CN107312098B

CN107312098B - 一种基于cd22的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN107312098B
Application number: CN201710586780.6A
Authority: CN
Inventors: 章睿; 何晋元
Original assignee: Shenzhen Geno-Immune Medical Institute
Current assignee: Shenzhen Geno-Immune Medical Institute
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2017-07-18
Publication date: 2020-06-12
Anticipated expiration: 2037-07-18
Also published as: CN107312098A

Abstract

本发明涉及一种基于CD22的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点CD22为基础的嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD22。本发明的嵌合抗原受体通过对所述针对肿瘤表面抗原CD22的单链抗体进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原‑抗体结合力更强，不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR‑T细胞的免疫效果增强，增强了CAR‑T细胞的治疗效果。

Description

一种基于CD22的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于CD22的嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤特异靶点CD22为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。

大多数患有B细胞恶性肿瘤(包括B细胞急性淋巴细胞性白血病(B cell acutelymphocytic leukemia,leukemia,B-ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocytic leukemia,CLL))的患者将由于其疾病而死亡。治疗这些患者的一种方法是通过CAR的表达，对T细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是经设计以人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)非依赖性方式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗这些类型的患者已经取得了有前景的成功。

CD19分子是治疗B淋巴细胞系肿瘤潜在的靶点，也是CAR研究中的热点，CD19的表达局限于正常和恶性B细胞，是广泛接受的用来安全测试的CAR靶标。靶向CD19分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(CD19CAR-T)在治疗多发性、难治性的急性B淋巴细胞白血病上取得巨大成功，而在难治性、复发性慢性B淋巴细胞白血病和B淋巴细胞系淋巴瘤的治疗中疗效明显较差。

CN 104788573A公开了了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成，该专利中的CD19在进行一次CAR-T细胞回输后，CD19的表达量会降低，容易逃过免疫机制。

因此，制备一种嵌合抗原受体能够解决CD19存在的易突变和表达量降低的问题显得尤为重要。

发明内容

针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中靶向不十分理想，以及肿瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本发明提供一种基于CD22的嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体通过将CD22靶点进行基因改造，从而提高了靶点的免疫效果，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种基于CD22的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成；

其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原为CD22。

本发明中，通过将抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原CD22，再通过对抗原结合结构域即针对肿瘤表面抗原CD22的单链抗体进行特定的人源基因码优化改造，从而使得肿瘤表面抗原CD22能够特异的结合在本申请的嵌合抗原受体上，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，靶点的表达量高，使得CAR-T细胞的免疫效果增强。

根据本发明，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD22的单链抗体(scFv)，所述针对肿瘤表面抗原CD22的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述针对肿瘤表面抗原CD22的单链抗体氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVS.

本发明中，所述针对肿瘤表面抗原CD22的单链抗体进行了特异性改造，使得改造后的序列表达出来的抗体的抗原-抗体结合力更强。

根据本发明，所述抗原结合结构域还包括针对肿瘤表面抗原CD22的突变体的单链抗体，所述针对肿瘤表面抗原CD22的突变体的单链抗体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列有90％以上的相似度。

根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。

根据本发明，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域或CD27信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域的组合，所述CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域和CD27信号传导结构域的排列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域和CD137信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体产生影响，本申请优选采用CD28-CD27-CD137的顺序组合。

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)如下：

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS.

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联，所述2A序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过注入激活剂，从而使得可诱导自杀融合结构域激活，从而导致嵌合抗原受体失去作用。

根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规的信号肽，所述信号肽可以为任何一个分泌蛋白基因的信号肽，本发明所述信号肽为Secretory信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

优选地，所述Secretory信号肽为CD8a基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列如下：MALPVTALLLPLALLLHAARP。

优选地，所述Secretory信号肽为GMCSFR基因的信号肽，所述Secretory信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列如下：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP。

本发明的嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域串联而成。

作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD22抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域和CD137信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成，具体排列如下：

Secretory-CD22-CD28-CD27-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9。

根据本发明，所述嵌合抗原受体Secretory-CD22-CD28-CD27-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列(SEQ IDNO.2)如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGTHWGVLFAYWGQGTLVTVSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPGGGGSGGGGSTSGGGGSGGGGSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS.

