CN111440245A - 一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体t淋巴细胞 - Google Patents

一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体t淋巴细胞 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞，是使用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的嵌合抗原修改制备的。本发明通过筛选，最终获得一个全新的、靶向实体瘤靶点Claudin18.2的嵌合抗原受体序列。该嵌合抗原插入pLVX‑IRES‑Neo慢病毒表达载体中，使用P3代293T细胞包装慢病毒；有效扩增的T细胞铺板48h后，加入慢病毒感染，获得修饰性的T细胞。利用流式细胞术，检测嵌合抗原受体的表达效率；并将构建成功的修饰性T细胞与Claudin18.2阳性表达的胰腺癌肿瘤细胞共培养，修饰的T细胞对PANC‑1细胞具有显著的杀伤效果。结果表明：构建的靶向实体瘤的CAR‑T细胞，可用于治疗Claudin18.2阳性表达的胰腺癌，胃癌和食管癌等恶性肿瘤。

Description

一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，是一种有效杀伤恶性肿瘤的免疫疗法。该疗法近几年取得重大进展，现已在白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗取得显著疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
目前，CAR-T技术已发展到第四代。CAR-T疗法中的CAR分子由胞外抗原结合区、跨膜区和胞内区组成。胞外抗原结合区由信号肽和识别靶抗原的单链抗体(scFV)片段组成。胞内区由共刺激分子和信号传导区组成。第四代CAR分子加入了调控开关。据统计，目前临床上最常用的仍为第二代CAR分子。
Claudin 18.2在正常细胞中表达高度受限，但在多种实体瘤(胰腺癌、胃癌和食管癌等)中呈现过表达。Claudin蛋白结构中包括四个跨膜区、两个细胞外环，两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。当前，一些Claudin 18.2单克隆抗体药物也获得了临床试验批件。因此，开发针对靶向Claudin 18.2的CAR-T疗法，将为实体瘤的患者提供新的治疗手段。
实体瘤是一种实质性肿瘤，因其内富含血管和免疫抑制细胞，CAR-T只有进入实体瘤微环境中才能发挥抗肿瘤功能。为了协助CAR-T分子克服肿瘤微环境这一屏障，因此很有必要开发出新的研究方法和工艺，从而给实体瘤的临床治疗带来益处。
发明内容
本发明的目的是一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞，从而提高CAR-T的在实体瘤上的治疗效果，以弥补现有技术之不足。
本发明首先提供一种靶向Claudin18.2分子的嵌合抗原，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
编码上述嵌合抗原的核苷酸片段，其一种序列为SEQ ID NO:2。
本发明所提供的嵌合抗原用于制备慢病毒来修饰T淋巴细胞；
本发明另一个方面是提供一种使用上述嵌合抗原修饰的T淋巴细胞；
本发明所提供的嵌合抗原修饰的T淋巴细胞在制备用于治疗恶性肿瘤的制品中的应用；
所述的恶性肿瘤，为表达Claudin18.2的胰腺癌，胃癌和食管癌。
本发明通过筛选，最终获得一个全新的、靶向实体瘤靶点Claudin18.2的嵌合抗原受体序列。该嵌合抗原插入pLVX-IRES-Neo慢病毒表达载体中，使用P3代293T细胞包装慢病毒；有效扩增的T细胞铺板48h后，加入慢病毒感染，获得修饰性的T细胞。利用流式细胞术，检测嵌合抗原受体的表达效率；并将构建成功的修饰性T细胞与Claudin18.2阳性表达的胰腺癌肿瘤细胞(PANC-1)共培养，修饰的T细胞对PANC-1细胞具有显著的杀伤效果。结果表明：构建的靶向实体瘤的CAR-T细胞，可用于治疗Claudin18.2阳性表达的胰腺癌，胃癌和食管癌等恶性肿瘤。
附图说明
图1为实施例3中PLV-CARClaudin18.2重组表达载体示意图。
图2为实施例4中重组表达质粒的部分测序结果峰值图。
图3为实施例6中修饰性T细胞表面CAR分子的结构示意图。
图4为实施例7中流式检测CAR-T细胞表面CAR分子表达效率图。
图5为实施例8中流式检测CAR-T细胞与PANC-1共培养后的杀伤效率统计图。
图6为实施例9中共培养36h后，细胞因子TNF-a分泌水平的改变图。
图7为实施例9中共培养36h后，细胞因子IFN-γ分泌水平的改变图。
具体实施方式
为了对本发明所作进一步说明，下面将结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。本发明的实现方式并不仅限于实施方式所公开的内容与技术，因此凡对本方案技术所进行的等同替换，均在本发明的保护范围之内。
