CN110981970B

CN110981970B - 一种靶向nkg2d配体和cd19的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN110981970B
Application number: CN201911352437.0A
Authority: CN
Inventors: 张坤
Original assignee: Sinoneural Shanghai Cell And Gene Engineering Holdings Co ltd
Current assignee: Sinoneural Shanghai Cell And Gene Engineering Holdings Co ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110981970A

Abstract

本发明公开了一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用，属于肿瘤免疫药物领域。所述双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区、连接片段、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，该双靶点嵌合抗原受体不仅能够特异性识别靶向NKG2D配体或CD19抗原这两个单个靶点表达的肿瘤细胞，还可以识别靶向NKG2D配体和CD19抗原共同表达的肿瘤细胞，该双靶点的CAR‑T具有更强的抗肿瘤活性，能够避免低丰度抗原表达的阳性肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低了复发风险。

Description

一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫药物领域，特别涉及一种NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，据不完全统计，目前中国的恶性肿瘤年发病病例达到400多万例，其中，血液肿瘤的发病率不断提高，发病年龄也有所提前，发病人群从过去的以中老年人居多，逐步扩散到年轻患者中，这可能与现代人生活压力大、环境污染加剧、生活习惯不健康等因素有关。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术是近些年发展非常迅速的一种细胞治疗技术。目前，虽然在CD19CAR-T细胞取得了很大的成功，但是接受CD19CAR-T细胞治疗后的病患中，多达三分之二的患者会出现CD19表达丧失导致抗原逃逸、肿瘤细胞继续生长而表现癌症复发的情况。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体，所述双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区、连接片段、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述靶向CD 19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：3所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

具体地，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

进一步地，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

具体地，所述连接片段为(G₄S)n或(EAAAK)n，n为1、2或3。

进一步地，所述连接片段为(G₄S)，n为1，所述连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

另一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括载体和上述的双靶点嵌合体抗原受体。

具体地，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、电转导载体或睡美人转座子载体。

又一方面，本发明提供了一种上述的表达载体的应用，所述应用包括：将所述表达载体作为抗B细胞系恶性血液肿瘤的药物。

具体地，所述抗B细胞系恶性血液肿瘤包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用，该双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区、连接片段、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，该双靶点嵌合抗原受体不仅能够特异性识别靶向NKG2D配体或CD19抗原这两个单个靶点表达的肿瘤细胞，还可以识别靶向NKG2D配体和CD19抗原共同表达的肿瘤细胞，该双靶点的CAR-T具有更强的抗肿瘤活性，能够避免低丰度抗原表达的阳性肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低了复发风险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例一提供的双靶点嵌合抗原受体的结构示意图；

图2是本发明实施例二提供的双靶点嵌合抗原受体(CART02)的双酶切鉴定图；

图3是本发明实施例二提供的慢病毒转染效率图；

图4是本发明实施例二提供的细胞因子IFNγ分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；

图5是本发明实施例二提供的细胞因子IL-2分泌量的对比图，其中，CAR-T为转染CAR结构的CAR-T细胞，T为未转染的T细胞；

图6为本发明实施例二提供的细胞杀伤效率对比图，其中，A为本发明实施例提供的双靶点嵌合抗原受体构建的CART02细胞对Raji细胞的杀伤能力，B为传统CD19 CART细胞对Raji细胞的杀伤能力，横坐标为效应细胞与靶细胞的个数比，纵坐标为细胞杀伤效率，单位为％。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例一

本发明实施例提供了一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体，如图1所示，该双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽(人CD8α信号肽，CD8α leader)、靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区(NKG2D ECD)、连接片段(linker)、靶向CD19的单链抗体(CD19scFv)、加长的CD8α铰链区(人

CD8α铰链区，CD8α Hinge)、跨膜区(人CD8α跨膜区，CD8α transmembrane)、共刺激因子和胞内信号肽(人CD3ζ胞内信号肽，CD3ζsignal)，信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：1所示，所述靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

具体地，共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

在本实施例中，共刺激因子为4-1BB(4-1BB signal)，且共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。

具体地，连接片段为(G₄S)n或(EAAAK)n，n为1、2或3。

在本实施例中，连接片段为(G₄S)n，且n为1，具体地，该连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

