CN106535925A - 基于car的免疫治疗 - Google Patents

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University of Florida Research Foundation Inc
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Abstract

本公开内容提供了嵌合抗原受体(CAR)、包含此类CAR的T细胞、编码此类CAR的核酸，及其使用方法，例如用于治疗癌症如B细胞恶性肿瘤。

Description

基于CAR的免疫治疗
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年5月23日提交的美国临时申请号62/002,603的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)为癌症的过继性T细胞免疫治疗提供了有前景的方法。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。
大多数患有B细胞恶性肿瘤(包括B细胞急性淋巴细胞性白血病(B cell acutelymphocytic leukemia，B-ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia，CLL))的患者将由于其疾病而死亡。治疗这些患者的一种方法是通过CAR的表达，对T细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是经设计以人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。
在大多数癌症中，肿瘤特异性抗原尚未明确限定，但在B细胞恶性肿瘤中，CD19是一种有吸引力的肿瘤靶标。CD19的表达局限于正常和恶性B细胞(Uckun等，Blood，1988，71：13-29)，因此CD19是广泛接受的用来安全测试CAR的靶标。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明优选实施方案的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的一些实施方案。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施方案的精确排列和手段。
图1提供了CAR-4S慢病毒设计的示意图。
图2是示出CAR T细胞靶向GFP+/B-ALL细胞的一系列照片。顶行示出明视场图像。底行示出GFP图像。
图3是描绘CAR T(CFSE)增殖测定的一系列图。
图4是示出靶向CD19+癌细胞的CAR T细胞的共聚焦显微成像的一系列照片。箭头指向CD19白血病细胞，所述细胞在0分钟时是完整的，并在8分钟时凋亡。与所述白血病细胞相邻和在左侧的细胞是抗CD19CAR T细胞。
图5是示出CAR二聚化和凋亡的合成诱导物的图。
图6是示出CAR T凋亡的迅速诱导的图。
图7是示出Lenti-4S-CAR T细胞治疗的图。
图8是示出慢病毒(lentiviral，LV)基因有效转移到人T细胞中的FACS数据的一系列图。
图9是示出第5天LV CAR T细胞的FACS数据的一系列图。
图10是示出CAR-T输注后血浆IgG的图。
图11是示出CAR-T输注后血浆IgA/IgM的图。
图12是示出IL-6浓度、IFN-γ浓度、PBMC中的CAR拷贝数和BM中的CAR拷贝数的一系列图。
图13是用于病例研究2的治疗方案的图。
图14是示出输注后不同时间点的血清尿酸和肌酐水平的一系列图。
图15是示出输注后不同时间点的血清IL-6和IFN-γ浓度的一系列图。
图16是示出输注后不同时间点的Ig(IgG、IgA或IgM)水平的图。
图17是示出在CAR T细胞治疗之前、细胞输注后20天和细胞输注后56天的临床响应的一系列照片。
具体实施方式
本发明部分涉及用于治疗癌症的组合物和方法，所述癌症包括但不限于血液型的癌症。本发明涉及经转导以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继性细胞转移的策略。CAR是这样的分子，其将期望的抗原(例如肿瘤抗原)的基于抗体的特异性与T细胞受体活化细胞内结构域组合以产生表现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供其中CAR或其部分完全是人源的组合物，从而使宿主免疫应答的风险最小化。
在一些实施方案中，本发明一般涉及经遗传修饰以稳定表达所需CAR的T细胞的用途。表达CAR的T细胞在本文中称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。优选地，可以对细胞进行遗传修饰以在其表面上稳定表达抗体结合结构域，从而赋予MHC非依赖性的新抗原特异性。在一些情况下，T细胞经遗传修饰以稳定表达将特定抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ链或FcR蛋白的细胞内结构域组合成单一嵌合蛋白质的CAR。在一个具体实例中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域，以及自毁性(self-destructive)基因设计，例如诱导的胱天蛋白酶9(iCasp9)基因。在一个甚至更具体的实施方案中，CAR的元件的如下排列：
scFv-28-137-27-CD3z-2A-iCasp9
CD28元件可以但不一定包含上述CAR实施方案的至少一部分跨膜结构域。CAR还可以包含几个铰链元件和/或间隔区序列(例如在单独的结构域元件之间)。
本发明的一些实施方案涉及并入了一系列新的结构域的CAR，所述结构域提供了不同功能方面，其协同地共同作用以提高功效。例如，在一些实施方案中，CAR包含抗原识别结构域、刺激活性的抗原共信号传导结构域、增加T细胞存活的存活结构域、T细胞记忆结构域和效应物活化结构域。或者，CAR还可以包含诱导安全性的结构域。图1提供了实现这种多功能性的一系列结构域的一个实例。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含具有抗原识别结构域、跨膜结构域和多功能胞质结构域的胞外结构域。在一些实施方案中，两个CAR蛋白在体内二聚化(例如形成同源或异源二聚体)。在一些实施方案中，CAR可以包含完全人抗体或抗体片段，例如scFv。在一个实施方案中，使用与CAR中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。在一些实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使得其与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。在一些实施方案中，跨膜结构域是CD8a跨膜结构域。
在一些实施方案中，本发明的CAR T细胞可以通过将包含编码靶向肿瘤抗原的所需CAR的核酸的慢病毒载体引入细胞中来产生。例如，慢病毒载体在细胞中包含编码包含肿瘤抗原结合结构域(例如靶向CD19)、任选CD8a铰链、跨膜结构域以及CD28、CD137、CD27和CD3-ζ信号传导结构域之CAR的核酸。在一些实施方案中，本发明的CAR T细胞能够在体内复制，从而导致长期持久性，其可以导致持续的肿瘤控制。在一些实施方案中，本发明的CAR T细胞可以通过将编码期望的CAR的RNA转染到细胞中产生。在一些实施方案中，CAR在经遗传修饰的CAR T细胞中瞬时表达。
在一些实施方案中，本发明涉及包含人抗体或其片段的CAR。本发明部分地基于这样的发现，即包含抗原识别结构域的CAR特异性识别肿瘤抗原，所述抗原识别结构域包含完全人抗体片段。因此，在一些实施方案中，本发明的人CAR可以用于治疗癌症和其他疾病，并避免诱导免疫应答的风险。
在一些实施方案中，本发明涉及施用表达CAR的经遗传修饰的T细胞，以使用淋巴细胞输注治疗患有癌症或有患癌风险的患者。优选地，在治疗中使用自体淋巴细胞输注。从需要治疗的患者收集自体PBMC，并使用本文所述和本领域已知的方法活化和扩增T细胞，然后再输注回患者。
本发明可以包括使用表达CAR的T细胞，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域。在一些实施方案中，本发明的CAR T细胞可以经历稳健的体内T细胞扩增，并且可以建立在血液和骨髓中以高水平持续延长量时间的特异性记忆细胞。在一些情况下，输注到患者体内的本发明CAR T细胞可以在癌症患者中体内消除癌细胞。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的测试的实践中，但是在本文中描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意在限制。
本文中无量词修饰的名词表示一个/种或多于一个/种(即至少一个/种)。例如，“一个/种要素”是指一个/种要素或多于一个/种要素。
当涉及可测量值例如量、持续时间等时，本文所使用的“约”意指包括特定值+20％或+10％，更优选+5％，甚至更优选+1％，且仍更优选+0.1％的变化，因为这些变化适于执行所公开的方法。
如本文所用，术语“FRa结合结构域”可以指本领域技术人员已知的任何FRa特异性结合结构域。在一个实例中，FRa结合结构域包含单链可变片段(scFv)，其包含特异性结合FRa的抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区。抗FRa抗体、抗体片段及其变体是本领域公知的，并且充分描述于美国专利公开U.S 20100055034；U.S.20090324594；U.S.20090274697；U.S.20080260812；U.S.20060239910；U.S.20050232919；U.S.20040235108中，其均通过引用以其整体并入本文。在一个实施方案中，FRa结合结构域是抗FRa抗体的同源物、变体、异构体或功能片段。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，“蛋白质结构域”或“结构域”是指可以通过以下方法鉴定的不同球形单元：结构测定方法如X射线晶体学或NMR；其他生物物理方法，例如扫描量热法(根据该方法蛋白质结构域作为独特单元溶解(参见例如Pabo等，Proc Natl Acad Sci U S A.(1979)76(4)：1608-12))；或者与已经测定其结构的蛋白质结构域的序列相似性。SCOP数据库(Murzin等，J Mol Biol.(1995)247(4)：536-40)提供了蛋白质结构域的鉴定，以使得可以通过序列比较鉴定新蛋白质的结构域组织。蛋白质结构域可以包含足以驱动这种多肽折叠成离散结构的氨基酸序列，其中沿着多肽主链的基本上所有可旋转键均被约束在约10度内。
本文所用的“活化”是指已经被充分刺激以诱导可检测细胞增殖的T细胞的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应物功能相关。术语“活化的T细胞”尤其指正在进行细胞分裂的T细胞。
本文所用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体、人抗体和人源化抗体(Harlow等，1999于：Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY；Harlow等，1989于：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等，1988，Science 242：423-426)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线性抗体、单链抗体(例如scFv抗体)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中较大的那种。
如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型多肽链中较小的那种，κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
本文所用的术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语也应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子产生的抗体，该DNA分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列，其中使用本领域可得且公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得了该DNA或氨基酸序列。
本文使用的术语“抗原”或“Ag”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解，任何大分子(包括实际上所有的蛋白质或肽)均可以充当抗原。此外，抗原可以来自重组或基因组DNA。因此，技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质之核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA均编码如本文所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显然，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以多种组合排列以引发所需的免疫应答。此外，本领域技术人员将理解，抗原完全不需要由“基因”编码。显然，抗原可以合成产生或者可以来自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
本文所用的术语“肿瘤抗原”是指与癌细胞相关的抗原。肿瘤抗原的实例包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素(mesothelin)、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR和MAGE A3 TCR。
本文所用的术语“抗肿瘤效应”是指这样的生物学效应，其可以表现为肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数目的降低、转移数目的减低、寿命期望的增加或改善与癌性病症相关的多种生理症状。“抗肿瘤效应”也可以表现为本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力。
根据本发明，术语“自身抗原”意指被免疫系统错误地识别为外来物的任何自体抗原。自身抗原包括但不限于细胞蛋白质、磷蛋白、细胞表面蛋白质、细胞脂质、核酸、糖蛋白(包括细胞表面受体)。
本文使用的术语“自身免疫病”定义为由自身免疫应答引起的病症。自身免疫病是对自体抗原的不适当和过度响应的结果。自身免疫病的实例包括但不限于，艾迪生病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、寻常性天疱疮、银屑病、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、脉管炎(vasculitis)、白癜风、粘液水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等。
如本文所使用的术语“自体的”意指来自相同个体的任何材料，其随后被重新引入所述个体中。
“同种异体”是指来自相同物种的不同动物的移植物。“异种”是指来自不同物种的动物的移植物。
本文使用的术语“癌症”定义为特征在于异常细胞的快速和不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部分。多种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在一个具体实施方案中，癌症是指B细胞相关的恶性肿瘤。
本文使用的术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如aAPC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而除了由例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子之结合提供的初级信号之外，提供介导T细胞应答的信号，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(inducible costimulatory ligand，ICOS-L)、细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体还尤其包括特异性结合存在于T细胞上的共刺激分子的抗体，所述共刺激分子例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和特异性结合CD83的配体。
“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伴侣，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激响应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。本文所用的“共刺激信号”是指与初级信号(primary signal)(例如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能维持体内稳态，并且其中如果疾病不被改善，则动物的健康继续恶化。相反，动物中的“病症”是这样的健康状态，其中动物能够维持体内稳态，但是其中动物的健康状态比不存在该病症时的状态更差。未经治疗，病症不一定引起动物健康状态的进一步降低。
本文所用的“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。
“编码”指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有性质，其充当在生物学过程中合成具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由其产生的生物学性质的其他聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可被认为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或在其中产生的任何材料。
如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何材料。
本文使用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；其他用于表达的元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，例如并入了重组多核苷酸的黏粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较的序列中的位置均被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子各自中的位置均被腺嘌呤占据，则分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置的数目除以所比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个匹配或同源，则这两个序列是60％同源的。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。一般地，两个序列比对时进行比较以给出最大同源性。
