CN109721659B

CN109721659B - 一种靶向cd19的新型嵌合抗原受体（car）及其应用

Info

Publication number: CN109721659B
Application number: CN201910182150.1A
Authority: CN
Inventors: 王振; 李静
Original assignee: Zhejiang Yuan Kangrui Biological Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Yuan Kangrui Biological Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2019-03-11
Filing date: 2019-03-11
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2039-03-11
Also published as: CN109721659A

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种靶向CD19的新型嵌合抗原受体(CAR)及其应用，该嵌合抗原受体包括信号肽、靶向CD19的纳米抗体、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述胞内信号域为突变的CD3ζ胞内信号域。使用靶向CD19的纳米抗体和突变的CD3ζ胞内信号域，不仅能够降低嵌合抗原受体的分子量，便于核酸转染和分子生物学操作，还能够提高抗肿瘤活性，发挥更强的肿瘤杀伤效果，为开发新型肿瘤免疫疗法提供了新的途径，可以用于CAR‑T疗法中，并展现出了良好的应用前景。

Description

一种靶向CD19的新型嵌合抗原受体（CAR）及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种靶向CD19的新型嵌合抗原受体(CAR)及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，据不完全统计，目前中国的恶性肿瘤年发病病例达到400 多万例，其中淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤的发病率居高不下，并且近年来的研究表明，血液肿瘤的发病率不断提高，发病年龄也有所提前，发病人群从过去的以中老年人居多，逐步扩散到年轻患者中，这可能与现代人生活压力大、环境污染加剧、生活习惯不健康等因素有关。然而，目前对于血液肿瘤仍缺乏行之有效的治疗手段，传统的化学药物疗法、放射疗法和手术疗法难以产生令人满意的治疗效果，作为治疗血液肿瘤的首选疗法——造血干细胞移植，也存在较大的缺陷，如符合配型要求的造血干细胞难以获取，移植并发症较多，移植后复发率较高等等。因此，临床上迫切需要开发新型的血液肿瘤治疗手段，以便满足患者的需求。

过继性细胞免疫治疗(adoptive cell therapy，ACT)，是将具有抗肿瘤活性的免疫细胞输注给癌症患者,是一种高度个体化的癌症治疗新手段，而早期的细胞免疫疗法往往依赖于T细胞自身的表面相容性抗原，限制了其治疗范围。为了解决这一问题，嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor gene-modifiedT cell， CAR-T)技术应运而生，CAR-T细胞是将融合有CAR基因的核酸导入到自体或异体T淋巴细胞基因组中构建而成。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的发展经历了不同阶段，第一代CAR中不包括共刺激因子，因而T细胞的增殖效应小，细胞因子释放少，导致抗肿瘤活性不足；第二代CAR包含一个共刺激分子，临床上使用的共刺激因子包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、 B7-H3等等，这些分子在调节T细胞增殖、存活和抗肿瘤效应方面发挥重要作用，从而使得第二代CAR-T 细胞可以被有效激活并杀死肿瘤细胞；第三代CAR具有两个共刺激分子，可进一步提高抗肿瘤效果。虽然 CAR-T细胞可以有效的杀死肿瘤细胞，但同时也带来了诸如免疫因子风暴、神经毒性、脱靶效应、移植抗宿主反应等不良反应，严重时可导致患者死亡，如Juno公司的JCAR015就曾导致了多例患者由于脑水肿而死亡的现象，为了应对这种棘手的不良反应事件，研究人员在CAR-T细胞中引入了Caspase 9等自杀基因，从而构建了第四代CAR，以便有效的控制治疗过程。

CAR-T细胞作为一种“活的药物”，与传统药物相比，其治疗过程更加繁琐，实施难度更大，对于质量控制要求更高，CAR-T细胞治疗的基本过程包括血浆提取、T细胞分离和筛选、外源基因转染、修饰后T 细胞体外扩增、CAR-T细胞回输等步骤，正是由于CAR-T细胞制备的复杂性，导致CAR-T细胞费用高昂， Hemandez I等(Hemandez I et al，Total costsof chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,JAMA Oncol,2018,4(7):994-996)对目前已上市的CAR-T疗法进行估价，诺华公司的Kymriah达51.1万美元，吉利德公司(收购了Kite公司)的Yescarta达40.3万美元，如果加上辅助药品费用、护理费用、重症监护费用等等，这一价格可能继续攀升。在CAR-T细胞制备过程中，外源基因修饰是该过程的核心步骤之一，因此如何降低外源基因的修饰难度，提高成功率是本领域研究人员所必须解决的问题，也是降低CAR-T治疗成本，提高患者可接受性的重要影响因素。CAR结构通常包括抗原结合域、跨膜区、共刺激分子及信号转导域，各个区域对于CAR-T治疗的效果均有重要影响，因此发明人试图通过对于CAR结构中不同区域进行改造或筛选，以便降低核酸操作的难度，降低生产成本。

