CN112940136B - 一种嵌合抗原结合受体car、载体、car-t细胞、药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种嵌合抗原结合受体CAR、载体、CAR‑T细胞、药物组合物及其应用。本发明嵌合抗原结合受体CAR，包括胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域，胞外结合结构域为筛选出的特定的CD22纳米抗体序列，能够靶向特异性结合CD22抗原。通过将CAR直接电转，或者插入慢病毒表达载体中构建CAR慢病毒表达载体，再通过将载体转染入T细胞构建CAR‑T细胞，对靶向肿瘤细胞具有很好的裂解效果。构建的CAR‑T细胞能够作为药物活性成分，制备治疗B细胞肿瘤或其他以CD22为治疗靶标的疾病，可单独用药也可与抗体等药物联合用药给予。

Description

一种嵌合抗原结合受体CAR、载体、CAR-T细胞、药物组合物及 其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种嵌合抗原结合受体CAR、载体、CAR-T细胞、药物组合物及其应用。
背景技术
CD22是免疫球蛋白（Ig）超家族的一种135kD I型跨膜唾液酸糖蛋白。CD22表达为B细胞所特有，并且受发育调控以使表达限于原B细胞和前B细胞中。当B细胞成熟中，表达增加，并且CD22的定位转向细胞表面。CD22在滤泡性、套膜和边缘区B细胞上强烈表达，单微弱存在于发生B细胞中。CD22是一种抑制性共受体，其通过设置防止B细胞受到过度刺激的信号传导阈值来下调B细胞受体信号传导。因为CD22调控B细胞功能和存活，所以它是用于调节体液免疫性和B细胞淋巴瘤的增殖的重要纽带，并且是癌细胞和自身免疫疾病中供治疗性抗体使用的靶标。
随着肿瘤免疫疗法和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）免疫疗法目前是最有前途的肿瘤免疫疗法方法之一。一般而言，嵌合抗原受体（CAR）包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域。胞外抗原结合域可包含靶向所鉴定的肿瘤抗原的单链可变片段。可以使用基因转染技术在T细胞的表面上表达CAR。在结合至靶标肿瘤抗原后，CAR可活化T细胞，用以以抗原依赖性方式发起特异性抗肿瘤响应，而不受对靶标肿瘤抗原具有特异性的主要组织相容性复合体的可用性的限制。
CD22是B淋巴细胞表达的抗原,其在恶性淋巴瘤细胞上也高度表达，其不表达于造血干细胞。因此作为B细胞肿瘤的高特异性抗原，CD22已成为B细胞恶性肿瘤中的理想治疗靶点。CD22与CD19在肿瘤细胞表面具有广泛的共表达，在部分CD19 CAR-T细胞治疗后会导致CD19抗原丢失，出现阴性复发的情况，但CD22仍然保留。因此CD22 CAR-T细胞不仅可以治疗B细胞肿瘤，也可以治疗复发性肿瘤；亦或者双靶点治疗。
现有的靶标CD22的药物有诸如依帕珠单抗已用于治疗多种癌症和自体免疫疾病，包括但不限于急性淋巴目细胞性白血病、慢性淋巴性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤等，市场上欠缺靶向CD22的CAR-T细胞。因此构建对抗原结合特异性好，靶标肿瘤细胞裂解效果显著的CAR-T细胞对治疗B细胞肿瘤，以及其他以CD22为靶标的疾病具有重要的前景意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种嵌合抗原结合受体CAR，嵌合有CD22抗体单链可变区序列的胞外抗原结合域，能够特异性结合CD22蛋白。
本发明的目的之二在于提供一种载体，包括将本发明嵌合抗原结合受体序列插入载体构建而成，载体结构可结合实际需求选择，优选慢病毒载体。
本发明的目的之三在于提供一种免疫效应细胞CAR-T，通过转基因手段将本发明载体转染T细胞等免疫细胞构建而成，T细胞可以来源于自体外周血，也可以来源于其他健康供体外周血。
本发明的目的之四在于提供一种药物组合物，以本发明免疫效应细胞为活性成分，对CD22蛋白表达异常的癌症等疾病具有治疗作用。
同时，本发明还在于提供本发明免疫效应细胞制备药物，作为联合治疗药物等方面的应用。
一种嵌合抗原结合受体，包括胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域；其中胞外抗原结合域包括CD22抗体的单链可变区序列。
为了提高嵌合抗原受体特异性结合CD22蛋白的功效，可选的，上述嵌合抗原结合受体的胞外抗原结合域包括CD22纳米抗体重链可变区；其中CD22纳米抗体重链互补决定区CDR1的氨基酸序列为GFTLDHYH，如SEQ NO：1所示；CDR2的氨基酸序列为ISNSGGST，如SEQNO：2所示；CD3氨基酸序列为AAGRWYYDGSRYCPPGAMDY，如SEQ NO：3所示。进一步的，作为优选的，胞外抗原结合域包括如SEQ NO：9所示的CD22纳米抗体序列；作为进一步优选的，胞外抗原结合域包括如SEQ NO：10所示的人源化CD22纳米抗体序列；作为更进一步优选的，其胞外抗原结合域包括如SEQ NO：11所示的人源化CD22纳米抗体序列。
