CN113549155B - 同时靶向cd19和cd20的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了编码同时靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含CD19和CD20结合结构域，其中，所述CD19和CD20结合结构域中的CD20结合结构域为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。通过实验证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对CD19+、CD20+和CD19+/CD20+B细胞淋巴瘤细胞和B细胞淋巴细胞白血病细胞有很强的杀伤作用，对不表达CD19和CD20的细胞几乎无杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体可用于CD19+B细胞和CD20+B细胞血液肿瘤的治疗，以及与CD19 CAR‑T细胞或CD20 CAR‑T细胞的联合治疗。

Description

同时靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及同时靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞作为一种免疫治疗策略，在肿瘤治疗中受到广泛的重视和应用。CAR的结构一般由胞外靶向连接区(常为具有抗原识别功能的单链抗体)，铰链区，跨膜区和胞内信号转导区四部分组成。目前根据胞内信号转导区加入共刺激分子的数量，将CAR分为一代(无共刺激分子)、二代(含一种共刺激分子)和三代(含两种共刺激分子)。目前应用最多的是二代CAR。
CAR-T细胞免疫治疗的应用使复发难治性急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblastic leukemia,ALL)的治疗取得了重大的突破，特别是靶向CD19的CAR-T细胞治疗在ALL患者中取得了显著的临床功效。然而，CAR-T治疗缺乏CAR靶向抗原的白血病细胞有很大的复发风险。多项试验也报告了由于CD19阴性白血病细胞的出现而导致患者复发。同时，CD19 CAR-T治疗淋巴瘤的效果一般。CD19和CD20表达于除浆细胞外的发育分化各阶段的B细胞的表面。抗CD20单克隆抗体是多种B细胞恶性肿瘤的有效治疗方案。虽然利妥昔单抗联合化疗在CD20阳性B细胞淋巴瘤患者中取得了良好的疗效，但对利妥昔单抗的获得性耐药已经成为一个问题，其机制可能是肿瘤细胞表面降低了CD20的表达。在这种情况下，具有CD19和CD20结合域的双特异性CAR旨在识别只有一个同源抗原的白血病细胞。抗CD19和CD20双特异性CAR-T细胞可能通过识别抗原丢失的白血病细胞而降低复发的风险。
因此，为了解决CD19 CAR-T技术对于淋巴瘤的治疗效果一般，并且治疗期间因逃避机制等而产生复发或无效的问题，需要寻找一种新的嵌合抗原受体。
发明内容
本发明的一个方面，是针对现有技术中CD19 CAR-T技术对于淋巴瘤的治疗效果一般，并且治疗期间因逃避机制等而产生复发或无效，提供了一种同时靶向CD20和CD19的双靶点嵌合抗原受体及其应用。
本发明提供的技术方案为：
编码同时靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其编码的所述胞外区包含CD19和CD20结合结构域，其中，所述CD19和CD20结合结构域中的CD20结合结构域为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在本发明的技术方案中，任意合适的能够特异性结合CD19的结合结构域与SEQ IDNO.2所示的CD20结合结构域形成双特异性结合结构域后，都能够实现本发明的目的。作为优选，本发明所述的CD19结合结构域的序列为SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列，可以根据其序列按照常规方法制得，例如但不限于，化学合成的方法。本发明所述CD20结合结构域是对现有技术中CD20结合结构域的特殊改造，目的是为了提高其功能效果。
作为优选，在本发明的实施方式中，核酸分子编码的所述CD19和CD20结合结构域由所述CD19的单链抗体可变区片段和所述CD20的单链抗体可变区片段通过连接序列连接组成，所述CD19和CD20结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-6所示。
作为优选，在本发明的实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO.13-16所示。
在本发明中，CD19+肿瘤细胞和CD20+肿瘤细胞与SEQ ID No.3所示的CAR(tan1920-CAR)、SEQ ID No.4所示的CAR(tan2019-CAR)、SEQ ID No.5所示的CAR(loop1920-CAR)或SEQ ID No.6所示的CAR(loop2019-CAR)结合后可以激活相应的CAR-T细胞，产生细胞毒效应；而CD20和CD19都不表达的细胞不能激活CAR-T细胞产生应答。因此，以tanCD19 scFv-CD20 scFv(SEQ ID No.3所示)、tanCD20 scFv-CD19 scFv(SEQ ID No.4所示)、loopCD19scFv-CD20 scFv(SEQ ID No.5所示)和loopCD20 scFv-CD19 scFv(SEQ ID No.6所示)为抗原识别区制备的CAR-T细胞在识别并杀伤CD20+肿瘤细胞和CD19+肿瘤细胞的同时，对不表达CD19和CD20的细胞不产生脱靶效应。
在本发明中，发明人还发现，CD20 scFv和CD19 scFv的连接、排列顺序对其组合后产生的杀伤肿瘤细胞的作用有影响。例如，在本发明的一个实施方式中，发明人验证了Tan2019 CAR-T这种连接方式的杀伤效果更为显著。
所述连接序列可以为任意合适的连接序列。作为优选，在本发明的实施方式中，所述连接序列为一个或多个EAAAK或linker 1(如SEQ.ID No.17所示)组成的序列。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述连接序列为3个EAAAK或linker 1。
在本发明中，可以对所述的tanCD19 scFv-CD20 scFv(tan1920 scFv)、tanCD20scFv-CD19 scFv(tan2019 scFv)、loopCD19 scFv-CD20 scFv(loop1920scFv)和loopCD20scFv-CD19 scFv(loop2019 scFv)氨基酸序列以合适的方式进行随机或者工程化的点突变，其目的可以为，例如，获得更好的亲和力和/或解离性质，而这些突变后的氨基酸序列均包含在本发明的保护范围之内。
在本发明中，所述CD20 scFv及CD19 scFv的同种或不同抗体的轻重链之间通过连接肽相连，任意合适长度或合适性质的连接肽或连接肽的组合均可实现本发明的目的。
在本发明中，所述核酸分子可编码信号肽。信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外。任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本发明的目的。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽或与所述信号肽具有90-99％同一性的氨基酸序列，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF。
更优选地，所述信号肽为如SEQ ID NO.7所示的信号肽。
在本发明的一个实施方式中，本发明核酸分子编码的所述CD20和CD19结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接。任意合适的铰链区序列均可实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述铰链区为CD8α。
在本发明中，所述核酸分子还编码跨膜结构域。任意合适的跨膜结构域均能实现本发明的目的。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