实施例1：人外周血单个核细胞(PBMC)分离与T细胞扩增
1.1人外周血PBMC的分离
采集供者外周血50ml，800g，离心10min。离心后可观察到分层现象。上层为血浆层，中间层为白膜层，最下端为红细胞层。用吸液管缓慢收集血浆层，56℃灭活30min。使用吸管小心抽吸白膜层细胞，加入PBS中，两者完全混匀；将淋巴分离液的加入15ml离心管中，再等体积加入PBS混合液。700g，离心15min。离心后小心抽吸离心管中间的白膜层细胞，加入PBS混匀清洗一次。离心后，弃PBS；再加入培养基重悬，再次清洗细胞。弃去培养基，加入新的培养基重悬PBMC细胞。
1.2：T细胞激活与扩增
(1)PBMC分离：将步骤1.1最终分离的PBMC全部加入T175cm2培养瓶，移入CO2培养箱中。
(2)2h后取出培养瓶，轻轻晃动，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜，移液器吸取细胞悬浮液转入新的培养瓶中，少许培养基清洗培养瓶将悬浮细胞全部收集。
(3)向新的培养瓶中加CD3/CD28磁珠，并加入IL-2(100U/ml)，混匀后移入培养箱中。
(4)第5日去磁珠，定期补液。取激活的T细胞，使用抗体CD4+和CD8+单克隆抗体染色，流式细胞仪上机鉴定T细胞的分型。流式鉴定结果表明，CD4+T和CD8+T表达效率分别为：63.4％和35.9％。细胞扩增效率明显，经过细胞计数可得细胞扩增倍数约为150倍。
实施例2：反转录获得PBMC中cDNA
(1)Trizol提取PBMC中总RNA：取2x106个PBMC细胞，加入1ml Trizol试剂。使用Takara的总RNA抽提试剂盒抽提PBMC中的RNA。
(2)反转录获得cDNA：使用上海生工生物工程股份有限公司的AMV第一链cDNA合成试剂盒反转录RNA。反转录体系如下：
逆转录反应体系 20μl
RNA样品 3μl
Oligo-dT primers 1μl
RNase free ddH<sub>2</sub>0 8μl
dNTPs(10mM) 4μl
RNase Inhibitor(40U/μl) 1μl
5×RT Buffer 2μl
AMV Reverse Transcriptase 2μl
反转录程序如下：
cDNA合成 42℃60min
终止反应 85℃5min(酶失活)处理后，冰上放置或-20℃保存
将反转录反应获得cDNA用于接下来的PCR扩增反应的模板。
实施例3：嵌合抗原CAR Claudin18.2重组载体的构建
3.1抗Claudin18.2单链抗体(scFV)基因序列的获得
人Claudin18.2蛋白免疫小鼠后纯化得到其抗体片段，分别对其修饰并构建为抗Claudin18.2的单链抗体；单链抗体由重链和轻链组成，重链与轻链之间的连接片段是GGGGSGGGGSGGGGS(3G4S)，最终经过效果筛选获得了与靶抗原Claudin18.2亲和力高的scFV抗体片段，其氨基酸序列如下：
KETDSLPQDFLAGMIGEYGPTSAELFEPGPYTQTWGACSADWCEVTGRLTCNEIYRTFRIGWPKEGRFLGVIDGFCLSDFEFLGYDFADSFCNEIPPKEWRTIGRFCLKGGGGSGGGGSGGGGSDMSDCPAVQTIIGWCREPYCYGRSMFPETLEPKELACDLIVCKMLQASNEFRNEIIGTGVTPEEIYAMCIRVYCLAEPETGWDLKEQRFIGTPKQFYDSTVCCMYCLAEYWYVIGTCMPAIQ；
其编码基因的核苷酸序列如下：
aaggagactgacagccttccccaggacttccttgcctggatgatcggagagtatggacccactagtgccgagctgttcgagcccggaccctacactcagacttggggagcctgcagtgccgactggtgcgaggtgactggaaggctgatttgcaacgagatctacaggactttcaggattggatggcccaaggaggggaggttcctgggagtgattgacggattctgcctgagtgacttcgagttcctgggatacgacttcgccgacagtttctgcaacgagatcccccccaaggagtggaggactatcggcaggttctgccttaagggaggaggaggtagtggaggaggaggtagtggaggaggaggtagtgacatgagtgactgccccgccgtgcagactatcatcggctggtgcaggcagccctactgctatggaaggagtatgttcccccagactcttgagcccaaggagcttgcctgcgaccttatcgtgtgcaagatgcttcaggccagtaacgagttcaggaacgagatcatcggcactggcgtgactcccgaggagatctatgccatgtgcatcagggtgtattgccttgcccagccccagactggctgggaccttaagcagggcaggttcatcggcactcccaagcagttctatgacagtactgtgtgctgcatgtattgccttgccaagtattggtatgtgatcggcacttgcgtgcccgccatccag。