应当可以理解的是，不抑制或者阻止特异性结合CD22蛋白的跨膜域序列均可，可选的，所述跨膜域来源于选自由T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152、CD154和PD1组成的组的分子；作为优选的，所述跨膜域来源于CD8。
进一步可选的，上述嵌合抗原结合受体还包括位于所述胞外抗原结合域的C-末端和所述跨膜域的N-末端之间的铰链域。优选的，所述铰链域来源于CD8或IgG4。
可选的，所述胞内信号传导域包含效应细胞的主要胞内信号传导域。作为优选的，所述主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。
更进一步优选的，所述胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。可选的，所述共刺激信号传导域来源于由：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD3Z、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2CSLP76、TRIM和ZAP70组成的组的分子。作为优选的，所述共刺激信号传导域来源于选自4-1BB。
可选的，上述嵌合抗原结合受体还包含位于胞外抗原结合域的N-末端的信号肽。作为优选的，所述信号肽来源于CD8α。
一种分离的核酸分子，其包含编码上述嵌合抗原结合受体的核酸序列。
一种载体，其包含上述核酸分子；所述载体是表达载体，进一步的为游离型载体，更进一步的为病毒载体，更进一步的为逆转录病毒载体，更进一步的为慢病毒载体。可选的，载体为腺病毒载体。
可选的，所述慢病毒载体包括5’逆转录病毒LTR、包装信号、可操作地连接上述核酸分子的启动子EF1-α、T2A、EGFRt、调节元件WPRE、3’逆转录病毒LTR、AMP。
一种免疫效应细胞，其包含上述分离的核酸分子，可以通过电转的方式将编码上述嵌合抗原结合受体的核酸分子转入T淋巴细胞或者自然杀伤细胞等免疫细胞，构建成免疫效应细胞。
作为免疫效应细胞的其他构建方式，一种免疫效应细胞，其包含上述载体。在本发明的一个实施例中，通过将上述载体引入到免疫效应细胞中，比如T淋巴细胞或自然杀伤细胞，构建获得CAR-T细胞，其中T细胞可以来源于自体外周血、脐带血，也可以来源于其他健康供体外周血、脐带血。经试验验证，构建的CAR-T细胞对高效表达CD22蛋白的细胞具有高的裂解性能。
一种药物组合物，其包含上述免疫效应细胞和生理学上可接受的赋形剂。
进一步的，上述免疫效应细胞应用于制备治疗B细胞肿瘤或其他以CD22为治疗靶标的药物。用于治疗急性淋巴目细胞性白血病、慢性淋巴性白血病或非霍奇金氏淋巴瘤，或其他复发性肿瘤。
可选的，免疫效应细胞单独或作为联合疗法给予。
附图说明
图1为实施例1中流式分选FITC和APC双阳性的单个细胞检测结果示意图；
图2为实施例1中流式检测结果示意图；其中CHO-K1为不表达CD22蛋白的原始细胞，CHO-K1-CD22为表达CD22蛋白的细胞；
图3为实施例2中不同人源化CD22纳米抗体的流式检测结果对比图；其中H10-2-1为氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45 L、119 Q的人源化CD22纳米抗体；H10-2-2为氨基酸替换设计为1E、34M、35S、37V、44G、45L、47W、119Q的人源化CD22纳米抗体；H10-2-3为氨基酸替换设计为1E、34M、35S、37V、44G、45L、47W、50A、119Q的人源化CD22纳米抗体；H10-2-4为氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45 L、119 Q、47W的人源化CD22纳米抗体；H10抗体为未做人源化处理的原始CD22纳米抗体；
图4为未人源化处理的原始CD22纳米抗体H10与靶蛋白亲和力检测结果示意图；
图5为人源化CD22纳米抗体H10-2-1与靶蛋白亲和力检测结果示意图；其中H10-2-1为氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45 L、119 Q的人源化CD22纳米抗体；
图6为人源化CD22纳米抗体H10-2-4与靶蛋白亲和力检测结果示意图；其中H10-2-4为氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45 L、119 Q、47W的人源化CD22纳米抗体；
