 치료받는 환자에서 일어날 수 있는 잠재적인 사안은 다중 치료 이후 과민증이다.
상기 이론에 얽매이는 일 없이, 그와 같은 과민성 반응이 체액성 항-TFP 반응, 즉, 항-IgE 아이소타입을 갖는 항-TFP 항체를 발생하는 환자에 의해 야기될 수 있다고 여겨진다. 환자의 항체 생산 세포가 항원에 노출에서 10 내지 14일 중단이 있는 경우 (과민증을 유발시키지 않는) IgG 아이소타입에서 IgE 아이소타입으로 부류 전환을 겪는 것으로 여겨진다.
환자가 일시적 TFP 요법(예컨대, RNA 형질도입에 의해 생성된 것)의 과정 동안 항-TFP 항체 반응 생성의 고위험에 있으면, TFP T-세포 주입 중단은 10 내지 14일 초과 지속되지 않아야 한다.
실시예
본 발명은 하기 실험적 실시예를 참고로 상세히 추가로 기재된다. 이들 실시예는 단지 실례의 목적으로 제공되고, 달리 구체화되지 않는 한 제한되도록 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 하기 실시예에 제한되는 것으로 결코 해석되지 않아야 하고, 오히려, 본 명세서에서 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 그리고 모든 변동을 포함하도록 해석되어야 한다. 추가 설명 없이, 당업자가, 이전의 설명 및 하기 예시적인 실시예를 이용하여, 본 발명의 화합물을 제조 및 이용할 수 있고 청구된 방법을 실시할 수 있다고 여겨진다. 하기 작업 실시예는 본 발명의 다양한 양상을 구체적으로 언급하고, 본 개시내용의 나머지를 어떤 식으로든 제한으로서 해석해서는 안 된다.
실시예 1: TFP 작제물
항-메소텔린 TFP 작제물은 XbaI 및 EcoR1 부위에서 짧은 링커(SL): AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(서열번호 2) 또는 긴 링커(LL): AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(서열번호 3)를 p510 벡터(System Biosciences (SBI))로 암호화하는 DNA 서열에 의해 CD3 또는 TCR DNA 단편에 연결된 항-메소텔린 scFv DNA 단편의 클로닝에 의해 조작된다.
생성된 항-메소텔린 TFP 작제물은, p510_항메소텔린_LL_TCRα(항-메소텔린 scFv - 긴 링커 - 인간 전장 T 세포 수용체 α쇄), p510_항메소텔린_LL_TCR αC (항-메소텔린 scFv - 긴 링커 - 인간 T 세포 수용체 α 불변 도메인 쇄), p510_항메소텔린_LL_TCRβ(항-메소텔린 scFv - 긴 링커 - 인간 전장 T 세포 수용체 β쇄), p510_항메소텔린_LL_TCRβC(항-메소텔린 scFv - 긴 링커 - 인간 T 세포 수용체 β불변 도메인 쇄), p510_항메소텔린_LL_CD3γ(항-메소텔린 scFv - 긴 링커 - 인간 CD3γ쇄), p510_항메소텔린_LL_CD3δ(항-메소텔린 scFv - 긴 링커 - 인간 CD3δ쇄), p510_항메소텔린_LL_CD3ε(항-메소텔린 scFv - 긴 링커 - 인간 CD3ε쇄), p510_항메소텔린_SL_TCRβ(항-메소텔린 scFv - 짧은 링커 - 인간 전장 T 세포 수용체 β쇄), p510_항메소텔린_SL_CD3γ(항-메소텔린 scFv - 짧은 링커 - 인간 CD3γ쇄), p510_항메소텔린_SL_CD3δ(항-메소텔린 scFv - 짧은 링커 - 인간 CD3δ쇄), p510_항메소텔린_SL_CD3ε(항-메소텔린 scFv - 짧은 링커 - 인간 CD3ε쇄)이다.
항-메소텔린 CAR 작제물, p510_항메소텔린_28ζ는 XbaI 및 EcoR1 부위에서 p510 벡터에 항-메소텔린, 부분적인 CD28 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인, CD28 세포내 도메인 및 CD3 제타를 암호화하는 합성된 DNA의 클로닝에 의해 생성된다.
실시예 2: 항체 서열
항체 서열의 생성
인간 메소텔린 폴리펩타이드 표준적 서열은 UniProt 수탁 번호 Q13421(또는 Q13421-1)이다. 인간 메소텔린 폴리펩타이드 및 이의 단편 또는 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 폴리펩타이드가 제공된다. 항-메소텔린 항체는 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다(예컨대, 문헌[Nicholson et al, 1997] 참조). 쥣과 항-메소텔린 항체가 개시 물질로서 사용되는 경우, 쥣과 항-메소텔린 항체의 인간화는 임상 셋팅에 요망되고, 여기서 마우스-특이적 잔기는 T-세포 수용체(TCR) 융합 단백질(TFP) 치료, 즉, TFP.메소텔린 작제물로 형질도입된 T-세포로 치료를 받는 대상체 내 인간-항-마우스 항원(HAMA) 반응을 유도할 수 있다. 인간화는, 선택적으로 CDR 및/또는 프레임워크 영역에 다른 변형을 포함하여, 적절한 인간 생식계열 수용체 프레임워크상에 쥣과 항-메소텔린 항체로부터 CDR 영역의 그라프팅에 의해 달성된다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 항체 및 항체 단편 잔기 넘버링은 카밧(Kabat E.A. et al, 1991; Chothia et al, 1987)을 따른다.
scFvs의 생성
인간 또는 인간화된 항-메소텔린 IgG는 TFP 작제물을 위한 scFv 서열을 생성하는데 사용된다. 인간 또는 인간화된 VL 및 VH 도메인을 위한 DNA 서열 암호화가 수득되고, 작제물을 위한 코돈은, 선택적으로, 호모사피엔스로부터 세포내 발현에 최적화된다. VL 및 VH 도메인이 scFv에서 나타나는 순서는 다양하고(즉, VL-VH, 또는 VH-VL 배향), 3 카피의 "G4S" 또는 "G4S" 서브유닛 (G4S)3은 가변 도메인을 연결하여 scFv 도메인을 창출한다. 항-메소텔린 scFv 플라스미드 작제물은 선택적인 Flag, His 또는 다른 친화도 태그를 가질 수 있고, HEK293 또는 다른 적합한 인간 또는 포유동물 세포주에 전기천공되고 정제된다. 검증 검정은 FACS에 의한 결합 분석, 프로테온(Proteon)을 이용한 동력학 분석, 및 메소텔린-발현 세포의 염색을 포함한다.
예시적인 항-메소텔린 VL 및 VH 도메인, CDR, 및 이들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 미국 특허 제9,272,002; 8,206,710; 9,023,351; 7,081,518; 8,911,732; 9,115,197호 및 제9,416,190호; 및 미국 특허 공개 제20090047211호에 기재된 것들일 수 있다. 기타 예시적인 항-메소텔린 VL 및 VH 도메인, CDR, 및 이들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 각각, 하기 단클론성 항체: 래트 항-메소텔린 항체 420411, 래트 항-메소텔린 항체 420404, 마우스 항-메소텔린 항체 MN-1, 마우스 항-메소텔린 항체 MB-G10, 마우스 항-메소텔린 항체 ABIN233753, 토끼 항-메소텔린 항체 FQS3796(3), 토끼 항-메소텔린 항체 TQ85, 마우스 항-메소텔린 항체 TA307799, 래트 항-메소텔린 항체 295D, 래트 항-메소텔린 항체 B35, 마우스 항-메소텔린 항체 5G157, 마우스 항-메소텔린 항체 129588, 토끼 항-메소텔린 항체 11C187, 마우스 항-메소텔린 항체 5B2, 토끼 항-메소텔린 항체 SP74, 토끼 항-메소텔린 항체 D4X7M, 마우스 항-메소텔린 항체 C-2, 마우스 항-메소텔린 항체 C-3, 마우스 항-메소텔린 항체 G-1, 마우스 항-메소텔린 항체 G-4, 마우스 항-메소텔린 항체 K1, 마우스 항-메소텔린 항체 B-3, 마우스 항-메소텔린 항체 200-301-A87, 마우스 항-메소텔린 항체 200-301-A88, 토끼 항-메소텔린 항체 EPR2685(2), 토끼 항-메소텔린 항체 EPR4509, 또는 토끼 항-메소텔린 항체 PPI-2e(IHC)의 것들일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단일-도메인(VHH) 결합체는 서열번호 53 내지 55(각각 SD1, SD4 및 SD6)에 제시된 것들이 사용된다.
TCR 서브유닛의 공급원
인간 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 서브유닛은 모두 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 함유한다. 인간 TCR 복합체는 CD3-엡실론 폴리펩타이드, CD3-감마 폴리펩타이드, CD3-델타 폴리펩타이드, CD3-제타 폴리펩타이드, TCR 알파쇄 폴리펩타이드 및 TCR 베타쇄 폴리펩타이드를 함유한다. 인간 CD3-엡실론 폴리펩타이드 표준적 서열은 하기이다: Uniprot 수탁 번호 P07766. 인간 CD3-감마 폴리펩타이드 표준적 서열은 하기이다: Uniprot 수탁 번호 P09693. 인간 CD3-델타 폴리펩타이드 표준적 서열은 하기이다: Uniprot 수탁 번호 P043234. 인간 CD3-제타 폴리펩타이드 표준적 서열은 하기이다: Uniprot 수탁 번호 P20963. 인간 TCR 알파쇄 표준적 서열은 하기이다: Uniprot 수탁 번호 Q6ISU1. 인간 TCR 베타쇄 C 영역 표준적 서열은 하기이고: Uniprot 수탁 번호 P01850, 인간 TCR 베타쇄 V 영역 서열은 P04435이다.
인간 CD3-엡실론 폴리펩타이드 표준적 서열은 하기이다: MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (서열번호 4).
인간 CD3-감마 폴리펩타이드 표준적 서열은 하기이다:MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN (서열번호 5).
인간 CD3-델타 폴리펩타이드 표준적 서열은 하기이다: MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNKS (서열번호 6).
인간 CD3-제타 폴리펩타이드 표준적 서열은 하기이다: MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호 7).
인간 TCR 알파쇄 표준적 서열은 하기이다: MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA (서열번호 8).
인간 TCR 알파쇄 C 영역 표준적 서열은 하기이다: PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS (서열번호 9).
인간 TCR 알파쇄 V 영역 CTL-L17 표준적 서열은 하기이다: MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL (서열번호 10).
인간 TCR 베타쇄 C 영역 표준적 서열은 하기이다: EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF (서열번호 11).
인간 TCR 베타쇄 V 영역 CTL-L17 표준적 서열은 하기이다: MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL (서열번호 12).
인간 TCR 베타쇄 V 영역 YT35 표준적 서열은 하기이다: MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV (서열번호 13).
TCR 도메인 및 scFvs로부터 TFP의 생성
메소텔린 scFvs는 링커 서열, 예컨대, G4S, (G4S)2 (G4S)3 또는 (G4S)4를 이용하는 CD3-엡실론 또는 다른 TCR 서브유닛(1C 참조)에 재조합으로 연결된다. 다양한 링커 및 scFv 배치구성이 이용된다. TCR 알파 및 TCR 베타쇄는 전장 폴리펩타이드 또는 단지 이의 불변 도메인으로서 TFP의 생성에 사용되었다. TCR 알파 및 TCR 베타쇄의 임의의 가변 서열은 TFP 제조를 위하여 허용된다.
TFP 발현 벡터
하기를 포함하는 발현 벡터가 제공된다: 프로모터(사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서-프로모터), 분비를 가능하게 하는 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결자(소 성장 호르몬 (BGH) 유전자), 에피솜 복제 및 원핵생물에서 복제를 허용하는 요소물(예컨대, SV40 기원 및 ColE1 또는 당해 기술에서 공지된 다른 것) 및 선택을 허용하는 요소(암피실린 저항 유전자 및 제오신 마커).
바람직하게는, TFP-인코딩 핵산 작제물은 렌티바이러스 발현 벡터에 클로닝되고 발현은 메소텔린+ 표적 세포에 대응하여 TFP.메소텔린-형질도입된 T-세포("메소텔린.TFP" 또는 "메소텔린.TFP T-세포" 또는 "TFP.메소텔린" 또는 "TFP.메소텔린 T-세포")의 효과기 T-세포 반응의 양 및 품질에 기반하여 입증된다. 효과기 T-세포 반응은, 세포 확장, 증식, 배가, 사이토카인 생산 및 표적 세포 용해 또는 세포용해 활성(즉, 탈과립화)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
TFP.메소텔린 렌티바이러스 전달 벡터는 VSV-G 모조타이핑된 렌티바이러스 입자에 패킹된 게놈 물질을 생산하는데 사용된다. 렌티바이러스 전달 벡터 DNA는 리포펙타민 시약과 조합으로 VSVG, gag/pol 및 rev의 3개 포장 구성요소와 혼합되어 이들을 함께 HEK-293(배아 신장, ATCC® CRL-1573™) 세포에 형질감염시킨다. 24 및 48시간 후, 배지를 수집하고, 여과시키고 초원심분리에 의해 농축시킨다. 수득한 바이러스성 제제는 -80℃에서 저장한다. 형질도입 유닛의 수는 Sup-T1(T-세포 림프모구 림프종, ATCC® CRL-1942™) 세포 상의 적정에 의해 결정된다. 재유도된 TFP.메소텔린 T-세포는 24시간 동안 예컨대 항-CD3 항-CD28 비드로 신선한 미경험 T-세포의 활성화 및 그 다음 형질도입된 T-세포의 목적하는 백분율을 수득하기 위해 형질도입 유닛의 적절한 수의 첨가에 의해 생산된다. 이들 변형된 T-세포는 이들이 휴지되고 크기가 작아질 때까지 확장되고 이 시점에서 이들은 나중의 분석을 위하여 동결보존된다. 세포 수 및 크기는 콜터 멀티사이저(Coulter Multisizer™) III를 사용해서 측정된다. 동결보존 전에, (세포 표면에서 TFP.메소텔린을 발현하는) 형질도입된 세포의 백분율 및 그 발현의 그의 상대 형광 강도는 유세포분석 분석에 의해 결정된다. 히스토그램 플롯으로부터, TFP의 상대 발현 수준은 그의 상대 형광 강도로 형질도입된 백분율의 비교에 의해 시험된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 다중 TFP는 다중 바이러스성 벡터를 이용한 T-세포 형질도입에 의해 도입된다.
