CN108101994B - 抗cd19抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗CD19抗体及其应用。本发明的抗CD19抗体或其抗原结合部分，其重链序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示，轻链的序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示，或者其重链和轻链与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％；同时基于该抗CD19抗体或其抗原结合部分，本发明提供其作为核酸分子、载体、宿主细胞、偶联物、组合物以及在用于制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。

Description

抗CD19抗体及其应用
技术领域
本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种抗CD19抗体及其应用。
背景技术
CD19又名B4或Leu-12，特异性地表达于正常和恶性B淋巴细胞膜表面，以及滤泡树突状细胞膜表面，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，其分子量为95kDa，位于16号染色体的短臂上，含有15个外显子，编码556个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。CD19是B细胞最可靠的表面标记物之一，其最早在晚期祖B细胞和早期前B细胞中表达，发生在免疫球蛋白基因重组时。CD19在整个B细胞的发育和成熟过程中均高表达，直至B细胞分化为浆细胞时，表达量下调，其在成熟 B细胞中的表达是未成熟细胞的3倍。
CD19通过同时调节B细胞受体(B cell recertor,BCR)依赖和非依赖信号建立B细胞信号阈值，对B细胞的发育，增殖和分化起着重要的调控作用。CD19作为成熟B细胞的表面多分子复合物的主要组成部分，与受体CD21(CD2)，CD81(TAPA-1)以及CD225共同形成复合体，通过调节内源性和受体诱导信号减少触发B细胞分裂及分化所需抗原浓度的阈值。CD81作为伴侣蛋白，提供信号传导途径的分子对接位点，并且调节CD19的表达。CD19通过招募和放大Src 家族蛋白酪氨酸激酶的活化，使蛋白酪氨酸激酶(PTK)激活，激活 BCR信号。同时当BCR信号激活时，CD19也可通过活化PI3K和下游的Akt激酶，增强BCR信号，促进B细胞的增殖。
CD19对B细胞的增殖和分化具有重要的调控作用。CD19在几乎所有的B细胞恶性肿瘤中广泛表达，包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤等，因此CD19成为B 细胞恶性肿瘤治疗的特异性分子靶点。近年来靶向CD19的免疫治疗策略在临床前以及临床研究中广泛发展，包括单克隆抗体、双特异性抗体和嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)，并取得了显著优于常规小分子化疗方案的临床效果，推动了免疫治疗的进展。
SAR3419(huB4-DM4)是一种抗体-药物偶联物，通过二硫键将人源化的CD19IgG抗体与天然抗肿瘤药物美登木素衍生物药物DM4连接，DM4能够抑制微管蛋白聚合以及微管组装，诱导细胞的凋亡。在临床前研究中SAR3419已被确定为一个新的，具有良好耐受性的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治疗剂。
MOR-208(XmAb5574)是一种Fc段修饰的人源化CD19抗体，通过替换Fc段的两个氨基酸(S239D和I332E)，增加对免疫细胞受体 FcγIIIa的亲和力，减少FcγRⅡb的结合，从而加强其抗体介导的细胞毒作用(ADCC)。通过体外和体内研究表明，MOR-208可增加ADCC100倍至1000倍，说明了其对多种B细胞淋巴瘤的抗癌作用。另外在食蟹猴实验中发现MOR-208可降低淋巴组织中的B细胞，其Ⅰ期临床试验正在进行中。MEDI-551可以靶向B细胞表面的CD19，是 Fc段糖基化修饰的人源化CD19单抗，对人的FcγIIIa亲和力增强，从而使ADCC效应加强，于2011进入Ⅱ期临床试验。
双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，可以分别靶向T细胞和肿瘤细胞表面抗原，诱导T细胞趋向肿瘤细胞，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。博纳吐单抗(Blinatumomab)是一个55kDa双特异性抗体融合蛋白，由CD19和CD3两个单链抗体(scFV)结合组成，可特异性针对CD3和CD19抗原。博纳吐单抗早在2004年进入临床Ⅰ期研究，在2014年12月3日获得FDA批准，治疗前体B细胞ALL。双特异性T细胞接合体可连接T细胞和表达CD19的B细胞，并使T细胞趋向恶性B细胞，使肿瘤细胞内的胱天蛋白酶(caspases)3和7 得到强有力的活化，诱导细胞凋亡，从而特异性杀伤恶性B细胞。
嵌合抗原受体主要由两部分构成，一端位于细胞外能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原，另一端位于胞内含有信号激活元件(如T 细胞受体的ζ链)，起传递信号激活T细胞的作用。将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Single chain antibody fragment of variable regions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimeric antigenreceptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptorT-cell，CAR-T)。CD19-CAR 嵌合抗原受体免疫疗法改变了恶性血液病治疗的传统方法，并在临床 I期的研究中取得了令人瞩目的成果。