图7为实施例3中CAR慢病毒表达载体结构示意图；其中Signal peptide：CD8a信号肽； VHH：CD22纳米抗体； CD8 TM：CD8铰链区及跨膜区；4-1BB：4-1BB胞内信号域；CD3Z：CD3zeta胞内信号域；T2A：自切割多肽；Truncated EGFR：截短型的EGFR受体（Domain III+Domain IV）；
图8为不同重组的CAR-T细胞的CAR的表达状况；其中Con-T为对照病毒（空载体）感染的T细胞；H10-CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞；
图9为Raji-Luciferase肿瘤细胞株CD22表达效力的流式检测结果示意图；
图10为以Raji-Luciferase肿瘤细胞株为靶细胞，不同的重组CAR-T细胞为效应细胞，将效应细胞与靶细胞共培养，效应细胞对靶细胞的裂解效力示意图；其中CTRL T为对照病毒（空载体）感染的T细胞； H10-CD8a CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞；
图11为以Raji-Luciferase肿瘤细胞株为靶细胞，不同的重组CAR-T细胞为效应细胞，将效应细胞与靶细胞共培养，IL-2分泌表达检测结果示意图；其中CTRL T为对照病毒（空载体）感染的T细胞； H10-CD8a CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞；
图12为Raji-Luciferase肿瘤细胞株为靶细胞，不同的重组CAR-T细胞为效应细胞，将效应细胞与靶细胞共培养，IFN-γ分泌表达检测结果示意图；其中CTRL T为对照病毒（空载体）感染的T细胞； H10-CD8a CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞；
图13为以CHO-K1-CD22-Luciferase肿瘤细胞株为靶细胞，不同的重组CAR-T细胞为效应细胞，将效应细胞与靶细胞共培养，效应细胞对靶细胞的裂解效力示意图；其中CTRLT为对照病毒（空载体）感染的T细胞； H10-CD8a CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞；
图14为以CHO-K1-CD22-Luciferase肿瘤细胞株为靶细胞，不同的重组CAR-T细胞为效应细胞，将效应细胞与靶细胞共培养，IL-2分泌表达检测结果示意图；其中CTRL T为对照病毒（空载体）感染的T细胞； H10-CD8a CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞；
图15为Raji-Luciferase肿瘤细胞株为靶细胞，不同的重组CAR-T细胞为效应细胞，将效应细胞与靶细胞共培养，IFN-γ分泌表达检测结果示意图；其中CTRL T为对照病毒（空载体）感染的T细胞； H10-CD8a CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
实施例1 CD22单域抗体筛选
1.1人CD22重组蛋白制备：
1）CD22重组蛋白序列构建：
从NCBI及Uniprot数据库获取到human CD22胞外段氨基酸序列后，进行人工基因合成，构建真核表达载体；
2）22序列载体转染表达
将上述构建的CD22序列的真核表达载体转染CHO-S细胞并表达CD22重组蛋白；
3）鉴定
将产物通过亲和柱纯化，并纯化后进行蛋白活性鉴定。
1.2单细胞分选
1）羊驼免疫
用上述制备的人CD22重组蛋白对前期经过四次免疫的羊驼进行冲击免疫；
2）采血及ELISA分析
冲击免疫10天后，采集部分外周血，分离得到血清，鉴定CD22免疫羊驼效价检测；若ELISA免疫效价达到1:160000以上，进行外周血大量采集；
3）从上述步骤2）免疫过的羊驼采集50mL外周血，采用淋巴细胞分离液分离PBMC细胞；
4）使用Biotin偶联的CD22重组蛋白孵育PBMC细胞，冰上孵育1小时，使用预冷的PBS清洗3次后，同时孵育APC-Streptavidn以及FITC-Anti-Camelid VHH抗体，冰上孵育1小时，使用预冷的PBS清洗3次，采用流式分选FITC和APC双阳性的单个细胞至96孔板中（预先加入裂解液），如图1所示；共分离2~3块96孔板，用于单域抗体的克隆。
1.3 驼源单域抗体制备
1）单域抗体克隆及测序
克隆上述1.2步骤4）培养后的96孔板，从每孔中的单个B细胞提取RNA，逆转为cDNA后，使用单域抗体扩增引物进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分离400bp左右的PCR产物进行Sanger测序，获取单域抗体编码区序列信息。将测序获得的序列进行基因合成，亚克隆至带有Fc标签的单域抗体表达载体中；
2）单域抗体表达载体构建
根据上述获取的单域抗体编码区序列信息，对所得的所有单域抗体序列进行比对分析，从不同的lineage中选择30个候选抗体序列（亲和力范围介于10-8～10-9M），对其基因合成；并构建在带有Fc标签的单域抗体表达载体中；