在本发明中，所述核酸分子编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。
作为优选，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90-99％同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、淋巴细胞活化信号分子、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述共刺激因子为4-1BB或与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
同时，本发明核酸分子还编码任意合适的胞内信号结构域。可以为CD3ζ胞内信号结构与其具有90-99％同一性的氨基酸序列。
作为优选，本发明核酸分子所编码的嵌合抗原受体是以tanCD19 scFv-CD20scFv、tanCD20 scFv-CD19 scFv、loopCD19 scFv-CD20 scFv或loopCD20scFv-CD19 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其序列如SEQ ID NO.8-11所示。
另外，在上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区之间合适的位置可插入任意肽链作为间隔区，所述肽链可以为寡肽或多肽。
对于上述核酸分子的制备方法，可基于上述抗原识别区、铰链区、跨膜区以及胞内信号区等结构域的碱基序列，通过化学合成或PCR扩增等已知技术制备。通常，可以对编码上述结构域的氨基酸的密码子进行优化，以优化其在宿主细胞中的表达。上述碱基序列的信息可通过检索已知文献或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库来获得。
在本发明的一个实施方式中，发明人所用的小鼠抗人CD20单克隆抗体杂交瘤细胞株(HI47)和小鼠抗人CD19单克隆抗体杂交瘤细胞株(HIB19)是由申请人——中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)研制的，用该杂交瘤生产的单克隆抗体已商品化，可分别用于CD20阳性和CD19阳性的急性淋巴细胞白血病及淋巴瘤的检测和诊断。当然，也可以根据序列利用其它现有技术中的方式获得。
本发明的另一个方面，是提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由上述核酸分子编码。
上述嵌合抗原受体的胞外区包含CD20和CD19结合结构域，所述CD20和CD19结合结构域由CD20的单链抗体可变区片段和CD19的单链抗体可变区片段通过连接序列连接组成；
所述CD20和CD19结合结构域按照SEQ ID No.3所示的氨基酸序列、SEQ ID No.4所示的氨基酸序列、SEQ ID No.5所示的氨基酸序列或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列的顺序排列。
所述连接序列可以为任意合适的连接序列。作为优选，在本发明的实施方式中，所述连接序列为一个或多个EAAAK或linker 1(如SEQ.ID No.17所示)组成的序列。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述连接序列为3个EAAAK或linker 1。
作为优选，本发明嵌合抗原受体是以CD8α信号肽、tan1920 scFv或tan2019scFv或loop1920 scFv或loop2019 scFv抗原识别区、CD8α铰链区和跨膜区、以及4-1BB和CD3ζ胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.13-16所示。
在本发明中，CD8α-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列优选为如SEQ ID NO.12所示。
本发明的另一个方面，是提供了一种载体，所述载体包含上述核酸分子。在本发明中，上述载体可以为直链载体，也可以为环状载体。可以为质粒等非病毒载体，也可以为病毒载体，还可以为利用转座子的载体。所述载体中可含有启动子、终止子等调控序列，以及耐药基因、报告基因等标记序列。另外，上述载体也可包含编码自杀基因的序列，可根据治疗过程，通过给予激活自杀基因的物质，从而控制体内CAR-T细胞的数目。
作为上述病毒载体，可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。在本发明的一个实施方式中，使用的是慢病毒表达载体。本发明的另一个方面，是提供了一种细胞，所述细胞包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体或上述载体。
在本发明的一个实施方式中，上述细胞为人的T细胞。所述T细胞可以来自血液、骨髓等体液，也可以来自脾脏、胸腺、淋巴等组织，或者原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌症组织，经分离、纯化后得到。同时，所述T细胞可以为CD4+T细胞、CD8+T细胞、αβT细胞或γδT细胞。所述T细胞可以以合适的方式替换为NK细胞，其也视为包含在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述核酸分子在制备抗B细胞血液肿瘤药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述嵌合抗原受体在制备抗B细胞血液肿瘤药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述载体在制备抗B细胞血液肿瘤药物中的应用。
本发明的另一个方面，是提供了一种上述细胞在制备抗B细胞血液肿瘤药物中的应用。
作为优选，上述应用为在制备患者CD19和CD20广泛共表达或经CD19CAR-T治疗后因抗原变异而复发或无效的抗B细胞血液肿瘤药物中的应用。
上述无效是指患者经CD19 CAR-T治疗后，因出现CD19抗原丢失、突变等，导致患者对CD19 CAR-T没有反应性，出现治疗无效。
只要其在病理过程中表达CD19和CD20，上述B细胞血液肿瘤包括但不限于B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)等。作为优选，上述B细胞血液肿瘤为B细胞淋巴瘤或慢性B淋巴细胞白血病。
本发明的另一个方面，是提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述核酸分子、上述嵌合抗原受体、上述载体或上述细胞，以及药学上接受的载体。
本发明药物组合物除包含上述成分以外，还可包含任意药学上允许的添加剂，例如，生理盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇以及它们的组合物、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、等渗剂等。
同样，本发明药物组合物也可以和其他合适的抗癌剂联合应用。例如，长春新碱、柔红霉素、门冬酰胺酶、环磷酰胺、泼尼松等。
作为优选，本发明药物组合物还包含编码CD19和CD20嵌合抗原受体的核酸分子、CD19和CD20嵌合抗原受体、含有编码CD19和CD20嵌合抗原受体的核酸分子的载体或含有CD19和CD20嵌合抗原受体的细胞。
上述编码CD19和CD20嵌合抗原受体的核酸分子、CD19和CD20嵌合抗原受体、含有编码CD19和CD20嵌合抗原受体的核酸分子的载体或含有CD19和CD20嵌合抗原受体的细胞可以为任意合适的编码CD19和CD20嵌合抗原受体的核酸分子、CD19和CD20嵌合抗原受体、含有编码CD19和CD20嵌合抗原受体的核酸分子的载体或含有CD19和CD20嵌合抗原受体的细胞。
本发明的有益效果为：