인간화된 TFP 재유도된 T 세포의 세포용해 활성도, 증식 능력 및 사이토카인 분비의 평가
세포-표면 발현된 TFP를 생산하기 위한, 그리고 표적 종양 세포를 표적화하고, 사이토카인을 증식 및 분비시키기 위한 TFP.메소텔린 T-세포의 기능성 능력은 당해 기술에 공지된 검정을 이용하여 결정된다.
인간 말초 단핵구 세포(PBMC, 예컨대, 미경험 T-세포가 T-세포, CD4+ 및 CD8+ 림프구에 대하여 음성 선택에 의해 얻어지는 정상 분리반출된 공여체로부터 혈액)는 인간 인터류킨-2(IL-2)로 처리되고 그 다음 TFP-암호화 렌티바이러스 벡터로 형질도입에 앞서 37℃, 5% CO2에서, 예컨대, 10% RPMI 중에서 항-CD3x 항-CD28 비드로 활성화된다. 유세포분석 검정은, 예컨대, 항-FLAG 항체 또는 항-쥣과 가변 도메인 항체에 의한 TFP의 세포 표면 존재를 확인하는데 이용된다. 사이토카인(예컨대, IFN-γ) 생산은 ELISA 또는 다른 검정을 이용하여 측정된다.
실시예 3: 인간 ALL 마우스 모델에서 인간 TFP T-세포 효능
원발성 인간 ALL 세포는, 이들을 시험관내 배양해야 하는 일 없이 면역 손상된 마우스(예컨대, NSG 또는 NOD)에서 성장될 수 있다. 마찬가지로, 배양된 인간 ALL 세포주는 이러한 마우스에서 백혈병을 유도할 수 있다. ALL-보유 마우스는, 예를 들어, 모델 HALLX5447에서 인간 TFP.메소텔린 T-세포의 효능을 시험하는데 사용될 수 있다. 이 모델에서의 독출치는 정맥내(i.v.) 투여된 인간 TFP.메소텔린 T-세포의 부재 및 존재하에 ALL 세포의 i.v. 주입 이후 마우스의 생존률이다.
실시예 4: 다중화된 TFP 폴리펩타이드의 입증, 및 다중화 인간화된 TFP 재유도된 T 세포의 사용
본 명세서에서 제공된 TFP 폴리펩타이드는 기능성 TCR 복합체를 형성하기 위해 내인성 TCR 서브유닛 폴리펩타이드와 기능적으로 연관될 수 있다. 여기서, 렌티바이러스 벡터내 다중 TFP는 기능성, 다중화된 재조합 TCR 복합체를 창출하기 위해 T-세포를 형질도입하는데 사용된다. 예를 들어, i) CD3-델타 폴리펩타이드 및 메소텔린-특이적 scFv 항체 단편으로부터 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 갖는 제1 TFP, 및 ii) CD3-감마 폴리펩타이드 및 메소텔린-특이적 항체 단편으로부터 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 갖는 제2 TFP를 함유하는 T-세포가 제공된다. 제1 TFP 및 제2 TFP는 서로와 그리고 내인성 TCR 서브유닛 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있고, 이로써 기능성 TCR 복합체를 형성한다.
이들 다중화 인간화된 TFP.메소텔린 T-세포의 이용은 상기 실시예 2 및 3에 제공된 바와 같이 액형 및 고형 종양에서 입증될 수 있다.
실시예 5: TFP로 형질도입된 T-세포의 제조
렌티바이러스 생산
적절한 작제물을 암호화하는 렌티바이러스는 다음과 같이 제조된다. 5x106개 HEK-293FT-세포를 100㎜ 접시에 파종하고 하룻밤 70 내지 90% 컨플루언시(confluency)를 달성하게 둔다. 2.5㎍의 표시된 DNA 플라스미드 및 20㎕의 렌티바이러스 패키징 혼합물(ALSTEM, cat# VP100)을 혈청 없이 0.5㎖의 DMEM 또는 Opti-MEM® I 배지에서 희석시키고 온화하게 혼합한다. 별개의 튜브에서, 30㎕의 NanoFect® 형질감염 시약(ALSTEM, cat# NF100)을 혈청 없이 0.5㎖의 DMEM 또는 Opti-MEM® I 배지에서 희석시키고 온화하게 혼합한다. NanoFect/DMEM 용액과 DNA/DMEM 용액을 이어서 함께 혼합하고 15분 동안 실온에서 DMEM-플라스미드-NanoFect 혼합물의 항온처리에 앞서 10 내지 15초 동안 와류시킨다. 이전의 단계로부터의 완전 형질감염 복합체를 세포의 플레이트에 적가하고 플레이트에서 형질감염 복합체를 고르게 분산되도록 흔들렸다. 이어서, 플레이트를 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에 하룻밤 항온처리한다. 다음 날, 상청액을 10㎖의 새로운 배지로 대체하고, 20㎕의 ViralBoost(500x, ALSTEM, cat# VB100)를 보충한다. 이어서, 플레이트를 추가의 24시간 동안 37℃에 항온처리한다. 그 후, 렌티바이러스 함유 상청액을 50㎖ 멸균된, 캡핑된 원뿔형 원심관 속에 수집하고 얼음 위에 놓는다. 4℃에 15분 동안 3000 rpm으로 원심분리 이후, 청소된 상청액을 저-단백질 결합 0.45㎛ 멸균된 필터로 여과시키고 바이러스를 이어서 4℃에 1.5시간 동안 25,000 rpm(Beckmann, L8-70M)에서 초원심분리에 의해 단리시킨다. 펠릿을 제거하여 DMEM 배지에서 재-현탁시키고 렌티바이러스 농도/역가는, Lenti-X qRT-PCR 적정 키트(Clontech; 카탈로그 번호 631235)를 이용하는, 정량적 RT-PCR에 의해 확립된다. 임의의 잔류 플라스미드 DNA는 DNaseI를 이용한 처리에 의해 제거되었다. 바이러스 스톡 제제는 즉시 감염에 사용되거나 또는 분취되어 장래의 사용을 위하여 -80℃에서 저장된다.
PBMC 단리
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 전혈 또는 버피 코트로부터 제조된다. 전혈을 10㎖ 헤파린 진공채혈기에서 수집하여 즉시 가공하거나 4℃에서 하룻밤 저장한다. 대략 10㎖의 항-응고된 전혈을 50㎖ 원뿔형 원심관(PBS, pH 7.4, Ca2 +/Mg2 + 없이)에서 20㎖의 총 용적으로 멸균된 인산염 완충 식염수(PBS) 완충액과 혼합한다. 20㎖의 이 혈액/PBS 혼합물을 이어서 중단 적용 없이 실온에서 30 내지 40분 동안 400g에서 원심분리에 앞서 15㎖의 Ficoll-Paque® PLUS(GE Healthcare, 17-1440-03)의 표면 상에 서서히 덮는다.
버피 코트는 Research Blood Components(매사추세츠주 보스톤 소재)로부터 구입한다. Leucosep® 튜브(Greiner bio-one)는 15㎖ Ficoll-Paque®(GE Health Care)를 첨가함으로써 제조되고 1분 동안 1000g에서 원심분리시킨다. 버피 코트는 PBS 중에 (pH 7.4, Ca2 + 또는 Mg2 + 없이) 1:3 희석시킨다. 희석된 버피 코트를 류코셉 튜브로 옮기고 중단 적용 없이 15분 동안 1000g에서 원심분리시킨다. 희석된 혈장/피콜 계면에서 보이는, PBMC를 함유하는 세포의 층은 피콜에 의한 오염을 최소화하기 위해 주의하여 제거한다. 잔류 피콜, 혈소판, 및 혈장 단백질은 이어서 실온에서 10분 동안 200g에서 원심분리에 의해 40㎖의 PBS로 PBMC를 3회 세척함으로써 제거된다. 이어서 세포를 혈구계로 계수한다. 세척된 PBMC를 CAR-T 배지(AIM V-AlbuMAX®(BSA)(Life Technologies), 5% AB 혈청 및 1.25㎍/㎖ 암포테리신 B(Gemini Bioproducts, 캘리포니아주 우드랜드 소재), 100 U/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)로 1회 세척한다. 대안적으로, 세척된 PBMC를 절연된 바이알로 옮기고 나중 사용을 위하여 액체 질소에 저장하기 전에 24시간 동안 -80℃에서 냉동시킨다.
T-세포 활성화
전혈 또는 버피 코트로부터 제조된 PBMC는 바이러스성 형질도입에 앞서 24시간 동안 항-인간 CD28 및 CD3 항체-접합된 자기 비드로 자극시킨다. 새롭게 단리된 PBMC를 CAR-T 배지(AIM V-AlbuMAX(BSA)(Life Technologies)에서, huIL-2 없이 5% AB 혈청 및 1.25㎍/㎖ 암포테리신 B(Gemini Bioproducts), 100 U/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신)에서 1회 세척하고, 이어서 300 IU/㎖ 인간 IL-2(1000x 스톡으로부터; Invitrogen)를 가진 CAR-T 배지에 1x106개 세포/㎖의 최종 농도에서 재-현탁시킨다. PBMC가 이전에 냉동되었다면 이들을 해동시키고 1x106개 세포/㎖의 농도에서 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신의 존재 하에 9㎖의 사전-가온된(37℃) cDMEM 배지(Life Technologies)에 1x107개 세포/㎖로 재-현탁시키고 나서, 위에서 기재된 바와 같이 CAR-T 배지에서 1회 세척, CAR-T 배지에 1x106개 세포/㎖에서 재-현탁, 및 IL-2의 첨가가 실시된다.
활성화에 앞서, 항-인간 CD28 및 CD3 항체-접합된 자기 비드(예컨대, Invitrogen, Life Technologies로부터 입수 가능)는, 용액으로부터 비드를 단리시키기 위한 자기 래크를 이용하여, 1㎖의 멸균된 1x PBS(pH7.4)로 3회 세척하고 나서, CAR-T 배지에서, 300 IU/㎖ 인간 IL-2로, 4x107개 비드/㎖의 최종 농도로 재-현탁시킨다. PBMC 및 비드는 이어서, 1㎖의 PBMC에 비드의 25㎕(1x106 비드) 이동에 의해, 1:1 비드-대-세포 비로 혼합시킨다. 이어서, 목적하는 수의 분취액은 그 다음 12-웰 저-부착의 단일 웰, 또는 비-처리된 세포 배양판에 분배되고, 바이러스성 형질도입 이전 24시간 동안 5% CO2로 37℃에서 항온처리된다.
T-세포 형질도입/형질감염 및 확장
PBMC의 활성화 이후 세포는 37℃, 5% CO2에서 48시간 항온처리된다. 렌티바이러스는 얼음 상에서 해동시키고 5x106 렌티바이러스는 2㎕의 트란스플러스(TransPlus™)(Alstem)/㎖의 배지(1: 500의 최종 희석액)와 함께 1x106개 세포의 각 웰에 첨가한다. 세포는 바이러스의 반복 첨가 이전 추가의 24시간 동안 항온처리시킨다. 대안적으로, 렌티바이러스를 얼음 상에서 해동시키고 각각의 바이러스를 5㎍/㎖ 폴리브렌(polybrene)(Sigma)의 존재 하에 5 또는 50 MOI에서 첨가한다. 세포를 실온에서 100분 동안 100g로 원심접종한다. 세포는 그 다음 6 내지 14일의 기간 동안 인간 IL-2의 300 IU/㎖의 계속된 존재 하에 성장된다(총 항온처리 시간은 요구된 CAR-T-세포의 최종 수에 의존한다). 세포 농도는 매 2 내지 3일 분석되고, 배지는 세포 현탁액을 1x106개 세포/㎖로 유지하기 위해 그때 첨가된다.
몇몇 경우에 있어서, 활성화된 PBMC를 시험관내 전사된(IVT) mRNA로 전기천공시킨다. 일 실시형태에 있어서, 인간 PBMC는 300 IU/㎖ 재조합 인간 IL-2(R&D System)의 존재하에 3일 동안 1-대-1 비로 Dynabeads®(ThermoFisher)로 자극시킨다(다른 자극 시약, 예컨대, Milyeni Pharmaceuticals로부터의 TransAct T Cell Reagent가 사용될 수도 있다). 비드는 전기천공 이전 제거된다. 세포를 세척하고 2.5x107개 세포/㎖의 농도로 OPTI-MEM 배지(ThermoFisher)에 재-현탁시킨다. 200㎕의 세포 현탁액(5x106개 세포)을 2㎜ 갭 Electroporation Cuvettes Plus™(Harvard Apparatus BTX)으로 옮기고 얼음에서 사전냉각시킨다. 10㎍의 IVT TFP mRNA를 세포 현탁액에 첨가한다. 이어서, mRNA/세포 혼합물을 ECM830 Electro Square Wave Porator(Harvard Apparatus BTX)를 이용하여 20 밀리초 동안 200V로 전기천공시킨다. 전기천공 직후, 세포를 신선한 세포 배양 배지(AIM V AlbuMAX (BSA) 무혈청 배지 + 5% 인간 AB 혈청 + 300 IU/㎖ IL-2)로 옮기고 37℃에서 항온처리한다.