然而，接受CD19-CAR嵌合抗原受体免疫疗法的其中一部分病人体内的CAR-T细胞持续存活的时间有限，这部分病人治疗后复发率较高。这是由于大部分CD19CAR-T的单链抗体片段都为鼠源的，鼠源scfv具有较高的免疫原性，在体内容易被人体自身的免疫系统清除，降低CAR-T细胞在体内存活的时间。人源化CAR-T细胞相对鼠源CAR-T细胞具有较低的免疫原性，不易被机体免疫系统识别，可以有效延长CAR-T细胞在体内存活时间，降低临床复发率。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种良好特异性、较高的亲和性和较低的人抗鼠抗体反应的抗CD19人源化抗体及其应用。
本发明第一方面涉及抗CD19人源化抗体或其抗原结合部分，其重链序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或 SEQ ID NO：5所示，轻链的序列分别如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO： 6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示，或者其重链和轻链与前述重链和轻链序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％；
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD19抗体或其抗原结合部分，包括选自于如下一组的重链，其序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示，或者其重链可变区与前述重链序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位、b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，包括选自于如下一组的重链，其序列如SEQ ID NO： 5所示。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD19抗体或其抗原结合部分，包括选自于如下一组的轻链，其序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示，或者其轻链与前述轻链序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位、b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，包括选自于如下一组的轻链，其序列如SEQ ID NO：6 或SEQ ID NO:7所示。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD19抗体或其抗原结合部分，其为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv 或嵌合抗原受体。
在本发明的一个实施方案中，所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括抗 CD19抗体或其抗原结合部分。
进一步的，所述跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段，所述胞外区肽段与CD8跨膜区肽段通过CD8的铰链区肽段相连。
进一步的，所述胞内结构域肽段为共刺激信号分子，选自4-1BB (又称CD137)、CD28、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。
进一步的，所述嵌合抗原受体分子还包括信号肽。信号肽可以提高嵌合抗原受体分子这种融合蛋白分泌的效果，在信号肽与融合蛋白其它氨基酸序列一起被表达后，最终被蛋白酶切除。蛋白酶具有一定的识别序列，而信号肽与其后面的肽段融合后构成新的氨基酸序列，所以如果选择的信号肽不当，可能会导致蛋白酶的误切，蛋白失活。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD19抗体或其抗原结合部分，其重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CD19抗体或其抗原结合部分，其轻链恒定区为κ或λ。
本发明第二方面涉及核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，所述重链包含选自如下一组的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：1
(2)SEQ ID NO：3
(3)SEQ ID NO：4或
(4)SEQ ID NO：5
(5)与前述(1)～(4)序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a) 结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，所述重链包含选自如下一组的氨基酸序列：
SEQ ID NO：5，或与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位、b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
本发明第三方面涉及核酸分子，其包含能够编码抗体轻链核酸序列，所述轻链包含选自如下一组的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：2
(2)SEQ ID NO：6
(3)SEQ ID NO：7或
(4)SEQ ID NO：8
(5)与前述(1)～(4)序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a) 结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，所述轻链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
SEQ ID NO：6或与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位、b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：7所示。