抗原结合域用于识别目标肿瘤细胞，通常采用靶向肿瘤抗原抗体的scFv区，它包括抗体的轻链可变区 (light chainvariable，V_L)和重链可变区(heavy chain variable，V_H)，并且二者之间采用Linker连接，虽然scFv区的分子量明显小于完整抗体结构，在一定程度上有利于CAR基因的重组构建，但是在分子生物学上，其核苷酸长度仍然较大，给后续的核酸构建、核酸导入、外源基因表达带来了一定的困难，故仍需要进一步对该区域进行简化，以便降低分子生物学操作难度，提高转染成功率和降低生产成本。纳米抗体(Nanoantibody)又称单域抗体，是20世纪90年代从骆驼科动物体内发现的一种新型抗体，它仅具有4个框架区和3个重链可变区，虽然与完整的免疫球蛋白相比缺少了轻链可变区等结构，但是仍具有完全的抗原结合能力，并且分子量更小，使得相应的核酸操作难度也相应地降低，对此研究人员已经开始试图将纳米抗体技术应用于CAR结构中，CN109232742A公开了一种基于纳米抗体的嵌合抗原受体 CD38Nb-CD8α-CD137-CD3ζ及其应用，CN105384825A公开了一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用，通过优化设计CD19、CD20特异的单域抗体，提供了一种CD19、CD20双靶点修饰的CAR-T细胞，能够特异地与CD19及CD20抗原结合。虽然已经有如上研究人员尝试将纳米抗体技术应用于CAR构建中，但是筛选并获得新型的分子量较小、亲和力适中的靶向CD19纳米抗体仍是本领域的研究热点之一。

跨膜区的插入有利于CAR在T细胞膜表面的稳定表达，也保证了CAR在T细胞膜表面的定位。有研究表明(PulèMA et al，A chimeric T cell antigen receptor thataugments cytokine release and supports clonal expansion ofprimary human Tcells.Mol Ther，2005，12(5):933-41)，含有CD28跨膜区的CAR在T细胞具有最高的表达，而跨膜区为OX40(肿瘤坏死因子超家族成员)和CD3ζ的CAR表达程度为中等和最低。因此，本发明所提供的嵌合抗原受体结构中选用CD28跨膜区，以便于CAR能够在T细胞表面有效表达。

共刺激因子是决定CAR-T细胞能够被有效激活的关键因素，目前已经发现并应用了多种共刺激因子，包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、B7-H3等等，其中目前临床试验中应用最多的共刺激因子为CD28和4-1BB(CD137)，CD28被认为对T细胞活化更有影响力，而4-1BB则主要与体内存活时间延长有关，与T细胞活化相比，获得可在患者体内长时间稳定存活的CAR-T细胞更为重要，故在本发明中选用4-1BB作为共刺激因子，这样既可以保证患者体内的肿瘤细胞被持续性清除，防止肿瘤复发，又能够防止由于T细胞免疫应答过于剧烈而导致的严重不良反应。

信号转导域，位于T细胞内部，故又称为胞内信号域，用于维持T细胞的激活状态。CAR结构中常用的信号转导域为CD3ζ，然而一方面野生型的CD3ζ分子量较大，给分子生物学操作带来了一定的困难，另一方面其促进和维持T细胞激活的能力也有待进一步加强，因此本发明中基于分子生物信息学信息和计算机辅助设计，优化了CD3ζ结构，在野生型CD3ζ分子的基础上进行了某些位点的突变和删除，获得了新型CD3ζ结构，与野生型相比，T细胞活化能力有所加强，并且分子量更小。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新型嵌合抗原受体及其应用，包括信号肽、靶向CD19的纳米抗体、跨膜区、共刺激因子和截短的CD3ζ胞内信号域，所述嵌合抗原受体具有更小的分子量，并且能够有效激活T细胞，使得在降低生产成本的同时，保持甚至提高抗肿瘤活性，为开发新型的CAR-T细胞疗法提供了新思路。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种靶向CD19的新型嵌合抗原受体及其应用，以便降低CAR-T细胞治疗过程中的分子生物学操作难度，提高细胞转染效率，改善抗肿瘤效果。

本发明的详细技术方案如下：

提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向CD19的纳米抗体、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述胞内信号域为突变的CD3ζ胞内信号域。

进一步的，本发明提供了一种抗人CD19纳米抗体，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示，本发明中基于纳米抗体筛选手段，利用人源CD19蛋白免疫羊驼，通过噬菌体展示技术筛选抗人CD19纳米抗体序列，该纳米抗体与CD19抗原具有较高亲和力，可有效地与靶标抗原进行结合。

进一步的，本发明提供了一种突变的CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示，该改进后的CD3ζ胞内信号域氨基酸序列长度有所缩短，但保持了T细胞激活活性，甚至相比于野生型序列，T 细胞激活能力有所提高，从而能够保证包含该序列的CAR-T细胞能够被有效激活，发挥肿瘤杀灭作用，改善抗肿瘤效果。

进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，选用CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQID NO:3所示，有研究表明该跨膜区可以使得CAR基因在细胞膜位置获得高表达。