本发明通过核酸分子化学合成或PCR技术，对小鼠抗人CD20 scFv和小鼠抗人CD19scFv的轻重链进行合成和重排，得到tanCD19 scFv-CD20 scFv、tanCD20 scFv-CD19 scFv、loopCD19 scFv-CD20 scFv和loopCD20 scFv-CD19scFv并克隆到含有信号肽和CD8α-4-1BB-CD3ζ的慢病毒表达载体中，包装成携带CD19 scFv-CD20 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(tan1920 CAR)、CD20 scFv-CD19scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(tan2019 CAR)、CD19 VL-CD20VL-CD20 VH-CD19VH-CD8α-4-1BB-CD3ζ(loop1920 CAR)或CD20 VL-CD19 VL-CD19 VH-CD20VH-CD8α-4-1BB-CD3ζ(loop2019 CAR)编码基因的慢病毒载体。利用慢病毒感染T细胞，使T细胞表达上述嵌合抗原受体。通过流式细胞术、脱颗粒分析实验、以及ELISA检测T细胞分泌的细胞因子，证明该嵌合抗原受体修饰的T细胞对CD19+、CD20+以及CD19+/CD20+的B细胞淋巴瘤细胞和B细胞淋巴细胞白血病细胞有很强的杀伤作用，对不表达CD19和CD20的细胞几乎没有杀伤作用，有效防止了脱靶效应。本发明嵌合抗原受体可用于CD19+B细胞和CD20+B细胞血液肿瘤的治疗，以及与CD19 CAR-T细胞或CD20 CAR-T细胞的联合治疗。
附图说明
图1为本发明实施例中鼠抗人CD20单链抗体和CD19单链抗体PCR扩增电泳图，其中，1为2000bp maker分子量标记泳道，2、3为CD19scFv扩增片段(735bp)泳道，5、6为CD20scFv扩增片段(732bp)泳道；
图2为overlap PCR扩增tanCD19scFv-CD20scFv(tan1920 scFv)和tanCD20scFv-CD19scFv(tan2019 scFv)片段，其中，1为2000bp marker分子量标记泳道，2为tan1920scFv(1539bp)，3为tan2019scFv(1539bp)；
图3为本发明实施例中慢病毒表达载tanCD19scFv-CD20scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(tan1920 CAR)、tanCD20scFv-CD19scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(tan2019 CAR)限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1为15kb核酸分子量标记泳道；2为用核酸内切酶XbaⅠ和NotⅠ双酶切慢病毒表达质粒tan1920 CAR及tan2019 CAR所得到的编码tan1920 CAR的DNA片段(1539bp)和载体片段(7728bp)泳道；3为用核酸内切酶XbaⅠ和NotⅠ双酶切慢病毒表达质粒tan2019 CAR所得到的编码tan2019 CAR的DNA片段(1539bp)和载体片段(7728bp)泳道；
图4为本发明实施例中慢病毒表达载体示意图，其中，逆时针序列是正向基因片段，顺时针序列为反向基因片段；
图5为利用流式细胞术检测本发明实施例中构建的tanCD19scFv-CD20scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(tan1920CAR-T)、tanCD20scFv-CD19scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(tan2019CAR-T)、loopCD19scFv-CD20scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(loop1920CAR-T)、loopCD20scFv-CD19scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ(loop2019CAR-T)修饰T细胞中CAR分子的表达结果图，其中，GFP为载体携带的标志蛋白的表达，F(ab')2为兔抗鼠IgG标记scFv在T细胞表面的表达；
图6为利用流式细胞术检测本发明实施例中Burkitt淋巴瘤细胞系Daudi、Raji，慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞，通过慢病毒外源过表达CD19抗原的K562细胞(简称K562-CD19)以及通过慢病毒外源过表达CD20抗原的K562细胞(简称K562-CD20)中CD19和CD20靶抗原分子的表达强度结果图，其中，A为CD19抗原分子表达阳性率；B为CD20靶抗原分子的表达强度(specific fluorescence intensity,SFI)；
图7为利用流式细胞术检测本发明实施例中tan1920CAR,tan2019CAR,loop1920CAR,loop2019CAR T细胞与靶细胞共培养后残留的肿瘤细胞存活率结果图。其中，图A-F所示的CAR-T组分别为CD19 CAR,CD20 CAR,tan1920 CAR,tan2019CAR修饰T细胞的实验组；vec-T为转染空载体的T细胞的对照组；图G-L所示的CAR-T组分别为CD19 CAR,CD20CAR,loop1920 CAR,loop2019CAR修饰T细胞的实验组；vec-T为转染空载体的T细胞的对照组；图A为T细胞与CD19+CD20+的Raji细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图B为T细胞与CD19+CD20+的Daudi细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图C为T细胞与CD19-CD20-的K562细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养24小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图D为T细胞与CD19-CD20-的K562细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图E为T细胞与CD19+CD20-的K562-CD19细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养72小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图F为T细胞与CD19-CD20+的K562细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养72小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图G为T细胞与CD19+CD20-的K562-CD19细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图H为T细胞与CD19+CD20-的K562-CD19细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养72小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图I为T细胞与CD19-CD20+的K562-CD20细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养48小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图J为T细胞与CD19-CD20+的K562-CD20细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养72小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图K为T细胞与1:1混合的K562-CD19/K562-CD20细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养72小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；图L为T细胞与1:1混合的K562-CD19/K562-CD20细胞系按效靶比1:4、1:2、1:1共培养24小时后残留的肿瘤细胞存活率结果图；