本文使用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”定义为一类蛋白质，其作为抗体起作用。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B cell receptor，B细胞受体)或抗原受体。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的第一抗体，所述身体分泌物例如唾液、泪、母乳、胃肠分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在大多数对象中在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、补体结合(complement fixation)和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒中是重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可以充当抗原受体。IgE是在暴露于变应原时通过引起介体从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中释放从而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
如本文所用，“说明材料”包括可用于传达本发明组合物和方法的有用性的出版物、记录、图表或任何其他表达介质。本发明试剂盒的说明材料可以例如附加到含有本发明核酸、肽和/或组合物的容器，或者与含有核酸、肽和/或组合物的容器一起运输。或者，该说明材料可以与容器分开运输，目的是说明材料和化合物由接受者合作使用。
“分离的”意指从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分分开或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，使用了以下通常出现的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，而“U”是指尿苷。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语核苷酸序列(其编码蛋白质或RNA)还可包括内含子，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可含有内含子。
本文所使用的“慢病毒”是指逆转录病毒科(Retroviridae family)的属。
慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的一种最有效方法。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。来自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平基因转移的手段。
本文所用的术语“调节”意指与不存在处理或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与在其他方面相同但未经处理的对象中的应答水平相比，介导了对象中可检测的应答水平的提高或降低。该术语包括干扰和/或影响天然信号或应答，从而在对象(优选人)中介导有益的治疗响应。
“密码子优化的”意指针对目的基因的翻译效率，将与特定氨基酸相关的密码子进行优化。密码子优化通常涉及评估目的基因或序列，并以用于特定细胞或物种中相同氨基酸的更普遍或共同的密码子取代该密码子。本领域技术人员用于评价密码子优化的程序包括由Integrated DNA Technologies、EnCor Biotechnology，Inc.、JCat、OptimumGene TM(GenScript USA，Inc.，Pisataway，NJ 08854)等提供的那些。编码本文所述CAR实施方案的序列可以是密码子优化的，这可以提高它们的翻译效率。
除非另有具体说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
术语“有效连接”是指调节序列与异源核酸序列之间的功能性连接，这导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与编码序列有效连接。通常，有效连接的DNA序列是连续的，并且在必要时在相同的阅读框中连接两个蛋白质编码区。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意在表示来自疾病区域(如患者的特定组织或器官内的实体瘤)的细胞中肿瘤抗原相对于来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平的异常水平。患有以肿瘤抗原的过表达为特征的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者可以通过本领域已知的标准测定来确定。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如，皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。
术语“患者”、“对象”、“个体”等在本文中可互换使用，并且指可适用于本文所述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施方案中，患者、对象或个体是人。
本文使用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有这样的一般知识，即核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即使用普通克隆技术和PCRTM等，以及通过合成手段从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列。
如本文所使用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体)，以及较长链(其在本领域中通常称为蛋白质)两者，其中有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或其组合。
本文所用的术语“启动子”定义为起始多核苷酸序列特异性转录所需的由细胞合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。
如本文所用的术语“启动子/调节序列”意指表达与启动子/调节序列有效连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在另一些情况下，该序列还可以包含增强子序列和表达基因产物所需的其他调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。“组成型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸有效连接时，使得基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生。
“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸有效连接时，基本上仅当对应于启动子的诱导物存在于细胞中时才在细胞中产生基因产物。
“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码基因或由基因指定的多核苷酸有效连接时，基本上只有该细胞是对应于该启动子的组织类型的细胞时，才在细胞中产生基因产物。
如本文所用，关于抗体的术语“特异性结合”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或更多个物种的该抗原。但是，这种种间交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意味着该相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体一般识别并结合特定的蛋白质结构，而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有经标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少结合于抗体的标记的A的量。
术语“刺激”意指通过刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合从而介导信号转导事件(例如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导)而诱导的初级应答。刺激可介导某些分子表达的改变，例如TGF-β的下调，和/或细胞骨架结构的再组织等。
本文所用的术语“刺激性分子”意指与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激性配体特异性结合的T细胞上的分子。
本文所用的“刺激性配体”意指这样的配体，当其存在于抗原呈递细胞(例如aAPC、树突状细胞、B细胞等)上时，可与T细胞上的同源结合伴侣(在本文中称为“刺激性分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初级应答，包括但不限于活化、免疫应答的起始、增殖等。刺激性配体是本领域公知的，并且尤其包括负载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超级激动剂(superagonist)抗CD28抗体和超级激动剂抗CD2抗体。
术语“对象”旨在包括其中可引起免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。对象的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、及其转基因种。
如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其他细胞类型分离的细胞，其中该细胞通常以其天然存在状态与其他细胞类型缔合。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在另一些情况下，该术语简单地指已经与在天然状态下天然地与其缔合的细胞相分离的细胞。在一些实施方案中，细胞在体外培养。在另一些实施方案中，细胞不在体外培养。
本文所用的术语“治疗的”意指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指将引起研究者、兽医、医生或其他临床医生所寻求的组织、系统或对象的生物或医学响应之目标化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以防止所治疗的病症或疾病之一种或更多种病征或症状发展或在一定程度上将其减轻的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度和待治疗对象的年龄、体重等而变化。
如本文使用的术语，“治疗”疾病意指降低对象所经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。
如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代对象细胞及其后代。
如本文所用的短语“在转录控制下”或“有效连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向，以控制通过RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
“载体”是包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
范围：贯穿本公开内容，本发明的多个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，诸如1至6的范围描述应当被认为已经具体公开了子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单独数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何均适用。
描述
在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗尤其是癌症的疾病的组合物和方法。所述癌症可以是血液恶性肿瘤、实体瘤、原发或转移性肿瘤。或者，本公开内容的一些实施方案可用于治疗其他疾病，包括感染性疾病。
在一些实施方案中，本发明提供了经工程改造以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，其中CAR T细胞表现出抗肿瘤性质。在一个优选的实施方案中，CAR是全人CAR。本发明的CAR可以经工程改造以包含胞外结构域，其具有与T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的细胞内信号传导结构域融合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，当在T细胞中表达时，本发明的CAR能够基于抗原结合特异性重定向抗原识别。一种示例性抗原是CD19，因为这种抗原在恶性B细胞上表达。然而，本发明不限于靶向CD19。相反，本发明包括任何抗原结合部分，当所述抗原结合部分与其同源抗原结合时，影响肿瘤细胞以使得肿瘤细胞不能生长，促使其死亡，或受到影响以使得患者的肿瘤负荷减少或消除。在一些实施方案中，抗原结合部分与来自多个共刺激分子的细胞内结构域和ζ链融合。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含以下排列：
scFv-28-137-27-CD3z-2A-iCasp9。
在一些实施方案中，上述示例性的，非限制性排列从左到右是CAR的N末端到C末端。CAR可以包含或另外包含如本文所述的元件的任意其他组合。
组合物
在一些实施方案中，本发明提供了包含胞外和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本发明的CAR完全是人的。在一些实施方案中，胞外结构域包含靶特异性结合元件，其另外称为抗原结合部分。细胞内结构域或其他胞质结构域包含共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效应答所需的。
应当理解的是，CAR可以包含具有本文所提供之序列或其变体的区域(例如，抗原结合结构域、跨膜结构域、胞质结构域、信号传导结构域、安全结构域和/或接头，或其任意组合)，或其任一个的片段(例如，保留CAR活性所需的功能的变体和/或片段)可以包含在如本文所述的CAR蛋白中。在一些实施方案中，变体相对于所示序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸改变。在一些实施方案中，变体具有与所示序列至少80％、至少85％、至少90％、90％至95％、至少95％或至少99％相同的序列。在一些实施方案中，片段比本文提供的序列短1至5个、5至10个、10至20个、20至30个、30至40个或40至50个氨基酸。在一些实施方案中，片段在所提供序列的N末端、C末端或两个末端区域处更短。在一些实施方案中，片段含有本文提供的序列中氨基酸数目的80％至85％、85％至90％、90％至95％或95％至99％。
在CAR的胞外结构域与跨膜结构域之间，或在CAR的胞质结构域与跨膜结构域之间，可以并入间隔区结构域。如本文所使用，术语“间隔区结构域”一般意指起作用将跨膜结构域与多肽链中的胞外结构域或胞质结构域连接的任何寡肽或多肽。间隔区结构域可以包含多至300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，且最优选25至50个氨基酸。
在一些实施方案中，CAR的间隔区和/或铰链序列选自一个或更多个以下间隔区序列或铰链序列：
间隔区序列：
GGGGS(SEQ ID NO：1)
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：2)
GGGGS x3(SEQ ID NO：3)
GS18：GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO：4)
218S：GSTSGSGKPGSSEGSTKG(SEQ ID NO：5)
GS8：GGGGSGGG(SEQ ID NO：6)
铰链序列：
天然：VEPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：7)
C233S：LDPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：8)
C233P：VEPKSPDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：9)
σ5：LDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：10)
抗原结合部分
在一些实施方案中，本发明的CAR包含靶特异性结合元件，其另外称为抗原结合部分或抗原结合结构域。部分的选择取决于限定了靶细胞表面的配体类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物起作用的配体。因此，可以作为本发明CAR中抗原部分结构域的配体起作用的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫病以及癌细胞相关的那些。在一些实施方案中，可以通过工程改造特异性结合肿瘤细胞上抗原的所需抗原结合部分，将本发明的CAR工程改造为靶向目的肿瘤抗原。在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性疾病抗原”或“与过度增殖性疾病相关的抗原”是指特定过度增殖性疾病(例如癌症)所共有的抗原。本文讨论的抗原仅作为实例包括其中。该列表不旨在为排他性的，并且其他实例对于本领域技术人员将是明显的。
CAR的抗原结合结构域可靶向例如CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、CD37 PSMA、糖脂F77、HER2、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR和MAGE A3 TCR。或者，CAR的抗原结合结构域部分靶向的抗原包括但不限于FRα、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、雌激素受体、孕酮受体、HER-2/neu、uPA、PAI-1等。可以用PCT公开WO2013/123061(第20页)中的教导靶向对癌症具有特异性的其他抗原。
抗原结合结构域可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、单链抗体(例如scFv)、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、及其片段。在一些情况下，抗原结合结构域来自CAR将最终用于其中的相同物种是有益的。例如，对于在人中使用，CAR的抗原结合结构域包含人抗体或其片段可能是有益的。因此，在一个实施方案中，抗原结合结构域部分包含人抗体或其片段。