3）单域抗体表达验证
将上述构建的单域抗体表达载体转染至293F细胞中，从上清中纯化单域抗体，将CD22抗原包被至96孔板上，采用ELISA及流式细胞验证候选单域抗体与靶蛋白的结合；根据FACS及ELISA结果，从中挑选流式检测信号值最高（亲和力10-9M））的1个克隆（如图2所示），表达纯化抗体。
筛选的单域抗体的氨基酸序列如SEQ NO：9所示，编码该单域抗体的核苷酸序列如SEQ NO：8所示；其中重链互补决定区CDR1的氨基酸序列为GFTLDHYH，如SEQ NO：1所示；CDR2的氨基酸序列为ISNSGGST，如SEQ NO：2所示；CD3氨基酸序列为AAGRWYYDGSRYCPPGAMDY，如SEQ NO：3所示；重链可变区还包括四个框架区域，其中FR1氨基酸序列为AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS，如SEQ NO：4所示；FR2氨基酸序列为IGWFRQAPGKEREGVSC，如SEQ NO：5所示；FR3氨基酸序列为NYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYC，如SEQ NO：6所示；FR4氨基酸序列为WGKGTLVTVSS，如SEQ NO：7所示。
实施例2 人源化单域抗体制备
2.1人源化纳米抗体设计及基因制备
采用表面氨基酸替换的设计对候选的单域抗体进行人源化，获得并合成人源化纳米抗体序列后，构建人源化单域抗体表达载体；对上述制备的表达载体进行质粒大量抽提，以此制备转染级别的质粒。
2.2人源化纳米抗体表达及纯化
以上述制备的人源化纳米抗体表达载体通过瞬时转染至293F细胞中，并使用Protein A纯化重组抗体，浓缩后使用BCA法定量。
2.3 人源化纳米抗体的结合特异性及亲和力检测：
流式实验设计
实验组：纯化后的人源化纳米抗体与表达CD22的重组细胞株共孵育
阳性对照组：原始的未进行人源化处理的CD22纳米抗体和表达CD22的重组细胞株孵育
FACS检测人源化纳米抗体与靶标蛋白的对比结合情况，若实验组与阳性对照组相比，流式细胞结合能力相当，则对其实验组进行克隆以便后续的亲和力检测（亲和力范围介于10-8～10-9M）；
1）结合能力测定：
流式检测步骤如下：
（1）将靶细胞分为若干份，每份细胞的数量为5*10^5个细胞，使用100ul PBS重悬细胞，使用瞬时转染表达的人源化纳米抗体分别孵育靶细胞（表达CD22的重组细胞株），充分混匀后，室温孵育1小时， H10抗体为阳性对照 ，800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
（2）加入1 ul PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30分钟；
（3）800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
（4）使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析，如图3所示；其中H10-2-1为氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45 L、119 Q的人源化CD22纳米抗体、H10-2-2为氨基酸替换设计为1E、34M、35S、37V、44G、45L、47W、119Q的人源化CD22纳米抗体、H10-2-3为氨基酸替换设计为1E、34M、35S、37V、44G、45L、47W、50A、119Q的人源化CD22纳米抗体、H10-2-4为氨基酸替换设计为1E、37V、44G、45 L、119 Q、47W的人源化CD22纳米抗体；H10抗体为未做人源化处理的原始CD22纳米抗体；
2）人源化单域抗体亲和力测定
根据上述流式结果，对抗体进行表达纯化，以及亲和力测定。采用Biacore T200仪器，以原始驼源抗体作为对照，分别检测上述制备的阳性人源化纳米抗体与靶蛋白CD22的结合能力，目标亲和力要求在10-9 M；
将人CD22重组蛋白使用10 mM Acetate缓冲液固定在CM5芯片上，以制备的阳性人源化纳米抗体及未人源化处理的原始CD22纳米抗体作为流动相，检测人源化前后抗体与靶蛋白CD22的结合能力；
使用未人源化处理的原始H10抗体作为阳性对照，根据流式检测结果，选择H10-2-1和H10-2-4进行抗体的表达纯化以及亲和力检测，结果如图4、图5和图6所示；
结果显示：H10抗体：ka = 6.787×105 M-1s-1；kd = 2.270 ×10-4 s-1 ；KD = 3.345× 10-10 M ；
H10-2-1抗体：结果： ka = 1.184 ×105 M-1s-1 ；kd = 2.569× 10-4 s-1 ；KD =2.169 ×10-9 M ；