根据本发明，所述嵌合抗原受体Secretory-CD22-CD28-CD27-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列(SEQ IDNO.3)如下：

ATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCCGCCTTCCTGCTGATCCCCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCATCCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACTTCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCCGGCAGCAGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGAAGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGCCTTCAGCATCTACGACATGAGCTGGGTGAGACAGACCCCCGAGAAGAGACTGGAGTGGGTGGCCTACATCAGCAGCGGCGGCGGCACCACCTACTACCCCGACACCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGAGACAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAAGAGCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCGCCAGACACAGCGGCTACGGCACCCACTGGGGCGTGCTGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCGCCGCCGCCATCGAGGTGATGTACCCCCCCCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGAAGCAAGAGAAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGAAGACCCGGCCCCACCAGAAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCGCCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGAGAAGAAAGTACAGAAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCCGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGCCCCAGAGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACAGAAAGCCCGAGCCCGCCTGCAGCCCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCACCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGTGGTGAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGAAGAAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGAACCAGCGGCAGCGGCGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGGCGTGCAGGTGGAGACCATCAGCCCCGGCGACGGCAGAACCTTCCCCAAGAGAGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGCATGCTGGAGGACGGCAAGAAGGTGGACAGCAGCAGAGACAGAAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAGGTGATCAGAGGCTGGGAGGAGGGCGTGGCCCAGATGAGCGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGCCCCGACTACGCCTACGGCGCCACCGGCCACCCCGGCATCATCCCCCCCCACGCCACCCTGGTGTTCGACGTGGAGCTGCTGAAGCTGGAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGCCATGGTGGGCGCCCTGGAGAGCCTGAGAGGCAACGCCGACCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGCGGCCACTGCCTGATCATCAACAACGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGCCTGAGAACCAGAACCGGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGAGAAGAAGATTCAGCAGCCTGCACTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACCGCCAAGAAGATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCCAGACAGGACCACGGCGCCCTGGACTGCTGCGTGGTGGTGATCCTGAGCCACGGCTGCCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCCGGCGCCGTGTACGGCACCGACGGCTGCCCCGTGAGCGTGGAGAAGATCGTGAACATCTTCAACGGCACCAGCTGCCCCAGCCTGGGCGGCAAGCCCAAGCTGTTCTTCATCCAGGCCTGCGGCGGCGAGCAGAAGGACCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCCGAGGACGAGAGCCCCGGCAGCAACCCCGAGCCCGACGCCACCCCCTTCCAGGAGGGCCTGAGAACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCAGCAGCCTGCCCACCCCCAGCGACATCTTCGTGAGCTACAGCACCTTCCCCGGCTTCGTGAGCTGGAGAGACCCCAAGAGCGGCAGCTGGTACGTGGAGACCCTGGACGACATCTTCGAGCAGTGGGCCCACAGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGAGAGTGGCCAACGCCGTGAGCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCCGGCTGCTTCAACTTCCTGAGAAAGAAGCTGTTCTTCAAGACCAGCGCCAGCTGA.

本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为EF1a、CMV-TAR或CMV中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体和/或如第二方面所述的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病和/或实体瘤，所述肿瘤疾病选自但不限于白血病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的嵌合抗原受体通过对CD22肿瘤表面抗原进行特定的基因改造，改造后的抗体能够使抗原-抗体结合力更强；

(2)本发明的嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原CD22，CD22在白血病及淋巴瘤中表达量高，且嵌合抗原受体上的针对肿瘤表面抗原CD22的单链抗体不容易发生突变，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得CAR-T细胞的免疫效果增强，增强了CAR-T细胞的治疗效果；

(3)本发明的嵌合抗原受体在进行CAR-T细胞回输后，肿瘤表面CD22的表达量不会降低，不容易逃过免疫机制，能够更好的进行治疗。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体的合成基因序列图谱；

图2(a)为人淋巴瘤细胞流式细胞分析结果图，图2(b)为B细胞淋巴瘤流式细胞分析结果图，其中，灰色区域为同型阴性对照；

图3(a)为B细胞淋巴瘤靶细胞的流式细胞分析结果图，图3(b)为B细胞淋巴瘤靶细胞的细胞凋亡结果图；

图4(a)为一般T细胞与B细胞淋巴瘤靶细胞共培养的流式细胞分析结果图，图4(b)为一般T细胞与B细胞淋巴瘤靶细胞共培养的细胞凋亡结果图；

图5(a)为CD22嵌合抗原受体T细胞与B细胞靶细胞淋巴瘤共培养的流式细胞分析结果图，图5(b)为CD22嵌合抗原受体T细胞与B细胞淋巴瘤靶细胞共培养的细胞凋亡结果图；