对于人中抗体的体内使用，可优选使用人抗体。完全人抗体对于人类对象的治疗性处理是特别理想的。人抗体可以通过本领域已知的多种方法制备，包括使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法，包括对这些技术的改进。也参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741；其各自均通过引用以其整体并入本文。人抗体也可以是其中重链和轻链由来自一个或更多个人DNA来源的核苷酸序列编码的抗体。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生人抗体。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可以随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除了人重链和轻链基因之外，可以将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞中。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以经由通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座分开或同时呈现非功能性。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制了内源抗体的产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后将嵌合小鼠繁殖以产生表达人抗体的纯合后代。用选定的抗原(例如本发明多肽的全部或一部分)以正常方式免疫转基因小鼠。
可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对抗原的抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可以产生治疗上可用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体，包括但不限于IgG1(γ1)和IgG3。对于用于产生人抗体和人单克隆抗体的这种技术和用于产生这样的抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公开号WO2014/055771、WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318和5,939,598，其各自均通过引用以其整体并入本文。
“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性，即在本发明中，结合例如CD19的能力。
在一些实施方案中，本发明CAR的抗原结合部分的部分靶向CD19。优选地，在一些实施方案中，本发明CAR中的抗原结合部分的部分是全人抗CD19 scFV。示例性CD19 scFV教导于美国专利号US7902338和US7109304，以及美国公开申请号US20070178103和US20130287748，以及PCT公开申请号WO2014153270A1中，关于与CD19 scFV相关的教导，其各自均通过引用并入本文。示例性CD19 scFV在SEQ ID NO：34至45的序列中提供。在一些实施方案中，CD19 scFV包含SEQ ID NO：34至45中任一个的序列或其变体，所述变体与SEQ IDNO：34至45中任一个至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，CAR可以设计成包含融合至CAR胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用了与CAR中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
跨膜结构域可以来自天然来源或来自合成来源。当来源为天然时，结构域可以来自任何膜结合或跨膜蛋白质。本发明中特别有用的跨膜区可以来自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154(例如，至少包含其跨膜区)。在一些情况下，也可以使用多种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链。可以使用本领域已知的或本文所述的任何方法(例如通过使用UniProt数据库)来鉴定跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，在合成的跨膜结构域的每个末端会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选长度为2至10个氨基酸，可以形成CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一些实施方案中，本发明CAR中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。用于此目的之CD8的序列在PCT公开号WO2014/055771中教导。
在一些实施方案中，本发明CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。
在一些实施方案中，本公开内容的CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。下文提供了CD28的一个示例性序列，以及一个示例性跨膜结构域序列。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含以下示例性跨膜结构域序列或者其片段或变体，其能够将包含所述序列的CAR锚定到细胞膜。本领域技术人员将理解，完整的跨膜结构域或其部分可以与胞质结构域或其部分一起实施。在一些实施方案中，所用的跨膜和胞质结构域是CD28序列的连续部分。
CD28(19至220位氨基酸)
NKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：11)
CD28(153至179位氨基酸，跨膜结构域)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO：12)
在一些实施方案中，本公开内容的CAR包含含有全部或部分胞外结构域、全部或部分跨膜结构域以及全部或部分胞质结构域的CD28区。下面提供了包含在CAR中的CD28区的一个示例性序列。在一些实施方案中，CD28跨膜结构域包含以下示例性跨膜结构域序列或者其片段或变体，其能够将包含所述序列的CAR锚定到细胞膜。
CD28区
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSAS(SEQ ID NO：13)
在一些实施方案中，本公开内容的CAR中的跨膜结构域是CD27跨膜结构域。下面提供了CD27的一个示例性序列。本领域技术人员将理解，CD27的完整跨膜结构域或其部分可以与胞质结构域或其部分一起实施。在一些实施方案中，所述结构域是CD27序列的连续部分。
CD27(20至260位氨基酸)
ATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：14)
在一些实施方案中，本公开内容的CAR的跨膜结构域包含铰链结构域，例如CD8铰链结构域。参见PCT公开号WO2014/055771，其教导了一个示例性CD8铰链结构域序列。下文还提供了一个示例性的CD8铰链结构域序列。在一些实施方案中，CD8铰链结构域包含下述示例性序列或者其片段或变体，其能够为CAR或连接于铰链结构域的结构域提供柔性或防止其空间位阻。在一些情况下，也可以使用多种人铰链，包括人Ig(免疫球蛋白)铰链。
CD8铰链结构域
AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：15)
胞质结构域
在一些实施方案中，本发明CAR的胞质结构域或细胞内信号传导结构域负责活化其中已经放置了CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包括细胞因子的分泌)。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应物功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度而言，只要其转导效应物功能信号，则此类截短部分可用于代替完整链。因此，术语细胞内信号传导结构域意指包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明CAR中的细胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(T cellreceptor，TCR)的胞质序列和共同受体，其共同作用以在抗原受体结合后起始信号转导；以及具有相同功能性能力的这些序列的任何衍生物或变体和任何合成序列。
已知单独通过TCR产生的信号不足以完全活化T细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可以由两种不同类别的胞质信号传导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
初级胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可含有称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有在本发明中特别有用的初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括来自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选的是，本发明CAR中的胞质信号传导分子包含来自CD3ζ的胞质信号传导序列。
可以将CAR的胞质结构域设计为包含CD3ζ信号传导结构域自身或与在本发明CAR的上下文中可用的任何其他所需的胞质结构域组合。例如，CAR的胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子细胞内结构域的CAR的一部分。因此，虽然本发明主要以CD28、CD137和CD27作为共刺激信号传导元件的示例，但是其他额外的共刺激元件也在本发明的范围内。
本发明CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，优选长度为2至10个氨基酸，可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
在一些实施方案中，设计胞质结构域以包含CD3ζ的信号传导结构域以及CD28、CD137和CD27的信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞质结构域包含CD27细胞内信号传导结构域(例如，CD27胞质信号传导结构域)。在一些实施方案中，CD27信号传导结构域显示增强免疫效应物活性(包括但不限于细胞增殖和细胞因子产生)的效应物信号传导功能。下文提供了一个示例性CD27信号传导结构域序列。在一些实施方案中，CD27信号传导结构域包含以下示例性序列或者其片段或变体，与包含下文示例性序列的CAR相比，当其包含在CAR中时具有相同或改善的功能(例如细胞溶解活性、细胞增殖或细胞因子分泌)。可以使用本领域已知的任何合适方法测试该功能。
CD27信号传导结构域
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：16)
在一些实施方案中，胞质结构域包含CD137细胞内信号传导结构域(例如，CD137胞质信号传导结构域)。下文提供了一个示例性的CD137信号传导结构域序列。
CD137信号传导结构域
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：17)
在一些实施方案中，胞质结构域包含CD28细胞内信号传导结构域(例如，CD28胞质信号传导结构域)。下文提供了一个示例性的CD28信号传导结构域序列。
CD28信号传导结构域
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：18)
在一些实施方案中，本公开内容的CAR包含来自CD3ζ的胞质信号传导序列。下文提供了CD3ζ结构域序列的实例。在一些实施方案中，CD3ζ信号传导结构域包含下述CD3ζ序列之一或者其片段或变体，与包含以下序列的CAR相比，当其包含在CAR中时具有相同或改善的功能(例如细胞溶解活性或细胞因子的分泌)。
CD3ζ信号传导结构域
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：19)
CD3ζ信号传导结构域
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：20)
可以设计CAR的胞质结构域以包含与本公开内容的CAR的上下文中可用的任何其他所需的胞质结构域相组合的CD3ζ信号传导结构域。例如，CAR的胞质结构域可以包含CD3ζ结构域和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。因此，尽管本公开内容主要以4-1BB、CD28、CD137和CD27作为共刺激信号传导元件的示例，但是其他额外的共刺激元件也在本公开内容的范围内。共刺激信号传导区的实例序列如下所示。
CD28(180至220位氨基酸，胞质结构域)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO：21)
4-1BB(CD137)细胞内TRAF结合结构域
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：22)
ICOS细胞内结构域
CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL(SEQ ID NO：23)
OX40细胞内结构域
ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(SEQ ID NO：24)
CD27细胞内结构域
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：25)
CD127细胞内结构域
KRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ(SEQ ID NO：26)
在一些实施方案中，本公开内容的CAR包含凋亡诱导基因Casp9或者其结构域或截短形式。一个示例性Casp9序列和截短序列如下。在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域与Casp9之间的接头(例如，肽接头)。
在一些实施方案中，本公开内容的CAR包含凋亡诱导基因Casp9或者其结构域或截短形式。一个示例性Casp9序列和截短序列如下。在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ结构域与Casp9之间的接头(例如，肽接头)。
CASP9氨基酸序列
MDEADRRLLRRCRLRLVEELQVDQLWDALLSRELFRPHMIEDIQRAGSGSRRDQARQLIIDLETRGSQALPLFISCLEDTGQDMLASFLRTNRQAAKLSKPTLENLTPVVLRPEIRKPEVLRPETPRPVDIGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO：27)
截短的CASP9氨基酸序列
VGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(SEQ ID NO：28)
在一些实施方案中，CD3ζ结构域与Casp9结构域之间的肽接头是2A肽接头。“2A肽接头”是指编码小核糖核酸病毒(picornavirus)(例如口蹄疫病毒(F2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、Thosea asigna病毒(T2A)和猪捷申病毒(teschovirus)-1(P2A))的2A区的氨基酸序列或其部分。通常，2A肽接头通过引起核糖体跳跃(ribosome skipping)使得能够进行多顺反子蛋白质表达。以下提供2A接头的实例。
F2A：VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：30)
E2A：QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：31)
T2A：EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：32)
P2A：ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：33)
在一些实施方案中，胞质结构域还包含iCasp9结构域和/或FKBP结构域。通常，FK506结合蛋白(FK 506binding protein，FKBP)在某些小分子(例如FK1012、FK506、FKCsA、雷帕霉素、香豆霉素、赤霉素、HaXS等)存在下二聚化。因此，FKBP可用于进行化学二聚化。例如，FKBP结构域可以与无活性的胱天蛋白酶9(inactive caspase 9，iCasp9)融合。在某些小分子存在下，iCasp9-FKBP蛋白将二聚化并活化Casp9，从而诱导含有iCasp9-FKBP融合蛋白的细胞的凋亡。下文提供了一个示例性突变的FK506结合蛋白基序。
FKBP f36v氨基酸序列
MGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE(SEQ ID NO：29)
在一些实施方案中，CAR包含以下序列或由其组成，其通过包含在其中的示例性结构域分解：
抗CD19 scFv链1(例如，SEQ ID NO：34至45中任一个的链1)
GSTSGSGKPGSSEGSTKG(任选的接头；SEQ ID NO：5)
抗CD19 scFv链2(例如，SEQ ID NO：34至45中任一个的链2)
GSTSGSGKPGSSEGSTKG(任选的接头；SEQ ID NO：5)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(CD28跨膜结构域；SEQ ID NO：12)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(CD137胞质信号传导结构域；SEQ ID NO：17)
GSTSGSGKPGSSEGSTKG(任选的接头；SEQ ID NO：5)
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(CD27胞质信号传导结构域；SEQ ID NO：14)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(CD3ζ信号传导结构域；SEQ ID NO：19)
2A接头(例如SEQ ID NO：30至33中的任一个)
VGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS(截短的Casp9，SEQ ID NO：28)。
然而，应当理解，本文所述序列的其他组合也可以用于CAR中。
载体
在一些实施方案中，本发明包括包含CAR序列的DNA构建体，其中所述序列包含与细胞内结构域的核酸序列有效连接的抗原结合部分的核酸序列。可用于本发明CAR中的示例性细胞内结构域包括但不限于CD3ζ、CD27、CD137、CD28等的细胞内结构域。在一些情况下，CAR还可以包含凋亡诱导基因Casp9。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如使用标准技术通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含所述基因的载体获得基因，或通过直接从含有所述基因的细胞和组织中分离。或者，可以合成地产生目的基因，而非克隆。
本发明还提供其中插入了本发明DNA的载体。来自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的扩增。慢病毒载体相对于来自致癌逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有附加的优点，在于它们可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的附加优点。在另一个实施方案中，所需CAR可以通过转座子在细胞中表达。