세포 염색에 의한 TFP 발현의 검증
렌티바이러스 형질도입 또는 mRNA 전기천공 이후, 항-메소텔린 TFP의 발현은, 쥣과 항-메소텔린 scFv를 검출하기 위하여 항-마우스 Fab 항체를 사용해서, 유세포분석에 의해 확인된다. T-세포를 3㎖ 염색 완충액(PBS, 4% BSA)에서 3회 세척하고 1x106개 세포/웰에서 재-현탁시킨다. 사멸 세포 배제를 위하여, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 LIVE/DEAD® Fixable Aqua Dead Cell Stain(Invitrogen)으로 항온처리한다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 50㎕ 염색 완충액에 재-현탁시킨다. Fc 수용체를 차단하기 위하여, 1㎕의 1:100 희석된 정상 염소 lgG(BD Bioscience)를 각각의 튜브에 첨가하고 10분 동안 얼음 위에서 항온처리한다. 1.0㎖ FACS 완충액을 각각의 튜브에 첨가하고, 잘 혼합하고, 세포를 5분 동안 300g으로 원심분리에 의해 펠릿화시킨다. scFv TFP의 표면 발현은 Zenon® R-피코에리트린-표지된 인간 MSLN IgG1 Fc 또는 인간 IgG1 아이소타입 대조군에 의해 검출된다. 1㎍의 항체를 각각의 샘플에 첨가하고, 얼음 위에서 30분 동안 항온처리한다. 이어서 세포를 2회 세척하고, BD bioscience로부터의 항-CD3 APC(클론, UCHT1), 항-CD4-Pacific blue(클론 RPA-T4), nti-CD8 APCCy7(클론 SK1)을 사용해서 표면 마커에 대해서 염색한다. 유세포 분석은 LSRFortessaTM X20(BD Biosciences)을 사용해서 수행하고, 데이터는 FACS 디바(diva) 소프트웨어를 사용해서 획득하고, FlowJo®(Treestar, Inc. 오리건주 애슐랜드 소재)로 분석한다.
예시적인 결과는 CD8(항-CD8 APCCy7, y-축) 및 메소텔린("MSLN")(Zenon® R-피코에리트린-표지된 hMSLN IgG, x-축)에 대해서 염색된 활성화된 PBMC 세포의 표면 발현 분석을 도시하는 도 5a에 도시되어 있다. 좌측으로부터 우측으로 비-형질도입되지 않은 세포 또는 항-MSLN-CD3ε, 항-MSLN-CD28ζ 및 항-MSLN-41BBζ 작제물로 형질도입된 세포가 도시되어 있다. CD8+, MSLN+ 세포의 비율이 각 패널의 우측 코너에 도시되어 있다.
도 5b는 인-하우스 단일 도메인("SD") 메소텔린 결합체를 포함하는 TFP 작제물로 형질도입된 MSLN 및 GFP로 염색된 활성화된 PBMC 세포로부터의 유사한 결과를 도시한다. 맨 위 행은 (좌측에서 우측으로) 비-형질도입 세포, 및 양성 대조군 항-MSLN-CD3ε TFP("SS1")로 형질도입된 세포를 나타낸다. 제2행 내지 제4행은 각각 GFP-태그된 (좌측에서 우측으로) CD3ε TFP, CD3γTFP, TCRβ TFP 및 CD28ζ CAR 작제물로 형질도입된 세포에서의 항-MSLN 결합체 SD1, SD4 및 SD6을 나타낸다. GFP+, MSLN+ 세포의 비율은 각 패널의 가장 우측 코너에 도시되어 있다.
실시예 6: 유세포 분석에 의한 세포독성 검정
메소텔린에 대하여 양성 또는 음성인 표적 세포는 형광 염료, 카복시플루오레신 다이아세테이트 석신이미딜 에스터(CFSE)로 표지된다. 이들 표적 세포는 비-형질도입되거나, 대조군 CAR-T 작제물로 형질도입되거나, TFP로 형질도입된 효과기 T-세포와 혼합된다. 표시된 항온처리 기간 이후, 사멸 대 살아있는 CFSE-표지된 표적 세포 및 음성 대조군 표적 세포의 백분율은 유세포분석에 의해 각각의 효과기/표적 세포 배양액에 대하여 결정된다. 각각의 T-세포 양성 표적 세포 배양액에서 표적 세포의 생존율 %는 표적 세포를 단독으로 함유하는 웰에 대해 계산된다.
효과기 T-세포의 세포독성 활성은, 유세포분석을 이용하는, 효과기 및 표적 세포의 코-항온처리 이후, 효과기 T-세포와 무관하게 표적 세포내 생존한 표적 세포의 수를 비교함으로써 측정되었다. 메소텔린 TFP 또는 CAR-T-세포를 이용한 실험에서, 표적 세포는 메소텔린-양성 세포이고, 반면에 음성 대조군으로서 사용된 세포는 메소텔린-음성 세포이다.
표적 세포는 1회 세척하고, 1×106개 세포/㎖에서 PBS에 재-현탁시킨다. 형광 염료 카복시플루오레신 다이아세테이트 석신이미딜 에스터 (CFSE)(ThermoFisher)를 0.03μM의 농도에서 세포 현탁액에 첨가하고 세포를 실온에서 20분 동안 항온처리되었다. 표지화 반응은, 반응 용적의 5배 용적에서 완전한 세포 배양 배지(RPMI-1640 + 10% HI-FBS)로 세포 현탁액에 첨가에 의해 중지시키고, 세포는 실온에서 추가의 2분 동안 항온처리시킨다. 세포는 원심분리에 의해 펠릿화시키고 2x105개 세포/㎖로 세포독성 배지(페놀 레드-무함유 RPMI1640(Invitrogen) 플러스 5% AB 혈청(Gemini Bioproducts)에서 재-현탁시킨다. 50 마이크로리터의 CFSE 표지된-표적 세포 현탁액(10,000개 세포와 동등)을 96-웰 U-바닥면 플레이트(Corning)의 각 웰에 첨가한다.
항-메소텔린 TFP 작제물로 형질도입된 효과기 T-세포는, 음성 대조군으로서의 비-형질도입 T-세포와 함께, 세척하고 세포독성 배지에서 2x106개 세포/㎖, 또는 1x106개 세포/㎖에서 현탁시킨다. 50㎕의 효과기 T-세포 현탁액(100,000 또는 50,000개 세포와 동등)을, 100㎕의 총 용적에서 10-대-1 또는 5-대-1 각각의 효과기-대-표적 비를 달성하기 위해 플레이팅된 표적 세포에 첨가한다. 이어서 배양액을 혼합하고, 회전시키고, 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 항온처리한다. 이 항온처리 직후에, 배양된 세포에 7AAD(7-아미노악티노마이신 D)(BioLegend)를 제조사에 의해 권고된 바와 같이 첨가하고, 유세포분석은 BD LSRFortessa™ X-20(BD Biosciences)으로 수행한다. 유세포분석 데이터의 분석은 FlowJo® 소프트웨어(TreeStar, Inc.)를 이용하여 수행한다.
표적 세포를 위한 생존 백분율은, 효과기 T-세포 및 표적 세포와 샘플 내 살아있는 표적 세포(CFSE+7-AAD-)의 수를 표적 세포 단독과 샘플 내 살아있는 (CFSE+7-AAD-) 세포의 수로 나누어서 계산한다. 효과기 세포에 대한 세포독성은 표적 세포에 대한 사멸 백분율 = 100% - 세포에 대한 생존 백분율로서 계산한다.
항-MSLN 28ζ CAR 작제물로 형질도입된 T-세포는, 비-형질도입된 또는 비-메소텔린-특이적 CAR 대조군으로 형질도입된 T-세포와 비교된 경우, 메소텔린-발현 세포에 대해 세포독성을 입증할 수 있다. 그러나, 항-메소텔린-CD3ε로 형질도입된 T-세포는 항-메소텔린 CAR 대조군보다 표적에 대해 더욱 효율적인 세포독성을 유도할 수 있다. 항-메소텔린-CD3γ TFP는 또한 효과기:표적비 5 내지 10:1에서 항-메소텔린-CAR에서 관찰된 것보다 더 많은 강력한 세포독성을 매개할 수 있다. 일부 세포독성은 항-메소텔린-TCRα 및 항-메소텔린-TCRβ TFP에서 관찰될 수 있다. 유사한 결과는 대안적인 힌지 영역으로 작제된 항-메소텔린 TFP에서 얻어질 수 있다. 다시 한번, 메소텔린-발현 표적 세포에 대한 세포독성은 항-메소텔린-CAR-형질도입된 T-세포보다 항-메소텔린-CD3ε 또는 항-메소텔린-CD3γ TFP-형질도입된 T-세포에서 더 많을 수 있다.
메소텔린에 특이적인 TFP를 암호화하는 mRNA로 전기천공된 T-세포는 또한 메소텔린-발현 세포에 대해 강력한 세포독성을 입증할 수 있다. 메소텔린-음성 세포의 상당한 사멸은 대조군 또는 항-메소텔린 TFP 작제물에서 볼 수 없었지만, 메소텔린-발현 세포의 메소텔린-특이적 사멸은 항-메소텔린-CD3ε SL, 또는 항-메소텔린-CD3γ SL TFP로 형질도입된 T 세포에 의해 관찰될 수 있다.
실시예 8: 실시간 세포독성 검정에 의한 세포독성의 결정
항-메소텔린 TFP는 또한 실시간 세포독성 검정(RTCA) 포맷으로 항-메소텔린 CAR에 비해서 우수한 세포독성을 입증할 수 있다. RTCA 검정은 실시간으로 특화된 96-웰 플레이트의 각각의 웰에서 부착 표적 세포 단일층의 전기 임피던스를 측정하고 세포 지수로 불리는 값으로서 최종 독출치를 제시한다. 세포 지수의 변화는 공동-항온처리된 T-세포 효과기에 의한 표적 세포의 사멸의 결과로서 표적 세포 단일층의 파괴를 나타낸다. 따라서 효과기 T-세포의 세포독성은 표적 세포 단독을 가진 웰의 것과 비교된 표적 세포 및 효과기 T-세포 둘 모두를 가진 웰의 세포 지수의 변화로서 평가될 수 있다.
부착 표적 세포는 DMEM, 10% FBS, 1% Antibiotic-Antimycotic(Life Technologies)에서 배양된다. RTCA를 제조하기 위해, 50㎕의 예컨대 DMEM 배지를 E-플레이트(ACEA Biosciences, Inc, 카탈로그#: JL-10-156010-1A)의 적절한 웰에 첨가한다. 이어서, 플레이트를 RTCA MP 기기(ACEA Biosciences, Inc.)에 배치하고 적절한 플레이트 레이아웃 및 검정 스케줄은 제조사 매뉴얼에서 기재된 바와 같이 RTCA 2.0 소프트웨어에 입력되었다. 기준치 측정은 100회 측정 동안 15분마다 수행한다. 이어서 각각의 검정 웰에 100㎕ 용적의 1x104개 표적 세포를 첨가하고 세포를 15분 동안 침강시킨다. 플레이트를 판독기에 되돌리고 판독을 재개한다.
다음날, 효과기 T-세포를 세척하고, 세포독성 배지(페놀 레드-무함유 RPMI1640(Invitrogen) 플러스 5% AB 혈청(Gemini Bioproducts; 100-318))에 재-현탁시킨다. 이어서, 플레이트를 기기로부터 제거하고고, 세포독성 배지(페놀 레드-무함유 RPMI1640 + 5% AB 혈청)에 현탁된 효과기 T-세포를, 10-대-1 또는 5-대-1 각각의 효과기-대-표적비를 달성하기 위해 100,000개 세포 또는 50,000개 세포로 각 웰에 첨가한다. 이어서, 플레이트를 기기에 도로 배치한다. 측정은 100회 측정 동안 2분마다, 이어서 1,000회 측정 동안 15분마다 수행한다.
RTCA 검정에서, 메소텔린-형질도입된 세포의 사멸은, 세포 단독 또는 대조군 CAR 작제물로 형질도입된 T-세포와 공동-항온처리된 세포에 비해 효과기 세포의 첨가 이후 세포 지수의 시간-의존적 감소에 의해 입증되는 바와 같이, 항-메소텔린-28ζ CAR-형질도입된 T-세포로 형질도입된 T-세포에 의해 관찰될 수 있다. 그러나, 항-메소텔린-CD3ε TFP-발현 T-세포에 의한 표적 세포 사멸은 항-메소텔린 CAR로 관찰된 것보다 더 깊고 더 신속할 수 있다. 예를 들어, 항-메소텔린-CD3ε TFP로 형질도입된 T-세포의 첨가 4시간 이내에, 메소텔린-발현 표적 세포의 사멸은 본질적으로 완전할 수 있다. 다른 CD3 및 TCR 작제물을 포함하는 수많은 TFP 작제물로 형질도입된 T-세포에 의한 사멸은 거의 또는 전혀 관찰될 수 없다. 유사한 결과가 대안적인 힌지 영역으로 작제된 항-메소텔린 TFP로 얻어질 수 있다. 메소텔린-형질도입된 표적 세포에 대한 세포독성은 항-메소텔린-CAR-형질도입된 T-세포보다 항-메소텔린-CD3ε 또는 항-메소텔린-CD3γ TFP-형질도입된 T-세포가 더 클 수 있다.
TFP-형질도입된 T-세포의 세포독성 활성은 형질도입에 사용된 바이러스의 양(MOI)에 관하여 용량-의존적일 수 있다. 메소텔린 양성 세포의 증가된 사멸은 항-메소텔린-CD3ε TFP 렌티바이러스의 MOI 증가, TFP 형질도입과 세포독성 활성 사이 관계의 추가 보강으로 관찰될 수 있다.
RTCA 검정의 예시적인 결과가 도 6에 도시되어 있다. 항-MSLN TFP 작제물을 XbaI 및 EcoRI 부위에서 링커를 암호화하는 DNA 서열: GGGGSGGGGSGGGGSLE (서열번호 1)에 의해 CD3ε DNA 단편에 연결된 항-MSLN scFv DNA 단편을 p510 벡터(SBI사로부터 입수)에 클로닝함으로써 조작하였다. 생성된 항-MSLN TFP 작제물은 p510_항MSLN_SS1_CD3ε(항-MSLN SS1 scFv - 링커 - 인간 CD3ε쇄)였다.
전장 메소텔린(NM_005823)은 깁슨 재조합 반응(Gibson Recombination reaction)을 통해서 pCMV6_XL4_메소텔린(Origene)으로부터 PCR 증폭시키고 XbaI 및 EcoRI 제한 소화된 p527a(pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro)(SBI)로 클로닝시켰다.
RTCA에 대한 표적 세포는 메소텔린-양성 HeLa 세포(자궁경부 선암종, ATCC® CCL-2™)였고 메소텔린-음성 PC-3 세포(전립선 선암종, ATCC® CRL-1435™)은 음성 대조군으로서 사용하였다. 부착 표적 세포를 10% FBS 및 1% Antibiotic-Antimycotic(Life Technologies)를 가진 DMEM에서 배양하였다.