本发明第四方面涉及载体，其含有本发明第二或第三方面所述的核酸分子。
根据本发明第四方面所述的载体，其含有本发明第二方面所述的核酸分子和第三方面所述的核酸分子。
本发明第五方面涉及宿主细胞，其含有本发明第二或第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体。
本发明第六方面涉及偶联物，其含有本发明第一方面所述的抗 CD19抗体或其抗原结合部分，以及其它生物活性物质，所述抗CD19 抗体或其抗原结合部分直接或通过连接片段与其它生物活性物质偶联。
在本发明的实施方案中，所述其它生物活性物质选自可间接抑制肿瘤细胞生长或通过激活机体免疫反应从而抑制或杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的化学物质、多肽、酶、细胞因子或其他具有生物活性的单一物质或混合物质，例如白介素类、肿瘤坏死因子、趋化因子、纳米颗粒等。
本发明第七方面涉及组合物(例如药物组合物)，其含有本发明第一方面所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、或者本发明第六方面所述的偶联物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。根据本发明第七方面所述的组合物(例如药物组合物)，所述其它生物活性物质包括但不限于其它抗体、融合蛋白或药物(例如抗肿瘤药物，如放、化疗药物)。
本发明还涉及本发明第一方面所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体、第五方面所述的宿主细胞、第六方面所述的偶联物或第七方面所述的组合物用于制备预防或治疗CD19抗原阳性的肿瘤的用途。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本研究以人CD19为靶点，基于鼠源单抗序列信息，采用抗体工程人源化手段对鼠源抗体进行人源化处理，获取的人源化抗体序列，可以用于嵌合抗原受体、抗体偶联药物及双特异性抗体等领域，靶向杀伤B淋巴细胞恶性肿瘤。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明中单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力结果图；
图2是本发明中嵌合抗原受体的示意图；
图3是SEQ5-SEQ6CAR-T细胞对靶细胞Raji和CHO-K1-CD19的裂解杀伤能力对比结果图；
图4是SEQ5-SEQ7CAR-T细胞对靶细胞Raji和CHO-K1-CD19的裂解杀伤能力对比结果图；
图5是SEQ5-SEQ6CAR-T细胞分泌IFN-γ能力对比结果图；
图6是SEQ5-SEQ7CAR-T细胞分泌IFN-γ能力对比结果图；
图7是本发明中载体的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一抗体人源化
根据本公司的靶向人CD19的小鼠单抗氨基酸序列，采用 Accelrys Discoverystudio软件对抗体的3D结构进行模拟，同时采用IMGT数据库DomainGapAlign工具对小鼠单克隆抗体在人的抗体库中进行相似性比对，选择相似程度最高的人抗体重链和轻链框架区作为骨架，用鼠抗的互补决定区替换选择的人抗体互补决定区，鼠源抗体重链和轻链序列分别为SEQ1、SEQ2，所获取的不同人源化抗体重链和轻链氨基酸序列依次命名为SEQ3、SEQ4、SEQ5、SEQ6、SEQ7、 SEQ8。将上述序列采用人工基因合成的方式进行全基因合成，并通过 (G4S)3连接肽进行overlap PCR组合，组合后的序列使用酶切位点 EcoRI-BglII亚克隆至pFUSE-hIgG1-Fc2载体中。组合所用到的引物序列如表1。首先分别用引物对SEQ9-SEQ14、SEQ9-SEQ15、 SEQ10-SEQ16、SEQ17-SEQ11、SEQ17-SEQ12、SEQ18-SEQ13进行PCR 克隆(PCR反应体系为PCR缓冲液5uL、10mM DNTP 1uL、10uM上下游引物各5uL、DNA模板10ng、pfu DNA酶1uL、用超纯水补足50uL； PCR条件为95℃预变性2分钟，然后进行30个循环95℃变性30秒，60℃30秒，72℃1分钟)，分别获得人源化抗体的重链和轻链片段 VH1、VH2、VH3、VL1、VL2、VL3。然后以上述获得的6条重链和轻链为模板DNA，进行两两组合，即分别向同一个50uLPCR反应体系内分别加入10ng的VH1-VL1、VH1-VL2、VH1-VL3、VH2-VL1、VH2-VL2、VH2-VL3、VH3-VL1、VH3-VL2、VH3-VL3的片段，分别加入的引物组合为SEQ9-SEQ12、SEQ9-SEQ12、SEQ9-SEQ13、SEQ10-SEQ11、 SEQ10-SEQ12、SEQ10-SEQ13；然后分别向每个PCR反应体系内加入1uL Pfu高保真Taq酶、PCR缓冲液5uL、10mM DNTP 1uL、10uM上下游引物各5uL、DNA模板10ng、pfu DNA酶1uL、用超纯水补足50uL； PCR条件为95℃预变性2分钟，然后进行30个循环95℃变性30秒， 60℃30秒，72℃1分钟，获得人源化抗体的单链抗体序列，使用EcoRI-BglII对上述获得的片段及pFUSE-hIgG1-Fc2进行双酶切，酶切体系为DNA片段5ug、酶切缓冲液5uL、酶各1uL、超纯水补足至 50uL，37℃酶切2小时后，分别回收酶切后的片段，使用T4DNA连接酶分别将单链抗体序列连入载体中，T4DNA连接体系为DNA片段 10pmol、载体3pmol、T4DNA连接酶0.5uL、缓冲液2uL、超纯水补足至20uL，16℃连接过夜。取10uL连接后的产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，涂布至LB琼脂平板上后，挑取单克隆进行测序验证，选择正确的克隆进行质粒大抽。
表1overlap PCR引物序列信息
Figure RE-GDA0001617524160000091
实施例二单链抗体的表达及纯化
从液氮中复苏CHO-K1细胞株，并使用F12K、10％FBS培养基连续培养2周左右时间，使细胞处于对数生长期。分别准备10个15cm 培养皿的细胞，将上述获得的单链抗体表达载体分别转染至CHO-K1 细胞株中，使其分泌表达单链抗体。转染过程如下：从冰箱中取出100μM PEI，在60℃水浴锅中加热15分钟，至PEI完全溶解。从冰箱中取出单链抗体表达质粒，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。制备PEI/DNA复合物(以下所用体积或质粒质量按照一个15cm皿的量)：取2mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入20ug单链抗体表达质粒，移液枪上下吹打充分混匀后，加入30uL 100μMPEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。转染：将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到一个15cm 培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养6小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基(F12K+10％FBS)过夜培养。第二天将培养基更换为不含FBS的培养基，连续培养4天，收集培养基上清。
将收获的培养基上清进行离心，1200g 4℃离心10分钟，去除细胞碎片，然后将离心后的上清液通过Protein A的柱子进行重力沉降，使培养基上清中的单链抗体结合到Protein A上，然后使用洗脱液将单链抗体洗脱下来。使用BCA法进行定量。
实施例三单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力分析
从液氮中复苏CHO-K1-CD19重组细胞株，并使用F12K、10％FBS 培养基连续培养2周左右时间，使细胞处于对数生长期。取1*106个细胞，使用100uL PBS重悬，然后加入1ug上述纯化的单链抗体，室温孵育30分钟后，加入1mL PBS洗涤细胞3次，然后用100uL PBS 重悬细胞，加入5uL PE标记的Anti-human IgG抗体，室温避光孵育 30分钟后，加入1mL PBS洗涤三次，最后用500uL PBS重悬细胞，使用流式细胞仪分析人源化单链抗体与靶标蛋白CD19的结合能力。使用未经人源化处理的鼠源单抗作为对照。结果如图1所示，鼠单抗原始序列构建的单链抗体(SEQ1-SEQ2)可以特异性的结合CD19蛋白，人源化后获得的单链抗体序列(SEQ3-SEQ8)可以与CD19蛋白结合，表现出不同的结合力，其中尤以SEQ5-SEQ6和SEQ5-SEQ7的组合表现为最高的亲和力，与初始的鼠源单链抗体亲和力相当。
实施例四嵌合抗原受体(CAR)慢病毒表达载体构建
以CD137的胞内结构域和CD3Zeta的ITAM区作为激活信号，与上述获取的单链抗体进行融合，构建嵌合抗原受体表达载体，并亚克隆至Lenti-EF1a-AT-Free载体中，载体图谱如图7所示。构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中各个元件的组合顺序如图2所示：
所构建的嵌合抗原受体中各元件氨基酸序列分别为：
信号肽：SEQ19
人源化单链抗体序列：SEQ5-6或SEQ5-7
CD8铰链区：SEQ20
CD8跨膜区：SEQ21
CD137胞内域：SEQ22
CD3Zeta：SEQ23
实施例五慢病毒制备
具体实验步骤如下：
S1、准备15cm皿，接种5*106个细胞，加入完全培养基(DMEM 高糖、10％FBS、双抗)，置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养。
S2、从冰箱中取出100μM PEI及慢病毒包装质粒 (Lenti-EF1a-CAR、pGP、pVSVG)，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS或HBSS缓冲液，温热至室温。取2mL PBS至6 孔板的一个孔，分别加入10μg Lenti-EF1a-CAR、4μg pGP、2μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μL 100μM PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
S3、将上述DNA/PEI复合物逐滴加入到15cm培养皿中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养6～8 小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。
连续培养48小时后，收集培养皿中含有病毒的培养基上清，用 0.45μm的滤膜过滤，转至离心管中，配平后，20000xg 4℃离心2 小时。离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入500μL PBS缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。
实施例六原代T细胞的分离
具体实验步骤如下：
S1、将淋巴细胞分离液上下颠倒数次，充分混匀Lymphoprep试剂。
S2、在生物安全柜中，向50mL离心管(或15mL离心管，视分离血样的体积而定)中加入15mL Lymphoprep试剂，备用。
S3、将血样使用等体积的PBS+2％FBS进行稀释。
S4、使用移液枪小心的将稀释后的血样沿管壁缓慢添加至分离试剂的上层，避免分离试剂与血样的混合。
S5、将离心机设置为800xg，转速下降速度设为最慢，室温离心 20分钟。
S6、离心结束后，收集上层浅黄色血清至另一个无菌离心管中，贮存于-80℃。
S7、轻轻的将处于血清与分离试剂界面的单核细胞层吸至一个新的离心管中，使用培养基洗涤细胞一次。
S8、将细胞密度调整至1*108细胞/mL(总体积不超过2.5mL)，重悬于5mL的圆底管中。
S9、加入100μl/mL的抗体cocktail，充分混匀后，室温孵育 15分钟。