简言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子有效连接，并将该构建体整合到表达载体中来实现。载体可以适合于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有可用于调节所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。本发明的表达构建体还可以用于使用标准基因递送方案的核酸免疫和基因治疗。基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，以其整体通过引用并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了基因治疗载体。
核酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到这样的载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和黏粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，可以以病毒载体的形式向细胞提供表达载体。病毒载体技术是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或更多个可选择标志物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统以将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将所选择的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并体内或离体递送至对象的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30至110bp的区域中，尽管最近已经示出许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，以使得当元件相对于另一个元件反转或移动时会保持启动子功能。在胸苷激酶(thymidine kinase，tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp远。依据于启动子，似乎单独元件可以协作或独立地发挥作用以激活转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1a(EF-1a)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)、人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)长末端重复(long terminal repeat，LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃-巴病毒立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了能够开启多核苷酸序列表达的分子开关，当期望这种表达时，其有效连接，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有可选择性标志物基因或报道基因或两者，以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群鉴定和选择表达的细胞。在另一些方面，可以在分开的DNA片段上携带可选择标志物并将其用于共转染方法中。可选择标志物和报道基因两者的侧翼可以有适当的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。可用的可选择标志物包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报告基因用于鉴定潜在被转染的细胞和用于评估调节性序列的功能。通常，报告基因是不存在于接受者生物体或组织中或不由接受者生物体或组织表达的基因，并且其编码多肽，所述多肽的表达通过一些容易检测的性质例如酶促活性表现。在将DNA引入接受者细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码以下的基因：萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因(例如Ui-Tei等，2000 FEBS Letters 479：79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，显示报告基因最高水平表达的具有最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可以连接到报告基因并用于评价试剂调节启动子驱动转录的能力。
将基因引入细胞和表达入细胞的方法是本领域已知的。在表达载体的情况中，可以通过本领域中的任何方法容易地将载体引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染(lipofection)、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。参见例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种优选方法是磷酸钙转染。
用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体已成为将基因插入哺乳动物(例如人)细胞中最广泛使用的方法。其他病毒载体可来自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠，和基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载剂的一种示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。
在使用非病毒递送系统的情况下，一种示例性递送载剂是脂质体。考虑了使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、通过与脂质体和寡核苷酸两者缔合的连接分子连接到脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、以悬浮液包含在脂质中、包含或与胶束复合、或者以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构存在，作为胶束或以“塌陷(collapsed)”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可以天然存在的脂肪物质或合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪液滴以及包含长链脂族烃及其衍生物的化合物类，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(dimyristylphosphatidylcholine，“DMPC”)可以从Sigma，St.Louis，MO获得；双十六烷基磷酸酯(dicetyl phosphate，“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇(cholesterol，“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(dimyristyl phosphatidylglycerol，“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易挥发。“脂质体”是涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的多种单层和多层脂质载剂的通用术语。脂质体可以表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊状结构。多层脂质体具有通过水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在封闭结构形成之前经历自我重排，并且将水和溶解的溶质包埋在脂质双层之间(Ghosh等，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，也涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。也考虑lipofectamine-核酸复合物。
无论是用于将外源核酸引入宿主细胞的方法或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或通过本文所述的测定来检测特定肽的存在与否，以鉴定落入本发明范围内的试剂。
RNA转染
在一些实施方案中，本发明经遗传修饰的T细胞为通过引入RNA进行修饰。在一个实施方案中，体外转录的RNA CAR可以作为瞬时转染形式引入细胞。通过使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)产生的模板通过体外转录产生RNA。来自任何来源的目的DNA可以通过PCR直接转化成模板以用于使用合适的引物和RNA聚合酶的体外mRNA合成。DNA的来源可以是例如基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他合适的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本发明的CAR。例如，RNA CAR的模板包含含有抗CD19scFv的胞外结构域；跨膜结构域(例如CD8a的铰链和跨膜结构域或CD28的跨膜结构域)；并且胞质结构域包含CD3ζ的信号传导结构域以及CD28、CD137和CD27的信号传导结构域。
在一个实施方案中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，DNA是全长目的基因或基因的一部分。该基因可以包含5’和/或3’非翻译区(untranslated region，UTR)中的一些或全部。该基因可以包含外显子和内含子。在一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人基因。在另一个实施方案中，待用于PCR的DNA是包含5’和3’UTR的人基因。或者，DNA可以是在天然存在的生物体中通常不表达的人工DNA序列。一种示例性人工DNA序列是含有连接在一起以形成编码融合蛋白之开放阅读框的基因部分的DNA序列。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个生物体。
可用作PCR的DNA来源的基因包括编码对生物体提供治疗或预防效果或可用于诊断生物体中的疾病或病症之多肽的基因。优选的基因是可用于短期治疗或其中存在关于剂量或表达的基因的安全性问题的基因。例如，为了治疗癌症，自身免疫病，寄生虫、病毒、细菌、真菌或其他感染，待表达的转基因可以编码作用为免疫系统细胞的配体或受体的多肽，或者可以起作用以刺激或抑制生物体的免疫系统。在一些实施方案中，不期望具有延长的对免疫系统的持续刺激，也不需要产生在成功治疗后持续的变化，因为这可能随后引起新的问题。对于自身免疫病的治疗，可能需要在突发期间但不是长期地抑制或阻抑免疫系统，这可能导致患者对感染过度敏感。
PCR用于产生用于转染的mRNA的体外转录的模板。用于进行PCR的方法是本领域公知的。设计用于PCR的引物以具有与待用作PCR模板的DNA区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”是指这样的核苷酸序列，其中引物序列中的大部分或全部碱基是互补的，或者一个或更多个碱基是非互补的或错配的。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。可以设计引物以与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可以设计引物以扩增在细胞(开放阅读框)中正常转录的基因部分，包括5’和3’UTR。还可以设计引物以扩增编码特定目的结构域的基因部分。在一个实施方案中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包括5’和3’UTR的全部或部分。通过本领域公知的合成方法产生可用于PCR的引物。
“正向引物”是包含与DNA模板上位于待扩增DNA序列上游的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。“上游”在本文中用于指相对于编码链在待扩增DNA序列5’的位置。“反向引物”是包含与待扩增DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指相对于编码链在待扩增的DNA序列3’的位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶均可用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选具有5’和3’UTR。在一个实施方案中，5’UTR的长度为0至3000个核苷酸。待添加到编码区的5’和3’UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计退火到UTR的不同区域的PCR引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以修饰所需的5’和3’UTR长度，以在将转录的RNA转染后实现最佳翻译效率。
5’和3’UTR可以是目的基因的天然存在的内源5’和3’UTR。或者，可以通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其他修饰来添加与目的基因非内源的UTR序列。使用与目的基因非内源的UTR序列可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域公知的UTR的性质选择或设计3’UTR以提高转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5’UTR可以含有内源基因的Kozak序列。或者，当如上所述通过PCR添加目的基因的非内源5’UTR时，可以通过添加5’UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎并不是所有RNA都需要其才能够有效翻译。许多mRNA对Kozak序列的需求是本领域已知的。在另一些实施方案中，5’UTR可来自其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在另一些实施方案中，可以在3’或5’UTR中使用多种核苷酸类似物以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了能够从DNA模板合成RNA，而不需要基因克隆，应该将转录启动子连接于待转录序列上游的DNA模板。当将用作RNA聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5’端时，RNA聚合酶启动子被并入待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方案中，如本文别处所述，启动子是T7聚合酶启动子。其他可用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个优选的实施方案中，mRNA具有在5’端上的帽和3’poly(A)尾两者，其确定细胞中的核糖体结合、翻译起始和mRNA稳定性。在环状DNA模板(例如质粒DNA)上，RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长多联产物(long concatameric product)。在3’UTR端线性化的质粒DNA的转录会导致产生正常大小的mRNA，其在真核生物转染中不是有效的，即使其在转录后是聚腺苷酸化的。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以将转录物的3’端延伸超过模板的最后碱基(Schenborn和Mierendorf，Nuc Acids Res.，13：6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.，270：1485-65(2003))。
将polyA/T段整合入DNA模板的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的polyA/T序列可以引起质粒的不稳定性，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板常常被缺失和其他偏差严重损害。这使得克隆过程不仅费力而且费时，并且通常不可靠。这就是为什么非常需要允许构建具有polyA/T3’段的DNA模板而不必克隆的方法。
转录DNA模板的polyA/T区段可以在PCR期间通过使用含有polyT尾的反向引物(例如100T尾(大小可以是50至5000T))产生，或者在PCR之后通过任何其他方法产生，所述方法包括但不限于DNA连接或体外重组。poly(A)尾也向RNA提供稳定性并减少其降解。通常，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，poly(A)尾为100至5000个腺苷。
使用poly(A)聚合酶(例如大肠杆菌(E.coli)polyA聚合酶(E-PAP))体外转录后，RNA的poly(A)尾可以进一步延伸。在一个实施方案中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300个至400个核苷酸导致RNA的翻译效率提高约两倍。另外，不同化学基团与3’端的连接可提高mRNA稳定性。这种连接可以包含修饰的/人工核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可使用poly(A)聚合酶将ATP类似物并入poly(A)尾中。ATP类似物可以进一步提高RNA的稳定性。
5’帽也向RNA分子提供稳定性。在一个优选的实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包含5’帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5’帽(Cougot等，Trends inBiochem.Sci.，29：436-444(2001)；Stepinski等，RNA，7：1468-95(2001)；Elango等，Biochim.Biophys.Res.Commun.，330：958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(internalribosome entry site，IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其起始不依赖于帽之核糖体与mRNA结合并促进翻译的起始。可以包括适合于细胞电穿孔的任何溶质，其可以包含促进细胞通透性和生存力的因子，例如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用多种不同方法中的任何一种将RNA引入靶细胞，例如，市售方法，其包括但不限于：电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，德国))，(ECM830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Mass.)或Gene Pulser II(BioRad，Denver，Colo.)，Multiporator(Eppendort，Hamburg，德国)，使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染，聚合物包封，肽介导的转染，或生物射弹颗粒递送系统例如“基因枪”(参见例如Nishikawa等，Hum Gene Ther.，12(8)：861-70(2001))。