图6为GFP染色图结果，其中，每个结果图中右侧的图的绿色荧光表示存活的急性淋巴白血病的存活细胞，第一列为急性淋巴白血病细胞的GFP染色图，第二列为经T细胞毒杀后的急性淋巴白血病细胞的GFP染色图，第三列为经CD22嵌合抗原受体毒杀后的急性淋巴白血病的GFP染色图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：嵌合抗原受体的构建

(1)通过全基因合成Secretory信号肽、CD22抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域和CD137信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域，如图1所示，即Secretory-CD22-CD28-CD27-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；

所述嵌合抗原受体的核苷酸序列SEQ ID NO.3如下：

实施例2：慢病毒包装

(1)用六孔板分别培养293T细胞，1×10⁶个细胞/孔，培养17-18小时；

(2)加入600μL/孔的新鲜的DMEM，内含10％的FBS；

(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取75μL的DMEM的上清液，2.7μg的helperDNA mix(1.8μg pNHP，0.5μg pHEF-VSV-G，0.2μg pHEFeGFP)以及0.8μg的pTYF DNA载体，漩涡振荡；

(4)从每孔板中央吸取7μL的Superfect加至离心管中吹打5次，室温静置7-10分钟；

(5)将离心管中的DNA-Superfect混合液逐滴加入至每个培养孔中，漩涡打匀；

(6)37℃3％CO₂培养箱里培养4-5小时；

(7)吸走培养基的培养液，用1.5mL AIM-V冲洗培养基，并加入1.5mL的AIM-V继续培养；

(8)将培养基放回3％CO₂培养箱中培养过夜，第二天早上用荧光显微镜观察转染效率。

实施例3：慢病毒的纯化和浓缩

1)病毒纯化

通过离心(1000g，5分钟)除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个0.45微米的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；

通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生10⁶到10⁷转导单位滴定的慢病毒载体。

2)用Centricon过滤器浓缩慢病毒载体

(1)在生物安全柜中，取Centricon管，用70％酒精消毒1次，然后用无菌PBS清洗3次；

(2)每个Centricon P-20过滤管中加入18ml的病毒上清液，然后在2500g下离心30分钟或者直到病毒体积减小到0.5ml；

(3)震荡过滤管，然后在400g下，离心2分钟，收集浓缩的病毒到收集杯中。最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中。

实施例4：CAR-T细胞的转染

将活化后的T细胞以5×10⁶接种到24孔板，加入50μl的浓缩目标基因的慢病毒，以100g离心力的速度，室温离心100分钟后，置于37℃培养24h，加入1ml的含有2％人血清，1％青霉素或链霉素与细胞培养因子的AIM-V基，培养2-3天后，将细胞收获并计数，以1×10⁷接种到12孔板，培养2-3天，用慢病毒载体携带GFP感染靶细胞并用annexinV/PI染色法观察细胞毒杀效果，结果如图2(a)-图2(b)所示。

从图2(a)-图2(b)可以看出，人淋巴瘤细胞和B细胞淋巴瘤表面都有CD22抗原的高度表达。

实施例5CAR-T细胞的体外肿瘤杀伤

(1)将非专一性的mesothelin CAR-T细胞和本申请制备的专一性的CD22CAR-T细胞与B细胞淋巴瘤靶细胞共培养，置于37度5％CO₂培养箱共培养18h；

(2)体外评估CAR-T细胞对靶细胞的识别杀伤功能，靶细胞为钙黄绿素标记或感染LV-GFP；

结果如图3-图6所示所示，从图3(a)可以看出，荧光强度为10³以上的细胞为B细胞淋巴瘤细胞，从图3(b)可知，2.4％的靶细胞濒临凋亡，1.3％的靶细胞凋亡。

通过图4(a)和图5(a)中，挑选T细胞与B细胞淋巴瘤靶细胞共培养采用荧光强度为10³以上的细做进一步分析，X-轴为AnnexinV染色标示apoptosis早期凋亡细胞，Y-轴为PI染色标示已经死亡细胞。如图4(b)和图5(b)所示，靶细胞与非专一性的mesothelin CAR-T细胞共培养后，3.9％的靶细胞濒临凋亡，5.8的靶细胞凋亡；靶细胞与制备的专一性的CD22CAR-T细胞共培养后，所示17.5％的靶细胞濒临凋亡，12.6％的靶细胞凋亡，可见本申请制备的专一性的CD22CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果最好。