S10、取出磁珠，用移液枪上下吹打至少5次，充分混匀。
S11、吸取50μl磁珠/mL至上述样品中，充分混匀后，室温孵育10分钟。
S12、添加完全培养基至管内总体积为2.5mL，将管子(开盖) 插入磁极中，室温静置5分钟。
S13、孵育完毕后，管子继续留在磁极中，轻轻倒置，将管内的细胞倒出。
S14、将细胞重悬于X-vivo 15培养基中，并添加10％FBS，300U/mL IL-2,5ng/mLIL-15和10ng/mL IL-7。
实施例七原代T细胞的激活与慢病毒感染
具体实验步骤如下：
S1、调整细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子及抗体复合物 (终浓度为300U/mL的IL-2、10ng/mL IL-7、5ng/mL IL-15、500ng/mL Anti-CD3(OKT3)、2ug/mL Anti-CD28)，连续培养48小时。
S2、按照MOI＝20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(mL)＝(MOI*细胞数量)/病毒滴度
S3、从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为6μg/mL的 polybrene，充分混匀后，使用封口膜将六孔板四边密封，800xg离心1小时。
S4、离心结束后，撕掉封口膜，将六孔板置于37℃5％CO2的培养箱中，继续培养24小时。
S5、250xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的六孔板中，继续培养3-6天备用。
实施例八CAR-T细胞对靶细胞裂解
具体实验步骤如下：
S1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2 次；
S2、用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*105个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，过夜培养。
S3、离心收集上述制备的CAR-T细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌PBS轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述E/T比例，加入CAR-T细胞，并将最终体积补至100μL/孔；Maxi lysis和Mini lysis为接种同样数量的靶细胞，但是不加CAR-T细胞。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，培养6小时。
S4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，向Maxi lysis孔加入LDH检测试剂盒中的裂解液，将其中的靶细胞完全裂解后，1200xg 室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μL至另一个新的96孔板中，加入LDH检测试剂后，使用酶标仪读取OD值。
靶细胞裂解百分数计算公式：
Figure RE-GDA0001617524160000141
S5、将上述处理后的数据使用GraphPad 6.0进行作图。
实验结果：
以CAR-T细胞为效应细胞，以天然表达CD19的淋巴瘤细胞株Raji 及基因工程化的重组CHO-K1-CD19细胞为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为50000个，分别加入不同数量的CAR-T细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10 分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30 微升上清，检测培养基上清中LDH的释放量，以此反映CAR-T细胞对靶细胞的裂解能力，结果如图3至4所示，SEQ5/SEQ6及SEQ5/SEQ7 构成的嵌合抗原受体，在效靶比为1：1时即可高效的介导T细胞对肿瘤细胞或重组细胞的杀伤；随着效靶比的升高，含有SEQ5/SEQ6及 SEQ5/SEQ7的CAR-T细胞对靶细胞Raji及CHO-K1-CD19的杀伤作用也随之升高，在效靶比为10:1时达到最高。
实施例九CAR-T细胞因子分泌水平检测
具体实验步骤如下：
S1、调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2 次；
S2、用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*105个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，过夜培养。
S3、离心收集上述制备的CAR-T细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌PBS轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述E/T比例，加入CAR-T细胞，并将最终体积补至100μL/孔；将孔板置于5％CO2 37℃培养箱中，培养6小时。同时设置对照T细胞组。
S4、培养结束后，将孔板从培养箱中取出，1200xg室温离心96 孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μL培养基上清，使用ELISA kit检测IL-2的表达，使用酶标仪读取OD值。
S5、将上述获取的数据使用GraphPad 6.0进行作图。
实验结果：