遗传修饰的T细胞
在一些实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将CAR序列(例如，如本文所述的编码CAR的核酸序列)递送到细胞中。使用转导细胞作为载体或者无细胞局部或全身递送的包封的、结合的或裸露的载体，可以将表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体中。所使用的方法可以用于其中需要稳定表达或稳定表达充分的任何目的。
在另一些实施方案中，使用体外转录的mRNA将CAR序列递送到细胞中。使用转染细胞作为载体或者无细胞局部或全身递送包封的、结合的或裸露的mRNA，可以将体外转录的mRNA CAR递送到不同类型的真核细胞以及组织和整个生物体中。所使用的方法可以用于其中需要稳定表达或稳定表达充分的任何目的。
在另一个实施方案中，所需的CAR可以通过转座子的方式在细胞中表达。
所公开的方法可以应用于在癌症、干细胞、急性和慢性感染以及自身免疫病领域中的基础研究和治疗中的T细胞活性调节，包括评估遗传修饰的T细胞杀伤靶癌细胞的能力。
所述方法还提供了通过改变例如启动子或输入RNA的量来控制广泛范围内的表达水平的能力，使得可以单独调节表达水平。此外，基于PCR的mRNA产生技术极大地促进具有不同结构及其结构域组合的嵌合受体mRNA的设计。例如，相同细胞中多种嵌合受体上的不同细胞内效应物/共刺激因子结构域的变化允许测定受体组合的结构，其评估针对多抗原靶标的最高水平的细胞毒性，同时对正常细胞具有最低的细胞毒性。
本发明RNA转染方法的一个优点是RNA转染基本上是瞬时的，并且无载体：可以在短暂的体外细胞活化后，将RNA转基因递送至淋巴细胞并作为最小表达盒在其中表达，而不需要任何额外的病毒序列。在这些条件下，转基因不可能整合到宿主细胞基因组中。
因为RNA的转染效率和其均匀修饰整个淋巴细胞群的能力，所以细胞的克隆不是必需的。用体外转录的RNA(in vitro-transcribed RNA，IVT-RNA)对T细胞的遗传修饰利用了两种不同的策略，这两种策略在多种动物模型中已经被成功地测试。通过脂质转染或电穿孔用体外转录的RNA转染细胞。优选地，期望使用多种修饰来稳定IVT-RNA，以实现转移的IVT-RNA延长的表达。
一些IVT载体在文献中是已知的，其以标准化方式用作用于体外转录的模板，并且已经以产生稳定的RNA转录物的方式进行遗传修饰。
目前本领域中所使用的方案基于具有以下结构的质粒载体：使得RNA转录的5’RNA聚合酶启动子，随后是3’和/或5’侧翼为非翻译区(UTR)的目的基因，和含有50至70个A核苷酸的3’聚腺嘌呤基盒(polyadenyl cassette)。在体外转录之前，将环状质粒通过II型限制酶(识别序列对应于切割位点)在聚腺嘌呤基盒的下游线性化。因此，聚腺嘌呤基盒对应于转录物中较后的poly(A)序列。作为该方法的结果，一些核苷酸在线性化后保留为酶切割位点的部分，并在3’端延伸或掩蔽poly(A)序列。还不清楚这种非生理性突出端是否会影响从这种构建体胞内产生的蛋白质的量。
RNA相对于更传统的质粒或病毒方法具有几个优点。来自RNA来源的基因表达不需要转录，并且在转染后迅速产生蛋白质产物。此外，由于RNA仅必须进入细胞质而不是细胞核，因此通常的转染方法导致极高的转染率。此外，基于质粒的方法需要驱动目的基因表达的启动子在所研究的细胞中有活性。
在另一个方面，RNA构建体可通过电穿孔递送入细胞。参见例如，将核酸构建体电穿孔进入哺乳动物细胞的制剂与方法，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841 A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教导。任何已知细胞类型的电穿孔所需的多种参数(包括电场强度)一般在相关研究文献中以及本领域的许多专利和应用中是已知的。参见例如美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔治疗应用的设备是可商购获得的，例如MedPulserTM DNA电穿孔治疗系统(Inovio/Genetronics，San Diego，Calif.)，并描述于专利中，如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482；电穿孔也可用于体外转染细胞，例如在US20070128708A1中所述。电穿孔也可以用于在体外将核酸递送到细胞中。
因此，使用本领域技术人员已知的许多可获得的装置和电穿孔系统中的任一种，经电穿孔介导将包括表达构建体的核酸施用到细胞中，提出了用于将目的RNA递送到靶细胞的令人兴奋的新手段。
T细胞来源
在本发明T细胞的扩增和遗传修饰之前，可以从对象获得T细胞来源。T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织，来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，可以使用技术人员已知的任何数量的技术例如FicollTM分离从获自对象的血液单位获得T细胞。在一个优选的实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采血液成分术(apheresis)获得。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞，其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在本发明的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)洗涤细胞。在一个替代实施方案中，洗涤溶液缺少钙并且可缺少镁或可缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。再次令人惊讶地，在不存在钙的情况下的初始活化步骤导致活化的放大。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法实现，例如通过根据制造商的说明书使用半自动化“无逆流”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬浮在多种生物相容性缓冲液中，例如不含Ca2+、不含Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或者含有或不含缓冲液的其他盐水溶液。或者，可以除去单采血液成分术样品不需要的组分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。
在另一个实施方案中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞(例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析)从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3x28)缀合珠(例如M-450CD3/CD28T)孵育足以进行阳性选择所需T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段为约30分钟。在另一个实施方案中，时间段范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一个实施方案中，所述时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选的实施方案中，所述时间段为10至24小时。在一个优选的实施方案中，孵育时间段为24小时。为了从患有白血病的患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间(例如24小时)可以提高细胞产量。在与其他细胞类型相比有很少T细胞的任何情况下，例如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)的情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长T细胞被允许结合CD3/CD28珠的时间和/或通过提高或降低珠与T细胞的比(如本文进一步描述)，可以在培养起始时或在过程中的其他时间点优先选择T细胞亚群或针对其选择T细胞亚群。此外，通过提高或降低珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比，可以在培养起始或其他所需时间点优先选择T细胞亚群或针对其选择T细胞亚群。技术人员将认识到，多轮选择也可以用于本发明的上下文中。在某些实施方案中，可能需要执行选择过程并在活化和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以进行其他轮的选择。
通过阴性选择进行的T细胞群富集可以与针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合来实现。一种方法是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择来富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。
或者，在某些实施方案中，通过抗C25缀合的珠或其他类似的选择方法耗尽调节性T细胞。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒(如珠))的浓度。在某些实施方案中，可能期望显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即，提高细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在其他实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增的增加。此外，高细胞浓度的使用允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原(例如CD28阴性T细胞)的细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)中捕获细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关实施方案中，可能需要使用更低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒(如珠))的混合物，颗粒与细胞之间的相互作用被最小化。这选择表达大量期望抗原的细胞结合到颗粒。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且与稀释浓度的CD8+T细胞相比被更有效地捕获。在一个实施方案中，所用细胞的浓度为5×106/ml。在另一些实施方案中，所用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml，以及其间的任何整数值。
在另一些实施方案中，细胞可以在2至10℃或室温下在旋转器上以变化的速度孵育不同长度的时间。
用于刺激的T细胞也可在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤会通过除去细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞而提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在本文的上下文中将是可用的，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或培养基，其含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLte A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°每分钟的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的汽相中。可以使用其他受控冷冻的方法，以及立即在-20℃下或在液氮中的不受控制的冷冻。在某些实施方案中，如本文所述解冻和洗涤冷冻保存的细胞，并使其在使用本发明的方法活化之前在室温下静置1小时。
在本发明的上下文中还涵盖，当可能需要本文所述的扩增细胞之前的时间段，从对象收集血液样品或单采血液成分术产物。因此，可以在任何需要的时间点收集待扩增的细胞的来源，并分离和冷冻期望的细胞(例如T细胞)以在之后用于针对任何数量的疾病或病症的T细胞治疗，所述疾病或病症将受益于T细胞治疗，例如本文所述的那些。在一个实施方案中，从通常健康的对象获取血液样品或单采血液成分。在某些实施方案中，血液样品或单采血液成分取自具有发生疾病风险但是尚未发生疾病的通常健康的对象，并且分离并冷冻目的细胞用于以后使用。在某些实施方案中，T细胞可以扩增、冷冻，并在以后使用。在某些实施方案中，在诊断本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一个实施方案中，在任何数量的相关治疗方式之前，从来自对象的血液样品或者单采血液成分中分离细胞，所述治疗方式包括但不限于用以下治疗：药剂例如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化学治疗、放射、免疫抑制剂如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体，或其他免疫清除剂(immunoablative agent)如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素(cyclosporine)和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等，Cell 66：807-815，1991；Henderson等，Immun.73：316-321，1991；Bierer等，Curr.Opin.Immun.5：763-773，1993)。在另一个实施方案中，针对患者分离细胞并冷冻用于随后的联用(例如，在之前、同时或之后)，所述联用为与骨髓或干细胞移植，使用化学治疗剂例如氟达拉滨、外束放射治疗(external-beam radiation theraoy，XRT)、环磷酰胺或抗体(如OKT3或CAMPATH)的T细胞清除治疗联用。在另一个实施方案中，细胞在之前分离，并且可以冷冻以随后用于B细胞清除治疗之后的治疗，例如与CD20反应的药剂(例如利妥昔单抗)。
在本发明的另一个实施方案中，T细胞为治疗后直接从患者获得。在这方面，已经观察到在某些癌症治疗之后，特别是使用损害免疫系统的药物的治疗之后，在患者通常从治疗中恢复期间的治疗后不久，所获得的T细胞的质量可能是对其离体扩增能力而言最佳的或改善的。同样，在使用本文所述的方法的离体操作之后，这些细胞可以处于植入和体内扩增增强的优选状态。因此，在本发明的上下文中，预期在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突状细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方案中，动员(mobilization)(例如，用GM-CSF动员)和条件化(condition)方案可用于在对象中产生这样的条件，其中特定细胞类型的再群体化(repopulation)、再循环、再生和/或扩增是有利的，特别是在治疗后的确定的时间窗口期间。举例说明性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞和免疫系统的其他细胞。
T细胞的活化和扩增
无论在T细胞的遗传修饰之前或之后表达所需的CAR，一般均可以使用例如在以下专利中所述的方法活化和扩增T细胞：美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和美国专利申请公开号20060121005。
通常，通过与其上连接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触而扩增本发明的T细胞。特别地，可以如本文所述刺激T细胞群，例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与联合钙离子载体的蛋白激酶C活化剂(例如苔藓虫素，bryostatin)接触。对于T细胞表面上辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国)，可以如本领域通常已知的其他方法那样使用(Berg等，Transplant Proc.30(8)：3975-3977，1998；Haanen等，J.Exp.Med.190(9)：13191328，1999；Garland等，J.ImmunolMeth.227(l-2)：53-63，1999)。
在某些实施方案中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，试剂可偶联到同一表面(即“顺式”形式)或偶联到不同的表面(即“反式”形式)。或者，可以将一种试剂偶联到表面，而另一种试剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂结合到细胞表面，而提供初级活化信号的试剂在溶液中或偶联到表面。在某些实施方案中，这两种试剂均可以在溶液中。在另一个实施方案中，试剂可以是可溶形式，然后交联到表面，例如表达Fc受体的细胞或抗体或将结合所述试剂的其他结合剂。在这方面，参见例如人工抗原呈递细胞(artificial antigen presenting cell，aAPC)的美国专利申请公开号20040101519和20060034810，其被考虑用于本发明中的T细胞活化和扩增。
在一些实施方案中，将两种试剂固定在珠上，或者在相同的珠上，即“顺式”，或者在不同的珠上，即“反式”。举例来说，提供初级活化信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且这两种试剂以相等的分子量共同固定至相同的珠。在一个实施方案中，使用了1∶1比例的与珠结合的每种抗体以用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用这样的与珠结合的抗CD3∶CD28抗体的比例，以使得与使用1∶1的比例观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个具体实施方案中，与使用1∶1的比例观察到的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个实施方案中，结合珠的CD3∶CD28抗体的比例范围为100∶1到1∶100和其间的所有整数值。在本发明的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体结合至颗粒，即CD3∶CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，结合珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2∶1。在一个特定实施方案中，使用1∶100的结合珠的CD3∶CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用1∶75的结合珠的CD3∶CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用1∶50的结合珠的CD3∶CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用1∶30的结合珠的CD3∶CD28抗体比例。在一个优选实施方案中，使用1∶10的结合珠的CD3∶CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用1∶3的结合珠的CD3∶CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用3∶1的结合珠的CD3∶CD28抗体比例。