图8为本发明实施例中tan1920 CAR、tan2019 CAR修饰T细胞对Raji、K562、K562-CD19、K562-CD20以及1：1混合的K562-CD19+/K562-CD20细胞，在效靶比1:1时作用(24h,48h或72h)杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，CAR-T分别为CD19 CAR,CD20 CAR,tan1920CAR,tan2019 CAR修饰的T细胞；vec-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图9为本发明实施例中tan1920 CAR、tan2019 CAR修饰T细胞与Raji、K562-CD19、K562-CD20以及1：1混合的K562-CD19+K562-CD20细胞系按效靶比2:1共培养48小时后，T细胞释放的细胞因子IFN-γ(A图)、IL-2(B图)和TNF-α(C图)水平结果图，其中，CAR-T分别为CD19 CAR,CD20 CAR,tan1920 CAR,tan 2019CAR修饰的T细胞；vec-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图10为利用流式细胞术检测CLL患者外周血单个核细胞(PBMCs)CD19和CD20靶抗原分子的表达结果图,其中P1～P3表示患者编号；
图11为本发明实施例中CD19 CAR,CD20 CAR,tan1920 CAR及tan2019CAR修饰的T细胞与CLL患者PBMCs按效靶比1:4共培养48小时后流式检测残留的肿瘤细胞细胞存活率结果图，其中，CAR-T为CD19 CAR,CD20 CAR,tan1920 CAR和tan 2019CAR修饰T细胞的实验组；vec-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图12为本发明实施例中tan1920 CAR,tan2019 CAR修饰T细胞对CLL患者的PBMCs杀伤作用的脱颗粒检测结果图，其中，CAR-T为CD19 CAR,CD20CAR,tan1920 CAR,tan2019CAR修饰T细胞的实验组；vec-T为转染空载体的T细胞的对照组；
图13为本发明实施例中tan1920 CAR,tan2019 CAR修饰T细胞在小鼠体内效果的评价结果图，选用6-8周的NOD/SCID雌性小鼠并随机分为五组，每组7只鼠。第0天经尾静脉注射1×106的Raji细胞，第3天、第6天和第9天分别经尾静脉注射1×107的vec-T细胞或CAR-T细胞(如A所示)，小鼠生存曲线如B所示，用SPSS软件计算生存期，其中，CAR-T为CD19 CAR,CD20 CAR,tan1920 CAR,tan 2019CAR修饰T细胞的实验组；vec-T为转染空载体的T细胞的对照组。
序列说明
SEQ ID NO.1为本发明靶向CD19的抗原结合部分的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2为本发明靶向CD20的抗原结合部分的氨基酸序列；
SEQ ID NO.3为本发明靶向CD19和CD20的tan1920 CAR抗原结合部分的氨基酸序列；
SEQ ID NO.4为本发明靶向CD19和CD20的tan2019 CAR抗原结合部分的氨基酸序列；
SEQ ID NO.5为本发明靶向CD19和CD20的loop1920 CAR抗原结合部分的氨基酸序列；
SEQ ID NO.6为本发明靶向CD19和CD20的loop2019 CAR抗原结合部分的氨基酸序列；
SEQ ID NO.7为本发明靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体中信号肽的氨基酸序列；
SEQ ID NO.8为本发明靶向CD19和CD20的tan1920 CAR嵌合抗原受体的核酸序列；
SEQ ID NO.9为本发明靶向CD19和CD20的tan2019 CAR嵌合抗原受体的核酸序列；
SEQ ID NO.10为本发明靶向CD19和CD20的loop1920 CAR嵌合抗原受体的核酸序列；
SEQ ID NO.11为本发明靶向CD19和CD20的loop2019 CAR嵌合抗原受体的核酸序列；
SEQ ID NO.12为本发明靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体中CD8α-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列；
SEQ ID NO.13为本发明靶向CD19和CD20的tan1920 CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列；
SEQ ID NO.14为本发明靶向CD19和CD20的tan2019 CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列；
SEQ ID NO.15为本发明靶向CD19和CD20的loop1920 CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列；
SEQ ID NO.16为本发明靶向CD19和CD20的loop2019 CAR嵌合抗原受体的氨基酸序列；
SEQ ID NO.17为本发明靶向CD19和CD20的loop1920 CAR和loop2019 CAR两个抗原结合部分之间的linker 1核酸序列。
具体实施方式
本发明公开了同时靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。
在本发明中，术语“和”是指同时满足，例如，CD19和CD20的嵌合抗原受体是指同时靶向CD19和CD20的双特异性嵌合抗原受体。
在本发明中，术语“或”是指选择性地满足任一条件。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：连接CD19 scFv和CD20scFv抗原识别结构域
1.设计引物，分别用PCR的方法扩增CD19scFv结构域和CD20scFv结构域。引物如下：
19F1:CTAGCTAGCGATATTGTGCTGACCCAG19R1:GCTCAATGTCCTTAGCAGCGGCTTCCTTAGCAGCGGCTTCCTTA GCAGCGGCTTCCTTAGCAGCGGCTTCCTTAGCAGCGGCTTCGCTGCTCACTGTCAGGGTGGT20F1:AGTGAGCAGCGAAGCCGCTGCTAAGGAA GCCGCTGCTAAGGAA GCCGCTGCTAAGGAAGCCGCTGCTAAGGAAGCCGCTGCTAAGGACATTGA GCTCACCCAGTC20R1:CCGGAATTCTGAGGAGACGGTGACCGTG19F2:ACCAAGCTGGAAATCAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCG GCTCCGGTGGTGGTGGTTCTGAGGTGAAGCTG19R2:CCGGAATTCGCTGCTCACTGTCAGGGTG20F2:CTAGCTAGCGACATCGAGCTCACTCAG20R2:CAGCTTCACCTCAGAACCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTTTGATTTCCAGCTTGGT
2.用19F1和19R1,19F2和19R2分别作为两对引物，扩增CD19scFv，得到19-1和19-2两个片段；用20F1和20R1,20F2和20R2分别作为两对引物扩增CD20scFv得到20-1和20-2两个片段。
配制PCR反应体系(50μl)如下：
cDNA(含19scFv/20scFv的质粒)：500ng
F引物：1μl
R引物：1μl
2×Pfu mix：25μl
ddH2O：补足至50μl。
反应条件：94℃预变性3分钟；重复如下循环30次：94℃30秒，64℃30秒，72℃40秒；最后，72℃延伸10分钟；
3.琼脂糖凝胶电泳分离并回收19-1、19-2、20-1、20-2片段。结果如图1所示。
4.overlap PCR方法构建tan1920 scFv和tan2019 scFv片段：
以19F1和20R1为引物，19-1及20-1两个片段为模板，扩增得到tan1920 scFv长片段(1539bp)，PCR体系如下：
19-1：200ng
20-1：200ng
19F1：1μl
20R1：1μl
2×Pfumix：25μl
ddH2O：补足至50μl。
反应条件：94℃预变性3分钟；重复如下循环30次：94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒；最后，72℃延伸10分钟；
获得NheI-19scFv-(EAAAK)3-20scFv-EcoRI片段，简称tan1920 scFv片段；以20F2和19R2为引物，19-2和20-2两个片段为模板，扩增得到tan2019 scFv长片段(1489bp)，PCR体系如下：
19-2：200ng
20-2：200ng
20F2：1μl
19R2：1μl
2×Pfu mix：25μl
ddH2O：补足至50μl。
反应条件：94℃预变性3分钟；重复如下循环30次：94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒；最后，72℃延伸10分钟；
获得NheI-20scFv-(EAAAK)3-19scFv-EcoRI片段，简称tan2019 scFv片段；
5.琼脂糖凝胶电泳分离并回收上述两种片段,结果如图2示。对两个片段进行测序确认PCR序列的正确性。
6.loop1920 scFv序列和loop2019 scFv序列由公司合成。
实施例2：嵌合抗原受体载体的构建
1.采用Nhe I、EcoR I核酸内切酶酶切含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒(来源CD19CAR)，获得CD8α-4-1BB-CD3ζ片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。所述含有CD8α-4-1BB-CD3ζ片段的质粒可通过现有技术中任意合适的方法制得。
2.将实施例1中得到的tan1920 scFv、tan2019 scFv、loop1920 scFv、loop2019scFv片段与目的载体进行连接，得到相应的CAR表达载体。将构建好的CAR表达载体用XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定。结果如图3所示，酶切结果表明阳性克隆含有目的条带且测序鉴定正确。载体示意图如图4示。
实施例3：嵌合抗原受体CD22 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ慢病毒修饰T细胞的制备
1.采用EndoFree Plasmid Maxi质粒抽提试剂盒(QIAGEN公司)提取tan1920 CAR、tan2019 CAR、loop1920 CAR、loop2019 CAR表达质粒和包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2G四种质粒用3:1:1:1比例用PEI转染试剂(polyscience公司)进行转染(具体方法见PEI转染试剂说明书)。转染后12小时更换新鲜培养液，之后24小时、48小时分别收取病毒上清，于4℃，3000rpm，离心15分钟，经0.45μm滤器过滤后，采用50000g，4℃，1.5小时超速离心后浓缩10倍，后转入-80℃保存。
2.T细胞的制备：取新鲜健康人外周血10ml，采用RosetteSep T cell enrichmentCocktail(Stemcell公司)和Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)提取T细胞(具体步骤按照RosetteSep T cell enrichment Cocktail说明书)。按细胞：磁珠＝1：1比例加入抗CD3/CD28磁珠(Gibco公司)，培养24小时即为转染前的T细胞。
3.慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的培养：从-80℃中取出病毒上清，室温下融化，按每1×106T细胞加入100μl病毒上清，加入Polybrene至终浓度为8μg/ml。32℃，1800rpm，离心1.5小时，转入5％CO2，37℃孵箱培养。
4.流式细胞术检测CAR修饰T细胞的阳性率：收集细胞，标记兔抗鼠IgG F(ab')2抗体，流式细胞术分析T细胞F(ab')2的表达。结果如图5所示，由图中可以看出，CD19 CAR-T的阳性率为61.0％，CD20 CAR-T的阳性率为66.3％，tan1920 CAR-T的阳性率为54.4％，tan2019 CAR-T的阳性率为39.8％，loop1920CAR-T的阳性率为57.4％，loop2019 CAR-T的阳性率为56.4％；vector-T细胞带有绿色荧光蛋白，用GFP标记阳性率为85％。
实验例1：双靶点嵌合抗原受体慢病毒修饰T细胞对白血病细胞的杀伤作用
1.血液肿瘤细胞系中CD19和CD20的表达水平：
Raji、Daudi和K562细胞系均购自美国ATCC。分别培养后，各吸取5×105细胞悬液，PBS洗2次后，标记PE抗人CD20单抗(Biolegend公司)、PerCP抗人CD19单抗(Biolegend公司)，以标记PE-isotype和PerCP-isotype为对照组，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各种细胞系CD19和CD20的表达水平，结果如图6所示。其中Raji、Daudi和K562细胞系表达CD19及对应的同型对照的直方图如图6的A所示，表达CD20及对应的同型对照的直方图结果如图6的B所示。结果表明，本实验例中所使用的各种细胞系除K562以外，均表达CD19和CD20。
2.CAR修饰的T细胞与Raji、Daudi和K562细胞系共培养后流式检测残留的肿瘤细胞：
将上述细胞按2×105细胞/孔接种24孔培养板，分别加入5×104(E:T＝1:4)、1×105(E:T＝2:1)、2×105(E:T＝1:1)浓度的CAR修饰的T细胞，将转染不含CAR的空载体T细胞(vec-T)设为对照组，于孵箱中共培养。将共培养后的细胞用PE抗人CD20单抗(Biolegend公司)标记Raji、Daudi和K562细胞系，用APC-Cy7抗人CD3单抗(Biolegend公司)标记T细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图7A、7B所示，CD19 CAR-T、CD20 CAR-T、tan1920 CAR-T及tan2019 CAR-T与共表达CD19和CD20的Raji细胞系(A)及Daudi细胞系(B)共培养48小时后，1:1为效靶比时，肿瘤细胞残留都为0，而vector-T分别为为100％和71％。如图7C、7D所示，CD19 CAR-T、CD20 CAR-T、tan1920CAR-T及tan2019 CAR-T与CD19-CD20-的K562细胞按效靶比1:1共培养24小时后(C)，残留靶细胞分别为108.2％、104.9％、96.40％和132.30％，与vector-T残留靶细胞水平相当(93.17％)；共培养48小时后(D)，残留靶细胞分别为161.90％，128.60％，124.74％和107.60％，与vector-T组残留靶细胞水平相当(157.8％)，说明双靶点CAR和单靶点CAR对不表达CD19或CD20的细胞系没有表达出脱靶效应。如图7E所示，tan1920 CAR-T和tan2019CAR-T与CD19+CD20-的K562-CD19细胞按效靶比1:1共培养72小时后，残留靶细胞分别为3.5％和2.75％，与CD19 CAR-T组的残留靶细胞(0％)相当，而CD20 CAR-T的残留靶细胞百分比为40％，说明CD20 CAR-T对CD19+CD20-的肿瘤细胞没有杀伤作用，而两个双靶点CAR可以有效杀伤。如图7F所示，tan1920 CAR-T和tan2019 CAR-T、CD20 CAR-T与CD19-CD20+的K562-CD20细胞按效靶比1:1共培养72小时后，残留靶细胞都为0％，而CD19 CAR-T组的残留靶细胞百分比为55％，说明CD19 CAR-T对CD19-CD20+的肿瘤细胞也没有杀伤作用，而两个双靶点CAR可以有效杀伤。如图7G所示，loop1920 CAR-T和loop2019CAR-T与CD19+CD20-的K562-CD19细胞按效靶比1:1共培养48小时后，残留靶细胞都为10％，与CD19 CAR-T组的残留靶细胞相当(15％)，而CD20 CAR-T组的残留靶细胞百分比为28％，vector-T的残留靶细胞百分比为69.4％。如图7H所示，loop1920 CAR-T和loop2019 CAR-T与CD19+CD20-的K562-CD19细胞按效靶比1:1共培养72小时后，残留靶细胞都为3％，与CD19 CAR-T的残留靶细胞相当(3.5％)，而CD20 CAR-T的残留靶细胞百分比为20％，vector-T的残留靶细胞百分比为73.3％。如图7I所示，loop1920 CAR-T和loop2019CAR-T与CD19-CD20+的K562-CD20细胞按效靶比1:1共培养48小时后，残留靶细胞分别为17％和24％，稍优于CD20 CAR-T(28％)，而CD19 CAR-T的残留靶细胞百分比为62％，vector-T的残留细胞百分比为81.7％。如图7J所示，loop1920CAR-T和loop2019 CAR-T与CD19-CD20+的K562-CD20细胞按效靶比1:1共培养72小时后，残留靶细胞分别为2.4％和4％，与CD20 CAR-T杀伤水平相当(3.4％)，而CD19 CAR-T的残留靶细胞百分比为33.3％，vector-T的残留靶细胞百分比为65.5％，说明loop1920 CAR-T、loop2019 CAR-T和tan1920CAR-T、tan2019 CAR-T一样，对CD19或CD20的靶细胞都有杀伤功能。如图7K所示，tan1920CAR-T、tan2019 CAR-T与1：1混合的K562-CD19/K562-CD20细胞按效靶比1:1共培养48小时后，残留靶细胞为9.18％和4.10％，CD19 CAR-T残留靶细胞为19.80％，且均为CD20+细胞，CD20 CAR-T残留靶细胞为23.00％，且均为CD19+细胞，vector-T残留靶细胞为42.8％，说明不同于只能针对单一抗原的单靶点CAR，双靶点CAR能够针对CD19和CD20两个抗原进行杀伤。如图7L所示，tan1920 CAR-T、tan2019 CAR-T、loop1920 CAR-T和loop2019 CAR-T与1：1混合的K562-CD19和K562-CD20细胞共培养24h后，在任何效靶比下，几种CAR-T细胞杀伤后的残留靶细胞百分比几乎一致，说明四种双靶点CAR-T的体外杀伤功能相似。
3.脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：
将CAR-T及vec-T细胞分别与Raji、K562-CD19、K562-CD20、1:1混合的K562-CD19/K562-CD20和K562细胞按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测CD3+细胞表面CD107a的表达水平。结果如图8所示，CD19 CAR-T与Raji、K562-CD19、K562-CD20、1：1混合K562-CD19/K562-CD20和K562共培养体系中，细胞激活百分率分别为23％、15.5％、2％、20％和6％，CD20 CAR-T与Raji、K562-CD19、K562-CD20、1:1混合的K562-CD19/K562-CD20和K562共培养体系中，细胞激活百分率分别为21.6％、3％、7.4％、19.3％和6％,tan1920 CAR-T与Raji、K562-CD19、K562-CD20、1:1混合的K562-CD19/K562-CD20和K562细胞共培养体系中，细胞激活百分率分别为22.3％、12.9％、11.4％、19％和1％；tan2019CAR-T与Raji、K562-CD19、K562-CD20、1:1混合的K562-CD19/K562-CD20和K562细胞共培养体系中，细胞激活百分率分别为22.9％、20.4％、12.2％、19.4％和2.4％；vec-T与Raji、K562-CD19、K562-CD20、1:1混合的K562-CD19/K562-CD20和K562共培养体系中，细胞激活百分率分别为2.3％，1.2％，0.4％，3.8％，1.8％。CAR-T与vec-T的激活有显著差异(P<0.001)；几种CAR-T与K562细胞共培养的激活水平显著低于与CD19/CD20阳性细胞共培养的激活水平；且CD20CAR对于CD19+CD20-的K562-CD19细胞系共培养的激活水平显著低于与其他组CAR-T细胞的共培养的激活水平；且CD19CAR对于CD19-CD20+的K562-CD20细胞系共培养的激活水平显著低于与其他组CAR-T细胞的共培养的激活水平。
4.ELISA检测淋巴瘤细胞系与CAR-T细胞共培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α的水平：
分别将Raji、K562-CD19、K562-CD20、1：1混合K562-CD19/K562-CD20和K562细胞系按照2×105细胞/孔接种24孔板。按每孔2×105细胞分别加入几种CAR-T、vec-T细胞，补充培养液至1ml于孵箱中共培养24小时后。采用人IFN-γ、IL-2、TNFαELISA检测试剂盒(R&D公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。结果如图9所示，结果表明，表达CD19的细胞系Raji、K562-CD19与CD19CAR-T、tan1920CAR-T、tan2019CAR-T共培养上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α细胞因子水平均较vec-T和CD20CAR-T组有显著性升高(P<0.001)；表达CD20的细胞系Raji、K562-CD20与CD20CAR-T、tan1920CAR-T、tan2019CAR-T共培养上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α细胞因子水平均较vec-T和CD19CAR-T组有显著性升高(P<0.001)，几组CAR在不表达CD19/CD20的K562细胞的共培养上清中的IFN-γ水平很低，IL-2、TNF-α几乎没有分泌。结果表明，双靶点CAR-T在表达CD19或CD20的肿瘤细胞刺激下，能够分泌Th1类细胞因子。
5.CLL患者的外周血单个核细胞(PBMCs)中CD19和CD20的表达水平：
病人标本均来自中国医学科学院血液病医院，并征得患者的知情同意。采用Ficoll梯度离心分离出PBMCs后，各吸取5×105细胞悬液，PBS洗2次后，标记PE抗人CD20单抗(Biolegend公司)、PerCP抗人CD19单抗(Biolegend公司)或APC-isotype(对照组)、PerCP-isotype(对照组)，冰上孵育30分钟。运用流式细胞术检测各患者PBMCs表达CD19和CD20的比例和强度，如图10所示，其中P1～P3代表1～3号患者。
6.CAR修饰的T细胞与CLL患者的PBMCs共培养后流式检测残留的肿瘤细胞：
将细胞按4×105细胞/孔接种24孔培养板，分别加入1×105(E:T＝1:4)的CAR修饰的T细胞，转染不含CAR的空载体T细胞(vec-T)设为对照组，于孵箱中共培养48h。将共培养后的细胞用PE抗人CD20单抗(Biolegend公司)标记CLL患者的白血病细胞，用APC-Cy7抗人CD3单抗(Biolegend公司)标记T细胞，流式细胞术检测残留细胞。结果如图11所示，结果显示，CAR-T与表达CD19/CD20的1-3号患者PBMCs在1:4的效靶比下共培养48小时后，1号患者CD19CAR-T、CD20CAR-T、tan1920CAR-T、tan2019CAR-T组分别存留CD20+细胞为4％，10％，5％，6％,2号患者CD19CAR-T、CD20CAR-T、tan1920CAR-T、tan2019CAR-T、loop1920CAR-T、loop2019CAR-T组分别存留CD20+细胞为16％，15％，11％，9％,，3号患者CD19CAR-T、CD20CAR-T、tan1920CAR-T、tan2019CAR-T、loop1920CAR-T、loop2019CAR-T组分别存留CD20+细胞为7％，20％，8.0％，7.0％，三位患者的VEC组分别为22.0％，38.0％，42.0。由上述结果可以说明，双靶点CAR-T对表达CD19/CD20+的CLL原代PBMCs具有杀伤作用。
7.双靶点CAR修饰的T细胞与CLL患者的PBMCs共培养后脱颗粒实验分析CAR修饰的T细胞的激活：
将几种CAR-T及vec-T细胞分别与1～3号患者的PBMCs按照效靶比1:1进行共培养，并在共培养体系中加入anti-CD107a抗体和monensin；4h后应用流式细胞仪检测CD3+细胞表面CD107a的表达水平。结果如图12所示，结果显示，CD19CAR-T与1～3号患者共培养体系中，细胞激活百分率分别为11.3％，12.0％，11.7％，CD20CAR-T与1～3号患者共培养体系中，细胞激活百分率分别为7.92％，11.00％，11.40％，tan1920CAR-T与1～3号患者共培养体系中，细胞激活百分率分别为9.70％，8.77％，11.60％，tan2019CAR-T与1～3号患者共培养体系中，细胞激活百分率分别为9.47％，9.90％，17.30％；vec-T与表达与1～3号患者共培养体系中，细胞激活百分率分别为0.81％，1.67％，1.73％。由上述结果可以说明，双靶点CAR-T与vec-T的激活有显著差异，与单靶点CAR-T的激活水平相似。
8.双靶点CAR修饰的T细胞在CD19+CD20+淋巴瘤小鼠模型的作用：
选取6-8周的NOD/SCID雌性小鼠并随机分为5组，经过尾静脉注射Raji细胞5×106/只；移植后的第3天、第6天和第9天分别经尾静脉注射1×107的vec-T细胞或CAR-T细胞(见图13A)，vector、19CAR、20CAR、tan1920CAR、tan2019CAR小鼠的中位生存期分别为23天、28天、30天、27天和31天。生存曲线如图13B所示，计算两组生存期差异发现，tan2019CAR-T组可以延长小鼠的生存期。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）
<120> 同时靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体及其应用
<130> NZ200274
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1 .0
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
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Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
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Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser
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Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val
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Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro
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Leu Thr Val Ser Ser
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<210> 2
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial
<400> 2
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser
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Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln
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Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val
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Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
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Leu Thr Val Ser Ser Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala
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Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
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Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp
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Ser
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Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala
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405 410 415
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Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Gln Leu Ser
435 440 445
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asn
450 455 460
Tyr Gly Asn Phe Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
465 470 475 480
Thr Val Thr Val Ser Ser
485
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 8
<211> 2283
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
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ttctgcgcca gaaagaccat cagcagcgtg gtggacttct acttcgacta ctggggacaa 780
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ctggttatca ccctttactg caaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 1860
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1920
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cgc 2283
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<213> Artificial
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65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln
100 105 110
Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly
130 135 140
Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala
145 150 155 160
Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr
165 170 175
Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly
180 185 190
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195 200 205
Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser
210 215 220
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Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
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Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
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Ser Thr Lys Gly Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
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Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
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<213> Artificial
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195 200 205
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ggaagtacaa gcggtagcgg aaaacccggc tctggagaag gatcaacaaa aggt 54

Claims (25)

1.编码同时靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含胞外区、跨膜区和胞内信号转导区，其特征在于，其编码的所述胞外区包含CD19和CD20结合结构域，其中，其编码的所述CD19和CD20结合结构域由所述CD19的单链抗体可变区片段和所述CD20的单链抗体可变区片段通过连接序列连接组成，所述CD19和CD20结合结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO.3-6所示。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞外区还包含构建在所述的嵌合抗原受体氨基末端的信号肽，所述信号肽为CD8α中的信号肽序列或GM-CSF。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述信号肽为如SEQ IDNO.7所示的信号肽。
4.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述CD19和CD20结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接；所述跨膜区为选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB或CD154。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述铰链区为CD8α中的铰链区序列。
6.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，其编码的所述胞内信号转导区还包含共刺激因子。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过MHC I类分子的氨基酸序列获得的功能性信号结构域。
8.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过TNF受体蛋白的氨基酸序列获得的功能性信号结构域。
9.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过免疫球蛋白样蛋白质的氨基酸序列获得的功能性信号结构域。
10.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过细胞因子受体的氨基酸序列获得的功能性信号结构域。
11.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过整联蛋白的氨基酸序列获得的功能性信号结构域。
12.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过淋巴细胞活化信号分子的氨基酸序列获得的功能性信号结构域。
13.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过活化NK细胞受体的氨基酸序列获得的功能性信号结构域。
14.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过Toll配体受体的氨基酸序列获得的功能性信号结构域。
15.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为通过选自以下蛋白质的氨基酸序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：BTLA、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。
16.根据权利要求15所述的核酸分子，其特征在于，所述共刺激因子为CD28或4-1BB。
17.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ IDNO.8-11所示。
18.同时靶向CD19和CD20的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由权利要求1～17中任意一项所述的核酸分子编码。
19.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.13-16所示。
20.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求1～17中任意一项所述的核酸分子。
21.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求1～17中任意一项所述的核酸分子、如权利要求18或19所述的嵌合抗原受体或如权利要求20所述的载体。
22.如权利要求1～17中任意一项所述的核酸分子、如权利要求18或19所述的嵌合抗原受体、如权利要求20所述的载体或如权利要求21所述的细胞在制备抗B细胞血液肿瘤药物中的应用。
23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述B细胞血液肿瘤为B细胞淋巴瘤或急性B淋巴细胞白血病。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述B细胞血液肿瘤为同时表达CD19和CD20的B细胞血液肿瘤，或患者经CD19 CAR-T治疗后因抗原变异而复发或无效的B细胞血液肿瘤。
25.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～17中任意一项所述的核酸分子、如权利要求18或19所述的嵌合抗原受体、如权利要求20所述的载体或如权利要求21所述的细胞，以及药学上接受的载体。
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