H10-2-4抗体：结果：ka = 4.239 × 105 M-1s-1 ；kd = 2.950 ×10-4 s-1 ；KD =6.958× 10-10 M；
最终得到有效的人源化CD22的抗体，氨基酸替换设计包括1E、37V、44G、45 L、119Q和/或47W，人源化纳米抗体的氨基酸序列如SEQ NO:10或SEQ NO:11所示；对应的编码相应的人源化纳米抗体的核苷酸序列如SEQ NO：12或SEQ NO：13所示。
实施例3 人源化CD22单域抗体表达验证
3.1 CAR慢病毒表达载体构建
根据上述筛选的单域抗体以及人源化单域抗体序列信息，构建CD22特异性二代CAR慢病毒表达载体以及空载体，如图7所示，其中Signal peptide：CD8a信号肽； VHH：CD22纳米抗体； CD8 TM：CD8铰链区及跨膜区；4-1BB：4-1BB胞内信号域；CD3Z：CD3zeta胞内信号域；T2A：自切割多肽；Truncated EGFR：截短型的EGFR受体（Domain III+Domain IV）；应当可以理解的是，跨膜域、信号肽结构域、胞内信号传导域的来源不仅限于图示结构来源，其他本领域技术人员已知的来源均可应用于本发明。
经测序验证后通过去内毒素质粒抽提试剂盒大量制备转染级别质粒；
3.2 CAR慢病毒包装
将上述CAR慢病毒表达载体通过慢病毒包装技术包装慢病毒，并采用qPCR测定慢病毒滴度，目标病毒的滴度不低于1×108 TU/mL。同时使用空载体制备作为慢病毒对照组；
3.3 T细胞分离、培养及CAR-T细胞制备
使用磁珠从健康供体的外周血中分离原代T细胞，并进行扩大培养至一定规模；使用制备的CAR慢病毒在特定条件下感染原代T细胞，并稳定培养，从而构建重组CAR-T细胞；同时使用对照病毒（空载体）感染T细胞，制备对照T细胞。
采用CD22蛋白标记CAR-T细胞后，通过FACS检测CAR的表达状况，如图8所示，以此初步反映转染效率，转染效率30%左右；其中Con-T为对照病毒（空载体）感染的T细胞；H10-CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞；
3.4 重组CAR-T细胞体外验证
以CD22高表达的Raji-Luciferase（如图9所示流式检测结果表征Raji-Luciferase肿瘤细胞株能够高表达）和和CHO-K1-CD22-Luciferase肿瘤细胞株为靶细胞，以上述构建的重组CAR-T细胞为效应细胞，建立效应细胞与靶细胞的共培养体系，效靶比设为1:1、5:1和10:1，通过检测Raji-Luciferase肿瘤细胞株活性，以此反映重组CAR-T细胞对靶细胞的裂解能力。同时，收集培养基上清，通过ELISA来检测IL-2和IFN-γ的分泌表达；如图10~15所示，其中CTRL T为对照病毒（空载体）感染的T细胞； H10-CD8a CAR-T为H10抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-1-CAR-T为H10-2-1抗体构建的重组CAR-T细胞；H10-2-4-CAR-T为H10-2-4抗体构建的重组CAR-T细胞。
应当可以理解的是，上述实施例仅以通过慢病毒载体转染T细胞的方式构建CAR-T细胞对免疫效应细胞进行举例说明，并不构成对本发明的具体限定，通过直接电转，或者腺病毒载体或者逆转录病毒载体构建的免疫效应细胞也在本发明的保护范围内，同样也可以实现如上述实施例所述的对肿瘤细胞的裂解效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 河南创新生物科技研究院有限公司
<120> 一种嵌合抗原结合受体CAR、载体、CAR-T细胞、药物组合物及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Gly Phe Thr Leu Asp His Tyr His
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Ala Ala Gly Arg Trp Tyr Tyr Asp Gly Ser Arg Tyr Cys Pro Pro Gly
1 5 10 15
Ala Met Asp Tyr
20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser
1 5 10 15
Cys
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gctgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttggac cattatcaca taggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgtgaggg ggtctcatgt attagtaata gtggtggtag cacaaactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acagctgtct attactgtgc agccgggcga 300