1∶500至500∶1的颗粒与细胞的比例以及之间的任何整数值可用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易理解的，颗粒与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸珠只能结合几个细胞，而较大的珠粒可以结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比例范围为1∶100至100∶1以及其间的任何整数值，并且在另一些实施方案中，比例包括1∶9至9∶1以及其间的任何整数值，其也可以用于刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗CD3偶联颗粒和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比例可以如上所述变化，然而某些优选的值包括1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1和15∶1，一个优选的比例为每个T细胞至少1∶1的颗粒。在一个实施方案中，使用颗粒与细胞的比例为1∶1或更小。在一个具体实施方案中，优选的颗粒：细胞比为1∶5。在另一些实施方案中，颗粒与细胞的比可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，颗粒与细胞的比例在第一天为1∶1至10∶1，并且之后每天或每隔一天将额外的颗粒添加至细胞多至10天，最终比例为1∶1至1∶10(基于添加当天的细胞计数)。在一个具体实施方案中，颗粒与细胞的比例在刺激的第一天为1∶1，并在刺激的第三和第五天调整为1∶5。在另一个实施方案中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒，至最终比例在刺激的第一天为1∶1，在第三和第五天为1∶5。在另一个实施方案中，颗粒与细胞的比例在刺激的第一天为2∶1，并且在刺激的第三天和第五天调整为1∶10。在另一个实施方案中，在每天或每隔一天的基础上添加颗粒，至最终比例在刺激的第一天为1∶1，在第三和第五天为1∶10。本领域技术人员将理解，多种其他比例可适用于本发明。特别地，比例将根据颗粒尺寸以及细胞尺寸和类型而变化。
在本发明的另一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)与药剂包被的珠组合，随后分离珠和细胞，然后培养细胞。在一个替代的实施方案中，在培养之前，药剂包被的珠和细胞不分离，而是一起培养。在另一个实施方案中，首先通过施加力(例如磁力)浓缩珠和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可以通过使连接有抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28个珠)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如，104至109个T细胞)和珠(例如，比例为1∶1的M-450CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液中组合，优选PBS(无二价阳离子如钙和镁)。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能是非常稀少的并且仅包含0.01％的样品，或者整个样品(即100％)可包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目均在本发明的情形中。在某些实施方案中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，提高细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另一些实施方案中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增的增加。此外，高细胞浓度的使用允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原(例如CD28阴性T细胞)的细胞。在某些实施方案中，这样的细胞群可具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方案中，混合物可以培养几小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，可以将混合物培养21天。在本发明的一个实施方案中，将珠和T细胞一起培养约8天。在另一个实施方案中，将珠和T细胞一起培养2至3天。也可能需要几个刺激循环，以使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括可含有增殖和存活所必需的因子的合适培养基(例如，最低必须培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，包含血清(例如胎牛或人血清)、白介素-2(interleukin-2，IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白制剂(plasmanate)和还原剂，例如N-乙酰基半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素的RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo 20、Optimizer，其中无血清或补充有足够用于T细胞生长和扩增的适量血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中，而不包含在将要输注到对象的细胞培养物中。将靶细胞保持在支持生长所需的条件下，例如，适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，通常的血液或单采血液成分的外周血单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制性T细胞群(Tc，CD8+)的辅助T细胞群(3/4，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体的T细胞的离体扩增产生了这样的T细胞群，其在约第8至9天之前主要由3/4细胞组成，而在约第8至9天后，该T细胞群包含越来越多的Tc细胞群。因此，根据治疗的目的，用主要包含TH细胞的T细胞群输注对象可能是有利的。类似地，如果已经分离了Tc细胞的抗原特异性亚组，则更大程度地扩增该亚组可能是有益的。
此外，除了CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物显著变化，但在大部分中，其在细胞扩增过程期间可重复。因此，这种可重复性使得能够为特定目的定制活化的T细胞产物。
治疗应用
在一些实施方案中，本发明包括经修饰以表达CAR的细胞(例如，T细胞)，所述CAR组合了特异性抗体的抗原识别结构域与CD3ζ、CD28、CD27、或其任意组合的细胞内结构域。因此，在一些情况下，经转导的T细胞可以引发CAR介导的T细胞应答。
在一些实施方案中，本发明提供了使用CAR将原代T细胞的特异性重定向到肿瘤抗原的用途。因此，本发明还提供了刺激针对哺乳动物靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，包括向哺乳动物施用表达CAR的T细胞的步骤，其中所述CAR包含与预定靶标特异性相互作用的结合部分，包含例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分和共刺激信号传导区。在一个实施方案中，本发明包括一类细胞治疗，其中T细胞被遗传修饰以表达CAR，并且CART细胞被输注到有此需要的接受者。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。与抗体治疗不同，CAR T细胞能够在体内复制，从而引起长期持久性，其可导致持续的肿瘤控制。
在一些实施方案中，本发明的CAR T细胞可以经历稳健的体内T细胞扩增，并且可以持续延长量的时间。在另一个实施方案中，本发明的CAR T细胞发展成特异性记忆T细胞，其可以被重新活化以抑制任何另外的肿瘤形成或生长。例如，本发明的CD19特异性CAR T细胞可以经历稳健的体内T细胞扩增，并在血液和骨髓中以高水平持续延长量的时间，并形成特异性记忆T细胞。不希望受任何特定理论的束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，CAR T细胞可在体内分化成中心记忆样状态。
不希望受任何特定理论的束缚，CAR修饰的T细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答。此外，CAR介导的免疫应答可以是过继性免疫治疗方法的一部分，其中CAR修饰的T细胞诱导了对CAR中的抗原结合部分具有特异性的免疫应答。例如，CD19特异性CAR T细胞引发针对表达CD19的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包含人抗CD19scFv(例如C4scFv)、跨膜结构域，以及CD28、CD137、CD27和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但是本发明应当解释为包括如本文别处所述的构建体的每个组分的任何数量的变化。也就是说，本发明包括使用在CAR中的任何抗原结合部分以产生对抗原结合部分具有特异性的CAR介导的T细胞应答。例如，本发明CAR中的抗原结合部分可以靶向肿瘤抗原以用于治疗癌症的目的。
在一些实施方案中，本发明CAR的抗原结合部分被设计为治疗特定的癌症。例如，可以设计CAR具有信号传导结构域CD28、CD137、CD27和CD3ζ以靶向FRα，其可用于治疗癌症和病症，所述癌症和病症包括但不限于卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、结肠直肠癌、其他实体癌等。如上所述，经设计靶向CD19的CAR可用于治疗癌症，例如B细胞相关癌症。
本发明的CAR修饰的T细胞还可以充当哺乳动物中离体免疫和/或体内治疗的一种疫苗。优选地，所述哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物之前，在体外发生以下的至少一种：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体方法在本领域中是公知的，并且在下文中更充分地讨论。简言之，从哺乳动物(优选人)分离细胞并用表达本文公开的CAR的载体进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用于哺乳动物接受者以提供治疗益处。所述哺乳动物接受者可以是人，并且CAR修饰的细胞对于接受者可以是自体的。或者，细胞对于接受者可以是同种异体、同基因或异种的。
用于离体扩增造血干细胞和祖细胞的方法描述于美国专利号5,199,942中，其通过引用并入本文，其可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)从哺乳动物的外周血采集物或骨髓外植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；并且(2)离体扩增这样的细胞。除了在美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子之外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可用于细胞的培养和扩增。除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供用于体内免疫以引发针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，本发明的CAR修饰的T细胞用于治疗卵巢癌。在某些实施方案中，本发明的细胞用于治疗处于发生卵巢癌风险中的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防卵巢癌的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明的CAR修饰的T细胞。
本发明的CAR修饰的T细胞可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分例如IL-2或其他细胞因子或细胞群组合施用。简言之，本发明的药物组合物可以包含本文所述的靶细胞群，其与一种或更多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；助剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。
本发明的组合物优选配制成用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。将通过诸如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度等因素来确定施用的量和频率，尽管合适的剂量可以通过临床试验确定。
当指“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可以由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和患者(对象)的状况的个体差异来确定。一般而言，包含本文所述T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，优选105至106个细胞/kg体重的剂量施用，包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以以这些剂量施用多次。可以通过使用在免疫治疗中通常已知的输注技术施用细胞(参见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319：1676，1988)。对于特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病病征并相应地调整治疗而容易地确定。
在某些实施方案中，可能期望向对象施用活化的T细胞，然后根据本发明随后再次抽取血液(或已进行单采血液成分术)，从其中活化T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞再输注患者。该过程可以每几周进行多次。在某些实施方案中，T细胞可以从10cc至400cc抽取的血液活化。在某些实施方案中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽取的血液活化。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可用于选择出某些T细胞群。
主题组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结内(intranodally)、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内向患者施用。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射向患者施用。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射来施用。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在本发明的某些实施方案中，将使用本文所述的方法或本领域已知的其中将T细胞扩增至治疗水平的其他方法活化并扩增的细胞与任何数量的相关治疗方式结合(例如，之前、同时或之后)向患者施用，所述治疗方式包括但不限于用药剂治疗如抗病毒治疗、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗来治疗MS患者，或依法珠单抗来治疗银屑病患者，或其他治疗来治疗PML患者。在另一些实施方案中，本发明的T细胞可与以下联用：化学治疗、放射、免疫抑制剂，例如环孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体，或其他免疫清除剂例如CAM PATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。在另一个实施方案中，将本发明的细胞组合物与以下联合施用(例如，之前、同时或之后)于患者：骨髓移植、使用化学治疗剂例如氟达拉滨、外束放射治疗(XRT)、环磷酰胺或抗体(如OKT3或CAMPATH)的T细胞清除治疗。在另一个实施方案中，本发明的细胞组合物在B细胞清除治疗后施用，所述B细胞清除治疗例如与CD20反应的药剂，如利妥昔单抗。例如，在一个实施方案中，对象可以经历高剂量化学治疗，接着为外周血干细胞移植的标准治疗。在某些实施方案中，在移植后，对象接受本发明扩增的免疫细胞的输注。在另一个实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
向患者施用的上述治疗的剂量将随所治疗的病症和治疗的接受者的确切性质而变化。可以根据本领域接受的实践进行用于人体施用的剂量的标度。对于成年患者，例如CAMPATH的剂量通常在1至约100mg的范围内，通常每天施用，持续1至30天的时间段。优选的日剂量为每天1至10mg，但在一些情况下可以使用多至每天40mg的更大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。已经讨论了CAR T细胞给药和日程安排的策略(Ertl等，2011，CancerRes，71：3175-81；Junghans，2010，Journal of Translational Medicine，8：55)。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明的一些方面。除非另有说明，提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，并且不旨在限制。因此，本发明绝不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖作为本文提供的教导的结果而变得明显的任何和所有变化。
实施例1：CAR T细胞工程改造靶向B细胞恶性肿瘤
图1-17阐述了多个实施例，其示出了证明CAR实施方案可用于治疗和有效治愈B细胞恶性肿瘤的数据。下面进一步描述数据。
过继性T细胞治疗的限制是MHC限制。肿瘤通过缺失MHC-I和MHC-II逃脱以分别逃避CD8和CD4 T细胞。CAR-T治疗的三个关键包括(a)鉴定靶抗原并获得scFv(b)高效率基因转移到T细胞中以及(c)为了功效和安全性而改善T细胞信号传导和扩增。
使用慢病毒载体向T细胞递送CAR可能是有利的，原因如下：
a)容易制备
b)有效负载大，＞9kb
c)整合到分裂和非分裂细胞中
d)扩增的向性(VSV-G)
e)没有表达病毒基因
f)无病毒启动子(SIN-自身失活)
g)没有关于免疫缺陷(AIDS)患者中HIV整合相关的癌症的报道。
创建CAR-4S慢病毒载体(图1)。CAR-4S包括scFv-CD28-CD137-CD27-CD3z-2A-iCasp9。所使用的scFV是抗CD19scFV。添加其他结构域以辅助共信号传导、T细胞存活、T细胞记忆、效应物活化和诱导的安全性。将CAR递送至T细胞并示出其靶向B-ALL细胞(图2)。进行CAR T增殖测定，并且示出4S CAR在6天时具有33％的值(图3)。证明抗CD19 CAR T细胞能够杀伤靶CD19白血病细胞，在一些情况下在8分钟内诱导凋亡(图4)。
为了提高CAR的安全性，可以使用CAR二聚化和凋亡的合成诱导物(例如AP1903)，其可以与FKBp-Casp9相互作用(图5)。这种“安全”CAR包括4S-CAR。可以在4S-CAR T细胞中快速诱导凋亡(图6)。这些4S-CAR可以用于慢病毒-4S-CAR T细胞治疗，例如通过在第1天收集血液和活化T细胞，在第2至3天进行CAR基因转移，在第4天扩增CAR T细胞，以及在第5天将CAR T细胞输注到人体中以靶向人的肿瘤(图7)。作为概念证明，示出慢病毒(lentiviral，LV)基因转移到人T细胞中是有效的(图8)。示出这些LV CAR T细胞在基因转移后笫5天表达CD28和CD8或CD28和CD27(图9)。
接下来，对人患者进行两个病例研究。病例研究1患者的详情如下：
a)43岁女性-复发性难治的Ph+ALL
b)诊断于2007年8月，超CVAD：CR
c)2007年11月，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)
d)BCR/ABL+：格列卫(Gleevec)
e)BCR/ABL＞125％
f)ALL复发，伊马替尼耐药
g)经口达沙替尼，VDLD+IL-2/胸腺素
h)尼洛替尼抗性
i)普纳替尼(Ponatinib)试验，复发的BCR/ABL
j)复发(BM 35％)。
病例研究1名患者接受1.1×108的CD19 CAR T输注。输注后7天的CAR T输注响应包括发热(39.7℃)、胸闷、呼吸短促和咳嗽以及血痰。在输注后9天，患者具有发热(40℃，非感染性发热)和升高的LDH(1333U/L相对于正常的114至240U/L)。在CAR-T输注后监测血浆IgG，并且在CAR输注后第19天和之后每3周向患者施用IVIg(图10)。在CAR-T输注后也监测血浆IgA/IgM水平(图11)。继续病例研究，总共3次输注：0.6至3×10e7/kg。在第120天，患者为BCR/ABL阴性。监测IL-6、干扰素-γ、外周血单核细胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)中的CAR拷贝数和骨髓(bone marrow，BM)中的CAR拷贝数的水平(图12)。
进行第二个病例研究(病例研究2)。病例研究2患者的详情如下：
a)34岁男性
b)有2周的腹部肿块病史
c)活组织检查：NHL，Burkitt淋巴瘤
a.IHC：CD20(+++)，PAX-5(+++)，CD79a(+++)，CD10(+)，Bcl-6(+)，Mum-1(-)，Ki-67(+＞75％)
b.FISH：Myc易位。
病例研究2患者的治疗史如下表所示。
病例研究2中患者的CAR T细胞输注治疗方案包括在第-7天的PBMC收集和CAR T细胞制备，在第-6天至-4天施用氟达拉滨(25mg/m2)，在第8天输注CAR T细胞(6×10e7)，在第3天输注CAR T细胞(6×10e7)，并在第7天输注CAR T细胞(3.0×10e8)。第11天的输注响应包括：
a)发汗、厌食、恶心、呕吐、缺氧
b)发热：39.3℃
c)低血压：BP 75/45mmHg
d)HR：150至180bpm
e)流体复苏，输注多巴胺。
还监测患者的血清尿酸和肌酸水平(图14)，以及血清细胞因子IL-6和干扰素-γ的水平(图15)。还监测IgG、IgA和IgM的水平(图16)。还监测患者的临床响应，并观察到B细胞减少(图17)。
总而言之，4S产生的CAR T细胞高效靶向B-ALL，CAR T细胞快速扩增并且在体内根除B细胞，输注的CAR T细胞能够快速到达BM，并且4S CAR设计在患者中具有重要的安全特征。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前述描述和以下说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的一些优选实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
序列表
<110> 佛罗里达大学研究基金会有限公司
<120> 基于CAR的免疫治疗
<130> U1197.70039WO00
<150> US 62/002,603
<151> 2014-05-23
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区
<400> 2
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔区
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS18 间隔区
<400> 4
Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 218S 间隔区
<400> 5
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GS8 间隔区
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 7
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C233S 铰链
<400> 8
Leu Asp Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C233P 铰链
<400> 9
Val Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> δ5 铰链
<400> 10
Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 202
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28氨基酸19-220
<400> 11
Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn
1 5 10 15
Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu
20 25 30
Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys
35 40 45
Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr
50 55 60
Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile
85 90 95
Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly
100 105 110
Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe
115 120 125
Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
130 135 140
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
145 150 155 160
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
165 170 175
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
180 185 190
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
195 200
<210> 12
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 12
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 13
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28区
<400> 13
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser
100 105
<210> 14
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD27氨基酸20-260
<400> 14
Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln
1 5 10 15
Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys
20 25 30
Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro
35 40 45
Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser
50 55 60
Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr
65 70 75 80
Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys
85 90 95
Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu Thr Ala Arg
100 105 110
Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr
115 120 125
Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro
145 150 155 160
Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile
165 170 175
Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu
180 185 190
His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu
195 200 205
Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser
210 215 220
Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser
225 230 235 240
Pro
<210> 15
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8铰链结构域
<400> 15
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 16
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD27信号传导结构域
<400> 16
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 17
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD137信号传导结构域
<400> 17
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 18
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28信号传导结构域
<400> 18
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDζ信号传导结构域
<400> 19
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域
<400> 20
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 21
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28胞质结构域
<400> 21
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 22
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB细胞内TRAF结合结构域
<400> 22
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 23
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS细胞内结构域
<400> 23
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 24
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40细胞内结构域
<400> 24
Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln
20 25 30
Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
35 40
<210> 25
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD27细胞内结构域
<400> 25
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 26
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD127细胞内结构域
<400> 26
Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys
1 5 10 15
Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser
20 25 30
Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp
35 40 45
Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro
50 55 60
Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln
65 70 75 80
Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe
85 90 95
Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala Cys
100 105 110
Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu Ser
115 120 125
Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu Gly
130 135 140
Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly Ile
145 150 155 160
Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser Leu
165 170 175
Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr Gln
180 185 190
Asn Gln
<210> 27
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CASP9结构域
<400> 27
Met Asp Glu Ala Asp Arg Arg Leu Leu Arg Arg Cys Arg Leu Arg Leu
1 5 10 15
Val Glu Glu Leu Gln Val Asp Gln Leu Trp Asp Ala Leu Leu Ser Arg
20 25 30
Glu Leu Phe Arg Pro His Met Ile Glu Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ser
35 40 45
Gly Ser Arg Arg Asp Gln Ala Arg Gln Leu Ile Ile Asp Leu Glu Thr
50 55 60
Arg Gly Ser Gln Ala Leu Pro Leu Phe Ile Ser Cys Leu Glu Asp Thr
65 70 75 80
Gly Gln Asp Met Leu Ala Ser Phe Leu Arg Thr Asn Arg Gln Ala Ala
85 90 95
Lys Leu Ser Lys Pro Thr Leu Glu Asn Leu Thr Pro Val Val Leu Arg
100 105 110
Pro Glu Ile Arg Lys Pro Glu Val Leu Arg Pro Glu Thr Pro Arg Pro
115 120 125
Val Asp Ile Gly Ser Gly Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser
130 135 140
Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys
145 150 155 160
Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly
165 170 175
Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg
180 185 190
Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr
195 200 205
Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His
210 215 220
Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln
225 230 235 240
Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys
245 250 255
Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys
260 265 270
Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly
275 280 285
Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu
290 295 300
Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln
305 310 315 320
Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro
325 330 335
Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val
340 345 350
Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp
355 360 365
Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu
370 375 380
Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met
385 390 395 400
Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser
405 410 415
<210> 28
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CASP9截短的结构域
<400> 28
Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile
1 5 10 15
Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn
20 25 30
Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp
35 40 45
Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu
50 55 60
Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu
65 70 75 80
Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile
85 90 95
Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val
100 105 110
Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile
115 120 125
Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe
130 135 140
Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val
145 150 155 160
Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro
165 170 175
Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp
180 185 190
Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp
210 215 220
Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu
225 230 235 240
Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys
245 250 255
Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys
260 265 270
Leu Phe Phe Lys Thr Ser
275
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FKBP f36v 结构域
<400> 29
Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe
1 5 10 15
Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu
20 25 30
Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys
35 40 45
Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val
50 55 60
Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp
65 70 75 80
Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala
85 90 95
Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A 肽接头
<400> 30
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A 肽接头
<400> 31
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A 肽接头
<400> 32
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A 肽接头
<400> 33
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 34
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 34
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 35
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 35
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr
195 200 205
Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
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<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scFV
<400> 36
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln
210 215 220
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 37
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
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Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu
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210 215 220
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys
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<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
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Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
145 150 155 160
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser
180 185 190
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Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
210 215 220
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 39
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 39
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
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Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
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Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
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Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys Ser
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210 215 220
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225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
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Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
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Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Gln Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser
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Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
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Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 42
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 42
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
145 150 155 160
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
165 170 175
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys Ser
180 185 190
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
195 200 205
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
210 215 220
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 43
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser
180 185 190
Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
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Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 44
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 44
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser
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195 200 205
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Ser Ser
<210> 45
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<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 scfv
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln
210 215 220
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys

Claims (45)

1.编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28 T细胞增殖信号传导结构域、CD137 T细胞活化信号传导结构域、CD27 T细胞记忆和存活信号传导结构域，以及可自毁结构域。
2.权利要求1所述的核酸序列，其中所述可自毁结构域包含胱天蛋白酶9结构域。
3.权利要求1所述的核酸序列，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，任选地，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdFv。
4.权利要求1所述的核酸序列，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR、及其任意组合。
5.权利要求1所述的核酸序列，其中所述核酸序列是分离的核酸序列和/或是合成的。
6.嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域。
7.权利要求6所述的CAR，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
8.权利要求6所述的CAR，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR、及其任意组合。
9.权利要求6所述的CAR，其中所述CAR是分离的形式和/或是合成的。
10.包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域。
11.权利要求10所述的细胞，其中所述CAR还包含casp9结构域。
12.权利要求10所述的细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，任选地，所述抗原结合片段是Fab或scFv。
13.权利要求10所述的细胞，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原任选是CD19。
14.权利要求10所述的细胞，其中所述CAR如下排列：
scFv-CD28-CD137-CD27-CD3z-2A-iCasp9。
15.权利要求10所述的细胞，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。
16.权利要求10所述的细胞，其中当所述抗原结合结构域结合其相应的抗原时，所述细胞表现出抗肿瘤免疫性。
17.包含编码嵌合抗原受体(CAR)之核酸序列的载体，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域。
18.权利要求17所述的载体，其中所述CAR还包含CASP9结构域。
19.权利要求17所述的载体，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，任选地，所述抗原结合片段是Fab或scFv。
20.权利要求17的载体，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3 TCR、及其任意组合。
21.权利要求20所述的载体，其中所述肿瘤抗原是CD19。
22.用于在哺乳动物中刺激针对靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括：
向哺乳动物施用有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域；并且其中选择所述抗原结合结构域以特异性识别所述靶细胞群或组织。
23.在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域，从而在所述哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性。
24.治疗患有与肿瘤抗原表达升高相关的疾病、病症或状况的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的经遗传修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域，从而治疗所述哺乳动物。
25.权利要求24所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
26.权利要求24所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR、及其任意组合。
27.治疗患有癌症的人的方法，所述方法包括向所述人施用经遗传工程改造以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域。
28.权利要求27所述的方法，其中所述人对至少一种化学治疗剂有抗性。
29.在被诊断患有癌症的人中产生持久的经遗传工程改造的T细胞群的方法，所述方法包括向所述人施用经遗传工程改造以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域，并且其中在施用后所述持久的经遗传工程改造的T细胞群在所述人中持续至少一个月。
30.权利要求29所述的方法，其中所述持久的经遗传工程改造的T细胞群包含选自以下的至少一种细胞：施用于所述人的T细胞、施用于所述人的T细胞的后代、及其组合。
31.权利要求29所述的方法，其中所述持久的经遗传工程改造的T细胞群包含记忆T细胞。
32.权利要求29所述的方法，其中在施用后所述持久的经遗传工程改造的T细胞群在所述人中持续至少三个月。
33.权利要求29所述的方法，其中在施用后所述持久的经遗传工程改造的T细胞群在所述人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
34.权利要求29所述的方法，其中所述癌症被治疗。
35.在被诊断患有癌症的人中扩增经遗传工程改造的T细胞群的方法，所述方法包括向所述人施用经遗传工程改造以表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域；并且其中所述施用的经遗传工程改造的T细胞在所述人中产生后代T细胞群。
36.权利要求35所述的方法，其中所述人中的所述后代T细胞包含记忆T细胞。
37.权利要求35所述的方法，其中所述T细胞是自体T细胞。
38.权利要求35所述的方法，其中在施用后所述后代T细胞群在所述人中持续至少三个月。
39.权利要求35所述的方法，其中在施用后所述后代T细胞群在所述人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
40.调节由T细胞分泌的细胞因子的量的方法，所述方法包括对所述T细胞进行遗传工程改造以表达CAR，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域。
41.权利要求40所述的方法，其中所述调节T细胞分泌的细胞因子的量降低调节性T细胞的增殖。
42.权利要求1所述的序列，其中所述序列经密码子优化以在人细胞中表达。
43.权利要求42所述的序列，其中所述人细胞是T细胞。
44.权利要求17所述的载体，其中所述核酸序列经密码子优化以在人细胞中表达。
45.权利要求43所述的载体，其中所述人细胞是T细胞。
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