3.2 PCR扩增CD8a信号肽、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、41BB和CD3ζ
(1)设计引物：使用Primer 5.0软件，设计PCR扩增所需的上下游引物。引物送往上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见下表：
Figure BDA0002446124950000061
(2)PCR反应体系(50μl)
本反应体系使用实施例2中逆转录反应获得的cDNA做为模板，PCR反应体系如下：
Figure BDA0002446124950000062
Figure BDA0002446124950000071
(3)PCR扩增程序
设定PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃2.5min；第2-4步重复32Cycles；72℃再延伸8min；4℃保温1小时。PCR反应液混匀后，置于PCR仪中进行扩增反应。
(4)PCR产物鉴定、纯化和测序
PCR扩增程序完成后，将PCR产物加入加样孔中，进行1％琼脂糖电泳鉴定。胶回收试剂盒回收与目的片段一致的PCR产物，并送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序；与目的片段序列一致的PCR产物，将用于嵌合抗原受体基因序列的连接反应。
PCR获得CD8a信号肽片段，其氨基酸序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP；其核苷酸序列为：atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg。
PCR获得CD8a铰链区片段：其氨基酸序列为：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；其核苷酸序列为：accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat。
PCR获得CD8a跨膜区片段：其氨基酸序列为：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；其核苷酸序列为：atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc。
PCR获得41BB胞内区片段：其氨基酸序列为：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；其核苷酸序列为:aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg。
PCR获得CD3ζ胞内区片段：其氨基酸序列为：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；其核苷酸序列为：agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccaaaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。
3.3 CD8a-hClaudin 18.2scFV-CD8aHM-CD8aTM-41BB-CD3ζ基因序列的连接
(1)重叠延伸PCR技术扩增CD8a信号肽-hClaudin 18.2scFV
向扩增体系中加入CD8a信号肽的上游引物和scFV的下游引物，以CD8a信号肽和靶点PCR纯化片段为模板，PCR扩增体系和扩增程序参照步骤3.2。将获取的PCR扩增产物纯化后，送往公司测序获得CD8a信号肽-hClaudin 18.2scFV片段。
(2)重叠延伸PCR技术扩增CD8a HM–CD8a TM-41BB-CD3ζ：PCR扩增方法参照步骤3.2。
该反应以步骤3.2获得的PCR产物CD8a HM、CD8a TM、41BB、CD3ζ四个片段为模板，分别使用CHF和CTR引物以及LF和D3R引物来进行PCR扩增,最终获得CD8a HM–CD8a TM-41BB-CD3ζ片段。
(3)重叠延伸PCR技术获得CAR序列
向扩增体系中加入CD8a信号肽上游引物和CD3ζ下游引物，以CD8a信号肽-hClaudin 18.2scFV和CD8a HM–CD8a TM-41BB-CD3ζPCR纯化片段为模板，扩增方法参照步骤3.2，获得的嵌合抗原的氨基酸序列如下：