进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，选用CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、 NKG2C、B7-H3和/或它们的任何组合作为共刺激因子，优选CD28、4-1BB和/或它们的组合，更优选4-1BB 作为共刺激因子，其氨基酸序列如SEQID NO:4所示。有研究表明，4-1BB主要与体内存活时间延长有关，可以使得体内CAR-T细胞长期处于激活状态，从而持续发挥抗肿瘤作用。

进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，包括信号肽序列，其氨基酸序列如SEQID NO:5所示。

进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，其氨基酸序列如SEQID NO:6所示。

进一步的，本发明提供的嵌合抗原受体中，其核苷酸序列如SEQID NO:7所示。

进一步的，本发明提供了一种表达载体，包括编码所述嵌合抗原受体氨基酸的核苷酸或所述嵌合抗原受体的核苷酸，所述表达载体优选为慢病毒载体。

进一步的，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达所述的嵌合抗原受体。

进一步的，本发明提供了一种所述的嵌合抗原受体T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括 B细胞恶性肿瘤，优选急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。

本发明提供了一种靶向CD19的新型嵌合抗原受体结构及其应用，包括靶向CD19的纳米抗体结构域和突变的CD3ζ胞内信号域，相对于传统的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体分子量更小，有利于保证T细胞转染过程的顺利进行，降低操作难度，提高转染效率，并且纳米抗体可有效发挥肿瘤杀伤作用，突变的 CD3ζ胞内信号域也能够增强T细胞激活程度，从而产生协同作用，本申请实施例中所提供的实验数据证明，采用该新型嵌合抗原受体构建的CAR-T细胞可发挥更强的抗肿瘤效果，从而展现出良好的应用前景。

附图说明

图1嵌合抗原受体结构图；

图2嵌合抗原受体目标核酸片段酶切电泳图；

图3流式细胞仪检测CAR慢病毒转染效率图；

图4CAR-T细胞因子分泌图，其中图4A为IL-6因子分泌情况，图4B为TNF-α因子分泌情况；

图5CAR-T细胞对于Raji细胞杀伤率图；

图6Raji细胞荷瘤小鼠肿瘤体积变化图；

图7Raji细胞荷瘤小鼠生存率图。

具体实施方式

下面对本发明涉及的部分术语进行解释。

本发明中，“核酸”或“核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其DNA 或RNA的组合及其聚合物，所述的核酸分子是合成的或重组的。

本发明中，“表达载体”是指包括重组核苷酸的载体，所述重组核苷酸包括与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包括足以用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)等等。

本发明中，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属，慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞，可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一，如HIV、SIV和FIV等均属于慢病毒。

本发明中，“肿瘤”是指因异常细胞不受控制的生长而造成的疾病，肿瘤细胞可以局部或通过血流和淋巴系统传播到身体的其它部位。本文描述了各种肿瘤，包括但不限于乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。本发明中“肿瘤”、“癌症”、“癌”可以互换使用，均包括实体肿瘤和液体肿瘤。

本发明中，“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。通常来讲，嵌合抗原受体依次包含信号肽、抗原结合域、跨膜区和胞内信号区。可采用本领域已知的用于构建CAR的信号肽、跨膜区和胞内信号区来构建本发明的嵌合抗原受体。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以较高或中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达膜抗原，该多肽通常插入有抗原表位；信号肽与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽之间，抗原结合域内部，以及抗原结合域和铰链区之间；所述抗原结合域为天然多肽或人工合成多肽。

本发明中，“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。T淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80、CD86与T细胞表面的CD28 分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。可采用本领域已知的用于构建CAR的共刺激因子，包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、B7-H3和/或它们的任何组合。

本发明克服了目前常用嵌合抗原受体氨基酸序列较长，分子量较大，核酸操作困难，转染效率较低，对于肿瘤细胞的杀伤作用有限等技术难题。为了降低嵌合抗原受体的分子量，本发明一方面筛选并获得了靶向CD19抗原的、亲和力较强的新型纳米抗体，另一方面对CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列结构进行了优化，不仅缩短了其序列长度，还提高了T细胞激活程度。下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1嵌合抗原受体基因序列的确定与合成

1.1靶向CD19的纳米抗体基因确定。

利用人源CD19蛋白免疫羊驼，通过噬菌体展示技术筛选，获得抗人CD19纳米抗体。具体为：选取健康成年单峰驼，将通过酵母表达的人CD19胞外域，分离纯化后获得人CD19胞外域蛋白。按15μg/Kg 人CD19胞外域蛋白与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，采用背部皮下多点注射的方式免疫，共免疫6-8次，间隔为4周。第一次免疫使用弗氏完全佐剂，其余各次免疫均采用弗氏不完全佐剂。免疫结束后采集单峰驼颈部外周血100mL，构建噬菌体展示文库。通过酶联免疫反应方法，以可溶解的人CD19为抗原，筛选阳性克隆。提取阳性克隆质粒并转化至大肠杆菌感受态细胞，以100mM IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，使用树脂分离纯化收集目的蛋白。通过BIACORE3000生物大分子相互作用仪(购自GE公司)测定目的蛋白与人CD19的亲和力，结果如表1所示。选择亲和力最高的XH5作为抗人CD19纳米抗体，测定其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