通过图6可以看出，第一列可以看出，RS4；11白血病靶细胞荧光强度变化不明显，第二列可以看出，靶细胞荧光强度在变弱，从第三列可以看出，靶细胞荧光强度明显下降，可见，经制备的专一性的CD22CAR-T(4GS-CAR22T)毒杀后的急性淋巴白血病细胞逐渐死亡，5天后基本全部死亡。说明制备的专一性的CD22CAR-T毒杀效果好，毒杀效果强。

综上所述，本发明的嵌合抗原受体的针对CD22肿瘤表面抗原的单链抗体不容易发生突变，且相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，使得CAR-T细胞的免疫效果增强，增强了CAR-T细胞的治疗效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市免疫基因治疗研究院

<120> 一种基于CD22的嵌合抗原受体及其应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ile Tyr Asp Met Ser

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile

165 170 175

Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His

210 215 220

Ser Gly Tyr Gly Thr His Trp Gly Val Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

245

<210> 2

<211> 1057

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ile Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe

165 170 175

Ser Ile Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro

195 200 205

Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg His Ser Gly Tyr Gly Thr His Trp Gly Val Leu

245 250 255

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ala

260 265 270

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

275 280 285

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

290 295 300

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

305 310 315 320

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

325 330 335

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

340 345 350

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

355 360 365

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys

385 390 395 400

Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro

405 410 415

Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys

420 425 430

Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

435 440 445

Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Val Lys

450 455 460

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

465 470 475 480

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

485 490 495

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

500 505 510

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

515 520 525

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

530 535 540

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

545 550 555 560

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

565 570 575

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

580 585 590

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

595 600 605

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

610 615 620

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn

625 630 635 640

Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

645 650 655

Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe

660 665 670

Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu

675 680 685

Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys

690 695 700

Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val

705 710 715 720

Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp

725 730 735

Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala

740 745 750

Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly

755 760 765

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu

770 775 780

Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly

785 790 795 800

His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu

805 810 815

Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg

820 825 830

Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala

835 840 845

Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Arg Gln Asp His Gly

850 855 860

Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala

865 870 875 880

Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro

885 890 895

Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro

900 905 910

Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly

915 920 925

Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp

930 935 940

Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu

945 950 955 960

Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr

965 970 975

Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser

980 985 990

Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp

995 1000 1005

Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu

1010 1015 1020

Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln

1025 1030 1035

Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys

1040 1045 1050

Thr Ser Ala Ser

1055

<210> 3

<211> 3174

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc cttcctgctg 60

atccccgaca tccagatgac ccagaccacc agcagcctga gcgccagcct gggcgacaga 120

gtgaccatca gctgcagagc cagccaggac atcagcaact acctgaactg gtaccagcag 180

aagcccgacg gcaccgtgaa gctgctgatc tactacacca gcatcctgca cagcggcgtg 240

cccagcagat tcagcggcag cggcagcggc accgactaca gcctgaccat cagcaacctg 300

gagcaggagg acttcgccac ctacttctgc cagcagggca acaccctgcc ctggaccttc 360

ggcggcggca ccaagctgga gatcaagggc agcaccagcg gcagcggcaa gcccggcagc 420

agcgagggca gcaccaaggg cgaggtgcag ctggtggaga gcggcggcgg cctggtgaag 480

cccggcggca gcctgaagct gagctgcgcc gccagcggct tcgccttcag catctacgac 540

atgagctggg tgagacagac ccccgagaag agactggagt gggtggccta catcagcagc 600

ggcggcggca ccacctacta ccccgacacc gtgaagggca gattcaccat cagcagagac 660

aacgccaaga acaccctgta cctgcagatg agcagcctga agagcgagga caccgccatg 720

tactactgcg ccagacacag cggctacggc acccactggg gcgtgctgtt cgcctactgg 780

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcgcc gccgccatcg aggtgatgta cccccccccc 840

tacctggaca acgagaagag caacggcacc atcatccacg tgaagggcaa gcacctgtgc 900

cccagccccc tgttccccgg ccccagcaag cccttctggg tgctggtggt ggtgggcggc 960

gtgctggcct gctacagcct gctggtgacc gtggccttca tcatcttctg ggtgagaagc 1020

aagagaagca gactgctgca cagcgactac atgaacatga cccccagaag acccggcccc 1080

accagaaagc actaccagcc ctacgccccc cccagagact tcgccgccta cagaagcgcc 1140

agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agccagagaa gaaagtacag aagcaacaag 1200