以CAR-T细胞为效应细胞，以天然表达CD19的淋巴瘤细胞株Raji 及基因工程化的重组CHO-K1-CD19细胞为靶细胞，按照不同的效靶比例建立共培养体系，即96孔板中，每个孔内固定靶细胞的数量为 50000个，分别加入不同数量的CAR-T细胞，共培养体系用无血清培养基进行培养，连续培养8小时后，取出孔板，室温1200xg离心10 分钟，使悬浮的细胞全部沉淀到孔板底部，然后从每个孔中取出30 微升上清，用ELISA的方法检测培养基上清中由CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后分泌的IFN-γ的表达量；结果如图5至6所示，SEQ5/SEQ6 及SEQ5/SEQ7构成的嵌合抗原受体与靶向肿瘤细胞结合后，可以有效的激活原代T细胞，并引起细胞因子分泌表达量的升高；在效靶比为 1:1时，CAR-T细胞被肿瘤细胞激活后，即可分泌大量的IFN-γ,显著高于对照T细胞；在效靶比为10:1时分泌量达到最高值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
<110> 广东万海细胞生物科技有限公司
<120> 抗CD19抗体及其应用
<160> 23
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
EVKLQESGPG LVAPSQSLSV TCTVSGVSLP DYGVSWIRQP PRKGLEWLGV IWGSETTYYN 60
SALKSRLTII KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AIYYCAKHYY YGGSYAMDYW GQGTSVTVSS 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS KYLNWYQQKP DGTVKLLIYH TSRLHSGVPS 60
RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPYTFGG GTKLEIT 107
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
EQVQLQESGP GLVKPSETLS LTCTVSGVSL PDYGVSWIRQ PPGKGLEWLG VIWGSETTYY 60
NSALKSRVTI SVDTSKNQFS LKLSSVTAAD TAVYYCARHY YYGGSYAMDY WGQGTLVTVS 120
S 121
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
EQVQLQESGP GLVKPSETLS LTCAVSGVSL PDYGVGWIRQ PPGKGLEWLG VIWGSETTYY 60
NSALKSRVTI SVDTSKNQFS LKLSSVTAAD TAVYYCARHY YYGGSYAMDY WGQGTLVTVS 120
S 121
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGVSLP DYGVSWVRQA PGKGLEWLGV IWGSETTYYN 60
SALKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAKHYY YGGSYAMDYW GQGTLVTVSS 120
<210> 6
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS KYLNWYQQKP GKAPKLLIYH TSRLHSGVPS 60
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPYTFGG GTKLEIT 107
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDIS KYLNWYQQKP GKAPKLLIYH TSRLHSGVPS 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GNTLPYTFGQ GTKLEIT 107
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS KYLNWYRQKP GKVPKLLIYH TSRLHSGVPS 60
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYGQQ GNTLPYTFGQ GTKLEIT 107
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
GAATTCGCAG GTGCAGCTGC AGGAATC 27
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
GAATTCGGAA GTGCAGCTGC TGGAATCTG 29
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
AGATCTGGTG ATTTCCAGCT TGGTGCCTCC 30
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
AGATCTGGTG ATTTCCAGCT TGGTGC 26
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
AGATCTGGTG ATTTCCAGCT TGGTGCC 27
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
AGATCCTCCG CCTCCGCTAG ACACGGTCAC GAG 33
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
AGATCCTCCG CCTCCGCTAG ACACGGTCAC GAG 33
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
TGATCCTCCG CCTCCGCTAG ACACGGTCAC GAG 33
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
GGAGGCGGAG GATCTGGCGG CGGAGGAAGT GGCGGAGGGG GATCCGATAT CCAGATGACC 60
CAGAGC 66
<210> 18
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
GGAGGCGGAG GATCAGGCGG CGGAGGAAGT GGCGGAGGGG GATCTGATAT CCAGCTGACC 60
CAGAGC 66
<210> 19
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
MALPVTALLL PLALLLHAAR P 21
<210> 20
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFACD 45
<210> 21
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
IYIWAPLAGT CGVLLLSLVI TLYC 24
<210> 22
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL 42
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
RVKFSRSADA PAYKQGQNQL YNELNLGRRE EYDVLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPQEGLYN 60
ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDT YDALHMQALP PR 112

Claims (14)

1.一种抗CD19抗体或其抗原结合部分，其特征在于：其重链的序列为SEQ ID NO：5所示，轻链的序列分别如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示。
2.根据权利要求1所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述抗CD19抗体或其抗原结合部分为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab' 、F(ab')2 、Fv或嵌合抗原受体。
3.根据权利要求2所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外区肽段、跨膜区肽段和胞内结构域肽段，所述胞外区肽段包括抗CD19抗体或其抗原结合部分。
4.根据权利要求3所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述跨膜区肽段为CD8跨膜区肽段，所述胞外区肽段与CD8跨膜区肽段通过CD8的铰链区肽段相连。
5.根据权利要求3所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述胞内结构域肽段为共刺激信号分子，选自4-1BB、CD28、CD3ζ的胞内结构域肽段中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述嵌合抗原受体分子还包括信号肽。
7.根据权利要求1所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述抗CD19抗体或其抗原结合部分，其重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
8.根据权利要求1所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分，其特征在于：所述抗CD19抗体或其抗原结合部分，其轻链恒定区为κ或λ。
9.一种核酸分子，其特征在于：
包含能够编码抗体重链SEQ ID NO：5的核酸序列以及能够编码抗体轻链的核酸序列，所述轻链包含选自如下一组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6或 SEQ ID NO：7。
10.一种载体，其特征在于：其含有权利要求9所述的核酸分子。
11.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求9所述的核酸分子或权利要求10所述的载体。
12.一种偶联物，其特征在于：其含有权利要求1-8任一项所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分，以及其它生物活性物质，所述抗CD19抗体或其抗原结合部分直接或通过连接片段与其它生物活性物质偶联。
13.一种组合物，其特征在于：其含有权利要求1-8任一项所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10的载体、权利要求11所述的宿主细胞、或者权利要求12所述的偶联物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。
14.权利要求1-8任一项所述的抗CD19抗体或其抗原结合部分、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的宿主细胞、权利要求12所述的偶联物、或者权利要求13所述的组合物在用于制备治疗肿瘤的药物中的用途。
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CONSTRUCTION AND CHARACTERISATION OF A FUNCTIONAL CD19 SPECIFIC SINGLE CHAIN Fv FRAGMENT FOR IMMUNOTHERAPY OF B LINEAGE LEUKAEMIA AND LYMPHOMA;IAN C. NICHOLSON等;《Molecuiur Immunology》;19980518;第34卷(第16-17期);1157-1165 *
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Mus musculus mRNA for immunoglobulin light chain variable region, subunits VL and JL;Hohmann,A.W.;《Genbank Database》;20160724;Y14284 *

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