表1纳米抗体解离常数

编号	解离常数KD(M)
		XH01	8.32E-09
XH02	7.55E-08
		XH03	9.18E-08
XH04	3.42E-10
		XH05	2.37E-10
XH06	6.81E-08
		XH07	2.95E-09
XH08	3.92E-09

1.2 CD3ζ胞内信号域的序列结构优化。

基于基因多态性和分散性分析，采用蛋白模拟软件Discovery Studio3.5对CD3ζ胞内信号域进行分析，在保留CD3ζ胞内信号域生物活性的基础上，适当截短或突变部分氨基酸序列，得到突变后的CD3ζ信号域氨基酸序列，如SEQIDNO:2所示。

1.3嵌合抗原受体基因序列的确定

通过生物信息学方法检索并获得信号肽、CD28跨膜区、4-1BB共刺激因子、CD3ζ胞内信号域、人CD28 铰链区的氨基酸和核苷酸序列，其中CD28跨膜区氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，4-1BB氨基酸序列如 SEQID NO:4所示，信号肽氨基酸序列如SEQID NO:5所示。靶向CD19ssFv片段由本实验室保持，其氨基酸序列如SEQID NO:8所示。基因全合成嵌合抗原受体基因序列，CAR01结构为signal peptide -antiCD19-Nb-CD28TM-4-1BB-Mu-CD3ζ，CAR02结构为signal peptide-antiCD19ssFv–h-CD8αhinge -CD28TM-4-1BB-CD3ζ，上述嵌合抗原受体结构如图1所示，其中CAR01为本发明中所要保护的嵌合抗原受体结构，CAR02为对照序列，CAR01的氨基酸序列如SEQID NO:6所示，核苷酸序列如SEQID NO:7 所示，CAR02的氨基酸序列如SEQID NO:9所示，核苷酸序列如SEQID NO:10所示。

实施例2携带嵌合抗原受体基因质粒载体的制备

2.1目标产物的酶切和质粒载体线性化

通过PCR法扩增并获得CAR01、CAR02基因序列，并在序列两端添加Xba I和Not I酶切位点。将目标基因片段与慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro(购自Addgene公司)进行Xba I和Not I 双酶切反应，酶切反应条件为：37℃，酶切30min。50μL酶切体系如下：

10×buffer：5μL；

DNA5μg；

Xba I酶：2μL；

Not I酶：2μL；

去离子水补足体积。

2.2酶切产物的回收

将含有CAR01、CAR02DNA片段和pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro DNA片段分别利用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有上述核酸片段的琼脂糖凝胶条带切下，放在两个洁净EP管中。采用DNAExtraction kitVer 4.0(购自Taraka公司)将琼脂糖凝胶中的DNA纯化并浓缩，具体方法为：

1)在紫外灯下切出含有目的核酸的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体。

2)切碎胶块，称量胶块重，计算体积，体积按1mg＝1μL进行计算。

3)向胶块中加入溶解液Buffer GM，按4倍胶块体积加入Buffer GM。

4)均匀混合后室温37℃溶解胶块10min。

5)待凝胶完全溶解后，加入3M醋酸钠溶液(pH5.2)10μL，混合均匀。

6)将溶液转移至Spin Column中，所述Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟，收集滤液。

7)将所述滤液转移至Spin Column中，重复步骤6)一次，弃去滤液。

8)将500μL的BufferWB加入Spin Column中，室温中，12000rpm离心30s，弃去滤液。

9)重复步骤8)一次。

10)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μL灭菌水，室温静置1分钟，室温12000rpm离心1min洗脱获得DNA。

2.3产物连接

将上述DNA片段在16℃过夜连接，分别形成pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-CAR01、 pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-CAR02质粒，连接体系(总体积10μL)为：

10×buffer：1μL；

T4连接酶：1μL；

CARDNA：4μL；

线性化的质粒DNA：4μL。

2.4连接产物转化

将连接产物转入DH5α感受态细胞中，具体步骤如下：

1)取出-80℃冰箱中保藏的DH5α感受态细胞，放置于冰上解冻。

2)将连接产物加入感受态中，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min。

3)将感受态细胞加入至900μL未添加抗生素的液体LB培养基中，37℃摇床200rpm，培养2h。

4)4000rpm离心2min，弃去上清，使用100μL液体LB培养基重悬沉淀。

5)将菌液涂抹至Amp抗性的固体LB平板上，将平板置于37℃细菌培养箱中，培养过夜。

6)挑取阳性克隆。

2.5阳性克隆的鉴定

提取阳性克隆中质粒，经Xba I和Not I双酶切(反应步骤同2.1节)，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定目标片段，如图2所示，获得了大小约为900bp和1500bp的目标片段。所述质粒经测序鉴定，目标序列正确。