从NCBI网站数据库搜索到人CD8α信号肽、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜区、4-1BB的胞内区、人CD3ζ胞内信号肽的基因序列信息，NKG2D胞外区和靶向CD19的单链抗体的重链和轻链可变区，将上述序列在网站http：//sg.id tdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。基因全合成双靶点嵌合抗原受体基因序列，结构为CD8α leader-NKG2D ECD-linker-CD19 scFv-CD8α Hinge-CD8αtransmembrane-(4-1BB signal)-CD3ζsignal，标记为CART02。

本实施例中，该双靶点嵌合抗原受体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示。相应地，该双靶点嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

实施例二

本发明提供了一种表达载体，表达载体包括载体和实施例一提供的双靶点嵌合抗原受体。具体地，载体可以为慢病毒载体、逆转录病毒载体、电转导载体或睡美人转座子载体。在本实施例中，载体为慢病毒载体。

下面简单介绍一下该表达载体的制备方法，具体如下：

通过PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)扩增并获得CART02基因序列，在CART02基因序列的两端分别添加酶切位点Xba I和酶切位点EcoR I，得到待酶切物，将其与慢病毒载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP分别进行Xba I和EcoR I的双酶切反应，得到含有CART02的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段。酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为30min。酶切体系(总体积50μL)包括：5μL的10×buffer；回收的待酶切物的DNA；2μL的Xba I酶；2μL的EcoR I酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。

将含有CART02的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段分别利用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有CART02的酶切片段和含有pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的酶切片段的条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中，然后将琼脂糖凝胶中的DNA纯化回收，得到CART02酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物。

将得到的CART02酶切产物和pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物在16℃下过夜连接，得到连接产物pCDH-EF1-(CART02)-T2A-copGFP，即表达载体。其中，总体积为10μL的连接体系包括：1μL的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP酶切产物、7μL的CART02酶切产物、1μL的T4DNA连接酶和1μL的10×T4 DNA连接酶Buffer。

将连接产物转入Stbl3感受态细胞(购买于TRANSGEN BIOTECH)中，具体方法如下：

取出保存在-80℃冰箱中的Stb13感受态细胞，并置于冰上解冻。将连接产物加入Stbl3感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热击45s，然后再冰浴2min，得到转化产物。

将转化产物加入700μL未添加抗生素的液体LB培养基中，于37℃下摇床的转速为200rpm，发酵培养45min，得到发酵液。未添加抗生素的液体LB培养基的制备方法包括：取5g进口酵母提取物、10g进口蛋白胨、10g无水氯化钠和1L无菌水混匀后，经121℃灭菌20min后使用。

将发酵液经过4000rpm离心5min，弃去上清液，保留沉淀物，将沉淀物采用100μL的液体LB培养基进行重悬，得到重悬液。

将重悬液涂抹至Amp抗性的固体LB平板培养基(购自上海科玛嘉微生物技术有限公司)上，将固体LB平板培养基置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养。

在固体LB平板培养基上挑取阳性克隆。

鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：

将得到的阳性克隆经Xba I和EcoR I双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将由阳性克隆获得的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，结果如图2所示，由图2可知获得了大小约为2000bp的目标片段。经测序鉴定可确定该目标序列为CART02基因序列。

提取质粒：将测序正确的阳性克隆制备成原始菌液接种至100mL的Amp抗性的液体LB培养基中，于37℃下，摇床转速为200rpm，进行过夜培养，得到原始菌发酵液。

将原始菌发酵液经过4000rpm离心10min，弃去上清液，保留沉淀物(菌体)。

采用无内毒素质粒大提试剂盒(购买于天根公司)提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。

慢病毒载体质粒包装：在转染前6h，以每皿约8.5×10⁶个细胞将293T细胞接种至直径为10cm的培养皿中。确保转染时细胞的汇合度在80％左右，且均匀分布于培养皿中。

制备溶液A和溶液B，其中，溶液A包括：4mL的2×HEPES buffer缓冲液(8个培养皿一起包装的量)，溶液B包括：72μg质粒(target plasmid)、37.04μg包装质粒PLP1、34.8μg包装质粒PLP2、24.08μg包装质粒PLP-VSVG和400μL 2.5M钙离子溶液，溶液B的总体积为4mL。充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，向溶液A中逐滴加入溶液B，静置3～5min，得到混合液。轻轻涡旋混合液，将混合液逐滴加入含293T细胞的培养皿上，每个培养皿中加入1mL该混合液，轻轻前后晃动培养皿使混合液均匀分布在培养皿的表面(注意晃动时不要旋转培养皿)，将培养皿放置于37℃培养箱中培养。培养12h后，更换新鲜的培养基，继续培养。培养48h后，将培养基经过1500rpm离心5min后保留上清液，收集含慢病毒载体质粒的上清液，将上清液用规格为0.45μm的滤膜过滤，得到含慢病毒载体质粒的滤液。