tggtactatg atggtagtcg ctactgccca ccaggtgcca tggactactg gggcaaaggg 360
accctggtca ccgtctcctc g 381
<210> 9
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp His Tyr
20 25 30
His Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Trp Tyr Tyr Asp Gly Ser Arg Tyr Cys Pro Pro Gly
100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp His Tyr
20 25 30
His Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Trp Tyr Tyr Asp Gly Ser Arg Tyr Cys Pro Pro Gly
100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp His Tyr
20 25 30
His Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Arg Trp Tyr Tyr Asp Gly Ser Arg Tyr Cys Pro Pro Gly
100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat cactatcaca tcggctgggt ccgacaggcc 120
cctggcaaag gacttgaagg cgtgtcctgc atcagcaaca gcggcggcag caccaattac 180
gccgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccgtgtac 240
ctgcagatga acagcctgaa gcctgaggac accgccgtgt actattgtgc cgctggcaga 300
tggtactacg acggcagcag atactgtcct cctggcgcca tggattattg gggccaggga 360
acactggtca ccgtgtctag t 381
<210> 13
<211> 381
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gaggtgcagc tggttgaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcttgtgccg ccagcggctt caccctggat cactatcaca tcggctgggt ccgacaggcc 120
cctggcaaag gacttgaatg ggtgtcctgc atcagcaaca gcggcggcag caccaattac 180
gccgatagcg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca acgccaagaa caccgtgtac 240
ctgcagatga acagcctgaa gcctgaggac accgccgtgt actattgtgc cgctggcaga 300
tggtactacg acggcagcag atactgtcct cctggcgcca tggattattg gggccaggga 360
acactggtca ccgtgtctag t 381

Claims (28)

1.一种嵌合抗原结合受体，其特征在于，包括胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域；其中胞外抗原结合域包括CD22抗体的单链可变区序列；
其胞外抗原结合域包括CD22纳米抗体重链可变区序列；其中CD22纳米抗体重链互补决定区CDR1的氨基酸序列为GFTLDHYH，如SEQ NO：1所示；CDR2的氨基酸序列为ISNSGGST，如SEQ NO：2所示；CD3氨基酸序列为AAGRWYYDGSRYCPPGAMDY，如SEQ NO：3所示。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，其胞外抗原结合域包括如SEQNO：9所示的CD22纳米抗体序列。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，其胞外抗原结合域包括如SEQNO：10所示的人源化CD22纳米抗体序列。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，其胞外抗原结合域包括如SEQNO：11所示的人源化CD22纳米抗体序列。