实施例3慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

3.1慢病毒载体质粒的提取

1)将测序正确的原始菌液接种至50mLAmp抗性的液体LB培养基，37℃摇床200rpm，过夜培养。

2)4000rpm离心2min，弃去上清，收集菌体。

3)采用Takara MiniBEST PlasmidPurification KitVer 4.0(购自Takara公司)质粒提取试剂盒提取质粒，具体方法按照说明书进行。

3.2慢病毒载体的包装

1)将293T细胞以1×10⁶Cells/孔的量接种于6孔细胞培养板中，37℃、5％CO₂条件下培养，待细胞汇合度至80％时进行下一步骤。

2)轻轻吸去6孔板中细胞培养上清，更换为新鲜培养基。

3)取两个15mL离也管，向其中一管中加入质粒，按目的载体质粒：dR8.9包装质粒：VSVG包膜蛋白质粒为4:3:1的比例加入，共加入质粒200μg，后加入Opti-MEM培养基补足体积5mL。将500μLTrans-EZ 加到另一管中，后用Opti-MEM 4.5mL稀释，混合均匀。

4)将两管溶液轻轻混合均匀，37℃、5％CO₂条件下孵育30min。

5)逐滴将质粒与转染试剂的混合溶液滴加至293T细胞培养液中，37℃、5％CO₂条件下培养48h。

6)2000rpm离心10min，0.45μm滤膜过滤上清，去除上清中的细胞与细胞碎片，使用0.22μm滤膜再次过滤，去除上清中的细菌。

3.3慢病毒的浓缩

1)每10mL过滤后的病毒上清液中加入2.5mL 5X PEG-8000NaCl溶液(将NaCl8.76g与PEG-800050 g溶解于200mL去离子水中，121℃高压灭菌获得)。

2)4℃中，每30min混合一次，共进行5次，4℃放置过夜。

3)6000rpm离心20min，弃去上清，静置离心管5min，吸尽残余液体。

4)加入300μL DMEM培养基对病毒沉淀进行重悬。

5)将病毒浓缩液分装后，放置于液氮中速冻后冻存于-80℃冰箱。

3.4慢病毒滴度检测

采用TCID50法检测上述病毒的滴度，具体方法如下：

1)去对数生长期的293T细胞，以1×10⁴Cells/孔的量接种于96孔细胞培养板中。

2)待细胞汇合度达到50％左右时添加浓缩后的慢病毒液体，第一孔加入10μL慢病毒液体，后面每孔按10:1的比例倍比稀释进行感染，每个浓度加样10孔，设2孔空白对照。

3)于37℃、5％CO₂培养，感染5天后，通过荧光显微镜观察，根据据出现毒斑的浓度和孔数计算样品的TCID50结果。

结果表明，含CAR01的重组慢病毒的滴度5.33×10⁷TCID50/mL，含CAR02的重组慢病毒的滴度 6.75×10⁷TCID50/mL。

实施例4靶向CD19CAR-T细胞的制备

4.1 PBMC的制备

1)采集20mL志愿者外周血至含有肝素的50mL离心管中，2000rpm离心10min，吸去上层血浆至离心管内冻存。

2)加入等体积预温的生理盐水溶液，重悬血细胞沉淀，充分混匀。

3)另取一只50mL离心管，在管中加入20mL预温的淋巴细胞分离液。

4)将20mL重悬的血细胞溶液缓慢的加至淋巴细胞分离液的上层。

5)800rpm离心20min。

6)匀速吸除上层血浆，当血浆距白膜层2～3cm时停止吸去血浆，快速吸去白膜层细胞，转移至新的50 mL离心管中，使用生理盐水补充体积至45mL，清洗细胞，1200rpm离心5min，重复2次。

7)使用RPMI1640+10％FBS培养基重悬细胞沉淀，并计算细胞数量。

4.2 T淋巴细胞的分选与培养

1)将分离得到的PBMC用PBS缓冲液洗涤2次，500rpm，10min，离心收集沉淀细胞。

2)重悬细胞，加入生物素偶联的筛选抗体。

3)室温下，孵育20分钟，然后用PBS缓冲液洗涤细胞，500rpm，10min，离心收集沉淀细胞。

4)加入亲和素偶联磁珠，室温下，孵育30min。

5)用PBS缓冲液重悬细胞，加入流式管中，将流式管放在细胞分选磁架上，静置10min。

6)收集未被磁珠富集的上清液，500rpm，10min，离心收集得到CD8⁺T细胞。

4.3 CAR-T细胞的制备

1)用RPMI1640+10％FBS培养基重悬CD8⁺T细胞，然后每孔按1×10⁶个细胞接种至24孔板中，静置 30min后1000rpm离心30min。

2)将CAR01、CAR02慢病毒浓缩液于37℃水浴中溶解，每孔加入1×10⁷TU慢病毒，至于37℃培养箱中培养。

3)转染48h后，更换培养基，并持续观察细胞生长状况，培养时间为7-10天。

4.4慢病毒转染效率检测

1)转染后，定时使用倒置荧光显微镜下观察转染细胞。

2)吸取转染培养后的CAR-T细胞，1000rpm离心5min收集细胞，用PBS溶液洗涤。

3)使用流式细胞仪FITC通道对细胞检测表达GFP荧光的细胞比例。

如图3所示，图3A为CAR01慢病毒转染T的效率，为67.5％，图3B为CAR02慢病毒转染T的效率，为42.1％，说明采用本发明所述的CAR结构可以明显降低分子生物学操作难度，使得转基因操作过程中的负载降低，从而提供了T细胞的转染效率。