ggcgagagcc ccgtggagcc cgccgagccc tgccactaca gctgccccag agaggaggag 1260

ggcagcacca tccccatcca ggaggactac agaaagcccg agcccgcctg cagccccggc 1320

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcacc agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 1380

agcgtggtga agagaggcag aaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgaga 1440

cccgtgcaga ccacccagga ggaggacggc tgcagctgca gattccccga ggaggaggag 1500

ggcggctgcg agctgggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 1560

agagtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cccgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1620

tacaacgagc tgaacctggg cagaagagag gagtacgacg tgctggacaa gagaagaggc 1680

agagaccccg agatgggcgg caagcccaga agaaagaacc cccaggaggg cctgtacaac 1740

gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagaga 1800

agaagaggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 1860

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccagaacca gcggcagcgg cgccaccaac 1920

ttcagcctgc tgaagcaggc cggcgacgtg gaggagaacc ccggccccat gggcgtgcag 1980

gtggagacca tcagccccgg cgacggcaga accttcccca agagaggcca gacctgcgtg 2040

gtgcactaca ccggcatgct ggaggacggc aagaaggtgg acagcagcag agacagaaac 2100

aagcccttca agttcatgct gggcaagcag gaggtgatca gaggctggga ggagggcgtg 2160

gcccagatga gcgtgggcca gagagccaag ctgaccatca gccccgacta cgcctacggc 2220

gccaccggcc accccggcat catccccccc cacgccaccc tggtgttcga cgtggagctg 2280

ctgaagctgg agggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcggcgccat ggtgggcgcc 2340

ctggagagcc tgagaggcaa cgccgacctg gcctacatcc tgagcatgga gccctgcggc 2400

cactgcctga tcatcaacaa cgtgaacttc tgcagagaga gcggcctgag aaccagaacc 2460

ggcagcaaca tcgactgcga gaagctgaga agaagattca gcagcctgca cttcatggtg 2520

gaggtgaagg gcgacctgac cgccaagaag atggtgctgg ccctgctgga gctggccaga 2580

caggaccacg gcgccctgga ctgctgcgtg gtggtgatcc tgagccacgg ctgccaggcc 2640

agccacctgc agttccccgg cgccgtgtac ggcaccgacg gctgccccgt gagcgtggag 2700

aagatcgtga acatcttcaa cggcaccagc tgccccagcc tgggcggcaa gcccaagctg 2760

ttcttcatcc aggcctgcgg cggcgagcag aaggaccacg gcttcgaggt ggccagcacc 2820

agccccgagg acgagagccc cggcagcaac cccgagcccg acgccacccc cttccaggag 2880

ggcctgagaa ccttcgacca gctggacgcc atcagcagcc tgcccacccc cagcgacatc 2940

ttcgtgagct acagcacctt ccccggcttc gtgagctgga gagaccccaa gagcggcagc 3000

tggtacgtgg agaccctgga cgacatcttc gagcagtggg cccacagcga ggacctgcag 3060

agcctgctgc tgagagtggc caacgccgtg agcgtgaagg gcatctacaa gcagatgccc 3120

ggctgcttca acttcctgag aaagaagctg ttcttcaaga ccagcgccag ctga 3174

<210> 4

<211> 423

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 4

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro

20 25 30

Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His

35 40 45

Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg Asp

50 55 60

Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg

65 70 75 80

Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly

100 105 110

Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys

115 120 125

Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met Val

130 135 140

Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu

145 150 155 160

Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe

165 170 175

Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys

180 185 190

Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val

195 200 205

Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu

210 215 220

Ala Arg Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu

225 230 235 240

Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr

245 250 255

Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe

260 265 270

Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe

275 280 285

Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala

290 295 300

Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp

305 310 315 320

Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala

325 330 335

Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr

340 345 350

Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr

355 360 365

Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp

370 375 380

Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly

385 390 395 400

Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu

405 410 415

Phe Phe Lys Thr Ser Ala Ser

420

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 6

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

Claims

1.一种基于CD22嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为Secretory-CD22-CD28-CD27-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；

所述嵌合抗原受体Secretory-CD22-CD28-CD27-CD137-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

3.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求2所述的重组慢病毒。

4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求2所述的重组慢病毒或如权利要求3所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在制备白血病和/或淋巴瘤治疗药物中的应用。