세포독성을 나타내는 정규화된 세포 지수를 결정하였다. 활성화된 PBMC는, 미처리되거나(자취 #1), 비-형질도입되거나(자취 #2), 또는 빈 벡터로 형질되입되거나(자취 #3), 항-MSLN TFP("항-MSLN-CD3ε TRuC", 자취 #4), CD28ζ(자취 #5) 또는 41BBζ(자취#6) 신호전달 도메인을 가진 항-MSLN CAR(각각 "항-MSLN-28ζ CAR" 및 "항-MSLN-41BBζ CAR")로 형질도입되었다.
도 6a에 도시된 바와 같이, 표적 MSLN-양성 HeLa 세포는 음성 대조군에 비해서 항-MSLN TFP-형질도입된 T 세포에 의해 효율적으로 사멸되었다. 이와 대조적으로, MSLN-음성 PC-3 세포는 어떠한 작제물에 의해서도 효율적으로 사멸되지 않았다(도 6b).
유사한 실험을 단일-도메인 항-메소텔린 결합체를 가진 인-하우스 TFP 작제물을 이용해서 수행하였다. 도 6c는 두 상이한 인간 공여체로부터의 T 세포를 이용해서 높은 표적 밀도 세포주(HeLa-(MSLN하이))에서 MSLN-양성 세포의 사멸을 나타낸다(상부 및 하부). 항-MSLN 결합체 SD1(좌측), SD4(중간) 및 SD6(우측)를 가진 TFP T 세포에 대한 세포 사멸 자취가 도시되어 있다. 활성화된 PBMC에 비-형질도입하거나(자취 #1), 또는 CD3ε TFP(자취 #2), CD3γ TFP(자취 #3), TCRβ TFP(자취 #4) 또는 CD28ζ CAR(자취 #5)로 형질도입하였다. 세포독성을 나타내는 정규화된 세포 지수는 실시간 세포 분석기(RTCA) 검정에서 결정되었다. 도면에 도시된 바와 같이, 비-형질도입된 것을 제외하고 모든 T 세포는 암세포를 사멸시킬 수 있었다.
실시예 7: 높은 또는 낮은 표적 밀도를 가진 세포에서의 루시퍼라제 -기반 세포독성 검정
루시퍼라제-기반 세포독성 검정("Luc-Cyto" 검정)은 공-배양 후 잔류하는 살아있는 표적 세포에서 루시퍼라제 효소 활성도를 간접적으로 측정함으로써 TFP T 및 CAR T 세포의 세포독성을 평가한다. Luc-Cyto 검정에서 사용된 높은 표적 밀도 세포는 HeLa-MSLN하이 세포였고, 사용된 낮은 표적 밀도 세포는 낮은 수준의 메소텔린(PC3-MSLN로우)을 발현하는 PC3 세포였고, 각각은 개똥벌레 루시퍼라제를 발현시키도록 안정적으로 형질도입되었다. 개똥벌레 루시퍼라제를 암호화하는 DNA는 GeneArt®(Thermo Fisher®)에 의해 합성하고 단일-프로모터 렌티바이러스 벡터 pCDH527A-1(System Bioscience)의 다중 클로닝 부위에 삽입하였다.
개똥벌레 루시퍼라제를 보유하는 렌티바이러스는 위에서와 같이 패키징하였다. 이어서 24시간 동안 HeLa-MSLN하이 또는 PC3-MSLN로우 세포 개똥벌레 루시퍼라제 작제물 보유 렌티바이러스를 형질도입하고 이어서 퓨로마이신(5㎍/㎖)으로 선택하였다. HeLa-luc-MSLN하이- 및 PC3-luc-MSLN로우-루시퍼라제 세포의 생성은 Bright-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(Promega)으로 세포 내 루시퍼라제 효소 활성도를 측정함으로써 확인하였다.
두 상이한 인간 공여체로부터의 개별의 집단에, 빈 발현 벡터("NT"), 또는 이하의 TFP 또는 CAR: 항-MSLN(양성 대조군, "SS1", 친화도 11nM), 항-MSLN-SD1(친화도 25nM), 항-MSLN-SD4(친화도 6nM), 또는 항-MSLN SD6(친화도 0.59nM)을, 각각 CD3ε TFP, CD3γ TFP, TCRβ TFP 및 CD28ζ CAR의 포맷으로 형질도입하였다. 형질도입된 T 세포의 두 집단을 HeLa- MSLN하이(도 7) 또는 PC3-MSLN로우(도 8)와 함께 배양하였다.
표적 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰당 5000개 세포로 평판배양하였다. TFP T, CAR T, 또는 대조 세포를 효과기-대-표적비 또는 1:1(흑색 막대) 또는 1:5(회색 막대)에서 표적 세포에 첨가하였다. 이어서, 세포의 혼합물을 37℃에서 5% CO2로 24시간 동안 배양하고 나서 살아있는 표적 세포 중의 루시퍼라제 효소 활성도를 Bright-Glo® 루시퍼라제 검정 시스템에 의해 측정하였다. 세포를 펠릿으로 스피닝하고 루시퍼라제 기질을 함유하는 배지에 재현탁시켰다. 루시퍼라제는 세포 용해물에 의해 방출되고, 따라서 더 높은 루시퍼라제 활성도가 더 높은 세포 사멸 퍼센트에 대응한다.
높은 수준의 MSLN을 발현하는 세포를 사용하는 결과가 도 7에 도시되어 있다. T 세포가 없거나("표적 단독"), 빈 벡터 형질도입었거나("NT"), 항-MSLN(양성 대조군, "SS1") 또는 인-하우스 항-메소텔린 결합체 SD1(도 7a), SD4(도 7b), 및 SD6(도 7c)를 가진 항-메소텔린 TFP T 세포로 각각 CD3ε TFP, CD3γ TFP, TCRβ TFP, 및 CD28ζ CAR의 포맷으로 형질도입된 샘플에서 사멸된 세포의 %가 도시되어 있다. 각 그래프에서, 흑색 막대는 1:1비의 T 세포 대 표적 세포를 나타내고, 회색 막대는 1:5비의 T 세포 대 표적 세포를 나타낸다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, TFP-T 세포, CAR-T 세포, 및 양성 대조군 SS1의 모두는 MSLN을 사멸시킴에 있어서 효과적이었다
도 8은 낮은 수준의 메소텔린(PC3-MSLN로우)을 발현하는 표적 세포주에 대한 항-MSLN CAR T 세포 및 TFP T 세포의 활성도를 도시하는 일련의 그래프이다. T 세포가 없거나("표적 단독"), 빈 벡터 형질도입되거나("NT"), 항-MSLN(양성 대조군, "SS1"), 또는 항-메소텔린 작제물 SD1, SD4 및 SD6으로 CD3ε(도 8a), CD3γ(도 8b), TCRβ(도 8c) 및 CD28ζ CAR(도 8d)의 TFP 포맷으로 형질도입된 샘플에서 사멸된 세포의 %가 도시되어 있다. 각 그래프에서, 흑색 막대는 1:1비의 T 세포 대 표적 세포를 나타내고, 회색 막대는 1:5비의 T 세포 대 표적 세포를 나타낸다. 마찬가지 결과가 두 번째 T 세포 공여체에 대해서 나타났다.
도면에 도시된 바와 같이, 1:1비의 T 세포 대 표적 세포는 예상된 바와 같이 가장 높은 수준의 표적 세포의 사멸을 초래하였다. 또한, 모든 TFP T 및 CAR T 세포는 높은 수준의 MSLN을 발현하는 세포에서 유사한 활성도를 나타내었다.
실시예 8: FACS에 의한 T 세포의 활성화의 측정
항-MSLN CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 T-세포의 활성화는 MSLN+ 및 MSLN- K562 세포를 이용해서 수행하였고, 도 9에 도시되어 있다. 위에서 기재된 바와 같이, 활성화된 PBMC에 연속 2일 동안 50 MOI LV로 형질도입하고, 확장시켰다. 형질도입 후 8일째에, PBMC의 공-배양물을 세포독성 배지(페놀 레드-무함유 RPMI1640(Invitrogen) 플러스 5% AB 혈청(Gemini Bioproducts; 100-318)에서 E:T, 1:1비(0.2 x 106개 각 세포 유형)에서 표적 세포(MSLN을 과발현하는 K562 세포)로 셋업하였다. BCMA를 과발현하는 K562 세포는 음성 대조군으로서 사용되었다. 공-배양 개시 후 24시간에, 세포를 수거하고, PBS로 3회 세척하고 얼음 위에서 30분 동안 Live/Dead Aqua로 염색하였다. Fc 수용체를 차단시키기 위하여, 인간 Fc 블록(BD)을 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. 이어서 세포를 BD Biosciences로부터의 항-CD3 APC(클론, UCHT1), 항-CD8 APCcy7(Clone SK1), 항-CD69-Alexa Fluor® 700(클론 FN50)로 그리고 항-CD25-PE(클론 BC96, eBioscience)로 염색하였다. 세포를 2회 세척하고, BD LSRII-Fortessa로 분석하였다. 데이터는 FlowJo® 분석 소프트웨어(Tree star, Inc.)를 사용해서 위에서와 같이 분석하였다.
도 9a에 도시된 바와 같이, 좌측으로부터 우측으로, T 세포는 비-형질도입되거나, 빈 벡터로 형질도입되거나, 항-MSLN-CD3ε TFP, 항-MSLN-28ζ CAR 또는 항-MSLN-41BBζ CAR로 형질도입되었다. MSLN- 세포와 공-배양된 세포는 위쪽 행에 도시되고, MSLN+ 표적 세포와 공-배양된 것은 아래쪽 행에 도시되어 있다. 이어서, 세포를 표면 활성화 마커 CD69 및 CD25에 대해서 특이적인 항체로 염색하였다. 항-CD69로 염색된 세포의 수는 x-축에 대응하고 항-CD25로 염색된 것은 y-축에 대응한다. 도시된 바와 같이, 항-메소텔린 CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 T-세포는, MSLN- 세포로 공-배양된 것에 비해서, 상승된 수준의 CD69 및 CD25 발현에 의해 입증되는 바와 같이 MSLN+ 세포와 배양함으로써 활성화되었다(도 9b). MSLN-(흰색 막대) 및 MSLN+(흑색 막대) 세포 내 각 작제물에 대한 CD25+ 세포의 퍼센트가 도시되어 있다.
유사한 실험은 비-형질도입 T 세포 또는 항-MSLN 양성 대조군 결합체("510-SS1-CD3ε)로 형질도입된 T 세포에서 K562 MSLN- 세포(도 9C, 원) 및 K562-MSLN+ 세포(도 9C, 사각형)를 사용해서 행하였다. 데이터는 CD25+, CD69+ 및 CD25+/CD69+ 세포의 합계를 나타낸다. 도 9d에서, 데이터는 CD3ε, CD3γ, TCRβ 및 CD28ζ CAR의 TFP 포맷을 가진 공여체 T 세포와 조합된 K562 MSLN- 표적 세포(좌측 패널) 및 K562 MSLN+ 세포(우측 패널) 내 인-하우스 항-MSLN 결합체 SD1(사각형), SD4(원) 및 SD6(삼각형)에 대해서 도시되어 있다. 마찬가지 결과는 두 번째 T 세포 공여체로부터의 세포를 사용해서 볼 수 있었다.
T-세포의 활성화는 그랜자임 B 생산의 분석에 의해 마찬가지로 평가될 수 있다. T-세포를 위에서 기재된 바와 같이 배양하고 확장시키고, 그랜자임 B에 대한 세포내 염색은 제조사의 키트 설명서(Gemini Bioproducts; 100-318)에 따라서 행한다. 세포를 수거하고 PBS로 3회 세척하고 인간 Fc 블록으로 10분 동안 차단시킨다. 세포를 항-CD3 APC(클론, UCHT1) 및 항-CD8 APCcy7(클론 SK1)을 가진 표면 항원에 대해서 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 고정화/투과 용액(BD Cytofix/Cytoperm 고정화/투과 키트(Fixation/Permealbilzation kit) cat #554714)으로 4℃에서 20분 동안 고정화시키고, 이어서 BD 투과/세척(Perm/Wash) 완충액으로 세척하였다. 이어서 세포를 항-그랜자임 B Alexafluor700(클로 GB11)으로 염색하고 BD 투과/세척 완충액으로 2회 세척하고 FACS 완충액에 재현탁시켰다. 데이터는 BD LSRII-Fortessa 상에서 획득하였고 FlowJo®(Tree star Inc.)를 사용해서 분석하였다.
도 10a에 도시된 바와 같이, 좌측으로부터 우측으로, T 세포를 비-형질도입하거나, 빈 벡터로 형질도입하거나, 항-MSLN-CD3ε TFP, 항-MSLN-28ζ CAR, 또는 항-MSLN-41BBζ CAR로 형질도입하였다. MSLN- 세포와 공-배양된 세포는 위쪽 행에 도시되고, MSLN+ 표적 세포와 공-배양된 것은 아래쪽 행에 도시되어 있다. 항-GrB로 염색된 세포의 수는 x-축에 대응하고, 항-CD8로 염색된 것은 y-축에 대응한다. 도시된 바와 같이, 항-메소텔린 CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 T-세포는 MSLN- 세포에 의해서가 아니라 MSLN+ 세포와 배양함으로써 활성화되었다. 이들 결과는 도 10b에 도시되어 있으며, 여기서 메소텔린 음성("MSLN-", 흰색 막대) 및 메소텔린 양성("MSLN+, 흑색 막대) 세포 내 각 작제물에 대한 GrB+ 세포의 퍼센트가 도시되어 있다. 이들 데이터는 T-세포를 특이적으로 활성화시키는 MSLN-발현 세포의 능력을 입증한다.
실시예 9: ELISA에 의한 IL-2 및 IFN-γ 분비
동족 항원을 보유하는 세포의 인식과 관련된 효과기 T-세포 활성화 및 증식의 또 다른 측정은 효과기 사이토카인, 예컨대, 인터류킨-2 (IL-2) 및 인터페론-감마 (IFN-γ)의 생산이다.