MALPVTALLLPLALLLHAARPKETDSLPQDFLAGMIGEYGPTSAELFEPGPYTQTWGACSADWCEVTGRLTCNEIYRTFRIGWPKEGRFLGVIDGFCLSDFEFLGYDFADSFCNEIPPKEWRTIGRFCLKGGGGSGGGGSGGGGSDMSDCPAVQTIIGWCREPYCYGRSMFPETLEPKELACDLIVCKMLQASNEFRNEIIGTGVTPEEIYAMCIRVYCLAEPETGWDLKEQRFIGTPKQFYDSTVCCMYCLAEYWYVIGTCMPAIQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGPKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNELYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKMAEAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:1)
其编码基因的核苷酸序列如下：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgaaggagactgacagccttccccaggacttccttgcctggatgatcggagagtatggacccactagtgccgagctgttcgagcccggaccctacactcagacttggggagcctgcagtgccgactggtgcgaggtgactggaaggctgatttgcaacgagatctacaggactttcaggattggatggcccaaggaggggaggttcctgggagtgattgacggattctgcctgagtgacttcgagttcctgggatacgacttcgccgacagtttctgcaacgagatcccccccaaggagtggaggactatcggcaggttctgccttaagggaggaggaggtagtggaggaggaggtagtggaggaggaggtagtgacatgagtgactgccccgccgtgcagactatcatcggctggtgcaggcagccctactgctatggaaggagtatgttcccccagactcttgagcccaaggagcttgcctgcgaccttatcgtgtgcaagatgcttcaggccagtaacgagttcaggaacgagatcatcggcactggcgtgactcccgaggagatctatgccatgtgcatcagggtgtattgccttgcccagccccagactggctgggaccttaagcagggcaggttcatcggcactcccaagcagttctatgacagtactgtgtgctgcatgtattgccttgccaagtattggtatgtgatcggcacttgcgtgcccgccatccagaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc(SEQ ID NO:2)。
3.4携带嵌合抗原受体重组载体的构建
在CD8a信号肽上游引物头端依次加入EcoRI酶切位点(GAATTC)、KozaK序列(GCCACC)；在CD3ζ末端加入BamHI限制性酶切位点(GGATCC)。分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切pLVX-IRES-Neo空载和CAR扩增片段，使用胶回收试剂盒纯化酶切片段。再通过T4连接酶作用，完成重组载体的构建。重组表达载体示意图见图1，如图1所示将扩增的PCR片段(CAR序列)插入多克隆酶切位点(MSC)，再次送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测序成功的重组质粒用于实施例4中质粒的提取和实施例5中慢病毒的包装。
实施例4:重组质粒的提取与测序
(1)转化：分别高压LB液体、LB固体培养基和三蒸水，超净台中分别制备无抗性LB平板和Amp抗性的LB平板。转化空载质粒和重组质粒。
(2)第2日观察平板上单克隆菌落生长情况。挑取成功转化的单克隆菌落，接种于10ml含有Amp的LB液体培养基中。37℃，200rpm/min振荡培养过夜。
(3)菌液培养14h后，停止摇菌。使用北京天根生物无内毒素质粒试剂盒抽提质粒；此后对抽提的质粒进行1％琼脂糖电泳，观察质粒抽提效果。
(4)质粒双酶切：取限制性内切酶EcoRI和BamHI进行酶切重组质粒2h，将酶切混合液进行1％琼脂糖电泳，观察重组质粒酶切结果。由电泳图可判定质粒双酶切后形成两条带。将酶切成功的质粒送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。部分测序结果见附图2，经过BlAST比对，测序结果与目的片段的核苷酸序列完全一致。此时测序成功的质粒将用于包装慢病毒。
实施例5：慢病毒包装及浓缩
5.1 293T细胞复苏
(1)提前温浴无菌水和培养基。从液氮中取出293T细胞，立即置于37℃水浴中，边晃动边观察冻存管内细胞溶解状态。溶解充分后，对冻存管表面喷洒75％酒精，擦拭酒精后迅速移入生物安全柜中。
(2)将1ml细胞冻存液移入已加有预热的9ml培养基离心管中，两者轻轻混匀；混匀后100g，离心5min。
(3)弃上清，加入一定体积的完全培养基，混匀吹打成单细胞状态，之后将其移入培养瓶中。
(4)第2日，镜下观察复苏后的细胞状态，并弃去原液，更换为新的完全培养基。
5.2.293T细胞传代
(1)细胞融合度至80％-90％时，37℃下胰酶消化细胞。弃胰酶，加入4ml培养基终止消化，再加入预热的PBS充分吹打细胞；此后将细胞液移入15ml离心管中，100g，离心5min。
(2)弃上清，加入完全培养基混匀后，计数并分瓶。
(3)再次传代后，离心弃上清。重悬细胞将用于慢病毒的包装。
5.3慢病毒包装、滴度测定及浓缩
(1)T100B包被10cm细胞培养皿，37度孵育4h。
(2)胰酶消化293T细胞，加入无抗生素的完全培养基吹打细胞数次，并进行计数，每个10cm细胞培养皿接种3.7x106个细胞。
(3)第2日，待细胞密度达到70％-80％，细胞状态良好，可进行慢病毒包装。分别将空载质粒和重组质粒转染液轻柔加入平皿中，边晃动边加入，37℃培养6-8h，更换为完全培养基。
(4)收集转染后48h和72h病毒液，离心后，取上清进行病毒滴度测定。
(5)病毒浓缩：取离心后的病毒上清液进行浓缩。暂不使用的浓缩病毒液，等量分装后置于-80℃冰箱保存。
实施例6：慢病毒感染T细胞
(1)PBMC分离步骤同1.1。
(2)将分离的PBMC细胞静置2h后，轻轻晃动培养瓶，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜，吸取细胞悬浮液转入新的培养瓶中。
(3)向新的培养瓶中加入CD3/CD28磁珠，并加入IL-2(100U/ml),混匀后移入培养箱中。
(4)次日，调整细胞密度至0.5x106个/ml，加入实施例5制备的病毒液(MOI＝5)，polybrene终浓度8μg/ml，混匀后，2000rpm离心1h。离心后重悬混合液，移入培养袋中。每隔两天进行补液，IL-2维持浓度为100U/ml。
(5)第5日去磁珠，定期补液并观察细胞生长情况。
(6)第7日，使用流式细胞仪检测慢病毒感染细胞中的CAR分子表达效率、并对细胞进行内毒素、血平板和支原体的检测。获得的修饰性T细胞表面CAR分子的结构示意图见于附图3。此结构示意图参见于重组质粒的构建方法。
(7)第9日，取T淋巴细胞与PANC-1细胞共培养，检测CAR-T细胞对PANC-1细胞的杀瘤能力。
实施例7修饰性T细胞表面CAR分子的表达效率检测：
(1)病毒感染96h后，取1x106个细胞，400g，离心5min，取出上清用于内毒素、血平板和支原体的检测；向细胞沉淀中再加入1ml PBS溶液，涡旋混匀后离心去上清。
(2)加入100ul PBS溶液，轻柔悬浮细胞沉淀，加入抗体Goat F(ab')2Anti-MouseIgG(Fab’)2(PE)，4度避光孵育1h。
(3)1000rpm，离心5min，去上清；再加入1ml PBS溶液，再次离心去上清。
(4)加入100ul PBS溶液，轻柔悬浮细胞。流式细胞仪上机检测T细胞表面CAR分子的表达效率。CAR分子表达效率见于附图4，如图所示，T细胞表面的CAR表达效率约为69.72％。
(5)分别使用内毒素检测试剂盒、血平板和支原体检测试剂盒进行检测，检测结果均为阴性。
实施例8流式鉴定CAR-T细胞对PANC-1细胞体外杀伤检测
慢病毒感染一周后，取感染的T细胞与PANC-1(Claudin18.2阳性表达)体外共培养。24孔板中，每孔取0.2x106个T细胞，T细胞与PANC-1以3:1效靶比进行共培养。每组均设实验组和对照组，实验组为CAR-T细胞，对照组为空载体包装的慢病毒感染后的T细胞。分别以3：1比例进行共培养24h，36h和48h，其后收集细胞进行流式鉴定靶细胞比例的变化(Claudin18.2抗体鉴定)，从而判定T淋巴细胞的杀伤作用；杀伤结果见图5。收集两者以3：1效靶比共培养的上清，离心后进行细胞因子水平的测定。如附图5所示，共培养24h后，对照组(Control)细胞和实验组(CAR-T)细胞对PANC-1的杀伤率分别为：51.19％和86.11％；共培养36h后Control组细胞和CAR-T细胞对PANC-1的杀伤率分别为：39.68％和88.89％；共培养48h后对Control组细胞和CAR-T细胞对PANC-1的杀伤率分别为：46.82％和95.23％；这提示实施例中构建的CAR-T细胞对PANC-1(Claudin18.2阳性表达)细胞具有良好的杀伤效果。
实施例9：CAR-T细胞与PANC-1细胞共培养后，TNF-a和IFN-γ细胞因子分泌水平的改变
将上清稀释7倍用于测定细胞因子TNF-a的分泌水平，同时将上清稀释45倍用于测定IFN-r的分泌水平。使用ELASA试剂盒测定细胞因子分泌水平。
(1)提前20分钟将即用试剂从试剂盒中取出，平衡至室温。配制如下浓度的标准品：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、0pg/ml。
(2)根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目。样品(含标准品)和空白孔均做三个复孔。
(3)加样：100μL/孔加入稀释后的Cytokine standard至标准品孔，100μL/孔加入样本至样本孔，100μL/孔加入Dilution buffer R(1x)至空白对照孔。