将含慢病毒载体质粒的滤液转移至超速离心管中，在超速离心管的底部小心地铺上一层浓度为20％的蔗糖(每8mL含慢病毒载体质粒的滤液加1mL蔗糖)。以PBS(phosphatebuffer saline，磷酸缓冲盐溶液)平衡超速离心管，在4℃下于27600rpm离心2h，小心取出超速离心管，倒掉上清液，倒置该超速离心管去掉残余上清液，保留沉淀物。向超速离心管中加入150μL PBS，使用微量移液枪在超速离心管的底部轻轻吹打几次，使沉淀物溶解在PBS中，得到浓缩的慢病毒(双靶点嵌合抗原受体的基因质粒载体)，在实现时可将浓缩的慢病毒分装于离心管，置于-80℃保存。

慢病毒滴度检测：取浓缩的慢病毒0.5μL、5μL和50μL分别感染293T细胞(1×10⁵个/孔)24h，24h后换液，72h后提取细胞基因组DNA，并将基因组DNA浓度稀释至5～100ng/μL。采用TransLv^TM Lentivirus qPCR Titration Kit(购自TransGen)，具体方法按照其说明书进行。经检测可知该慢病毒滴度为2.8×10⁸TU/mL。

制备双靶点嵌合抗原受体的T细胞，具体方法如下：

PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞)的制备：采集志愿者20mL外周血，将外周血加入至含有肝素的50mL离心管中，经过2000rpm离心10min，将上层血浆转移至新的离心管内冻存。向离心管中加入与沉淀等体积的37℃预热的生理盐水，充分混匀，进行血细胞沉淀重悬，得到重悬细胞液。另取一只50mL离心管，加入20mL预温的淋巴细胞分离液。将20mL重悬细胞液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。于800rpm离心20min。匀速吸去上层血浆，当血浆距白膜层2～3em时停止吸去血浆，然后快速吸去白膜层细胞，并转移至另一新的50mL离心管中，用生理盐水将其体积补充至45mL，于1200rpm离心5min，重复2次，用于清洗细胞。使用RPMI1640+浓度为10％的FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算T细胞数量。在本实施例中，T细胞数量为1.2×10⁷个。

慢病毒转染人的T细胞：在本实施例中，将T细胞密度调整到1×10⁶/mL，将T细胞按照1mL/孔接种到含抗人CD3抗体和CD28抗体的激活剂中(购买于STEMCELL TECHNOLOGIES)，再加入200IU/mL的白细胞介素2，刺激培养48h。T细胞活化培养两天后，将慢病毒以MOI＝10的感染系数进行转染，并添加终浓度为8μg/mL的polybrene，于37℃培养培养箱中培养。转染24h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为8～13天。得到转染的CAR-T细胞。

慢病毒转染效率检测：转染完成后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。吸取转染的CART02细胞，于1500rpm离心5min收集沉淀物，将沉淀物用生理盐水洗涤。使用流式细胞仪FITC通道检测转染的CAR-T细胞的表达GFP荧光的细胞比例。其转染效率如图3所示。

CART02细胞的细胞因子分泌检测，具体如下：

为了检测经过慢病毒转染后的CART02细胞是否被有效激活，本实施例采用CART02细胞和不表达CAR的T细胞分别与靶细胞共培养，然后通过ELISA试剂盒检测细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2的分泌量。具体地，分为2组：第一组，将每孔1×10⁶个效应细胞(表达CART02的T细胞)和每孔1×10⁵个靶细胞(含NKG2D配体和CD19靶蛋白的Raji细胞)接种至6孔板中共培养，做3个重复；第二组，每孔1×10⁶个效应细胞(不表达CAR的T细胞)和每孔1×10⁵个靶细胞(含NKG2D配体和CD19靶蛋白的Raji细胞)接种至6孔板中共培养，做3个重复；将第一组和第二组分别于37℃、浓度为5％的CO₂中培养24h。吸取培养的上清液，于1500rpm离心5min去除细胞沉淀，收获上清液。按照ELISA剂盒说明书检测培养上清液中的细胞因子IFNγ和细胞因子IL-2。如图4和图5所示，图4为细胞因子IL-2分泌量的对比图，图5为细胞因子IFN γ分泌量的对比图。结合图4和图5可知，该经过CART02慢病毒转染后的CAR-T细胞已经被有效激活。

体外抗肿瘤效果比较，具体操作如下：

将本发明实施例提供的双靶点嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞记作CART02，将传统靶向CD19构建的CAR-T细胞记作CD19 CART，其中，CD19 CART的序列如序列表中SEQ IDNO：11所示。①组：在96孔板中取其中40个孔并分成八个小组，每个小组设置五个复孔，第一组中均只加入200μL培养基(记作Ab)，第二组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁴个靶细胞(记作Ack)，第三组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第四组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝1∶1)，第五组中均加入100μL培养基和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作Acn)，第六组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 5×10⁴个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝5∶1)，第七组中均加入100μL培养基和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作Acn)，第八组中均加入100μL 1×10⁴个靶细胞和100μL 1×10⁵个效应细胞(记作As，效应细胞个数∶靶细胞个数＝10∶1)。①组靶细胞为Raji细胞，效应细胞为本实施例构建的CART02细胞。

②组：将96孔板另外的40个孔分成八个小组，每个小组设置五个复孔，分组方法与①组相同，且②组的靶细胞为含Raji细胞，效应细胞为传统的CD19CART。

将96孔板孵育过夜后每孔加入20uL的CCK-8溶液，将96孔板在培养箱内再孵育2～3h。用酶标仪在450nm处测定吸光度。根据吸光度分别计算①组和②组的细胞杀伤效率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100％，式中，As为试验孔(含有靶细胞的培养基、效应细胞和CCK-8)，Ack为靶细胞对照孔(含有靶细胞的培养基和CCK-8溶液)，Acn为效应细胞对照孔(含有效应细胞的培养基、CCK-8溶液)，Ab为空白对照(不含细胞的培养基和CCK-8溶液)。图6为本发明实施例提供的细胞杀伤效率对比图，如图6所示，本发明实施例提供的靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体构建的CART02细胞对Raji细胞杀伤能力明显优于传统的CD19构建的CAR-T细胞。由此可见，本发明实施例提供的表达载体具有更强的抗肿瘤活性。

又一方面，本发明实施例提供了本发明实施例一提供的双靶点嵌合抗原受体的应用，该应用包括：将表达载体作为抗B细胞系恶性血液肿瘤的药物。

具体地，抗B细胞系恶性血液肿瘤包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。

本发明实施例提供了一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用，该双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区、连接片段、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，该双靶点嵌合抗原受体不仅能够特异性识别靶向NKG2D配体或CD19抗原这两个单个靶点表达的肿瘤细胞，还可以识别靶向NKG2D配体和CD19抗原共同表达的肿瘤细胞，该双靶点的CAR-T具有更强的抗肿瘤活性，能够避免低丰度抗原表达的阳性肿瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低了复发风险。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司

<120> 一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体及其表达载体和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60

aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120

gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180

gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240

acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300

attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360

aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405

<210> 3

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggactaagt tggaaataac aggctccacc tctggatccg gcaagcccgg atctggcgag 360

ggatccacca agggcgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 420

cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 480

tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 540

accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 600

agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 660

gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 720

gtcaccgtct cctca 735

<210> 4

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggccgcat tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 60

ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 120

cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 180

atctgggcg 189

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 60

cacaggaac 69

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 7

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcggtggcg gttct 15

<210> 9

<211> 1938

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120

aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180

tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240

gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300

ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360

ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420

gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtggg cggtggcggt 480

tctgacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 540

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 600

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 660

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 720

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 780

ggggggacta agttggaaat aacaggctcc acctctggat ccggcaagcc cggatctggc 840

gagggatcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 900

tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 960

agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 1020

gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 1080

aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 1140

tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 1200

tcagtcaccg tctcctcagc ggccgcattc gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc 1260

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 1320

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1380

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1440

tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac aggaacaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1500

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1560

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1620

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1680

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1740

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1800

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1860

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1920

caggccctgc cccctcgc 1938

<210> 10

<211> 646

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro Leu Pro Ala Gly Gly Val Gly Ile Pro Leu Thr

20 25 30

Gly Ser Thr Cys Gly Pro Cys Pro Leu Ala Thr Ile Cys Thr Leu Ala

35 40 45

Ala Cys Thr Gly Pro Pro Ala Gly Ser Leu Ala Thr Thr Gly Ser Gly

50 55 60

Ala Ser Cys Met Ser Gly Ala Ala Ser Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu

65 70 75 80

Gly Ala Gly Ala Leu Leu Leu Leu Val Leu Ser Thr His Thr Met Gly

85 90 95

Leu Val His Ile Pro Thr Ala Gly Ser Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ser

100 105 110

Ile Leu Ser Pro Ala Leu Leu Thr Ile Ile Gly Met Gly Leu Gly Ala

115 120 125

Cys Ala Leu Thr Ala Ser Ser Pro Leu Gly Thr Ile Gly Ala Cys Ser

130 135 140

Thr Pro Ala Thr Thr Ile Cys Met Gly Ala Thr Val Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Ala Ile Gly Met Thr Gly Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu

165 170 175

Gly Ala Ala Val Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Ile Ser Leu

180 185 190

Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu

195 200 205

Ile Thr His Thr Ser Ala Leu His Ser Gly Val Pro Ser Ala Pro Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Thr Ser Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ala Ile Ala Thr Thr Pro Cys Gly Gly Gly Ala Thr Leu Pro

245 250 255

Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Thr Gly Ser Thr Ser

260 265 270

Gly Ser Gly Leu Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Leu Gly Gly Val

275 280 285

Leu Leu Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly Ser Leu

290 295 300

Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Ala Thr Gly Val

305 310 315 320

Ser Thr Ile Ala Gly Pro Pro Ala Leu Gly Leu Gly Thr Leu Gly Val

325 330 335

Ile Thr Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala Leu Leu Ser Ala

340 345 350

Leu Thr Ile Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ser Gly Val Pro Leu Leu Met

355 360 365

Ala Ser Leu Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr Cys Ala Leu His

370 375 380

Thr Thr Thr Gly Gly Ser Thr Ala Met Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr

385 390 395 400

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Pro

405 410 415

Ala Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Thr Pro Ala Pro

420 425 430

Thr Ile Ala Ser Gly Pro Leu Ser Leu Ala Pro Gly Ala Cys Ala Pro

435 440 445

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Ala Gly Leu Ala Pro Ala Cys Ala

450 455 460

Ile Thr Ile Thr Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

465 470 475 480

Ser Leu Val Ile Thr Leu Thr Cys Ala His Ala Ala Leu Ala Gly Ala

485 490 495

Leu Leu Leu Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met Ala Pro Val Gly

500 505 510

Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro Pro Gly Gly Gly

515 520 525

Gly Gly Gly Cys Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala

530 535 540

Pro Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu

545 550 555 560

Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala

565 570 575

Pro Gly Met Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu

580 585 590

Thr Ala Gly Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile

595 600 605

Gly Met Leu Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr

610 615 620

Gly Gly Leu Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met

625 630 635 640

Gly Ala Leu Pro Pro Ala

645

<210> 11

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacta agttggaaat aacaggctcc acctctggat ccggcaagcc cggatctggc 420

gagggatcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480

tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540

agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600

gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660

aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720

tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 780

tcagtcaccg tctcctcagc ggccgcattc gtgccggtct tcctgccagc gaagcccacc 840

acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 900

ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 960

ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1020

tcactggtta tcacccttta ctgcaaccac aggaacaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1080

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260

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ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgc 1518

Claims

1.一种靶向NKG2D配体和CD19的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述双靶点嵌合抗原受体包括：依次连接的信号肽、靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区、连接片段、靶向CD19的单链抗体、加长的CD8α铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述靶向NKG2D配体的NKG2D胞外区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述靶向CD19的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，所述加长的CD8α铰链区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示，所述跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述胞内信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：6所示。

2.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子包括：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2D和B7-H3中的至少一种。

3. 根据权利要求2所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激因子为4-1BB，且所述共刺激因子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：7所示。

4.根据权利要求1所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述连接片段为(G4S)n或(EAAAK)n，n为1、2或3。

5. 根据权利要求4所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述连接片段为(G4S)n，n为1，所述连接序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：8所示。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括载体和如权利要求1～5任一项所述的双靶点嵌合体抗原受体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、电转导载体或睡美人转座子载体。

8.一种如权利要求6或7所述的表达载体在制备药物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述表达载体作为抗B细胞系恶性血液肿瘤的药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗B细胞系恶性血液肿瘤包括：非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤。