CN107098981B

CN107098981B - 一种靶向cd19的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞

Info

Publication number: CN107098981B
Application number: CN201710518024.XA
Authority: CN
Inventors: 刘燕丽; 张道强; 刘传杰; 徐矫健; 刘鹏飞; 葛淑娟; 王玉娟
Original assignee: Qingdao Maidisaisi Medical Technology Co ltd
Current assignee: Qingdao Maidisaisi Medical Technology Co ltd
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2037-06-29
Also published as: CN107098981A

Abstract

本发明提供一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，是使用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的嵌合抗原修饰T淋巴细胞制备的。本发明通过筛选，最终得到一个全新的、靶向CD19的嵌合抗原受体序列。构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞，可用于治疗CD19阳性的B细胞恶性肿瘤。

Description

一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。

背景技术

B淋巴细胞瘤是起源于造血系统的最常见的恶性肿瘤。目前，多种B淋巴细胞恶性肿瘤应用传统疗法难以治愈。此外，传统的治疗方法具有多种副作用。例如，异体骨髓移植后，会引起移植物抗宿主病(GVDH)，从而导致骨髓移植的失败。近年来，嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)技术的发展给一些B细胞表面分化抗原相关疾病的治疗带来希望；其中靶向CD19的CAR-T细胞疗法已进入临床试验阶段，一些患者达到了完全缓解的效果。该疗法在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，目前被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

目前，CAR-T技术已发展到第三代，但第二代在临床治疗上最为常见。CAR-T技术的CAR分子由胞外抗原结合区、跨膜区和胞内区组成。胞外抗原结合区由信号肽和靶抗原的单链抗体(scFV)片段组成，第二代胞内区由一个共刺激分子(主要为CD28或CD137分子)和信号传导区(CD3ζ)组成。第三代胞内区则由两个共刺激分子和信号传导区组成。随着该项技术的发展，修饰性T细胞(CAR-T)的疗效和机体内的持久性将得到更好的提高。

由于CAR-T抗原的靶向性非常强，无法区分表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，因此针对表达相应抗原的肿瘤细胞和正常细胞，都具有攻击性，可能会导致靶向细胞毒性的产生。因此很有必要开发出靶向肿瘤特异性抗原的有效且安全性高的抗体片段，用于构建新的CAR分子，进而尽可能降低靶向毒性对机体带来的危险。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，从而降低CAR-T的靶向毒性，以弥补现有技术之不足。

本发明首先提供一种嵌合抗原，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

编码上述嵌合抗原的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:2；

上述的嵌合抗原用于修饰T淋巴细胞；

本发明在一个方面提供一种使用上述嵌合抗原修饰的T淋巴细胞，其构建步骤如下：

1)人外周血PBMC的分离

采集人外周血50ml,使用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(PBMC)；该群细胞在CD3/CD28抗体和IL-2作用下，激活得到大量增殖的T细胞。同时提取PBMC中总RNA，逆转录为PCR反应的模板cDNA。

2)构建重组质粒

将编码上述嵌合抗原的核苷酸片段插入pLVX-IRES-Neo载体中，获得重组嵌合抗原受体表达质粒；

本发明的嵌合抗原受体，优选的是慢病毒表达载体pLVX-IRES-Neo。

3)慢病毒制备：

将步骤2)构建的重组质粒和病毒包装质粒转染进入293T细胞中，获得携带上述嵌合抗原的慢病毒；

其一种具体操作方法如下：

复苏293T细胞，消化传代至第三代。T100B包被培养板后，接种293T细胞；将重组质粒和病毒包装质粒共转染293T细胞，转染后48h、72h收集病毒液。

4)修饰性T细胞的获得

使用步骤3)制备的慢病毒感染T细胞，获得修饰性T细胞

所述修饰性T细胞制备的过程中，其一种具体步骤如下：

分离外周血，获得PBMC；通过CD3/CD28抗体磁珠作用，得到特异性增殖的T细胞，加入浓缩好的慢病毒来感染T细胞；慢病毒与T细胞混合后，再加入polyberen进行感染，最终获得修饰性T细胞。

本发明通过筛选，最终得到一个全新的、靶向CD19的嵌合抗原受体序列。该嵌合抗原受体经过密码子优化，插入慢病毒表达载体pLVX-IRES-Neo(空载)中，构成抗人CD19分子的重组表达质粒。该质粒利用慢病毒包装体系(Lenti-X Packaging Single Shots，VSVG)，获得高滴度的慢病毒；T100B包被后进行T细胞铺板，再利用慢病毒感染，获得修饰性的T细胞。多次实验表明，T100B可显著提高慢病毒对T细胞的感染率。利用流式细胞术，检测嵌合抗原受体的表达效率；并将构建成功的修饰性T细胞与B细胞系来源的Raji肿瘤细胞共培养，前者对Raji细胞具有显著的杀伤性。由此可见，构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞，可用于治疗CD19阳性的B细胞恶性肿瘤。

附图说明

图1为PLV-CAR19重组表达载体示意图。

图2为CAR19重组质粒的限制性内切酶EcoRI/BamHI双酶切电泳鉴定图。

图3为PLV-CAR19重组表达质粒的部分测序结果峰值图。

图4为靶向CD19的嵌合抗原受体的基因结构示意图。

图5为CAR19修饰性T淋巴细胞与Raji共培养后的杀瘤检测图。

具体实施方式

为了对本发明所作进一步说明，下面将结合附图说明和具体实施方式做分别介绍。本发明的实现方式并不仅限于实施方式所公开的内容与技术，因此凡对本方案技术所进行的等同替换，均在本发明的保护范围之内。

实施例1：人外周血单个核细胞(PBMC)分离与T细胞扩增

1.1 人外周血PBMC的分离

1)采集供者外周血50ml，800g，离心10min。离心后可观察到分层现象。上层为血浆层，中间层为白膜层，最下端为红细胞层。

2)用吸液管缓慢收集血浆层，56度灭活30min。

3)淋巴细胞分离液分离白膜层：使用吸管小心抽吸白膜层细胞，加入PBS中，两者完全混匀；将淋巴分离液的加入15ml离心管中，再等体积加入PBS混合液。700g，离心15min。

4)洗涤PBMC：离心后小心抽吸离心管中间的白膜层细胞，加入25mlPBS混匀清洗一次。离心后，弃PBS；再加入培养基25ml重悬，重复清洗一次细胞。

5)弃去培养基，加入新的培养基重悬PBMC细胞。

1.2 T细胞激活与扩增

1)PBMC分离：将步骤1.1最终分离的PBMC全部加入T175cm²培养瓶，移入CO₂培养箱中。

2)2h后取出培养瓶，轻轻晃动，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜，移液器吸取细胞悬浮液转入新的培养瓶中，少许培养基清洗培养瓶将悬浮细胞全部收集。

3)向新的培养瓶中加CD3/CD28磁珠，并加入IL-2(100U/ml),混匀后移入培养箱中。

4)第5日去磁珠，定期补液。取激活的T细胞，使用抗体CD4+和CD8+单克隆抗体染色，流式细胞仪上机鉴定激活的T细胞的分型。

1.3 RT-PCR获得PBMC中cDNA

1)Trizol提取PBMC中总RNA:取2x10⁶个PBMC细胞，加入1mlTrizol。使用上海生工生物工程股份有限公司的Q-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒抽提PBMC中的总RNA。

2)反转录RNA获得cDNA:使用上海生工生物工程股份有限公司的AMV第一链cDNA合成试剂盒中Oligo dT Primer反转录RNA。反转录体系如下：

逆转录反应体系	20μl
		RNA样品	3μl
Oligo-dT primers	1μl
		RNase free ddH<sub>2</sub>0	8μl
5×RT Buffer	4μl
		RNase Inhibitor(40U/μl)	1μl
dNTPs(10mM)	2μl
		AMV Reverse Transcriptase	2μl

反转录程序如下：

cDNA合成	42℃60min
		终止反应	85℃5min(酶失活)处理后，冰上放置或-20度保存

实施例2:嵌合抗原CAR19重组载体的构建

2.1 抗CD19单链抗体(scFV)基因序列的获得

人CD19蛋白免疫小鼠后纯化得到其抗体片段，对其进行氨基酸测序，之后进行密码子优化，得到其核苷酸序列。修饰并构建为抗CD19的单链抗体，命名为CAR19scFV。该单链抗体由重链和轻链组成，重链与轻链之间的连接片段是GGGGSGGGGSGGGGS(3G4S)。将修饰后的单链抗体送往上海生工生物工程股份有限公司合成。

2.2 PCR扩增CD8a信号肽、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、41BBL和CD3ζ

1)设计引物：使用Primer5.0软件，设计PCR扩增所需的上下游引物。引物送往上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见下表：

2)PCR反应体系(50μl)

3)PCR扩增程序

首先设置PCR仪盖温为95℃。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃2min；第2步到第4步重复32个Cycles；72℃再延伸8min；4℃保温30min。反应体系完全混匀后，开始进行目的片段的扩增。

4)PCR产物鉴定、纯化和测序

PCR扩增程序完成后，将PCR产物加入加样孔中，进行1％琼脂糖电泳鉴定。胶回收试剂盒回收与目的片段一致的PCR产物,并送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序；与目的片段序列一致的PCR产物，将用于嵌合抗原受体基因序列的连接反应。

2.3 CD8a-hCD19scFV-CD8aHM–CD8aTM-41BBL-CD3ζ基因序列的连接

1)序列比对

从GenBank(NCBI)数据库中搜索到人CD8a信号肽基因、人CD8a铰链区和跨膜区基因、人CD137(4-1BBL)胞内区基因、以及人CD3ζ胞内区基因序列。将PCR扩增的片段测序结果与数据库序列进行Blast比对，两者核苷酸序列完全一致。

2)重叠延伸PCR技术扩增CD8a信号肽-hCD19scFV

扩增体系中加入CD8a信号肽上游引物和hCD19scFV的下游引物，以以CD8a信号肽和hCD19scFV PCR纯化片段为模板，扩增体系和扩增程序参照步骤2.2。将PCR扩增产物纯化并送往公司测序获得CD8a信号肽-hCD19scFV。

3)重叠延伸PCR技术扩增CD8aHM–CD8aTM-41BBL-CD3ζ：扩增方法参照步骤2.2。

4)重叠延伸PCR技术扩增CD8a信号肽-hCD19scFV-CD8aHM–CD8a TM-41BBL-CD3ζ

向扩增体系中加入CD8a信号肽上游引物和CD3ζ下游引物，以CD8a信号肽-hCD19scFV和CD8aHM–CD8aTM-41BBL-CD3ζPCR纯化片段为模板，扩增方法参照步骤2.2，最终得到CAR19嵌合抗原受体。

2.4 嵌合抗原CAR19重组载体的构建

在CD8a信号肽上游引物头端依次加入EcoRI酶切位点(GAATTC)、KozaK序列(GCCACC)；在CD3ζ末端加入BamHI限制性酶切位点(GGATCC)。分别用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切空载pLVX-IRES-Neo和CD8a信号肽-hCD19scFV-CD8aHM–CD8aTM-41BBL-CD3ζPCR扩增片段，使用胶回收试剂盒纯化酶切片段。再通过T4-DNA连接酶作用，完成CAR19重组载体的构建。靶向CD19的嵌合抗原受体的连接顺序及基因结构示意图见附图3。

实施例3:重组质粒的提取与测序

1)转化：分别高压LB液体培养基、LB固体培养基、三蒸水和50％甘油，超净台中制备无抗性LB平板和Amp抗性的LB平板。转化空载质粒和重组质粒。

2)第2日观察平板上单克隆菌落生长情况，若生长良好表明转化成功。挑取转化的单克隆菌落，接种于5ml含有Amp的LB液体培养基中。37℃下200rpm振荡培养过夜。

3)菌液培养14-16h后，停止摇菌。使用北京天根生物无内毒素质粒中提试剂盒抽提质粒；此后对抽提的质粒进行1％琼脂糖电泳，观察质粒抽提效果。完好的质粒电泳应呈现出三条带。

4)质粒酶切：限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切重组质粒2h，将酶切混合液进行1％琼脂糖电泳，观察质粒酶切结果；电泳鉴定结果见附图2。由电泳图可判定质粒双酶切后形成两条带，两条带的片段大小与目的片段大小一致。

5)质粒测序：将酶切成功的质粒送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果与目的片段的核苷酸序列完全一致，部分测序结果见附图3。测序成功的质粒将用于包装慢病毒。

实施例4:慢病毒包装、滴度测定及浓缩

4.1 293T细胞复苏与传代

1)从液氮中取出细胞，立即置于37度水浴中，边晃动边观察细胞溶解状况。全部溶解后，对冻存管表面喷洒酒精，擦拭酒精后迅速移入超净工作台。

2)将1ml冻存液移入15ml离心管中，其内已提前加入预热的1ml培养基,两者轻轻混匀；再向管中加入8ml的预热培养基，混匀后100g,离心5min。

3)弃上清，加入7ml完全培养基，混匀吹打成单细胞状态，之后将其移入TC处理的25cm²培养瓶中。

4)第2日，镜下观察复苏后的细胞状态，并弃去原液，更换为新的完全培养基。

4.2. 293T细胞传代与冻存

1)传代：细胞融合度至80％-90％时，0.25％的胰酶37度下消化细胞1min。弃胰酶，加入4ml培养基终止消化，再加入6ml预热的PBS充分吹打细胞；此后将细胞液移入15ml离心管中，100g，离心5min。

2)弃上清，加入完全培养基混匀后，计数并分瓶。

3)再次传代后，离心弃上清，可加入细胞冻存液进行细胞冻存。剩余的细胞将用于包装慢病毒。

4.3 慢病毒包装、滴度测定及浓缩

1)T100B包被培养板，常温孵育2-4h。胰酶消化293T细胞，用无抗生素的完全培养基吹打细胞，并计数，六孔板中每孔加入2ml培养基，接种0.8x10⁶个细胞。

2)包装病毒：第2日，待细胞密度达到80％-90％，细胞长出正常形态并状态良好，可进行病毒包装。将质粒和转染试剂混合液加入六孔板中，37度培养6h后，更换为无抗生素的完全培养基。

3)分别于换液后24h、48h和72h收集病毒液。

4)病毒滴度测定：收集病毒液离心，弃沉淀，取上清进行滴度测定。质粒pLVX-IRES-Neo(空载)和pLVX-CAR19病毒浓缩液的滴度分别为8x10⁶TU/ml和5x10⁶TU/ml。

5)病毒浓缩：取病毒液离心后所得上清进行浓缩，病毒浓缩倍数约为15倍。浓缩液等量分装于-80度保存。浓缩液若3天之内使用，可暂放于4度保存。

实施例5:慢病毒感染T细胞

(1)PBMC分离：采集外周血50ml，加入淋巴分离液分离获得单个核细胞(PBMC)，最终分离的PBMC全部加入T175cm²培养瓶，移入CO₂培养箱中。

(2)2h后取出培养瓶，轻轻晃动，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜，移液器吸取细胞悬浮液转入新的培养瓶中，少许培养基清洗培养瓶将悬浮细胞全部收集。

(3)向新的培养瓶中加CD3/CD28磁珠，并加入IL-2(100U/ml),混匀后移入培养箱中。

(4)次日，调整细胞密度至0.5x10⁶个/ml，加入病毒液(Mol＝3)，polybrene终浓度8ug/ml，混匀后，2000rpm离心1h。离心后重悬混合液，移入培养袋中。每隔两天进行补液，IL-2维持浓度为100U/ml。

(5)第5日去磁珠，定期补液并观察细胞状态。

(6)第7日取病毒感染的细胞进行流式细胞仪检测CAR分子表达情况、并对细胞进行内毒素、细菌和支原体的检测。

(7)第9日，取T淋巴细胞与Raji细胞共培养，检测CAR-T细胞对Raji细胞的杀瘤效果。

实施例6:修饰性T细胞表面CAR分子的表达效率检测

(1)取0.5-1x10⁶个病毒感染72h的细胞，1000rpm，离心4min,去上清；再加入1mlPBS溶液，再次离心去上清。

(2)加入100ulPBS溶液，轻柔悬浮细胞沉淀，加入2ul抗体Goat F(ab')₂Anti-Mouse IgG(Fab’)₂(FITC),4度避光孵育30min。

(3)1000rpm，离心5min,去上清；再加入1ml PBS溶液，再次离心去上清。

(4)加入100ulPBS溶液，轻柔悬浮细胞。流式细胞仪上机检测T细胞表面CAR分子的表达效率。

实施例7:CAR-T细胞对Raji细胞体外杀瘤检测

慢病毒感染一周后，取感染的T细胞与B淋巴细胞瘤细胞系Raji体外共培养。24孔板中，每孔取0.5x10⁶个T细胞，T细胞与B细胞瘤细胞系Raji三种效靶比(E:T＝6：1；3:1；1:1)。每组均设实验组和对照组，实验组为CD19CAR-T细胞，对照组为空载体病毒感染的T细胞(control-T)。分别于共培养24h,36h和48h后收集细胞进行流式鉴定Raji细胞比例的变化(CD19抗体鉴定)，从而判定T淋巴细胞的杀伤作用。CAR19的杀伤结果见附图5。

统计学分析

所有数据均为

表示。使用SPSS18.0(Statistical Product and ServiceSolutions)软件，分析实验结果。当P<0.05时，认为具有统计学意义。

实验结果统计分析表明，本发明中构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞与Raji细胞效靶比为6:1时，T细胞对后者的杀伤性最高。附图5可见，当两者效靶比为6:1，共培养24h、36h和48h后，Raji细胞比率由14.3％分别下降至1.81％、0.60％和0.01％，该数据表明本发明构建的CAR19对Raji的杀伤性依次为91.9％、94.0％和99.9％。由此可见，本发明构建的嵌合抗原受体对Raji肿瘤细胞表现出显著的杀伤效果。

本发明构建了一个新的杀伤力显著的CAR19的嵌合抗原受体，其氨基酸序列为SEQID NO:1；编码上述嵌合抗原的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:2。附图说明中为其图示及数据统计分析相关结果。本发明构建的嵌合抗原受体修饰的T细胞，可用于治疗CD19阳性的B细胞恶性肿瘤。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛麦迪赛斯医疗技术有限公司

<120> 一种靶向CD19的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 490

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Lys Leu Ile Glu Gln Val Gly Asp Ser Leu Thr

20 25 30

Ile Ser Leu Gln Ser Trp Gly Phe Tyr Met Phe Ala Val Ala Tyr Leu

35 40 45

Thr Glu Leu Gly Pro Ile Gly Ala Tyr Thr Tyr Ser Thr Arg Leu Arg

50 55 60

Pro Lys Ala Ser Asn Glu Ile Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Gln

65 70 75 80

Leu Lys Pro Gly Gln Ala Pro His Thr Ser Gly Ile Gly Arg Phe Leu

85 90 95

Pro Gly Thr Asp Thr Tyr Ser Gly Ser Leu Ala Arg Gln Pro Ser Thr

100 105 110

Pro Cys Arg Glu Ser Asp Phe Lys Gln Cys Ser Lys Leu His Tyr Thr

115 120 125

Gln Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Val Ser Lys Gln Lys Ser Asn Glu Ala Thr Val Ser Leu Thr

145 150 155 160

Tyr Ser Val Thr Ser Tyr Leu His Pro Ser Thr Ser Arg Leu Ile Val

165 170 175

Ile Arg Asp Lys Leu Ile Gly Trp Val Ile Gly Thr Gly Glu Tyr Gln

180 185 190

Ser Ser Leu Gln Lys Val Gly Thr Pro Ser Gly Asp Lys Asn Trp Gly

195 200 205

Ala Gly Gln Ser Thr Leu Lys Gln Gly Trp Pro Gln Thr Leu Val Val

210 215 220

Tyr Cys Leu Leu Ser Val Ala Val Ser Pro Ser Thr Leu Ser Val Glu

225 230 235 240

Ser Thr Asp Gly Ala Val Tyr Cys Ala Trp Ser Lys Pro Tyr Ser Tyr

245 250 255

Gly Gly Glu Ser Gly Tyr Met Tyr Arg Val Asp Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 2

<211> 1470

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgaagctta tcgagcaggt gggcgacagt ctgactatca gcctgcagag ctggggcttc 120

tacatgttcg ccgtggccta tctgactgag ctggggccca ttggagccta cacttatagt 180

actcgactgc gacctaaagc cagtaacgag attcaggaca tcagtagcta cctgaaccag 240

ctgaagcccg gccaggcccc tcatactagt ggaactggcc ggttcctgcc cgggactgac 300

acttatagtg gcagtctggc ccggcagccc agtactccct gccgggaaag tgacttcaaa 360

cagtgcagta agctgcatta tactcagggc ggcggggggg ggtccggcgg gggggggagc 420

gggggggggg gcagccaggt gagtaagcag aaaagcaacg aagccactgt gagtctgact 480

tacagtgtga ctagctacct gcatcccagt actagccgac tgatcgttat tcgagacaag 540

ctgatcggct gggttattgg aactggggag taccagagta gcctgcagaa ggtgggaact 600

cccagtggcg acaaaaactg gggcgccggg cagagtactc tgaagcaggg atggccccag 660

actctggtgg tttattgcct gctgagtgtg gccgtgagtc ccagtactct gagtgttgag 720

agtactgacg gggccgtgta ctgcgcctgg agtaagccct acagttacgg gggagagagt 780

ggctacatgt accgagtcga caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1470

Claims

1.一种嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.核苷酸片段，所述的核苷酸片段编码权利要求1所述的嵌合抗原受体。

3.如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ IDNO:2。

4.一种嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，所述的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞是使用权利要求1所述的嵌合抗原受体进行了修饰。

5.如权利要求4所述的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其制备方法如下：

步骤1)人外周血PBMC的分离

采集人外周血50ml,使用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞；该群细胞在CD3/CD28抗体和IL-2作用下，激活得到大量增殖的T细胞；同时提取PBMC中总RNA，逆转录为PCR反应的模板cDNA；

步骤2)构建重组质粒

将编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的核苷酸片段插入载体中，获得重组嵌合抗原受体表达质粒；

步骤3)慢病毒制备：

将步骤2)构建的重组质粒和病毒包装质粒转染进入293T细胞中，获得携带上述嵌合抗原受体的慢病毒；

步骤4)修饰性T细胞的获得

使用步骤3)制备的慢病毒感染T细胞，获得修饰性T细胞。

6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的步骤2)中的载体优选为pLVX-IRES-Neo载体。

7.如权利要求5所述的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，其特征在于，所述的步骤3)中慢病毒的制备方法，是复苏293T细胞，消化传代至第三代；T100B包被培养板后，接种293T细胞；将重组质粒和病毒包装质粒共转染293T细胞，转染后收集病毒液。