(4)加检测抗体：50μL/孔加入Bitotinylated antibody工作液。混匀后盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育1小时。
(5)扣去孔内液体，300μL/孔加入1xWashing buffer工作液；停留1分钟后弃去孔内液体。重复3次，每一次在滤纸上扣干。
(6)加酶：100ul/孔加入Streptavidin-HRP工作液。盖上封板膜，室温(18-25℃)孵育20分钟。
(7)洗板：重复步骤5。
(8)显色：100μL/孔加入TMB，室温避光孵育20-30分钟，根据孔内颜色的深浅来判定终止反应。
(9)终止反应：100μL/孔迅速加入Stop solution终止反应。
统计学分析：
所有数据均为
Figure BDA0002446124950000151
表示。使用SPSS18.0(Statistical Product and ServiceSolutions)软件，分析实验结果。当P<0.05时，认为具有统计学意义。
流式鉴定杀伤实验结果统计分析表明，本发明中构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞与PANC-1细胞效靶比为3:1时，T细胞对后者的杀伤性活性可达到95.23％以上。图6可见，当两者共培养36h，细胞因子TNF-a分泌水平提高了12.43倍。附图7可见，当两者共培养36h,细胞因子IFN-γ分泌水平提高了27.82倍。由数据分析可得，本发明构建的嵌合抗原受体对PANC-1肿瘤细胞表现出显著的杀伤效果。
综上，本发明构建了一个靶向实体瘤的嵌合抗原受体，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1；编码上述嵌合抗原的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:2。本发明构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞，可应用于治疗PANC-1阳性表达的胰腺癌、胃癌和食管癌等恶性肿瘤。
序列表
<110> 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司
<120> 一种用于靶向治疗实体瘤的嵌合抗原受体T淋巴细胞
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Lys Glu Thr Asp Ser Leu Pro Gln Asp Phe Leu
20 25 30
Ala Gly Met Ile Gly Glu Tyr Gly Pro Thr Ser Ala Glu Leu Phe Glu
35 40 45
Pro Gly Pro Tyr Thr Gln Thr Trp Gly Ala Cys Ser Ala Asp Trp Cys
50 55 60
Glu Val Thr Gly Arg Leu Thr Cys Asn Glu Ile Tyr Arg Thr Phe Arg
65 70 75 80
Ile Gly Trp Pro Lys Glu Gly Arg Phe Leu Gly Val Ile Asp Gly Phe
85 90 95
Cys Leu Ser Asp Phe Glu Phe Leu Gly Tyr Asp Phe Ala Asp Ser Phe
100 105 110
Cys Asn Glu Ile Pro Pro Lys Glu Trp Arg Thr Ile Gly Arg Phe Cys
115 120 125
Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Met Ser Asp Cys Pro Ala Val Gln Thr Ile Ile Gly Trp Cys
145 150 155 160
Arg Glu Pro Tyr Cys Tyr Gly Arg Ser Met Phe Pro Glu Thr Leu Glu
165 170 175
Pro Lys Glu Leu Ala Cys Asp Leu Ile Val Cys Lys Met Leu Gln Ala
180 185 190
Ser Asn Glu Phe Arg Asn Glu Ile Ile Gly Thr Gly Val Thr Pro Glu
195 200 205
Glu Ile Tyr Ala Met Cys Ile Arg Val Tyr Cys Leu Ala Glu Pro Glu
210 215 220
Thr Gly Trp Asp Leu Lys Glu Gln Arg Phe Ile Gly Thr Pro Lys Gln
225 230 235 240
Phe Tyr Asp Ser Thr Val Cys Cys Met Tyr Cys Leu Ala Glu Tyr Trp
245 250 255
Tyr Val Ile Gly Thr Cys Met Pro Ala Ile Gln Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Gly Pro Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
370 375 380
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Glu Leu Tyr Asn
385 390 395 400
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
405 410 415
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
420 425 430
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Met Ala Glu Ala Glu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
450 455 460
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
465 470 475 480
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 2
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgaaggaga ctgacagcct tccccaggac ttccttgcct ggatgatcgg agagtatgga 120
cccactagtg ccgagctgtt cgagcccgga ccctacactc agacttgggg agcctgcagt 180
gccgactggt gcgaggtgac tggaaggctg atttgcaacg agatctacag gactttcagg 240
attggatggc ccaaggaggg gaggttcctg ggagtgattg acggattctg cctgagtgac 300
ttcgagttcc tgggatacga cttcgccgac agtttctgca acgagatccc ccccaaggag 360
tggaggacta tcggcaggtt ctgccttaag ggaggaggag gtagtggagg aggaggtagt 420
ggaggaggag gtagtgacat gagtgactgc cccgccgtgc agactatcat cggctggtgc 480
aggcagccct actgctatgg aaggagtatg ttcccccaga ctcttgagcc caaggagctt 540
gcctgcgacc ttatcgtgtg caagatgctt caggccagta acgagttcag gaacgagatc 600
atcggcactg gcgtgactcc cgaggagatc tatgccatgt gcatcagggt gtattgcctt 660
gcccagcccc agactggctg ggaccttaag cagggcaggt tcatcggcac tcccaagcag 720
ttctatgaca gtactgtgtg ctgcatgtat tgccttgcca agtattggta tgtgatcggc 780
acttgcgtgc ccgccatcca gaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470

Claims (10)

1.一种靶向Claudin18.2分子的嵌合抗原，其特征在于，所述的嵌合抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原，其特征在于，所述的嵌合抗原的编码核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:2。
3.权利要求1所述的嵌合抗原在制备慢病毒中的应用。
4.一种慢病毒，其特征在于，所述的慢病毒是使用权利要求1所述的嵌合抗原制备的。
5.权利要求1所述的嵌合抗原在制备慢病毒来修饰T淋巴细胞中的应用。
6.一种嵌合抗原修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原修饰的T淋巴细胞是使用权利要求1所述的嵌合抗原修饰制备的。
7.权利要求6所述的嵌合抗原修饰的T淋巴细胞在制备用于治疗恶性肿瘤的制品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的恶性肿瘤为表达Claudin18.2的恶性肿瘤。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的恶性肿瘤为胰腺癌，胃癌或食管癌。
10.一种用于治疗表达Claudin18.2的恶性肿瘤的制品，其特征在于，所述的制品包含有权利要求6所述的嵌合抗原修饰的T淋巴细胞。
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