实施例5靶向CD19CAR-T细胞的细胞因子分泌检测

为了考察经过慢病毒转染后的T细胞是否能够被有效激活，本实施例中检测CAR-T的细胞因子分泌情况，通常情况下，细胞因子分泌越多，说明T细胞的激活程度越高。本实施例中通过ELISA试剂盒检测IL-6和TNF-α的分泌情况，所述IL-6ELISA试剂盒和TNF-αELISA试剂盒均购自美国R&D公司。

5.1 IL-6因子的ELISA检测

1)分别将1×10⁶个CAR01-T细胞和CAR02-T细胞接种至6孔板中，37℃、5％CO₂培养24h。

2)吸取培养上清，1000rpm离心5min去除细胞沉淀，收获培养上清。

3)按试剂盒说明书所述步骤配置标准品。

4)取50μL上清液样品置于96孔酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

5)用封板膜封板后置于37℃恒温箱中孵育30min。

6)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复3次，拍干。

7)每孔加入酶标试剂50μL，用封板膜封板后置于37℃恒温箱中孵育30min。

8)小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复3次，拍干。

9)每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。

10)每孔加终止液50μL，终止反应。

11)450nm波长依序测量各孔的吸光度。

5.2 TNF-α因子的ELISA检测

3)按试剂盒说明书所述步骤配置标准品。

5)用封板膜封板后置于37℃恒温箱中孵育30min。

10)每孔加终止液50μL，终止反应。

11)450nm波长依序测量各孔的吸光度。

所测得细胞因子浓度采用SPSS 11.5软件进行统计分析，结果如图4所示，与CAR02T细胞相比， CAR01T细胞中的IL-6和TNF-α分泌水平均较高，并且具有统计学意义(p<0.05)，这反映出本发明中所提供的突变后的CD3ζ胞内信号域可以有效激活T细胞，而且激活能力相比于野生型CD3ζ胞内信号域有所增强，可以作为开发新型嵌合抗原受体的基因元件。

实施例6靶向CD19CAR-T细胞体外抗肿瘤效果

为检测本发明所提供的CAR-T细胞的肿瘤杀伤效果，选用可表达CD19抗原的淋巴瘤细胞Raji细胞作为体外实验对象，验证CAR-T细胞的抗肿瘤效果。

1)取稳定表达荧光素酶(Luciferase，Luc)的Raji细胞，于37℃、5％CO₂培养至处于对数生长期。

2)培养上述CAR01T细胞和CAR02T细胞，37℃、5％CO₂培养至处于对数生长期。

3)采用含10％FBS的RPMI1640培养基调整上述Raji细胞、CAR01T细胞和CAR02T细胞浓度至 5×10⁵个/mL，将Raji细胞接种于96孔板中，每孔1×10⁵个细胞。

4)按CAR-T细胞与Raji细胞的比例为1:1、3:1、5:1加入CAR-T细胞，以去离子水作为空白对照，混合均匀。

5)37℃、5％CO₂培养24h。

6)分别取出各孔板1000rpm离心5min，去除培养细胞的培养基。

7)用预热好的细胞培养基1:200稀释荧光素酶底物(D-Luciferase)储存液，配成工作液，终浓度150μg/mL。

8)向上述每孔细胞中加入荧光素工作液100μL，使用多功能酶标仪生物发光信号检测系统检测。

9)根据读板数据，计算肿瘤细胞杀伤率。

细胞杀伤率＝(1-效应细胞靶细胞共培养孔荧光强度)/单独靶细胞孔荧光强度

如图5所示，本发明中所提供的两种CAR-T细胞均能有效杀死淋巴瘤细胞，并且随着CAR-T细胞比例的增加，杀伤效果逐渐增强。此外，与CAR02相比，CAR01T细胞的杀伤能力似乎更强，在加入比例为5:1 时，对于Raji细胞的杀伤率已达80％以上，这一方面与选用经过突变改造的CD3ζ，提高了T细胞的激活程度有关(实施例4中已经证明)；另一方面CAR01中使用了本发明所提供的独特的靶向CD19的纳米抗体，该抗体不仅与CD19抗原具有较高的亲和力(如实施例1所示)，而且相对于CAR01等传统嵌合抗原受体的胞外抗原结合域仅含有抗体scFv区，不具有完整的抗体结构，故传统的嵌合抗原受体的胞外抗原结合域通常仅能够结合目标抗原，而由于抗体结构不完整，严重限制了该区域的肿瘤杀伤能力，本申请所提供的纳米抗体本身具有一定的肿瘤杀伤能力，并且与CAR-T细胞技术结合，因而产生了协同杀伤作用，故可以说明其抗肿瘤效应更强。