인간 IL-2(카탈로그 #EH2IL2, Thermo Scientific) 및 IFN-γ 카탈로그 #KHC4012, Invitrogen)에 대한 ELISA 검정은 제품내 삽입물에서 기재된 바와 같이 수행한다. 간단히, 50㎕의 재구성된 표준 및 샘플을 두 벌로 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 이어서 50㎕의 바이오티닐화된 항체 시약을 첨가한다. 플레이트를 몇 번 약하게 탭핑함으로써 샘플을 혼합시킨다. 이어서, 50㎕의 표준 희석제를 표준 또는 샘플을 함유하지 않았던 모든 웰에 첨가하고 플레이트는 실온(20 내지 25℃)에서 3시간 동안 항온처리에 앞서 접착제 플레이트 커버로 주의하여 밀봉한다. 이어서 플레이트 커버를 제거하고, 플레이트 내용물을 비우고 각각의 웰을 세척 완충액으로 채운다. 이러한 세척 절차는 총 3회 반복하고 플레이트를 종이 타월 또는 다른 흡수제 물질 상에 흡입시킨다. 100㎕의 제조된 스트렙타비딘-HRP 용액을 각 웰에 첨가하고 새로운 플레이트 커버를 실온에서 30분 동안 항온처리에 앞서 부착시킨다. 플레이트 커버를 재차 제거하고, 플레이트 내용물을 버리고, 100㎕의 TMB 기질액을 각 웰에 첨가한다. 반응은 30분 동안 암소에서 실온으로 전개시키고, 그 후 100㎕의 중지 용액을 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 평가한다. 흡광도는 반응 중지 30분 이내에 450㎚ 및 550㎚에서 세트된 ELISA 플레이트 판독기에서 측정된다. 550㎚ 값은 450㎚ 값으로부터 공제하고 미지의 샘플 내 IL-2 양은 IL-2 표준 곡선으로부터 얻어진 값에 대해서 계산되었다.
대안적으로, 2-플렉스(Plex) 검정은 인간 IL-2 자기 비드 키트(Invitrogen, LHC0021M) 및 인간 IFN-γ 자기 비드 키트(Invitrogen, LHC4031M)와 인간 사이토카인 자기 완충액 시약 키트(Invitrogen, LHB0001M)을 이용하여 수행되었다. 간단히, 25㎕의 인간 IL-2 및 IFN-γ 항체 비드를 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 하기 지침을 이용하여 세척한다: 200㎕ 1x 세척액의 2회 세척, 자기 96-웰 플레이트 분리기(Invitrogen, A14179)와 접촉하여 플레이트 배치, 1분 동안 비드 침강 및 액체의 따라버리기. 이어서, 50㎕의 항온처리 완충액을 플레이트의 각 웰에 100㎕의 재구성된 표준과 두 벌로 또는 50㎕의 샘플(세포독성 검정으로부터 상청액) 및 50㎕의 검정 희석제와, 세 벌로 150㎕의 총 용적으로 첨가한다. 샘플을 암소에서 3㎜ 궤도 반경을 가진 회전식 진탕기에서 600 rpm에서 2시간 동안 실온에서 혼합한다. 플레이트를 동일한 세척 지침에 따라 세척하고 100㎕의 인간 IL-2 및 IFN-γ 바이오티닐화된 검출기 항체를 각 웰에 첨가한다. 샘플은 암소에서 3㎜ 궤도 반경을 가진 회전식 진탕기에서 600 rpm에서 1시간 동안 실온에서 혼합한다. 플레이트를 동일한 세척 지침에 따라 세척하고 100㎕의 스트렙타비딘-R-피코에리트린을 각 웰에 첨가한다. 샘플을 암소에서 3㎜ 궤도 반경을 가진 회전식 진탕기에서 600 rpm에서 30분 동안 실온에서 혼합한다. 플레이트를 동일한 세척 지침을 이용하여 3회 세척하고 액체 따라버리기 이후 샘플을 150㎕의 1x 세척액에 재-현탁시킨다. 샘플을 3㎜ 궤도 반경을 가진 회전식 진탕기에서 600 rpm에서 3분 동안 혼합하고 4℃에서 하룻밤 저장한다. 나중에, 플레이트를 동일한 세척 지침에 따라 세척하고 샘플을 150㎕의 1x 세척액에 재-현탁시킨다.
플레이트는 MAGPIX 시스템(루미넥스) 및 xPONENT 소프트웨어를 이용하여 판독한다. 데이터의 분석은, 표준 곡선 및 사이토카인 농도를 제공하는, MILLIPLEX Analyst 소프트웨어를 이용하여 수행한다.
비-형질도입된 또는 대조군 CAR-형질도입된 T-세포에 비하여, 항-메소텔린 TFP로 형질도입된 T-세포는, 메소텔린 또는 메소텔린-형질도입된 세포를 내인성으로 발현하는 어느 하나의 세포와 공-배양된 경우에 IL-2 및 IFN-γ 둘 다 더 높은 수준을 생성할 수 있다. 이와 대조적으로, 메소텔린 음성 세포 또는 비-형질도입 세포와의 공-배양물은 TFP-형질도입된 T-세포로부터 사이토카인 방출을 거의 또는 전혀 초래하지 않을 수 있다. 이전의 세포독성 데이터와 일관되게, 대안적인 힌지 영역으로 작제된 항-메소텔린 TFP는 메소텔린-보유 표적 세포와 공-배양 시 유사한 결과를 발생할 수 있다.
이전의 세포독성 데이터와 일차하여, 항-메소텔린-CD3ε 및 항-메소텔린-CD3γ는 TFP 작제물의 최고 IL-2 및 IFN-γ 수준을 생산할 수 있다. 그러나, 항-메소텔린-CD3ε 및 항-메소텔린-CD3γ TFP로 형질도입된 T-세포에 의한 사이토카인 생산은, 훨씬 높은 수준의 표적 세포 사멸을 입증하는 TFP에도 불구하고, 항-메소텔린-28ζ CAR을 발현하는 T-세포의 것과 비교할만한 할 수 있다. TFP가 CAR보다 더 효율적으로 표적 세포를 사멸시킬 수 있지만, 전-염증성 사이토카인의 비교할 만한 방출 또는 더 낮은 수준은, 이들 사이토카인의 상승된 수준이 입양 CAR-T 요법에 대하여 용량-제한 독성과 연관되어 있기 때문에 CAR에 비하여 TFP에 잠재적인 이점을 나타낸다.
예시적인 결과는 도 11에 도시되어 있다. 위에서 설명된 바와 같이, 활성화된 PBMC에 연속 2일 동안 50 MOI 렌티바이러스로 형질도입하였다. 형질도입 후 8일째에, PBMC의 공-배양물을 세포독성 배지(페놀 레드-무함유 RPMI1640(Invitrogen) 플러스 5% AB 혈청(Gemini Bioproducts; 100-318)에서 E:T, 1:1비(0.2 x 106개 각 세포 유형)에서 표적 세포(MSLN을 과발현하는 K562 세포)로 셋업하였다. BCMA를 과발현하는 K562 세포는 음성 대조군으로서 사용되었다. 24시간 후에, 세포는, 위에서 기재된 바아 같이 ELISA에 의해서 IFN-γ(도 11a) 및 IL-2(도 11b) 발현에 대해서 분석되었다. 각 도면에서, 좌측으로부터 우측으로, T 세포에는 비-형질도입하거나, 빈 벡터로 형질도입하거나, 항-MSLN-CD3ε TFP, 항-MSLN-28ζ CAR 또는 항-MSLN-41BBζ CAR로 형질도입하였다. MSLN- 세포와 공-배양된 세포는 흰색 막대로 나타내고, MSLN+ 표적 세포와 공-배양된 것은 흑색 막대로 나타낸다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 항-메소텔린 CAR 및 TFP 작제물을 발현하는 T-세포는, MSLN- 세포에 의해서가 아니라 MSLN+ 세포와 공-배양함으로써 IFN-γ 및 IL-2 둘 다의 생산에 의해 입증되는 바와 같이 활성화되었으며, 이는 T-세포를 특이적으로 활성화시키는 MSLN-발현 세포의 능력을 더욱 입증한다.
실시예 10: 유세포분석에 의한 CD107a 노출
T-세포 활성화를 위한 추가의 검정은 휴지 세포내 세포질 세포용해 과립의 막에서 위치한 CD107a, 리소좀 연관 막 단백질(LAMP-1로서도 공지됨)의 표면 발현이다. 효과기 T-세포의 탈과립화, 세포용해 활성을 위한 전제조건은 활성화-유도된 과립 엑소사이토시스 이후 세포 표면에 CD107a의 동원을 초래한다. 따라서, CD107a 노출은, 사이토카인 생산에 더하여, 세포독성과 밀접하게 상관하는 T-세포 활성화의 추가의 측정을 제공한다.
표적 및 효과기 세포를 개별적으로 세척하고 세포독성 배지(RPMI+5% 인간 AB 혈청 + 1% 항생제 항진균성)에 재-현탁시킨다. 검정은, 0.5㎕/웰의 PE/Cy7-표지된 항-인간 CD107a(LAMP-1) 항체(클론-H4A3, BD Biosciences)의 존재 하에, U-바닥면 96-웰 플레이트(Corning) 내 100㎕ 최종 용적으로 2x105개 표적 세포와 2x105개 효과기 세포를 배합시킴으로써 수행된다. 이어서, 배양액을 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 항온처리한다. 이러한 항온처리 직후, 10㎕의 1:10 희석액의 분비 억제제 모넨신(1000x 용액, BD GolgiStopTM)을 세포를 교란시키는 일 없이 각 웰에 주의하여 첨가한다. 이어서, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 추가 2.5시간 동안 항온처리한다. 이 항온처리 후에, 세포를 APC 항-인간 CD3 항체(클론-UCHT1, BD Biosciences), PerCP/Cy5.5 항-인간 CD8 항체(클론-SK1, BD Biosciences) 및 퍼시픽 블루 항-인간 CD4 항체(클론-RPA-T4, BD Biosciences)로 염색하고, 그 후 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 항온처리한다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 2x 세척하고, 분석 전에 100㎕ FACS 완충액 및 100ul IC 고정 완충액에 재현탁시킨다.
T-세포의 표면 상에 CD107a의 노출은 유세포 분석에 의해 검출된다. 유세포 분석은 LSRFortessaTM X20(BD Biosciences)로 수행되고 유세포분석 데이터의 분석은 FlowJo 소프트웨어(Treestar, Inc. 오리건주 애슐랜드 소재)를 사용해서 수행된다. CD3 게이트 내에, CD107 +ve인 CD8+ 효과기 세포의 퍼센트는 각각의 효과기/표적 세포 배양액에 대해서 결정된다.
이전의 세포독성 및 사이토카인 데이터와 일관되게, 항-메소텔린-28ζ CAR로 형질도입된 효과기 T-세포와 메소텔린-발현 표적 세포의 공-배양은 메소텔린 음성 표적 세포로 항온처리된 효과기에 비해 표면 CD107a 발현에서 증가를 유도할 수 있다. 비교로서, 동일한 상태 하에, 항-메소텔린-CD3ε LL 또는 항-메소텔린-CD3γ LL TFP-발현 효과기는 CD107a 발현의 5 내지 7-배수 유도를 나타낼 수 있다. 대안적인 힌지 영역으로 작제된 항-메소텔린 TFP는 메소텔린-보유 표적 세포로 공-배양한 때와 유사한 결과를 생성할 수 있다.
실시예 11: 생체내 마우스 효능 연구
생체내 항-종양 반응을 달성하기 위하여 항-메소텔린 TFP로 형질도입된 효과기 T-세포의 능력을 평가하기 위해, 항-메소텔린-28ζ CAR, 항-메소텔린-CD3ε LL TFP 또는 항-메소텔린-CD3γ LL TFP로 형질도입된 효과기 T-세포는 메소텔린+ 인간 암세포주로 이전에 접종되어 있던 NOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX) 마우스에 입양 전달된다.
연구 시작에 앞서 적어도 6주령인, 암컷 NOD/SCID/IL-2Rγ-/-(NSG-JAX) 마우스를 잭슨(Jackson) 실험실(스톡 번호 005557)로부터 얻고, 실험 사용 이전 3일 동안 순응시킨다. 접종을 위한 인간 메소텔린-발현 세포주는 생세포 계수치를 결정하기 위해 수확 및 트리판 블루로의 계수에 앞서 대수상 배양에서 유지된다. 종양 시험감염 날에, 세포를 5분 동안 300g로 원심분리시키고 0.5 내지 1x106개 세포/100㎕에서 사전-가온된 멸균된 PBS에서 재-현탁시킨다. 비-형질도입된 또는 항-메소텔린-28ζ CAR, 항-메소텔린-CD3ε LL TFP 또는 항-CD3γ LL TFP 작제물로 형질도입된, 입양 전달용 T-세포가 제조된다. 연구 0일째에, 실험군당 10마리의 동물을 0.5 내지 1x106개 메소텔린 세포로 정맥내 시험감염시킨다. 3일 후, 5x106개의 표시된 효과기 T-세포 집단을 100㎕의 멸균된 PBS 중에서 각각의 동물에 정맥내로 시험감염시킨다. 동물에 관한 상세한 임상 관찰은 안락사까지 매일 기록한다. 체중 측정은 사망 또는 안락사까지 매주 모든 동물에서 실시된다. 모든 동물은 시험 및 대조군 물품의 입양 전달 35일후 안락사시킨다. 연구 동안 빈사를 보이는 임의의 동물은 수의사와 협의하여 연구 책임자의 재량으로 안락사시킨다.
비-형질도입된 T-세포에 비해서, 항-메소텔린-28ζ CAR, 항-메소텔린-CD3ε LL TFP 또는 항-메소텔린-CD3γ LL TFP 중 어느 하나로 형질도입된 T-세포의 입양 전달은 메소텔린-발현 세포주 종양-보유 마우스의 생존을 연장시킬 수 있고, 양쪽 항-메소텔린 CAR 및 TFP-형질도입된 T-세포가 이들 마우스 모델 내 대응하는 증가된 생존율로 표적 세포 사멸을 매개할 수 있음을 나타낼 수 있다. 집합적으로, 이들 데이터는 TFP가 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 제1 생성 CAR보다 우수한 항원-특이적 사멸을 입증하는 키메라 수용체를 조작하기 위한 대안적인 플랫폼을 나타내는 것을 표시할 수 있다.
실시예 12: 생체내 고형 종양 이종이식 마우스 모델에서의 인간 TFP T-세포 치료
인간 TFP. 메소텔린 T-세포의 에 의한 치료 효능이 또한 인간 메소텔린-발현 ALL, CLL, NHL, 또는 MSTO 인간 세포주로부터 유래된 피하 고형 종양을 보유하는 면역 손상된 마우스 모델에서 시험될 수 있다. 인간 TFP.메소텔린 T-세포에 의한 치료에 반응하는 종양 수축이 종양 크기의 캘리퍼스 측정에 의해 또는 녹색 형광 단백질(GFP)-발현 종양 세포에 의한 것 또는 방출된 GFP 신호의 강도에 의한 것 중 어느 하나로 평가될 수 있다.
원발성 인간 고형 종양 세포는 시험관내에서 배양하는 일 없이 면역 손상된 마우스에서 성장될 수 있다. 예시적인 고형 암세포는, 예컨대, The Cancer Genome Atlas(TCGA) 및/또는 the Broad Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE, 문헌[Barretina et al., Nature 483:603 (2012)] 참조)에 의해 제공된 것과 같은 고형 종양 세포주를 포함한다. 예시적인 고형 암세포는 중피종, 신장 세포 암종, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 신장암, 자궁내막암 또는 위암으로부터 단리된 원발성 종양 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 치료될 암은 중피종, 유두상 장액성 난소 선암종, 투명 세포 난소 암종, 혼합 뮐러 난소 암종, 자궁내막양 점액성 난소 암종, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁 장액성 암종, 폐 선암종, 간외 담관 암종, 위 선암종, 식도 선암종, 결장직장 선암종 및 유방 선암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 마우스는 인간 종양 이종이식 모델에서 TFP.메소텔린 T-세포의 효능을 시험하는데 사용될 수 있다(예컨대, 문헌[Morton et al., Nat. Procol. 2:247 (2007)] 참조). 1x106 내지 1x107개의 원발성 세포(EC 매트릭스 물질 중의 콜라게나제-처리된 벌크 종양 현탁액) 또는 종양 단편(EC 매트릭스 물질 중의 원발성 종양 단편)의 피하 이식 또는 주입 후에, 종양은 치료 개시 전에 200 내지 500㎣로 성장되도록 허용된다.
하나의 이러한 실험은 위에서 기재된 바와 같은 중피종 이종이식 마우스 모델에서 생체내 MSLN-특이적 단일 도메인 항체(sdAb) 활성도의 효능을 시험하기 위하여 수행되었다. 루시퍼라제-표지된 MSTO-211H-FL-MSLN-Luc)는 Matrigel®과 1:1비로 마우스당 1x106개 세포로 피하 접종되었다. 종양 용적은 주당 2회 캘리퍼스 측정에 의해 모니터링되었다. 종양 주입 후 14일에, 종양 용적이 대략 300㎣가 된 경우에, 1x107개의 T 세포를 각 동물에게 정맥내 주사하였다. 사용된 T 세포는 CD3ε-SD1 TFP, CD3γ-SD1 TFP, CD3ε-SD4 TFP, CD3γ-SD4 TFP, CD28ζ SD1 CAR 및 CD28ζ SD1 CAR로 형질도입된 것들을 포함하였다. T 세포 주입이 없는 마우스의 군은 음성 대조군으로서 사용되었다.
그 결과는 도 12a에 도시되어 있다. T 세포가 없는 대조군으로 주사된 마우스가 T 세포의 주입 후에 종양 용적의 저감을 보였지만, CD3ε-SD1 TFP 및 CD3γ-SD1 TFP T 세포가 주사된 마우스는, 종양 용적의 가장 크고 가장 신속한 저감을 보였다.
SD1ε - 및 γ-TFP T 세포의 지속 효능은 중피종 이종이식 마우스 모델에서 살아있는 마우스를 재시험감염시킴으로써 생체내에서 시험하였다.
마우스에게 Matrigel®로 마우스당 1x106개 종양 세포(MSTO 211H FL MSLN Luc)(1 대 1 비)를 경피 접종하였다. 하나의 군의 마우스에게는 음성 대조군으로서 Raji 세포를 주사하고, 하나의 군의 마우스에는 재차 대조군으로서 MSTO 세포를 단독으로 주사하였다. 종양 용적은 주 2회 캘리퍼스 측정에 의해 모니터링하였다. 종양 주사 후 14일째에(종양 용적이 대략 300㎣에 도달한 경우), 1x107 MSTO(MSLN+) 또는 Raji(MSLN-, 음성 대조군으로서)를 각 동물에게 정맥내 주사하였다. 그 결과는 도 12b에 도시되어 있다. 도면의 각 라인은 단일 동물을 나타낸다. 도면에 도시된 바와 같이, 항-MSLN TFP T 세포로 미리 처리된 마우스는 종양 용적을 재차 저감시키거나 종양을 근절시킬 수 있었는데, 이것은 원래 주사된 T 세포가 마우스에서 지속되었거나 또는 마우스가 항-MSLN 기억 반응을 전개시켰던 것을 나타낸다. 이와 대조적으로, Raji(MSLN-) 세포로 재시험감염된 마우스는 Raji 종양의 성장을 제어하는 것이 가능하지 않았으며, 따라서 이것은 TFP T-세포 반응의 특이성을 나타낸다.
실시예 13. MSLN 종양 이종이식 마우스 모델에서의 환자 유래 MSLNε - TFP T 세포의 생체내 효능
난소암 환자로부터의 SD1ε-TFP T 세포를 메소텔린 발현 종양 세포(MSTO-MSLN-Luc)에 대한 SD1ε-TFP T 세포의 시험관내 및 생체내 항-종양 효능을 시험하는데 사용하였다.
렌티바이러스는 위에서 기재된 바와 같이 제조하였다.
난소암 환자의 전혈로부터의 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 제조
CD4+ 및 CD8+ T 세포를 다음과 같이 난소암 환자의 전혈로부터 정제하였다(저체적인 개략도가 도 13a에 도시됨). 난소암 환자의 헤파린화된 전혈 40 내지 50㎖를 수집하여 Conversant Bio(앨라배마주 헌츠빌 소재)에 의해 하룻밤 옮겼다. 이 혈액을 등용적의 PBS로 희석시키고, 35㎖의 희석된 전혈을, 50㎖ 코니칼 튜브(conical tube)에서 15㎖의 Ficoll-Paque®(GE healthcare, cat#: 17-5442-02) 상에서 주의해서 층상화시켰다. 이어서, 제동 없이 스윙 버킷 회전자(swinging bucket rotor)에서 RT에서 20분 동안 800×g에서 원심분리시켰다. 상부층을 흡인해내고, 상간에 방해받지 않은 단핵 세포층(림프구, 단핵구 및 혈소판)을 남겼다. 단핵 세포층을 새로운 50㎖ 코니칼 튜브로 옮기고, 30㎖의 PBS를 첨가하고 RT에서 10분 동안 300×g에서 원심분리시켰다. 1 내지 2㎖의 ACK 용해물 완충액(ThermoFisher, cat#: A1049201)을 펠릿에 첨가하고, 철저하고 혼합하고, RT에서 2분 동안 항온처리하고, 20㎖의 PBS를 첨가하고, RT에서 10분 동안 300×g에서 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 10㎖의 빙랭 MAC 완충액에 재현탁시키고, 세포를 Cellometer Auto 2000을 통해서 계수하였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포 단리는 제조사의 지시에 따라서 Miltenyi 인간 CD4/8 마이크로비드(cat#: 130-045-101; 130-045-201)를 사용해서 수행하였다.
TFP T 세포는 위에서 기재된 바와 같이 제조하고, 형질도입은 FACS에 의해 결정하였다. 메소텔린 발현은 표적 세포(MSLN하이 세포주 MSTO-211H-FL MSLN(모 MSTO-211H로부터 인 하우스에서 생성됨, ATCC, CRL-2081)) 상에서 확인되었고, MSLN-Fc 발현은 루시퍼라제 검정과 동일자에 유세포 분석에 의해 SD1ε-TFP T 세포를 확인하였다. 루시퍼라제-표지된 표적 세포(MSTO-211H-FL MSLN-Luc 또는 MSLN- 세포주 C30-Luc(A2780, Sigma))의 단일 현탁액을 R10 배지에서 제조하였다. 100㎖ 중 1 x 104개의 표적 세포를 96-웰 평탄한 바닥면 플레이트에 첨가하였다. TFP T 세포를 표시된 바와 같이 상이한 효과기-대-표적비(E:T)에서 100㎖에 첨가하였다.
FACS -기반 형질도입 효율 및 T 세포 활성화 결정
TFP T 세포를 해동시키고, 탈비드화시키고(Dynabeads+IL-2 조건에서 탈체 확장된 경우), 세척하고, 이어서 사이토카인 없는 T 세포 배양 배지에 재현탁시켰다. 목적하는 수의 T 세포(100㎖ 중)를 각각 5-대-1, 1-대-1 및 1-대-5의 효과기-대-표적비에 도달하도록 첨가하였다. 이들 복제물을 시험된 비에서 각 유형의 T 세포에 대해서 제조하였다. 이어서 세포를 37℃에서 5% CO2로 24시간 동안 배양하였다. 공-배양 24시간 후에, 플레이트를 300×g에서 2분 동안 원심분리시켜 세포를 펠릿화하였다. 각 웰로부터의 100㎖의 배양 상청액을 Luminex 검정을 위하여 주의해서 제거하였다. Bright-Glo™ 루시퍼라제 검정 시스템(Promega, #E2650)으로부터 100㎖의 검정 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 각 웰 내 내용물을 상하로 온화하게 피펫팅함으로써 혼합하였다. 세포-시약 혼합물을 세포의 완전한 용해를 위하여 암소에서 실온에서 3분 동안 두었다. 각 웰로부터의 200㎖의 세포 용해물을 Greiner-One 백색 벽을 가진 96 웰 플레이트로 옮겼다. 발광은 SpectraMax M5 플레이트 리더(Molecular devices)에 의해 상대 발광 단위(RLU)로 측정하였다.
종양 용해의 퍼센트(%)는 이하에 나열된 식에 의해 계산하였다:
발광 (종양 + T 세포)
종양 용해 % = 100* [1 - -------------------------------------]
발광(종양)
Luminex ® 검정
종양-T 세포 공-배양물로부터의 상청액을 수거하고 앞서 기재된 바와 같이 -80℃에서 저장하였다. 사이토카인 프로파일은 제조사의 지시에 따라서 Millipore Luminex 키트(HCD8MAG-15K)를 사용해서 검출하였다. 상청액은 어떠한 희석도 없이 평판배양하고 판독치는 Magpix xMAP® Technology를 사용해서 측정하였다.
피하 중피종 이종이식 마우스 모델 및 생체내 평가
암컷 6-주령의 NSG 마우스(NOD.Cg-Prkdcscid　Il2rgtm1Wjl/SzJ, cat#: 005557, Jackson Laboratories)를 이 연구에서 사용하였다. 이 동물을 연구와 동일한 조건 하에서 최소 3일간 순응시켰다. MSTO-211H-FLMSLN-Luc 세포를 1×106개 세포/100㎕의 농도에서 멸균 PBS에 현탁시켰다. 이어서 PBS 세포 현탁액을 각 마우스에 대해서 200㎕의 최종 주입 용적에 대해서 빙랭 Matrigel®과 1-대-1로 혼합하였다. 얻어진 PBS/ Matrigel® 세포 현탁액을, 마우스의 등쪽 뒷 옆구리에 경피 투여할 때까지 얼음 위에 유지시켰다. 종양 성장은 캘리퍼스 측정에 의한 종양 용적으로서 모니터링하였다. 종양의 용적은 다음과 같이 계산하였다:
종양 용적 = ½(길이×폭2)
종양 세포 주입 후 10일째에, 동물은 종양 용적(200 내지 300㎣)에 따라서 무작위화하여, 상이한 환자로부터의 SD1ε-TFP T 세포의 주입을 받도록 10개 군으로 나누었다(군당 마우스의 수는 주입 일에 회수된 SD1ε-TFP T 세포의 수에 따라서 달라진다). T 세포 주입일은 연구 제0일째로서 상정되었다. T 세포는 5×106개 세포/100㎕의 농도로 멸균 PBS에 제조하였다. 이어서 세포 현탁액을 꼬리 정맥을 통해서 마우스에 정맥내 주사하였다.
난소암 환자로부의 SD1ε - TFP T 세포의 탈체 확장
MSLN-특이적 sdAb TFP T 세포는 SD1 결합체 표적화 MSLN을 가진 TFP의 CD3ε 포맷을 암호화하는 렌티바이러스로 제조하였다. 10일째 생세포 계수치에 의해 결정된 배수 확장은, Dynabeads®+IL-2로 제조된 세포에서 제0일째에 비해서 8.58 내지 28.2배(17.8 +/- 3.3)의 범위였고, TransAct® + IL-7/15로 제조된 세포에서 제0일째에 비해서 10 내지 33.6배(22.9 +/- 5.0)의 범위였다. SD1ε-TFP T 세포에 대한 형질도입 효율은 CD4+ 및 CD8+ 집단 상의 GFP 및 MSLN-Fc의 존재에 대해서 표면 염색에 의해 확장 제10일째에 결정하였다. 형질도입 효율은 Dynabeads+IL-2로 제조된 세포에서 28.6% 내지 52.1%(40.9 +/- 4.0%), 그리고 TransAct+IL-7/15로 제조된 세포에서 5.7% 내지 46.9%(26.8 +/- 6.3%)의 범위였으며; Dynabeads+IL-2 조건과 TransAct+IL-7/15 조건 간의 배수 확장 및 형질도입 효율에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 세포당 벡터 카피수는 형질도입 효율과 비슷하였고, 세포당 0.38 벡터 카피수를 가졌단 환자 1을 제외하고, Dynabeads+IL-2 또는 TransAct+IL7/15 조건에서 세포당 대략 1 내지 2 카피수였다.
난소암 환자로부터의 SD1ε - TFP T 세포의 시험관내 항-종양 활성도
난소암 환자로부터의 SD1ε-TFP T 세포의 시험관내 효능은 루시퍼라제 리포터 종양 세포 용해 검정을 사용해서 시험되었다. 메소텔린 발현은 검정일에 MSTO-211H-FLMSLN-Luc 세포주 상에서 확인되었고(도 13b); 모든 SD1ε-TFP T 세포는 상이한 수준의 종양 사멸을 나타내었다. 강인한 종양 세포 용해는 환자 1, 2, 4 및 5 (75%~97%)에 대해서 관찰되었다. 5-대-1 효과기 대 표적비에서 MSTO-211H-FLMSLN-Luc(MSLN 하이 발현체)와 공-배양된 경우의 MSLN ε-TFP T 세포에서, 환자 3은 5-대-1 효과기 대 표적비에서 대략 35%의 종양 용해를 나타내고, 5명 중 4명의 환자(환자 1, 2, 4 및 5)는 1-대-1 효과기 대 표적비에서 평균 50%의 종양 용해를 나타내며, 5명 중 2명의 환자(환자 4 및 5)는 1-대-5 효과기 대 표적비에서 대략 50%의 종양 용해를 나타내었다. 모든 T 세포는 종양 세포의 신속한 사멸을 나타내었다. 메소텔린 음성 세포주 C30-Luc와 공-배양된 경우 모든 MSLN ε-TFP™ T 세포에 대해서는 종양 용해가 관찰되지 않았다(도 13c). 5명의 환자로부터의 MSLN ε-TFP의 사이토카인 프로파일은 인간 CD8 Luminex® 패널을 사용해서 분석되었고, IFN-γ, GM-CSF, 그랜자임-A/B, IL-2, MIP-1α/β, TNF-α 및 퍼포린과 같은 세포용해 사이토카인은 비-형질도입 T 세포에 비해서 MSLN ε-TFP™ T 세포에서 유의하게 증가되었다(도 13d 내지 도 13l).
MSLN -발현 종양 마우스 이종이식 모델에서의 MSLN ε- TFP T 세포의 생체내 효능
MSTO-211H-FLMSLN-Luc는 피하 이종이식 메소텔린-발현 종양 마우스 모델을 확립시키기 위하여 사용되었다. 종양 용적은 1주에 2회 측정되었다. 종양 주입 후 10일째에, 평균 종양 용적은 200 내지 300㎣에 도달하였고, 하나의 정상 공여체(ND12, 도 14a) 및 환자 1 내지 4(도 14b 내지 도 14e)로부터의 MSLN ε-TFP T 세포를 제10일에 확장시키고, 해동시키고, 형질도입 효율을 확인하였다. 마우스당 5× 106개의 MSLN ε-TFP T 세포 또는 매칭된 비-형질도입 T 세포를 i.v. 주사하고, 그 후 종양 용적을 모니터링하였다. 4명 중 3명의 환자(환자 1, 2 및 4)로부터의 MSLN ε-TFP T 세포는, T 세포 주입 후 20일째에 완전한 종양 제거(tumor clearance)를 보였다. 종양 제거는 40일까지 유지되었다. 환자 3으로부터 MSLN ε-TFP T 세포를 받은 6마리 중 5마리의 마우스는, 부분 보호를 보였다. ND12로부터 MSLN ε-TFP T 세포를 받은 4명의 환자 모두로부터, 하나는 완전한 종양 제거를 보였고, 둘은 부분 종양 제거를 보였다.
미주
본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에서 도시되고 기재되었지만, 이러한 실시형태가 단지 예로써 제공되는 것임은 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변동, 변화, 및 치환이 이제 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 당업자에게 떠오를 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시함에 있어서 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 하기 청구항들은 본 발명의 범위를 한정하고 그리고 이들 청구항 및 이들의 등가물의 범위 내에서 방법 및 구조가 이로써 포함되는 것임이 의도된다.
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SEQUENCE LISTING <110> TCR2 THERAPEUTICS INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TCR REPROGRAMMING USING FUSION PROTEINS <130> 48538-702.601 <140> PCT/US2017/055628 <141> 2017-10-06 <150> 62/510,108 <151> 2017-05-23 <150> 62/405,551 <151> 2016-10-07 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10 15 Glu <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Glu 20 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly 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190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 5 <211> 182 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu 1 5 10 15 Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys 20 25 30 Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala 35 40 45 Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe 50 55 60 Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp 65 70 75 80 Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro 85 90 95 Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala 100 105 110 Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val 115 120 125 Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln 130 135 140 Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr 145 150 155 160 Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly 165 170 175 Asn Gln Leu Arg Arg Asn 180 <210> 6 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg 20 25 30 Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val 35 40 45 Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 55 60 Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys 85 90 95 Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val 100 105 110 Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His 115 120 125 Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr 145 150 155 160 Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys Ser 165 170 <210> 7 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu 1 5 10 15 Pro Ile Thr Glu Ala Gln 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Phe Ser 50 55 60 Ala Gly Asn Gly Ser Ala Leu Asp Ala Phe Thr Tyr Gly Pro Ser Pro 65 70 75 80 Ala Thr Asp Gly Thr Trp Thr Asn Leu Ala His Leu Ser Leu Pro Ser 85 90 95 Glu Glu Leu Ala Ser Trp Glu Pro Leu Val Cys His Thr Gly Pro Gly 100 105 110 Ala Glu Gly His Ser Arg Ser Thr Gln Pro Met His Leu Ser Gly Glu 115 120 125 Ala Ser Thr Ala Arg Thr Cys Pro Gln Glu Pro Leu Arg Gly Thr Pro 130 135 140 Gly Gly Ala Leu Trp Leu Gly Val Leu Arg Leu Leu Leu Phe Lys Leu 145 150 155 160 Leu Leu Phe Asp Leu Leu Leu Thr Cys Ser Cys Leu Cys Asp Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Thr Thr Arg Leu Arg Ala Leu Gly 180 185 190 Ser His Arg Leu His Pro Ala Thr Glu Thr Gly Gly Arg Glu Ala Thr 195 200 205 Ser Ser Pro Arg Pro Gln Pro Arg Asp Arg Arg Trp Gly Asp Thr Pro 210 215 220 Pro Gly Arg Lys Pro Gly Ser Pro Val Trp Gly Glu Gly Ser Tyr Leu 225 230 235 240 Ser Ser Tyr Pro Thr Cys Pro Ala Gln Ala Trp Cys Ser Arg Ser Ala 245 250 255 Leu Arg Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Phe Phe Ala Gly Asp Leu 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attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380 aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440 ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500 acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560 ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620 agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680 tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740 tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800 aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860 aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920 atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1980 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2040 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2100 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2160 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2220 tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2280 agagccgcca ccatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2340 gcattcctcc tgatcccaga cattcagcag gtccagctcc agcagtctgg ccctgaactc 2400 gaaaaacctg gcgctagcgt gaaaatttcc tgtaaagcct ccggctactc ttttactggc 2460 tacacaatga attgggtgaa acagtctcac ggcaaatccc tcgaatggat cggactcatc 2520 acaccctaca atggcgcctc ttcctacaac cagaaattcc ggggcaaggc aacactcact 2580 gtggacaaat catcctctac cgcctacatg gatctgctct ccctcacatc tgaggactcc 2640 gctgtctact tttgtgcccg aggaggatac gacggacgag gattcgatta ctggggacag 2700 ggaacaactg tgaccgtgtc tagtggcggc ggagggagtg gaggcggagg atcttctggc 2760 gggggatccg atattgaact cacacagtct cccgctatca tgtctgcttc tcccggcgag 2820 aaagtgacta tgacttgctc tgcttcctct tctgtgtcct acatgcactg gtaccagcag 2880 aaatctggca catcccctaa acggtggatc tacgatacta gcaaactggc atccggcgtg 2940 cctgggcgat tctctggctc tggctctggc aactcttact ctctcacaat ctcatctgtc 3000 gaggctgagg acgatgccac atactactgt cagcagtggt ctaaacaccc actcacattc 3060 ggcgctggca ctaaactgga aataaaagcg gccgcaggtg gcggcggttc tggtggcggc 3120 ggttctggtg gcggcggttc tctcgaggat ggtaatgaag aaatgggtgg tattacacag 3180 acaccatata aagtctccat ctctggaacc acagtaatat tgacatgccc tcagtatcct 3240 ggatctgaaa tactatggca acacaatgat aaaaacatag gcggtgatga ggatgataaa 3300 aacataggca gtgatgagga tcacctgtca ctgaaggaat tttcagaatt ggagcaaagt 3360 ggttattatg tctgctaccc cagaggaagc aaaccagaag atgcgaactt ttatctctac 3420 ctgagggcaa gagtgtgtga gaactgcatg gagatggatg tgatgtcggt ggccacaatt 3480 gtcatagtgg acatctgcat cactgggggc ttgctgctgc tggtttacta ctggagcaag 3540 aatagaaagg 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gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct 4440 cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc 4500 ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg 4560 catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc 4620 gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca 4680 ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc 4740 cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct 4800 cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac 4860 ccgcaagccc ggtgcctgag tcgacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt 4920 gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc 4980 tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg 5040 gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac 5100 tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc 5160 cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc 5220 ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa 5280 atcatcgtcc tttccttggc tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc 5340 cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc 5400 ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg 5460 ggccgcctcc ccgcctggta cctttaagac caatgactta caaggcagct gtagatctta 5520 gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg aagggctaat tcactcccaa cgaaaataag 5580 atctgctttt tgcttgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 5640 ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 5700 tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 5760 cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct tattattcag tatttataac 5820 ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggaacttgtt tattgcagct tataatggtt 5880 acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 5940 gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggctctag ctatcccgcc 6000 cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta 6060 tgcagaggcc 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ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 6960 tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 7020 tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 7080 caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 7140 aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 7200 cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 7260 ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 7320 tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 7380 atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 7440 tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 7500 aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 7560 catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 7620 gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 7680 ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 7740 aaaagcggtt 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cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag 8640 gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc 8700 gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg 8760 acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct g 8791 <210> 15 <211> 622 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln 20 25 30 Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu 35 40 45 Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg 50 55 60 Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu 65 70 75 80 Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu 85 90 95 Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro 100 105 110 Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro 115 120 125 Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile 130 135 140 Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 35 caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtctgcat ttccagggga gaaggtcact 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagtgt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccacgct cacgttcggt 300 gctgggacca agctggagct gaaa 324 <210> 36 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 59 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Ser Ser Ile Asn 20 25 30 Thr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asn Val Arg Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Thr Tyr Ile Pro Tyr Gly Gly Thr Leu His Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(20) <223> /note="This sequence may encompass 1-4 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units" <400> 60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 64 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 65 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 65 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 66 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass 50-5000 nucleotides" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 66 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 67 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> /note="This sequence may encompass 1-6 'Gly Gly Gly Gly Ser' repeating units" <220> <221> source <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 67 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 68 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 68 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 100 <210> 69 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass 50-5000 nucleotides" <400> 69 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2460 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2520 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2580 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2640 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2700 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2760 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2820 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2880 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2940 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3000 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3060 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4980 tttttttttt tttttttttt 5000 <210> 70 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass 100-5000 nucleotides" <400> 70 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 71 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 71 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 72 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10

Claims (102)

  1. 단리된 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) T-세포 수용체(T-cell receptor: TCR) 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및
    (ii) CD3 엡실론의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인
    을 포함하는 TCR 서브 유닛; 및
    (b) 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인
    을 포함하는 TCR 융합 단백질(TFP)을 암호화하되,
    상기 TCR 서브유닛과 상기 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, 그리고
    상기 TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입되는, 단리된 재조합 핵산 분자.
  2. 단리된 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) T-세포 수용체(TCR) 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및
    (ii) CD3 엡실론의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인
    을 포함하는 TCR 서브 유닛; 및
    (b) 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인
    을 포함하는 TCR 융합 단백질(TFP)을 암호화하되,
    상기 TCR 서브유닛과 상기 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, 그리고
    상기 TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입되는, 단리된 재조합 핵산 분자.
  3. 단리된 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) T-세포 수용체(TCR) 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및
    (ii) CD3 감마의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인
    을 포함하는 TCR 서브 유닛; 및
    (b) 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인
    을 포함하는 TCR 융합 단백질(TFP)을 암호화하되,
    상기 TCR 서브유닛과 상기 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, 그리고
    상기 TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입되는, 단리된 재조합 핵산 분자.
  4. 단리된 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) T-세포 수용체(TCR) 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및
    (ii) CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인
    을 포함하는 TCR 서브 유닛; 및
    (b) 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인
    을 포함하는 TCR 융합 단백질(TFP)을 암호화하되,
    상기 TCR 서브유닛과 상기 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, 그리고
    상기 TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입되는, 단리된 재조합 핵산 분자.
  5. 단리된 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) T-세포 수용체(TCR) 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및
    (ii) TCR 알파의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인
    을 포함하는 TCR 서브 유닛; 및
    (b) 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인
    을 포함하는 TCR 융합 단백질(TFP)을 암호화하되,
    상기 TCR 서브유닛과 상기 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, 그리고
    상기 TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입되는, 단리된 재조합 핵산 분자.
  6. 단리된 재조합 핵산 분자로서,
    (a) (i) T-세포 수용체(TCR) 세포외 도메인의 적어도 일부분, 및
    (ii) CD3 베타의 세포내 신호전달 도메인으로부터의 자극 도메인을 포함하는 TCR 세포내 도메인
    을 포함하는 TCR 서브 유닛; 및
    (b) 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인
    을 포함하는 TCR 융합 단백질(TFP)을 암호화하되,
    상기 TCR 서브유닛과 상기 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되고, 그리고
    상기 TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입되는, 단리된 재조합 핵산 분자.
  7. 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인 및 T-세포 수용체(TCR) 서브유닛을 포함하는 TCR 융합 단백질(TFP)을 암호화하는, 단리된 재조합 핵산 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛과 상기 항체 도메인은 작동 가능하게 연결되는, 단리된 핵산 분자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 TFP는 T-세포에서 발현된 경우 TCR에 편입되는, 단리된 핵산 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 암호화된 항원 결합 도메인이 링커 서열에 의해 상기 TCR 세포외 도메인에 연결되는, 단리된 핵산 분자.
  11. 제10항에 있어서, 암호화된 링커 서열이 (G4S)n을 포함하되, n은 1 내지 4인, 단리된 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 세포외 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 막관통 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 TCR 세포내 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 (i) TCR 세포외 도메인, (ii) TCR 막관통 도메인, 및 (iii) TCR 세포내 도메인을 포함하되, (i), (ii), 및 (iii) 중 적어도 2개가 동일한 TCR 서브유닛으로부터 유래된, 단리된 핵산 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 CD3 엡실론, CD3 감마 또는 CD3 델타의 세포내 신호전달 도메인으로부터 선택된 자극 도메인, 또는 이에 대한 적어도 1개의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 세포내 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 서브유닛은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인으로부터 선택된 자극 도메인 또는 이에 대한 적어도 1개의 변형을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 항체 단편을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 scFv 또는 VH 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 sdAb 또는 VHH 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 각각 본 명세서에 제공된 항-메소텔린 경쇄 결합 도메인의 경쇄(LC) CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3과 70 내지 100% 서열 동일성을 갖는 항-메소텔린 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄(LC) CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3, 및/또는 (ii) 각각 본 명세서에 제공된 항-메소텔린 중쇄 결합 도메인의 중쇄(HC) CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3과 70 내지 100% 서열 동일성을 갖는 항-메소텔린 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄(HC) CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 암호화하는, 단리된 핵산 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역을 암호화하되, 상기 경쇄 가변 영역은 본 명세서에 제공된 경쇄 가변 영역의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본 명세서에 제공된 경쇄 가변 영역의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역을 암호화하되, 상기 중쇄 가변 영역은 본 명세서에 제공된 중쇄 가변 영역의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본 명세서에 제공된 중쇄 가변 영역의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역을 암호화하되, 상기 중쇄 가변 영역은 본 명세서에 제공된 중쇄 가변 영역의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 본 명세서에 제공된 VHH 영역의 단일 도메인 항체 아미노산 서열과 95 내지 99% 동일성을 가진 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  25. 제24항에 있어서, 상기 VHH 영역의 서열이 본 명세서에 제공된 서열에 제시된 것인, 단리된 핵산 분자.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP는 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편, 및 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이들의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 TCR 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암호화된 TFP가 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편, 및 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암호화된 TFP가 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, TCR 제타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, CD45, CD2, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD28, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, 이들의 기능성 단편, 및 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극 도메인을 암호화하는 서열을 더 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  30. 제29항에 있어서, 상기 공자극 도메인이 DAP10, DAP12, CD30, LIGHT, OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 및 4-1BB(CD137), 및 이에 대한 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이들의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 얻어진 기능성 신호전달 도메인인, 단리된 핵산 분자.
  31. 제1항 내지 제30 중 어느 한 항에 있어서, 거기에 상기 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형이 세포 신호전달을 매개하는 아미노산의 변형 또는 상기 TFP에 결합하는 리간드에 대응하여 인산화되는 아미노산의 변형을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자는 mRNA인, 단리된 핵산 분자.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFP는 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, TCR 제타쇄, Fc 엡실론 수용체 1쇄, Fc 엡실론 수용체 2쇄, Fc 감마 수용체 1쇄, Fc 감마 수용체 2a쇄, Fc 감마 수용체 2b1쇄, Fc 감마 수용체 2b2쇄, Fc 감마 수용체 3a쇄, Fc 감마 수용체 3b쇄, Fc 베타 수용체 1쇄, TYROBP(DAP12), CD5, CD16a, CD16b, CD22, CD23, CD32, CD64, CD79a, CD79b, CD89, CD278, CD66d, 이의 기능성 단편, 및 이에 대한 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 면역수용체 티로신 내지 기반된 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) 또는 이의 일부를 포함하는 TCR 서브유닛의 ITAM을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  34. 제33항에 있어서, 상기 ITAM은 CD3 감마, CD3 델타, 또는 CD3 엡실론의 ITAM을 대체하는, 단리된 핵산 분자.
  35. 제33항에 있어서, 상기 ITAM은 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택되고 CD3 제타 TCR 서브유닛, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 ITAM을 대체하는, 단리된 핵산 분자.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  37. 제36항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T 내지 데옥시 내지 2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-다이메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-다이메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-다이메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N 내지 메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩타이드 핵산(PNA), 1',5'-안하이드로헥시톨 핵산(HNA), 몰폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드, 티올포스포네이트 뉴클레오타이드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 핵산 분자.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 서열을 더 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산에 의해 암호화된 항-메소텔린 결합 도메인인 항원 결합 도메인, 또는 상기 항-메소텔린 결합 도메인을 포함하는 항체, 또는 상기 핵산에 의해 암호화된 상기 항-메소텔린 결합 도메인을 발현하는 세포를 포함하는 인간 또는 인간화된 항체 도메인은 최대 약 200nM, 100nM, 75nM, a 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM 또는 0.01nM; 및/또는 적어도 약 100nM, 75nM, a 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM 또는 0.01nM; 및 또는 약 200nM, 100nM, 75nM, 50nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM, 12nM, 11nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM 또는 0.01nM의 친화도값을 갖는, 단리된 핵산 분자.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 암호화된, 단리된 폴리펩타이드 분자.
  41. 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는, 단리된 재조합 TFP 분자.
  42. 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 단리된 재조합 TFP 분자로서, 상기 TFP 분자가 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 단리된 재조합 TFP 분자.
  43. 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 단리된 재조합 TFP 분자로서, 상기 TFP 분자가 내인성 TCR 복합체와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 단리된 재조합 TFP 분자.
  44. 제41항에 있어서, 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 단리된 TFP 분자.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-메소텔린 결합 도메인은 scFv 또는 VH 도메인인, 단리된 TFP 분자.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 제공된 항-메소텔린 경쇄의 아미노산 서열과 95 내지 100% 동일성을 가진 중쇄, 이의 기능성 단편, 또는 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 TFP 분자.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-메소텔린 결합 도메인은 본 명세서에서 제공된 항-메소텔린 중쇄의 아미노산 서열과 95 내지 100% 동일성을 가진 경쇄, 이의 기능성 단편, 또는 적어도 1개 그러나 30개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 TFP 분자.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, CD3 델타 TCR 서브유닛, 이들의 기능성 단편, 및 적어도 1개 그러나 20개 이하의 변형을 갖는 이의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는 TCR 세포외 도메인을 포함하는, 단리된 TFP 분자.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR은 T-세포 수용체의 알파 또는 베타쇄, CD3 델타, CD3 엡실론, 또는 CD3 감마로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는, 단리된 TFP 분자.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-메소텔린 결합 도메인이 링커 서열에 의해 상기 TCR 세포외 도메인에 연결되는, 단리된 TFP 분자.
  51. 제50항에 있어서, 링커 영역이 (G4S)n을 포함하되, n은 1 내지 4인, 단리된 TFP 분자.
  52. 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 공자극 도메인을 암호화하는 서열을 더 포함하는, 단리된 TFP 분자.
  53. 제41항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 서열을 더 포함하는, 단리된 TFP 분자.
  54. 제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 서열을 더 포함하는, 단리된 TFP 분자.
  55. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 TFP를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
  56. 제55항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 핵산은 mRNA인, 핵산.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는, 핵산.
  59. 제58항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 유사체는 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필, 2'-데옥시, T 내지 데옥시 내지 2'-플루오로, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-다이메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-다이메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), T-O-다이메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 변형된 2'-O-N 내지 메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌 핵산(ENA), 펩타이드 핵산(PNA), 1',5'-안하이드로헥시톨 핵산(HNA), 몰폴리노, 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드, 티올포스포네이트 뉴클레오타이드, 및 2'-플루오로 N3-P5'-포스포르아미다이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터를 더 포함하는, 핵산.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 시험관내 전사된 핵산인, 핵산.
  62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 폴리(A) 꼬리를 암호화하는 서열을 더 포함하는, 핵산.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 3'UTR 서열을 더 포함하는, 핵산.
  64. 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 TFP를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  65. 제64항에 있어서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스성(RSV) 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
  66. 제64항 또는 제65에 있어서, 프로모터를 더 포함하는, 벡터.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 시험관내 전사된 벡터인, 벡터.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터내 핵산 서열이 폴리(A) 꼬리를 더 포함하는, 벡터.
  69. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터내 핵산 서열이 3'UTR을 더 포함하는, 벡터.
  70. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제40항의 폴리펩타이드 분자, 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 TFP 분자, 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항의 핵산, 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 세포.
  71. 제70항에 있어서, 상기 세포는 인간 T-세포인, 세포.
  72. 제71항에 있어서, 상기 T-세포는 CD8+ 또는 CD4+ T-세포인, 세포.
  73. 제71항에 있어서, 상기 T-세포는 감마-델타 T 세포인인, 세포.
  74. 제71항에 있어서, 상기 T-세포는 NKT 세포인인, 세포.
  75. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인으로부터 양성 신호를 포함하는 제2 폴리펩타이드와 연관된, 저해 분자의 적어도 일부분을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 포함하는 저해 분자를 암호화하는 핵산을 더 포함하는, 세포.
  76. 제75항에 있어서, 상기 저해 분자는 PD1의 적어도 일부분을 포함하는 제1 폴리펩타이드와, 공자극 도메인 및 1차 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는, 세포.
  77. 적어도 2개의 TFP 분자를 포함하는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포로서, 상기 TFP 분자는 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고, 상기 TFP 분자는 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 표면 내에, 상기 표면에서 그리고/또는 상기 표면 상에서 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포.
  78. 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 단백질 복합체:
    (i) 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하는 TFP 분자; 및
    (ii) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체.
  79. 제78항에 있어서, 상기 TCR은 TCR 알파쇄, TCR 베타쇄, CD3 엡실론 TCR 서브유닛, CD3 감마 TCR 서브유닛, 및 CD3 델타 TCR 서브유닛으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 일부를 포함하는, 단백질 복합체.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 항-메소텔린 결합 도메인은 링커 서열에 의해 상기 TCR 세포외 도메인에 연결되는, 단백질 복합체.
  81. 제80항에 있어서, 상기 링커 영역이 (G4S)n을 포함하되, n은 1 내지 4인, 단백질 복합체.
  82. 하기 (a) 및 (b)를 포함하는, 단백질 복합체:
    (a) 제1항 내지 39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자에 의해 암호화된 TFP, 및
    (b) 적어도 하나의 내인성 TCR 서브유닛 또는 내인성 TCR 복합체.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항의 단백질 복합체당 적어도 2개의 상이한 TFP 단백질을 포함하는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포.
  84. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자에 의해 암호화된 적어도 2개의 상이한 TFP 분자를 포함하는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포.
  85. 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단으로서, 상기 집단의 상기 T-세포는 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 집합적으로 포함하고, 상기 TFP 분자는 인간 또는 인간화된 항-메소텔린 결합 도메인, TCR 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하며, 상기 TFP 분자는 상기 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 상기 표면 내에, 상기 표면에서 및/또는 상기 표면 상에 내인성 TCR 복합체 및/또는 적어도 하나의 내인성 TCR 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용할 수 있는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단.
  86. 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단으로서, 상기 집단의 상기 T-세포는 제1항 내지 39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자에 의해 암호화된 적어도 2개의 TFP 분자를 개별적으로 또는 집합적으로 포함하는, 인간 CD8+ 또는 CD4+ T-세포의 집단.
  87. 세포의 제조 방법으로서, 제1항 내지 39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항의 핵산, 또는 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 벡터로 T-세포를 형질도입하는(transducing) 단계를 포함하는, 세포의 제조 방법.
  88. RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법으로서, 시험관내 전사된 RNA 및 합성 RNA를 세포에 도입을 단계를 포함하되, 상기 RNA는 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 TFP 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는, RNA-조작된 세포의 집단을 생성하는 방법.
  89. 포유동물에 항-종양 면역력을 제공하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제40항의 폴리펩타이드 분자, 제40항의 폴리펩타이드 분자를 발현하는 세포, 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 TFP 분자, 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항의 핵산, 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제70항 내지 제77항 및 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항의 세포를 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에 항-종양 면역력을 제공하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 세포는 자가 T-세포인, 포유동물에 항-종양 면역력을 제공하는 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 세포는 동종이계 T-세포인, 포유동물에 항-종양 면역력을 제공하는 방법.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 포유동물에 항-종양 면역력을 제공하는 방법.
  93. 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제40항의 폴리펩타이드 분자, 제40항의 폴리펩타이드 분자를 발현하는 세포, 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 TFP 분자, 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항의 핵산, 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제70항 내지 제77항 및 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항의 세포를 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 메소텔린의 발현과 연관된 질환은 증식성 질환, 암, 악성종양, 및 메소텔린의 발현과 연관된 비-암 관련된 징후로 이루어진 군으로부터 선택되는, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
  95. 제93항에 있어서, 상기 질환은 중피종, 신장 세포 암종, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 간암, 췌장암, 갑상선암, 방광암, 요관암, 신장암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 흉선 암종, 단관암종 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암인, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
  96. 제93항에 있어서, 상기 질환은 중피종, 유두상 장액성 난소 선암종, 투명 세포 난소 암종, 혼합 뮐러 난소 암종, 자궁내막양 점액성 난소 암종, 췌장 선암종, 췌관 선암종, 자궁 장액성 암종, 폐 선암종, 간외 담관 암종, 위 선암종, 식도 선암종, 결장직장 선암종, 유방 선암종, 메소텔린 발현과 연관된 질환, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암인, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
  97. 제93항에 있어서, TFP 분자를 발현하는 상기 세포가 TFP 분자를 발현하는 세포의 상기 효능을 증가시키는 제제와 조합으로 투여되는, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
  98. 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물에서, 항-메소텔린 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유동물과 비교해서 더 적은 사이토카인이 방출되는, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
  99. 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, TFP 분자를 발현하는 상기 세포가 TFP 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 완화시키는 제제와 조합으로 투여되는, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
  100. 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, TFP 분자를 발현하는 상기 세포가 상기 메소텔린과 연관된 질환을 치료하는 제제와 조합하여 투여되는, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
  101. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제40항의 단리된 폴리펩타이드 분자, 제40항의 폴리펩타이드 분자를 발현하는 세포, 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 단리된 TFP, 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항의 핵산, 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 벡터, 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항의 복합체, 또는 제70항 내지 제77항 및 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 세포.
  102. 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 39항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제40항의 폴리펩타이드 분자, 제40항의 폴리펩타이드 분자를 발현하는 세포, 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항의 TFP 분자, 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항의 핵산, 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제70항 내지 제77항 및 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항의 세포를 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 포유동물에서, 항-메소텔린 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T-세포의 유효량이 투여된 포유동물과 비교해서 더 적은 사이토카인이 방출되는, 메소텔린의 발현과 연관된 질환을 지닌 포유동물을 치료하는 방법.
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