5.如权利要求1~4任一项所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，所述跨膜域来源于选自由T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD152、CD 154和PD1组成的组的分子。
6.如权利要求5所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，所述跨膜域来源于CD8。
7.如权利要求1~4任一项或6所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，还包括位于所述胞外抗原结合域的C-末端和所述跨膜域的N-末端之间的铰链域。
8.如权利要求7所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，所述铰链域来源于CD8或IgG4。
9.如权利要求8所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，所述胞内信号传导域包含效应细胞的主要胞内信号传导域；主要胞内信号传导域来源于CD3ζ。
10.如权利要求9所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，所述胞内信号传导域包含共刺激信号传导域。
11.如权利要求10所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，所述共刺激信号传导域来源于由：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD3Z、CD54、CD83、CD134、4-1BB、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、DAP10、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM和ZAP70组成的组的分子。
12.如权利要求11所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，所述共刺激信号传导域来源于选自4-1BB。
13.如权利要求9~12任一项所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，还包含位于胞外抗原结合域的N-末端的信号肽。
14.如权利要求13所述的嵌合抗原结合受体，其特征在于，所述信号肽来源于CD8α。
15.一种分离的核酸分子，其特征在于，其为编码如权利要求1~14任一项所述的嵌合抗原结合受体的核酸序列。
16.一种载体，其特征在于，其包含如权利要求15所述的核酸分子。
17.如权利要求16所述的载体，其特征在于，所述载体是表达载体。
18.如权利要求16所述的载体，其特征在于，所述载体是游离型载体。
19.如权利要求16所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。
20.如权利要求16所述的载体，其特征在于，所述载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒载体。
21.如权利要求20所述的载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括5’逆转录病毒LTR、包装信号、可操作地连接上述核酸分子的启动子EF1-α、T2A、EGFRt、调节元件WPRE、3’逆转录病毒LTR、AMP。
22.一种免疫效应细胞，其特征在于，其包含如权利要求15所述的核酸分子。
23.一种免疫效应细胞，其特征在于，其包含如权利要求16~21任一项所述的载体。
24.如权利要求22或23所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为T淋巴细胞或自然杀伤细胞。
25.如权利要求24所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞来源于自体外周血、脐带血或其他健康人外周血、脐带血。
26.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求23或24或25所述免疫效应细胞和生理学上可接受的赋形剂。
27.一种如权利要求23或25所述的免疫效应细胞的应用，其特征在于，应用于制备治疗B细胞肿瘤或其他以CD22为治疗靶标的药物。
28.如权利要求27所述的免疫效应细胞的应用，其特征在于，应用于制备治疗急性淋巴目细胞性白血病、慢性淋巴性白血病或非霍奇金氏淋巴瘤的药物。
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