实施例7靶向CD19CAR-T细胞体内抗肿瘤效果

本实施例以Balb/c小鼠移植瘤模型(负载淋巴瘤Raji细胞)为生物体材料进行的相关药学实验，包括抑瘤率实验、小鼠生存期实验等检测指标，从而反映靶向CD19CAR-T细胞在抗肿瘤形成方面的治疗效果，具体的实验步骤和结果如下：

7.1动物模型制备

1)取5-6周龄BALB/C小鼠，SPF级，适应饲养一周。

2)收集处于对数生长期Raji细胞，在显微镜下计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。

3)小鼠分别皮下注射Raji细胞，1×10⁶个细胞/只，正常饲养一周。

4)每天观察其生长情况。

5)8-10天后，瘤块己经鼓起直径约5mm大小，表明肿瘤小鼠模型建立成功。

7.2动物模型抑瘤实验

1)Raji细胞荷瘤小鼠模型构建成功后，按体重随机分为3组，每组10只，雌雄对半分，具体3个组别为：空白对照组(生理盐水NS)、CAR01组(CAR01T细胞，5×10⁶细胞)、CAR02组(CAR02T细胞， 5×10⁶细胞)。

2)上述各组采用尾静脉给药，共给药一次。

3)每2天测定一体肿瘤体积，共测定20天。

4)实验结束后颈椎脱位法处死小鼠，剥取肿瘤，测量大小。

肿瘤体积计算公式:体积＝(a²xb)/2，a为肿瘤最宽部分长度，b为肿瘤最长部分长度。

如图6所示，在Raji细胞荷瘤小鼠模型中，CAR01T细胞和CAR02T细胞，相对于生理盐水，均可以明显延缓肿瘤生长，治疗组的肿瘤体积明显小于空白对照组。此外，在抑制肿瘤体积方面，CAR01T细胞相比于CAR02T细胞更加有效，从治疗后的第8天开始，CAR01组中小鼠模型肿瘤体积明显小于CAR02 组，且该组的肿瘤体积增长速度最为缓慢，说明CAR01T细胞的肿瘤抑制效果最好。

7.3小鼠生存期实验

2)上述各组采用尾静脉给药，共给药一次。

3)记录各组小鼠的死亡情况，共记录70天。

如图7所示，CAR01T细胞和CAR02T细胞均可明显提高小鼠生存率，并且CAR01T细胞的抗肿瘤效果更强，明显优于CAR02T细胞组，说明本发明所提供的新型靶向CD19的嵌合抗原受体具有更强的肿瘤抑制效果，能够有效延长实验动物的生存期。

序列表

<110> 苏州立豪生物科技有限公司

<120> 一种靶向CD19的新型嵌合抗原受体（CAR）及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Gln Val Asp Leu Asn Glu Ser Gly Gly Pro Leu Val Gln Ile Gly Asp

1 5 10 15

Val Val Ser Leu Ser Cys Trp Ala Ser Gly Pro Cys Phe Asp Trp Glu

20 25 30

Gln Leu Met Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Val Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Cys Pro Arg Trp Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ser Cys Thr Trp Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Trp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Cys Gly Trp Ser

85 90 95

Thr Pro Val Ala Val Pro Ser Ser Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Arg His Arg

115 120

<210> 2

<211> 86

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Val Lys Phe Ser Trp Ser Ala Pro His Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln

1 5 10 15

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Leu Asp Lys Arg Arg Gly

20 25 30

Arg Asp His Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Leu Gln

35 40 45

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly His Glu Arg Arg

50 55 60

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Lys Lys Asp Thr Tyr

65 70 75 80

His His Met Gln Ala Leu

85

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 4

<211> 42

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

Met Leu Pro Trp Thr Ala Leu Leu Leu Pro Thr Trp Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Pro Ile Ser

20

<210> 6

<211> 295

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

Met Leu Pro Trp Thr Ala Leu Leu Leu Pro Thr Trp Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Pro Ile Ser Gln Val Asp Leu Asn Glu Ser Gly Gly Pro Leu Val

20 25 30

Gln Ile Gly Asp Val Val Ser Leu Ser Cys Trp Ala Ser Gly Pro Cys

35 40 45

Phe Asp Trp Glu Gln Leu Met Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Val

50 55 60

Arg Glu Phe Val Ala Thr Cys Pro Arg Trp Gly Gly Ala Asn Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ser Cys Thr Trp Tyr

85 90 95

Leu Gln Met Asn Trp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Cys Gly Trp Ser Thr Pro Val Ala Val Pro Ser Ser Asp Ser Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Arg His Arg Phe Trp Val Leu

130 135 140

Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

145 150 155 160

Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr

165 170 175

Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu

180 185 190

Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

195 200 205

Leu Val Lys Phe Ser Trp Ser Ala Pro His Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

210 215 220

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Leu Asp Lys Arg Arg

225 230 235 240

Gly Arg Asp His Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Leu

245 250 255

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly His Glu Arg

260 265 270

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Lys Lys Asp Thr

275 280 285

Tyr His His Met Gln Ala Leu

290 295

<210> 7

<211> 885

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

atgctgccgt ggaccgcgct gctgctgccg acctggctgc tgctgcatgc gccgattagc 60

caggtggatc tgaacgaaag cggcggcccg ctggtgcaga ttggcgatgt ggtgagcctg 120

agctgctggg cgagcggccc gtgctttgat tgggaacagc tgatgtgggt gcgccagagc 180

ccgggcaaag tgcgcgaatt tgtggcgacc tgcccgcgct ggggcggcgc gaactatgcg 240

gatagcgtga aagatcgctt taccattagc aaaagctgca cctggtatct gcagatgaac 300

tggctgaaac cggaagatac cgcggtgtat tattgctgcg gctggagcac cccggtggcg 360

gtgccgagca gcgatagctg gggccagggc acccaggtga ccgtgagcag ccgccatcgc 420

ttttgggtgc tggtggtggt gggcggcgtg ctggcgtgct atagcctgct ggtgaccgtg 480

gcgtttatta ttttttgggt gaaacgcggc cgcaaaaaac tgctgtatat ttttaaacag 540

ccgtttatgc gcccggtgca gaccacccag gaagaagatg gctgcagctg ccgctttccg 600

gaagaagaag aaggcggctg cgaactggtg aaatttagct ggagcgcgcc gcattatcag 660

cagggccaga accagctgta taacgaactg aacctgggcc gccgcctgga taaacgccgc 720

ggccgcgatc atatgggcgg caaaccgcgc cgcaaaaacc cgcagctgca gaaagataaa 780

atggcggaag cgtatagcga aattggccat gaacgccgcc gcggcaaagg ccatgatggc 840

ctgtatcagg gcaaaaaaga tacctatcat catatgcagg cgctg 885

<210> 8

<211> 247

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Trp Val Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Met Ala Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gln Asn Ser Leu Phe Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp

85 90 95

Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro

130 135 140

Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Phe Cys Thr

145 150 155 160

Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Leu Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Asn Asn Gln Arg Pro

180 185 190

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala

195 200 205

Ser Cys Pro Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Ser Ser Lys Thr Pro Cys

210 215 220

Gly Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Val Val Phe Gly Gly

225 230 235 240

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 9

<211> 492

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

Met Leu Pro Trp Thr Ala Leu Leu Leu Pro Thr Trp Leu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Pro Ile Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

20 25 30

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Trp Val Ala Ala Ser Gly Phe Thr

35 40 45

Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Met Ala Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Arg Ile Gly Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Gln Asn Ser Leu

85 90 95

Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ala Arg Asp Gln Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Ser Ala Glu His Ala

115 120 125

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala

145 150 155 160

Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr

165 170 175

Ile Phe Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val

180 185 190

Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Pro Lys Asn

195 200 205

Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Ser Ala Ser Cys Pro Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Ser Ser

225 230 235 240

Lys Thr Pro Cys Gly Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Val

245 250 255

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

305 310 315 320

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

325 330 335

Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln

340 345 350

Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser

355 360 365

Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 10

<211> 1476

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

atgctgccgt ggaccgcgct gctgctgccg acctggctgc tgctgcatgc gccgattagc 60

gaagtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcagc cgggccgcag cctgcgcctg 120

tgggtggcgg cgagcggctt tacctttgat gattatgcga tgcattgggt gcgccaggcg 180

atggcgaaag gcctggaatg ggtgagcggc attagctgga acagcggccg cattggctat 240

gcggatagcg tgaaaggccg ctttaccatt agccagcaga acagcctgtt tctgcagatg 300

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ctgacccagc cggcgagcgt gagcggcagc ccgggccaga gcattaccat tttttgcacc 540

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aaaaccccgt gcggctattg cgcggcgtgg gatgatagcc tgagcgtggt gtttggcggc 780

ggcaccaaac tgaccgtgct gaccaccacc ccggcgccgc gcccgccgac cccggcgccg 840

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gcggtgcata cccgcggcct ggattttgcg tgcgattttt gggtgctggt ggtggtgggc 960

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cgccgcggca aaggccatga tggcctgtat cagggcctga gcaccgcgac caaagatacc 1440

tatgatgcgc tgcatatgca ggcgctgccg ccgcgc 1476

Claims

1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向CD19的纳米抗体、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述胞内信号域为突变的CD3ζ胞内信号域，所述靶向CD19的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述突变的CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述跨膜区为CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，所述信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述共刺激因子选自4-1BB，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述嵌合抗原受体氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

3.一种表达载体，其特征在于，包括编码权利要求1所述嵌合抗原受体的核苷酸或包括权利要求2所述的核苷酸。

4.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。

5.权利要求4中所述的嵌合抗原受体T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述的肿瘤包括急性淋巴细胞白血病、慢性B-淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤。