CN110204619B

CN110204619B - 包含FcγRⅠ的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN110204619B
Application number: CN201910500433.6A
Authority: CN
Inventors: 汪洋
Original assignee: Nanjing Rongjiekang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guo Wei
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN110204619A

Abstract

本公开涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种包含Fcγ受体Ⅰ的嵌合抗原受体及其应用。该嵌合抗原受体包含A)Fcγ受体Ⅰ胞外区，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区。其可通过ADCC效应，提高抗体药物的治疗效果。

Description

包含FcγRⅠ的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种包含FcγRⅠ的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。

大量研究表明，肿瘤在形成过程中，可通过多重机制，逃避免疫系统的监视，我们将这一过程称之为肿瘤组织的免疫逃逸或免疫编辑。T细胞在肿瘤免疫的过程中处于核心地位，如果能调动体内的杀伤武器，将是非常有效且安全的治疗策略。T细胞的活化启动和效应发挥的过程中至少需要两种信号存在，第一种信号是抗原特异性的，由主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)以及与其结合的抗原肽被T细胞受体(T cell reCeptor，TCR)识别并结合后，由TCR复合物向T细胞内传导激活信号；第二种激活信号是抗原非特异性的，是由抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)和T细胞上多种辅助分子之间的配对和相互作用而提供的，能够提供第二种激活信号的一类T细胞膜蛋白又被称为共刺激分子，在T细胞活化中发挥重要作用。

人类中的多种治疗策略是基于使用治疗抗体。其中包括例如使用被开发用于减少靶细胞、特别是患病的细胞如病毒感染的细胞、肿瘤细胞或其它病原细胞包括异源的免疫活性细胞的治疗抗体。这样的抗体一般是IgG种类的单克隆抗体，典型的是IgG1和IgG3。这些抗体可以是重组抗体和人源化抗体，含有不同物种或来源或特异性的功能结构域。

单克隆抗体(MAbs)已经在各种恶性肿瘤中表现出临床效力。单克隆抗体现在常用作用于治疗和/或预防癌症、自体免疫性疾病、血栓形成、炎症和感染的治疗剂。但是，有一些低抗体活性情况导致对癌症、自体免疫性疾病、炎症和感染的治疗作用不足。这样不足的药物作用可能导致治疗所需的剂量和成本提高。在这些情况下，增强单克隆抗体的治疗活性是重要的目标。目前FDA批准的用于肿瘤的单克隆抗体种类繁多，例如主要用于治疗非霍奇金淋巴瘤的利妥昔单抗，主要用于乳腺癌的曲妥珠单抗，主要用于结直肠转移癌的贝伐单抗和用于治疗淋巴瘤的Brentuximab Vedotin等。这些抗体代表了人类治疗、特别是肿瘤治疗的一种新的有效的方法，但是它们并不总是能够表现出强的效力，这些单克隆抗体主要依赖于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)效应杀死靶细胞。ADCC效应是指具有杀伤活性的细胞通过其表面表达的Fc受体(FcR)识别包被于靶抗原上的Fc段，直接杀伤靶细胞。癌症治疗过程中两种常用的手段是放疗和化疗，该方法不仅能够杀死肿瘤细胞，而且对病人的免疫细胞也会造成一定程度的损伤，因此导致ADCC效应减弱，单克隆抗体不能充分发挥治疗作用，治疗效果往往不是特别理想。

治疗性单克隆抗体优选能发挥抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，特别是在用于治疗癌症或其它细胞疾病时。也就是说，治疗性MAbs优选对它们的靶细胞，如靶癌细胞或淋巴细胞发挥细胞毒性效应。这样的抗体通过它们的Fc结构域结合至靶细胞表面上的抗原上，结合至效应细胞，如NK细胞和巨噬细胞的表面上的Fc受体上，由此在靶细胞上施加破坏。这种机制是抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。或者，抗体通过经由Fc结构域活化补体来破坏细胞。这被称作补体依赖性细胞毒性(CDC)。经由Fc结构域发挥的这种抗体活性被称作效应子活性(effectoractivity)。

Fc受体是在有助于免疫系统的保护功能的某些细胞(包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞)的表面上发现的蛋白质。Fc受体结合到附着在受感染细胞、入侵病原体或癌细胞上的抗体上。它们的活性刺激吞噬或细胞毒性细胞以通过抗体介导的吞噬作用或ADCC破坏微生物、受感染细胞或癌细胞。一些病毒如黄病毒(flaviviruses)使用Fc受体以助于它们通过被称作抗体依赖性感染增强的机制感染细胞。Fc受体参与ADCC过程。例如，在ADCC过程中，自然杀伤(NK)细胞表面上的FcγRIII受体刺激NK细胞以从它们的颗粒中释放细胞毒性分子以杀死抗体覆盖的靶细胞。

Fc受体(Fc receptor,FcR)是能特异亲和免疫球蛋白(Ig)的Fc区域的一类重要的免疫细胞表面分子。广泛表达于免疫辅助细胞和免疫效应细胞，介导免疫细胞与免疫复合物及其他细胞之间的相互作用，触发并调控机体多种免疫学效应，包括抗原加工与提呈、免疫复合物的清除、抗体生成调节、肿瘤细胞的裂解、T细胞增殖与分化等，将体液免疫和细胞免疫联系起来，从整体上看将先天性免疫和获得性免疫联系起来。一方面FcR使抗体作为“标记物”，介导特定的细胞效应事件,如抗体依赖细胞介导的细胞毒(ADCC)作用和吞噬作用，另一方面，不同的FcR利用抗体作为整体免疫调节的调控者，它们传递的信号可诱导细胞表面受体的表达、细胞因子分泌和广泛的分化的改变。FcγRI(CD64)是70kD左右的跨膜糖蛋白，由胞内区、跨膜区和3个Ig样胞外区组成，主要分布于单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等多种免疫细胞，其中在单核细胞和巨噬细胞中表达较高。FcγRI对人IgG1、IgG3和小鼠IgG2a的亲和力较高，对人IgG4、IgG2的亲和力低下。IFN-γ和G-CSF可刺激中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞表达FcγRI的水平增加5～10倍，人FcγRI由hu FcγRI A、hu FcγRI B和加hu FcγRI C 3个同源基因编码形成4种转录体。hu FcγRI A编码含3个Ig样结构域的跨膜受体，是唯一的高亲和力结合IgG单体的FcγR，在低抗体浓度下可结合免疫复合物，诱导免疫细胞对抗原的摄入加工及提呈等，在免疫细胞中，FcγRI A与FcRγ链形成复合体表达于细胞表面，并通过γ链的AM基序进行信号传导。hu FcγRI b1和huFcγRIC因缺失跨膜区和胞内区形成可溶性受体。hu FcγRI b2是huFcRIB的选择性剪接产物，缺失第三个胞外区，编码含2个Ig样结构域的跨膜受体，该受体只结合IgG复合物，而不能结合IgG单体，推断胞外区第三个Ig结构域可能对该受体的高亲和力起关键作用。

现有技术进一步需要改进单克隆抗体的治疗效力。需要增强抗体的效应子功能，例如增强抗体的ADCC功能。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

基于以上问题，本公开旨在设计一种FcγRⅠ嵌合受体，通过在淋巴细胞表面表达FcγRⅠ嵌合受体，构建重组细胞。使用时向受试者给予有效量的该遗传修饰的细胞，同时给予抗体联合治疗，该方法可用于预防和/或治疗和/或辅助治疗肿瘤抗原表达相关疾病或者其他需要使用抗体治疗的疾病。

本公开所提供的嵌合受体，其包含A)FcγRⅠ胞外区，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区。

在FcγRⅠ嵌合受体设计方面，本公开采用了一种类似于嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术的方法。CAR-CD19的T细胞在治疗CD19特异性的B淋巴细胞瘤方面已经获得了显著疗效。目前临床上常用的为二代CAR-T和三代CAR-T，二代CAR-T主要包括单抗scFv、CD8α铰合区、CD8α跨膜区和胞内信号转导区CD3ζ和4-1BB，三代CAR-T则比二代CAR-T增加了一个共刺激区，最常用的为CD28。基于以上设计理念，我们将三代CAR-T中的ScFv替换为FcγRⅠ的胞外区域，即由FcγRⅠ信号肽、FcγRⅠ胞外区、CD8α铰链区、CD28跨膜信号区、胞内信号转导区4-1BB和CD3ζ组成的嵌合基因，其中CD28既为跨膜区，又为信号传导区。该设计一方面保留了T淋巴细胞激活的必要组成部分，另一方面FcγRⅠ可通过ADCC效应，提高单克隆抗体药物的治疗效果。

根据本公开的一方面，本公开还涉及含有如上所述核酸分子的载体；

根据本公开的一方面，本公开还涉及表达嵌合受体的细胞，其被如上所述的载体所转化。

本公开还提供了制备权利要求如上所述的表达嵌合受体的细胞的体外方法。

本公开还涉及组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂以及如上所述的表达嵌合受体的细胞。

组合物是含有治疗作用药物的组合物，将该组合物给予需要药物治疗的病人。在一个实施方案中，所述药品是含有抗体的药品，例如重组生产的抗体药物。对于重组抗体药物而言，重组抗体药物最初在宿主细胞中产生，经过重组DNA技术的细胞融合、收获、纯化抗体并配制成抗体药物。本技术领域众所周知生产抗体细胞类型的选择、修饰酶(例如糖类转移酶)的共转染和培养和/或工艺条件的不同可能影响所获得抗体的药效。重组肽的生产也同样。重组抗体的收获、纯化和配方方法在工艺上是已知的，可能包含一步或更多步骤例如净化、浓缩、过滤和色谱层析(例如分子排阻和离子交换层析)。除了药物以外，组合物还包含任何数量的其他例如在纯化过程中添加的成份，这些成份应当是药用上可接受的，例如载体、稀释剂、佐剂和辅料。药用载体或稀释剂还有任何其他已知佐剂和辅料的实例都是本领域技术人员已知的。

根据本公开的一方面，本公开还涉及如上所述的表达嵌合受体的细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗和/或辅助治疗疾病药物中的应用；其中所述疾病由于病毒或异常细胞导致。

附图说明

下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本公开所提供的Fcγ受体Ⅰ嵌合受体结构示意图；

图2为本公开一个实施例中pCAR慢病毒过表达载体结构示意图；

图3为本公开一个实施例中pCAR-Fcγ受体Ⅰ慢病毒过表达载体构建双酶切电泳图；

将构建好的pCAR-Fcγ受体Ⅰ慢病毒载体用Xba I和BstB I双酶切后获取目的基因片段和载体，其中目的基因片段长度为1692bp；泳道1为未酶切的重组pCAR-Fcγ受体Ⅰ质粒，泳道2为重组pCAR-Fcγ受体Ⅰ质粒经Xba I和BstB I双酶切的产物；

DL15000：15000bp DNA Ladder Marker；

1：pCAR-Fcγ受体Ⅰ；2：pCAR-Fcγ受体Ⅰ/BstBⅠ+XbaⅠ；

图4pCAR-Fcγ受体Ⅰ慢病毒滴度检测结果图；

pCAR为不含Fcγ受体Ⅰ嵌合基因的空病毒，pCAR-Fcγ受体Ⅰ为含有Fcγ受体Ⅰ嵌合基因的病毒；

图5为本公开一个实施例中Jurkat细胞验证Fcγ受体Ⅰ的过表达；

A：Jurkat细胞转染Fcγ受体Ⅰ的Q-PCR检测结果；

B：Jurkat细胞转染Fcγ受体Ⅰ的流式检测结果；

图6为本公开一个实施例中PBMC的分离；

由图可见，经密度梯度离心后的人血可分为清晰可见的四层，从上到下依次为血浆层、淋巴细胞层、分离液层和红细胞层，收集第二层雾状淋巴细胞层即为PBMC；

图7为本公开一个实施例中CD3⁺T淋巴细胞的磁珠分选；

采用hCD3磁珠对PBMC进行阳性分选；A：磁珠分选前B：磁珠分选后；

图8为本公开一个实施例中最佳感染条件的摸索；

A：病毒感染48小时后荧光显微镜检测结果(设置MOI＝20、50、100、150，polybrene浓度为0、2、4、6、8、10微克/毫升，例如20-0表示MOI＝20，polybrene＝0微克/毫升)；

B：台盼蓝染色检测细胞活率；

图9为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T细胞的构建；

blank为空白对照组，是指不加病毒、不加polybrene的细胞对照组，pCAR为空病毒感染对照组，pCAR-Fcγ受体Ⅰ为实验组；该图所用检测方法为流式细胞术检测法；

图10为本公开一个实施例中WB检测CD3ζ的磷酸化水平结果图；

图11为本公开一个实施例中EGFR高表达细胞株的鉴定；

使用流式细胞术法对图中细胞表面EGFR进行检测；其中sgc7901为人胃腺癌细胞，HCT116为人结肠癌细胞，BGC-823为人胃腺癌细胞，Caco-2为人结肠腺癌细胞，MKN-45为人胃癌细胞；

图12为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合Nimotuzumab的ADCC效应检测(LDH乳酸脱氢酶检测法)；

A：不同效靶比(E:T)对ADCC作用的影响结果；靶细胞为sgc7901、HCT116和MKN-45，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为4小时；

B：不同抗体浓度对ADCC作用的影响结果；靶细胞为sgc7901、HCT116和MKN-45，E:T为10:1，孵育时间为4小时；

C：sgc7901、HCT116、MKN-45的ADCC效应；

图13为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合Nimotuzumab肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果；

检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为24小时，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45；

图A、图B、图C分别为hIL-2、hIFNγ、和hTNF-α的ELISA检测结果；

图14为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与EGFR高表达肿瘤细胞和Nimotuzumab共孵育的“玫瑰花环”实验；

检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为4小时，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45；

图15为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与EGFR高表达肿瘤细胞和Nimotuzumab共孵育后CD107a的流式检测结果；

检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为4小时，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45；CD107a为免疫细胞活化后脱颗粒的标记；

图16为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞表面FasL以及EGFR高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果；

检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为4小时，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45；FasL是能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，在T-cell发育中介导其由于细胞毒性引起的凋亡；Fas主要表达在肿瘤细胞表面，FasL主要表达在T淋巴细胞表面；

图17为本公开一个实施例中PD-L1高表达细胞株的鉴定；

使用流式细胞术法对图中细胞表面PD-L1进行检测；

图18为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合pembrolizumab的ADCC效应检测；

图19为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合pembrolizumab肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果；

图20为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与PD-L1高表达肿瘤细胞和pembrolizumab共孵育后CD107a的流式检测结果；

图21为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与PD-L1高表达肿瘤细胞和单pembrolizumab共孵育后CD107a的流式检测结果(A：Fas；B：FasL；检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为4小时，靶细胞为HCT116、sgc7901、BGC-823、Caco-2、MKN-45)；

图22为本公开一个实施例中Her-2高表达细胞株的鉴定；Her-2高表达细胞株：SKBr-3、skov-3、JIMT-1(乳腺癌细胞株)阴性对照细胞株：MCF-7(乳腺癌细胞株)；

图23为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合曲妥珠单抗的ADCC效应检测；

图24为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合曲妥珠单抗肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果(A:hIL-2；B：hIFN-γ；C：hTNF-α；检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为24小时)；

图25为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与Her-2高表达肿瘤细胞和曲妥珠单抗共孵育后CD107a的流式检测结果(检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为4小时，靶细胞为SKBr-3、skov-3、JIMT-1、MCF-7)；

图26为本公开一个实施例中Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞表面FasL以及EGFR高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果；检测条件为E:T＝10:1，抗体浓度为0.01微克/毫升，孵育时间为4小时，靶细胞为H460、H358、EKVX、H1993；FasL是能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，在T-cell发育中介导其由于细胞毒性引起的凋亡；Fas主要表达在肿瘤细胞表面，FasL主要表达在T淋巴细胞表面。

具体实施方式

本公开涉及一种嵌合受体，其包含A)Fcγ受体Ⅰ胞外区，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述Fcγ受体Ⅰ胞外区的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述Fcγ受体Ⅰ嵌合受体还包括信号肽区；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述信号肽区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述铰链区选自CD8α的hinge区；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述铰链区氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述跨膜域选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述跨膜域选自CD28；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述跨膜域氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、PKCθ、FcεRIγ、ZAP70、和CD3ζ中的任一种，或其任意组合；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述胞内信号传导区选自4-1BB以及CD3ζ；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体包含A)Fcγ受体Ⅰ胞外区，B)CD8α铰链区，C)CD28跨膜域和D)4-1BB以及CD3ζ的胞内信号传导区。

所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

Fcγ受体Ⅰ信号肽可指导Fcγ受体Ⅰ分子的穿膜表达和后期剪切。铰链区使Fcγ受体Ⅰ具有灵活性，有利于Fcγ受体Ⅰ与与抗体Fc片段的互补性结合。跨膜信号区CD28既为跨膜分子，又充当胞内信号传导分子，这样可缩短嵌合分子的大小，有利于其构建表达，同时又不会影响信号传递过程。胞内信号传导分子4-1BB和CD3ζ则在T淋巴细胞的激活、信号传导以及体外存活方面发挥着重要的作用。

根据本公开的另一方面，本公开还涉及一种分离的核酸分子，其为DNA或RNA，能够表达得到如上所述的嵌合受体；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述Fcγ受体Ⅰ胞外区的核苷酸序列如SEQID NO：7所示；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述跨膜域的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述胞内信号传导区由4-1BB以及CD3ζ组成，4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述信号肽区的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

根据本公开的另一方面，本公开还涉及含有如上所述核酸分子的载体；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述载体选自逆转录病毒载体、腺病毒、腺病毒相关病毒或CRISPR/CAS质粒；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述逆转录病毒载体为慢病毒载体；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述CRISPR/CAS质粒选自CRISPR/CAS-1、CRISPR/CAS-5、CRISPR/CAS-7、CRISPR/CAS-9、CRISPR/CAS-2、CRISPR/CAS-3、CRISPR/CAS-10中的任一种。

根据本公开的另一方面，本公开还涉及表达嵌合受体的细胞，其被如上所述的载体所转化。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述宿主细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述T细胞为辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任意一种。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述宿主细胞是原代的。

在本公开的一些具体的实施方式中，本公开提供了一种慢病毒感染原代T淋巴细胞的方法。

根据本公开的一方面，本公开还涉及制备如上所述的表达嵌合受体的细胞的体外方法，其包括：

a)提供如上内容中所提及的核苷酸序列，并将所述核苷酸序列按顺序拼接得到用于表达嵌合受体的嵌合核酸片段；

b)将所述嵌合核酸片段连接入权利要求如上所述载体；

c)将所述载体转染入如上所述的宿主细胞并表达出嵌合受体。

在本公开的一些具体的实施方式中，转染的MOI＝40～60；在本公开的一些具体的实施方式中，转染的MOI还可以选择41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。

在本公开的一些具体的实施方式中，转染时加入polybrene，更优选加入的浓度为6～14微克/毫升，也可以选择8微克/毫升、9微克/毫升、11微克/毫升、12微克/毫升，优选10微克/毫升的polybrene。

在本公开的一些具体的实施方式中，在T淋巴细胞活化30～42小时，优选33～39小时，更优选36小时后进行第一次转染，活化42～54小时，优选45～51小时，更优选48小时后进行第二次转染。

由于T淋巴细胞很难转染外源基因，因此本公开采用了加入助染剂聚凝胺(polybrene)的方法。polybrene是一种阳离子聚合物，可通过中和细胞表面的唾液酸和病毒粒子之间的电荷排斥实现提高细胞转染效率的目的，但是polybrene对细胞存在一定的毒性，故在使用前应对其最适使用浓度进行摸索。病毒感染复数(MOI)是指病毒量与细胞数的比值，MOI值越大，说明细胞越难感染，需要加入的病毒量越大。本公开对CD3磁珠分选后的T细胞的最适MOI和polybrene的工作浓度进行了摸索，最终确定了MOI＝50，polybrene的工作浓度为8微克/毫升为最适感染条件。为了进一步提高其转染效率，本公开还采用了二次感染的方法，在T细胞活化36小时左右后进行第一次感染，感染48小时左右后进行第二次感染，结果表明，二次感染的细胞转染效率较单次感染的效率大大提高，因此本公开优先采用二次感染的方法。

根据本公开的一方面，本公开还涉及一种组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂以及如上所述的表达嵌合受体的细胞；优选T细胞。

在本公开的一些具体的实施方式中该组合物用于治疗疾病，例如肿瘤，病毒感染或其他病原体感染，包含提供细胞免疫应答的嵌合受体修饰的细胞，优选T淋巴细胞(尤其是CD8+细胞毒性)制剂和药学上可接受的载体。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述组合物中还包含抗体，抗体优选自派姆单抗(Pembrolizumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)以及尼妥珠单抗(Nimotuzumab)。

在诊断、预防、治疗或改善癌症的症状的方法中，本公开的嵌合抗原受体典型地以缀合物转导的细胞形式给予，所述缀合物转导的细胞如T细胞、NK细胞或淋巴细胞，包括但不限于NKT细胞、γδT细胞、粘膜相关恒定T细胞或固有淋巴细胞。将本公开公开的核酸、载体或宿主细胞与生理学上合适的缓冲液、佐剂或稀释剂组合得到根据本公开的医药组合物，并且这些医药组合物适用于给药以诊断、预防、治疗或改善癌症的症状。

根据本公开的另一方面，本公开还涉及如上所述的表达嵌合受体的细胞或如上所述的组合物在制备用于预防和/或治疗和/或辅助治疗疾病药物中的应用；其中所述疾病由于病毒或异常细胞导致。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述异常细胞包括肿瘤细胞，所述肿瘤包括：骨、骨连接、血液、毛细血管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、睾丸、输精管、阴茎、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、外阴部、阴囊、静脉、眼、耳、鼻、舌、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、淋巴结、淋巴管、胸腺、肝、胆、胰腺、腮腺、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、舌下腺、性腺、舌下腺中任一处病变生成的肿瘤；

在本公开的一些具体的实施方式中，所述病毒选自腺病毒科(adenoviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、星状病毒科(astroviridae)、本雅病毒科(bunyaviridae)、D型肝炎病毒(hepatitis delta virus)、小RNA病毒科(picornaviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、肝炎病毒科(hepeviridae)、单分子负链RNA病毒目(mononegavirales)、网巢病毒目(nidovirales)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、反转录病毒科(retroviridae)或披膜病毒科(togaviridae)中的一种或多种。

下面将结合实施例对本公开的实施方案进行详细描述；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均是可以通过市场购买获得的常规产品。

实施例1 pCAR-Fcγ受体Ⅰ慢病毒过表达载体的构建

NCBI获取Fcγ受体Ⅰ的信号肽区和胞外区基因序列以及对应氨基酸序列，同样方法获取跨膜区CD28、胞内信号区4-1BB以及CD3ζ的基因序列以及对应氨基酸序列，构成Fcγ受体Ⅰ嵌合基因，图1为Fcγ受体Ⅰ嵌合基因结构示意图。基因两端分别加上BstBI和XbaI酶切位点，全长1692bp，送至上海捷瑞生物工程有限公司合成后，获得克隆有目的基因的载体PGH-Z1528G。慢病毒过表达载体pCAR购自爱康得生物医学技术(苏州)有限公司和汉恒生物，具体图谱参照图2。

将PGH-Z1528G和pCAR质粒载体分别转化至感受态大肠杆菌DH5α中扩增，试剂盒抽提新鲜的PGH-Z1528G和pCAR质粒，用BstBI和XbaI限制性内切酶对PGH-Z1528G和pCAR质粒分别进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳、割胶回收获得Fcγ受体Ⅰ嵌合基因片段和载体片段，随后用T4DNA连接酶16摄氏度连接过夜，连接子转化至感受态大肠杆菌DH5α中，次日挑取单菌落，重新接种后提取质粒，进行双酶切验证及测序分析，确保目的基因的完整性及插入片段的正确性。

对双酶切验证正确及测序比对正确的质粒，本公开将其命名为pCAR-Fcγ受体Ⅰ，图3为双酶切验证图，泳道1为未酶切的重组pCAR-Fcγ受体Ⅰ质粒，泳道2为重组pCAR-Fcγ受体Ⅰ质粒经Xba I和BstB I双酶切的产物。结果显示，双酶切后目的基因片段和载体片段位置大小正确，结合测序序列比对结果，说明Fcγ受体Ⅰ嵌合基因已成功构建至载体pCAR上，可以用于下一步实验。将pCAR-Fcγ受体Ⅰ重新转化感受态大肠杆菌DH5α扩增，按照无内毒素质粒提取试剂盒说明书的要求，抽提无内毒素质粒，通过微量分光光度计测定相应质粒的浓度(一般要求质粒浓度大于500纳克/微升)后待用。

本公开采用三质粒慢病毒包装系统，因此，除了表达质粒pCAR-Fcγ受体Ⅰ之外，另外两个辅助质粒我们选用了本实验室保存的pMD2.G和psPAX2，同样转化大肠杆菌扩增后提取无内毒素质粒，测序验证正确后待用。

实施例2 pCAR-Fcγ受体Ⅰ慢病毒的制备

嵌合基因Fcγ受体Ⅰ的慢病毒制备、纯化和浓缩采用如下所述方法：

1.HEK293T细胞的冻存

细胞冻存时细胞密度最好为60％～80％，此时细胞处于对数生长期，增殖旺盛，细胞状态良好。

1)取出细胞，加入胰酶消化，终止消化后，将细胞转入15mL离心管中，1000r/min离心5min；

2)按照DMSO与FBS的比例为1:9(V/V)配制细胞冻存液，配制好的细胞冻存液需放入4℃冰箱预冷；

3)离心结束后，弃除培养基上清，加入预冷的冻存液，移液枪重悬细胞沉淀后，按照1mL/管分装至冻存管中，做好标记，放入加满异丙醇并事先恢复至室温的梯度降温盒中，将梯度降温盒直接放入-80℃冰箱即可，长期保存需要转移至液氮罐中。

复苏一支-80摄氏度冻存的HEK293T细胞至T75一次性塑料培养皿中，待细胞长满后用胰酶消化，传代至新的100mm培养皿中，37摄氏度，5％二氧化碳培养箱中培养过夜。第二天，待细胞融合度为70％-80％时最适合进行转染，转染试剂为abm2500G PLUS(南京爱必梦生物科技有限公司)，按照abm2500G PLUS转染试剂说明书进行转染。

2.转染后6小时将培养基更换为新鲜的含10％FBS的DMEM高糖培养基。转染48小时后收集细胞上清至干净的50毫升无菌离心管，4摄氏度保存，并添加新的培养基，重新放回培养箱继续培养，转染72小时后二次收集培养上清至同一离心管中并丢弃细胞及培养皿。

3.4摄氏度，2000g离心5分钟去除细胞及大的细胞碎片，将上清用0.45μm滤器过滤至新的无菌离心管中，4摄氏度可暂存过夜，长期保存需置于-80摄氏度，但是要尽量避免反复冻融。

慢病毒浓缩方法包括但不限于超速离心法、透析法、超滤法等，本公开优选超高速离心法，具体步骤如下：无菌条件下，将上述纯化好的病毒上清装至超速离心管中，注意配平，4摄氏度，72000g/分钟离心120分钟，弃除上清，用新鲜培养基重悬沉淀，集中后的病毒悬液分装成110微升每份，保存在成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80摄氏度冰箱中，另留取少量病毒悬液用于后续滴度检测。

pCAR-Fcγ受体Ⅰ慢病毒滴度检测采用如下所述方法：

由于表达载体pCAR-Fcγ受体Ⅰ上无荧光标记，故本公开采用Q-PCR的方法对上述病毒进行滴度检测，选用慢病毒滴度检测试剂盒(南京爱必梦生物科技有限公司)检测其滴度，按照说明书进行病毒裂解、加样、上机。图4是Q-PCR检测病毒滴度结果，其中pCAR为不含Fcγ受体Ⅰ嵌合基因的空病毒，pCAR-Fcγ受体Ⅰ为含有Fcγ受体Ⅰ嵌合基因的病毒，结果显示，浓缩后的病毒滴度可达到10⁸以上，可满足后续实验的要求。

实施例3 Jurkat细胞初步验证Fcγ受体Ⅰ的过表达

Jurkat细胞是人外周血白血病细胞，在血液肿瘤及免疫学研究中具有广泛应用，因其生理特性与T淋巴细胞最为接近，故本公开用Jurkat细胞初步验证Fcγ受体Ⅰ的过表达情况，一方面可判断包装的病毒是否正确和具有感染性，另一方面，可判断Fcγ受体Ⅰ蛋白是否可以正确转录和翻译。

Jurkat细胞的复苏

Jurkat细胞的复苏具体步骤参考上述HEK293T细胞的复苏，但是需要注意的是，Jurkat细胞所用培养基为RPMI 1640，使用前加入10％FBS即可。

Jurkat细胞的传代

Jurkat细胞为悬浮细胞，显微镜下观察细胞密度为60％-80％时即可进行传代，传代时轻轻吹打培养基，使细胞全部悬浮，将培养基全部吸出至15mL离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀，用3mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀为单细胞悬液，每瓶1mL细胞悬液加入至新的细胞培养瓶中，用新鲜培养基补足至5mL培养体系，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。

Jurkat细胞的冻存

Jurkat细胞的冻存具体步骤参考HEK293T细胞的冻存。

提前一天将Jurkat细胞按照适当的细胞密度铺至24孔板，37摄氏度，5％二氧化碳培养过夜，次日取出平板，1000转/分子室温平板离心10分钟，轻轻移除细胞上清，加入正常体积一半的含10％FBS的1640培养基，按照MOI＝20加入适当体积的上述浓缩好的病毒，放回培养箱继续培养，4小时后将培养基补足至正常体积，继续培养。于感染后24小时换液，感染96小时后即可收集细胞用于检测。

本公开采用Q-PCR法和流式细胞术法检测Jurkat细胞中Fcγ受体Ⅰ的表达情况。收集细胞，提取总RNA，经逆转录成cDNA后进行Q-PCR检测，检测结果如图5-A所示，结果表明，与对照组相比，实验组在基因转录水平上具有显著差异。流式细胞术检测细胞表面Fcγ受体Ⅰ的表达，结果显示，实验组较对照组的Fcγ受体Ⅰ表达量有明显提高，由0.6％提高至77.2％。综上，本公开使用的慢病毒具有较强的感染性，可介导Fcγ受体Ⅰ正确表达于细胞表面。

实施例4 T淋巴细胞的分离制备

新鲜血液来源于患者或者健康供者，采用经典的Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(PBMC)。取15毫升新鲜人抗凝血液，与磷酸盐缓冲液PBS按照1：1比例混匀稀释。于15毫升离心管中预先加入3毫升淋巴细胞分离液，用滴管沿离心管壁缓慢加入5毫升稀释后的新鲜血液于分离液液面上，保持界面清晰，水平离心1690转/分子，30分钟。离心后离心管内液体分为如图6所示的四层，上层为血浆，下层主要为红细胞和粒细胞沉淀，中间层为淋巴细胞分离液，在中上层液面交界处有一层明显的乳白色云雾状狭带，此带富含淋巴细胞和单个核细胞(PBMCs)。用一次性滴管轻轻吸取云雾状的细胞，转移入另一新的离心管中。按照1：10比例(V/V)加入PBS，充分混合均匀后，水平离心1200转/分子，10分钟，弃去上清液，细胞沉淀以同样方法再洗涤2次。最后一次洗涤后进行细胞计数，置于培养皿中过夜贴壁，去除贴壁细胞。

CD3⁺T淋巴细胞的磁珠分选：

1.细胞收集：用移液枪吸取上述经过夜贴壁处理的细胞上清，置于15毫升无菌离心管中，300g室温离心10分钟，弃上清，沉淀用PBS重悬，计数。

2.根据实验需求，吸取适量细胞悬液，300g室温离心10分钟，弃上清。

3.按照每10⁷个cell加80微升MACS buffer和20微升human anti-CD3磁珠的标准，向细胞沉淀中加入适当体积的MACS buffer和anti-CD3磁珠，重悬，移液枪轻吹重悬细胞沉淀为单细胞悬液。4摄氏度，暗处孵育15分钟，中间每隔5min轻弹一次，磁珠在使用前最好用移液枪轻轻吹匀。

4.孵育结束后，加1-2毫升MACS buffer，300g室温离心10分钟，弃上清，加入500微升MACS buffer重悬，标本液制备完毕。

5.将LS磁珠分选柱正确放置在磁力架上，加入3毫升MACS buffer润洗柱子。

6.待液体快要流尽时，逐滴加入步骤4中的标本液，柱子下面放置一个干净的离心管收集阴性细胞。

7.待液体快要流尽时，加入3毫升MACS buffer洗柱子，重复洗涤2次，充分回收阴性细胞。

8.待液体彻底流尽后，取下柱子，置于一个干净的15毫升离心管上，加入5毫升MACS buffer，使用磁珠分选柱配套的活塞快速推尽液体，收集的细胞即为CD3阳性细胞。

9.加入适量的MACS buffer，300g室温离心10分钟，弃上清，清洗细胞。

10.加入含10％FBS的1640培养基，细胞计数，调整细胞密度至适当浓度后铺于预先包被好anti-CD3单克隆抗体的24孔板中，加入终浓度为1微克/毫升human anti-CD28使T淋巴细胞活化，加入终浓度为100单位/毫升的hIL-2维持T淋巴细胞生长并使其扩增。

图7为CD3⁺T淋巴细胞的磁珠分选结果，其中A图为磁珠分选前的流式检测结果，图B为磁珠分选后的流式检测结果图。对比可看出，分选前CD3⁺T淋巴细胞的比例为38.4％，磁珠分选后CD3⁺T淋巴细胞的比例可达到97.6％，说明磁珠分选效果好，分选后CD3⁺T淋巴细胞的纯度高，为下一步实验奠定了基础。

实施例5慢病毒最佳感染条件的确立

使用上述浓缩好的慢病毒感染human CD3⁺T淋巴细胞，具体步骤如下：

1)polybrene的预处理：T淋巴细胞活化36小时后，取出平板，1200r/分钟室温平板离心10分钟，小心吸除培养上清，更换为正常培养体积一半的含10％FBS的1640新鲜培养基，设置polybrene的浓度为0微克/毫升、2微克/毫升、4微克/毫升、6微克/毫升、8微克/毫升、10微克/毫升的浓度梯度，37摄氏度预处理15分钟；

2)提前从-80摄氏度冰箱取出病毒，4摄氏度溶解彻底，然后按照MOI＝20、50、100和150加入对应体积的病毒液，封好，放入平板离心机中，400g室温离心1小时使病毒颗粒与细胞混合均匀，离心有利于病毒颗粒与细胞的接触；

3)离心结束后，将96孔板重新放回37摄氏度，5％二氧化碳培养箱中继续培养；

4)感染6小时后补齐培养液至正常体积。感染24小时后，更换新鲜培养基，并补加anti-CD28和hIL-2，继续放置于37摄氏度，5％二氧化碳培养箱中培养；

5)于病毒感染48小时后，利用相同的感染条件进行二次感染，具体操作见步骤1到4；

6)继续培养48小时后，荧光显微镜下观察感染情况，收集细胞，使用1％台盼蓝染色，Countstar仪下观察细胞活率。结果图如图8-A和8-B所示。

实施例6 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T细胞的流式细胞术检测

1.设置分组：空白组、pCAR双染组和pCAR-Fcγ受体Ⅰ双染组。

2.每组取1×10⁶个上述细胞，加入1毫升PBS 1200转/分子，4摄氏度离心5分钟清洗细胞。

3.重复清洗细胞1次。

4.加入1:100稀释的APC Mouse anti-human CD3和FITC Mouse anti-human CD64表面标记流式抗体，轻轻振荡混匀，冰上暗处孵育30分钟，孵育期间可取出混匀一次。

5.加入1毫升PBS 1200转/分子，4摄氏度离心5分钟清洗细胞，重复清洗2次，加500微升PBS重悬即可上机检测。流式检测结果如图9所示，从图中经过分析可以看出，pCAR感染效率为2.6％，pCAR-Fcγ受体Ⅰ感染效率为55.2％，与对照组相比，pCAR-Fcγ受体Ⅰ组的Fcγ受体Ⅰ(CD64)的表达量有显著提高，说明约有55.2％的T淋巴细胞成功表达了Fcγ受体Ⅰ。

实施例7 WB检测CD3ζ的磷酸化水平结果图

收集对照组和实验组的病毒感染的T淋巴细胞，细胞裂解提取总蛋白，WB检测内源性的CD3ζ和磷酸化CD3ζ的蛋白表达情况，本公开检测的CD3ζ磷酸化位点为Y83，使用的抗体为anti-CD3zeta(phospho Y83)，检测结果如图10所示，检测结果表明Fcγ受体Ⅰ融合蛋白在T淋巴细胞中已成功表达，并可在外源分子的刺激下成功激活。

实施例8 EGFR高表达肿瘤细胞株的鉴定

1)肿瘤细胞的复苏、传代和冻存

选用本实验室保藏的人结肠癌细胞株HCT116和人胃癌细胞株sgc7901、BGC-823，MKN45(MKN-45为人低分化胃癌细胞)复苏、传代和冻存时，HCT116、sgc7901、BGC-823使用RPMI1640培养基，血清浓度均为10％。

2)流式细胞术检测EGFR的表达

取1×10⁶个上述肿瘤细胞，消化、离心和清洗后，流式染色，随后上机检测即可。流式抗体选用PE Mouse anti-human EGFR。

结果显示，BGC-823、Caco-2、sgc7901、HCT116表面EGFR的表达均处于较高水平，但MKN-45表面EGFR的表达量几乎为零，因此本公开将MKN-45作为EGFR阴性对照细胞。

实施例9 LDH释放法检测FcγRⅠ嵌合受体T细胞联合Nimotuzumab的ADCC效应

提前一天将靶细胞消化、离心和清洗后，按照5×10³个/孔将肿瘤细胞铺至圆底96孔板中，同时设置试验分组，每组设置三个复孔，终体积与实验孔相等：

1)靶细胞自发LDH释放：将靶细胞按照5×10³个/孔的标准铺至96孔板中；

2)效应细胞自发LDH释放：根据效应细胞/靶细胞(E/T)比例，将5×10⁴个效应细胞铺至96孔板中；

3)靶细胞最大LDH释放：将靶细胞按照5×10³个/孔的标准铺至96孔板中，并在收获上清前15min，加入10％实验孔体积的细胞裂解液；

4)体积校正对照：加入与实验孔体积相等的培养基，另外收获上清前15min，加入10％实验孔体积的细胞裂解液，目的是校正靶细胞最大LDH释放孔因加入细胞裂解液后终体积大于实验孔而影响最终测量值；

5)培养基背景：加入与实验孔体积相等的培养基，用于校正反应产物引起的背景吸光值；

6)实验孔：向96孔板中的所有实验孔加入5×10³个靶细胞。

靶细胞过夜贴壁后，弃去培养基上清，用含5％FBS的1640培养基洗细胞三次，按照实验要求在实验孔中加入5×10⁴个效应细胞，同时设置不同浓度的抗体，分别为10微克/毫升、1微克/毫升、0.1微克/毫升、0.01微克/毫升和0微克/毫升，放置于37摄氏度，5％二氧化碳培养箱中共孵育4小时，按照以下步骤对LDH进行检测：

1)孵育结束前15分钟，于靶细胞最大释放孔和体积校正孔各加入5微升lysissolution，37℃避光孵育；

2)取出平板，室温平板离心1200转/分钟×10分钟，将100微升上清转移至新的96孔平底板中；

3)配置混合液：按照100test需要250微升的solution1和11.25毫升的solution2，配置所需体积的混合液；

4)每孔加入100微升上述新鲜配置的反应混合液，5～25摄氏度避光孵育30分钟。

孵育结束后，每孔加入50微升反应终止液，轻摇10秒，于490nm或492nm处检测吸光值(检测波长)，600nm处检测吸光值(校正波长)。

本公开对不同抗体浓度和不同的E/T对ADCC效应的影响进行了探究，抗体浓度设置梯度：0.001、0.01、0.1、1微克/毫升，E/T设置比例：2:1、5:1、10:1、20:1，结果如图12所示。B图反映了不同抗体浓度对ADCC效应的影响，从图中经过分析可以看出，当抗体浓度为0.01微克/毫升时，效应细胞对肿瘤细胞的杀伤能力最强。A图反映了不同E/T比例对ADCC效应的影响，从图中经过分析可以看出，当E/T为10:1时，细胞裂解率最大，ADCC效应最强。综上，本公开确定了ADCC效应的最佳条件为抗体浓度为0.01微克/毫升，E/T为10:1。在上述最佳条件下，检测sgc7901、HCT116、MKN-45的ADCC效应，结果如C图所示，从图中经过分析可以看出，同等条件下，与对照组相比，Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞可介导更强的ADCC效应。

实施例10 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合Nimotuzumab肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果

本公开使用ELISA法对肿瘤细胞sgc7901和HCT116与效应细胞Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞共孵育24小时后的细胞上清进行了检测，检测指标为hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α，检测结果如图13所示。图A、图B、图C分别为hIL-2、hIFNγ、和hTNF-α的ELISA检测结果。结果显示，与对照组相比，pCAR-Fcγ受体Ⅰ组的hIL-2、hIFN-γ、和hTNF-α的表达量均有显著提高，提示Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞较单纯的T淋巴细胞可通过释放肿瘤杀伤细胞因子引发更强的细胞杀伤，即具有更强的肿瘤杀伤能力。

实施例11 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与EGFR高表达肿瘤细胞和Nimotuzumab共孵育的“玫瑰花环”实验

本公开将Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与HCT116、sgc7901、BGC-823共孵育4小时，PBS洗去未结合的T淋巴细胞，显微镜下观察“玫瑰花”的形态、大小、数量，结果如图所示。图14可以看出，对照组基本没有出现“玫瑰花环”现象，实验组则可以明显看出上文所述的“玫瑰花环”样细胞团，由此推断，本公开构建的Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞可以通过Nimotuzumab靶向肿瘤细胞，发挥杀伤作用。

实施例12 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与EGFR高表达肿瘤细胞和Nimotuzumab共孵育后CD107a的流式检测结果

Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与sgc7901、HCT116、Caco-2、BGC-823、MKN-45和Nimotuzumab共孵育24小时后，流式检测T淋巴细胞表面CD107a的表达，检测结果如图15所示，从图中经过分析可以看出，较对照组，sgc7901、HCT116、Caco-2、BGC-823实验组Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞表面CD107a的表达量分别提高了约26％、16％、17％、23％。CD107a反映了免疫细胞脱颗粒，活化具备杀伤功能的情况，其表达量的上升说明Nimotuzumab可诱导Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞脱颗粒为具有杀伤功能的T淋巴细胞。

实施例13 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞表面FasL以及EGFR高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果

Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与sgc7901、HCT116、Caco-2、BGC-823、MKN-45和Nimotuzumab共孵育24小时后，流式检测肿瘤细胞表面的Fas和T淋巴细胞表面的FasL，FasL是能够结合到死亡受体TNFRSF6/FAS的细胞因子，在T-cell发育中介导其由于细胞毒性引起的凋亡。检测结果如图16所示，从图中经过分析可以看出，较对照组，sgc7901、HCT116、Caco-2、BGC-823实验组Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞表面的FasL的表达量分别提高了约20％、10％、10％、15％，sgc7901、HCT116、MKN-45、Caco-2、BGC-823细胞表面Fas的表达量分别提高了约30％、10％、6％、5％，提示Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞可能是通过Fas/FasL途径发挥肿瘤杀伤过程。

实施例14 PD-L1高表达细胞株的鉴定

流式细胞术法检测几个肿瘤细胞株表面PD-L1的表达情况，流式抗体选用PEMouse anti human PD-L1，肿瘤细胞株为HCC827、H1299、H460和A549。这四种细胞均为人肺癌细胞。检测结果如图17所示。结果显示，HCC827、H1299、H460表面PD-L1的表达均处于较高水平，但A549表面PD-L1的表达量很低，因此本公开将A549作为阴性对照细胞。

实施例15 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合pembrolizumab的ADCC效应检测

ADCC效应检测方法参照实施例9，靶细胞为HCC827，结果如图18所示。A图反映了不同抗体浓度对ADCC效应的影响，从图中经过分析可以看出，当抗体浓度为0.01微克/毫升时，效应细胞对肿瘤细胞的杀伤能力最强。B图反映了不同E/T比例对ADCC效应的影响，从图中经过分析可以看出，当E/T为10:1时，细胞裂解率最大，ADCC效应最强。综上，本公开确定了ADCC效应的最佳条件为抗体浓度为0.1微克/毫升，E/T为10:1。在上述最佳条件下，检测HCC827、H1299、A549的ADCC效应，结果如C图所示，从图中经过分析可以看出，同等条件下，与对照组相比，Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞可介导更强的ADCC效应。

实施例16 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合pembrolizumab肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果

ELISA法检测HCC827、H1299、H460和A549与效应细胞Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞共孵育24小时后的细胞上清中hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的表达水平，检测结果如图19所示。图A、图B、图C分别为hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的ELISA检测结果。结果显示，与对照组相比，pCAR-Fcγ受体Ⅰ组的hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的表达量均有显著提高，提示Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞可联合pembrolizumab引发肿瘤杀伤细胞因子的释放，进一步发挥肿瘤杀伤作用。

实施例17 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与PD-L1高表达肿瘤细胞和pembrolizumab共孵育后CD107a的流式检测结果

实验过程参考实施例12，靶细胞选择HCC827、H1299、H460和A549，检测结果如图20所示，从图中经过分析可以看出，较对照组，HCC827、H1299实验组Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞表面CD107a的表达量分别提高了约10％、15％，说明pembrolizumab可以诱导Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞脱颗粒为具有杀伤功能的T淋巴细胞。

实施例18 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞表面FasL以及PD-L1高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果

Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与HCC827、H1299、H460、A549和pembrolizumab共孵育24小时后，流式检测肿瘤细胞表面的Fas和T淋巴细胞表面的FasL。检测结果如图21所示，从图中经过分析可以看出，较对照组，HCC827、H1299、H460实验组Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞表面的FasL的表达量分别提高了约23％、37％、30％，HCC827、H1299和H460细胞表面Fas的表达量分别提高了约12％、15％和8％，提示Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞可能是通过Fas/FasL途径发挥肿瘤杀伤过程。

实施例19 Her-2高表达细胞株的鉴定

流式细胞术法检测几个肿瘤细胞株表面Her-2的表达情况，流式抗体选用PEMouse anti-human PD-L1，肿瘤细胞株为SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87和MDA-MB-231。其中SK-BR-3、SK-OV-3和MDA-MB-231为人乳腺癌细胞，NCI-N87为人胃癌细胞。检测结果如图22所示。结果显示，SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87表面Her-2的表达均处于较高水平，但MDA-MB-231表面Her-2的表达量很低，因此本公开将MDA-MB-231作为阴性对照细胞。

实施例20 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合曲妥珠单抗的ADCC效应检测

ADCC效应检测方法参照实施例9，靶细胞为SK-BR-3，结果如图所示。A图反映了不同抗体浓度对ADCC效应的影响，从图中经过分析可以看出，当抗体浓度为0.01微克/毫升时，效应细胞对肿瘤细胞的杀伤能力最强。B图反映了不同E/T比例对ADCC效应的影响，由图23可知，当E/T为10:1时，细胞裂解率最大，ADCC效应最强。综上，本公开确定了ADCC效应的最佳条件为抗体浓度为0.01微克/毫升，E/T为10:1。在上述最佳条件下，检测SK-BR-3、SK-OV-3、MDA-MB-231的ADCC效应，结果如C图所示，从图中经过分析可以看出，同等条件下，与对照组相比，Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞可介导更强的ADCC效应。

实施例21 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞联合曲妥珠单抗肿瘤杀伤相关细胞因子的ELISA检测结果

ELISA法检测SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87、MDA-MB-231与效应细胞Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞共孵育24小时后的细胞上清中hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的表达水平，检测结果如图24所示。图A、图B、图C分别为hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的ELISA检测结果。结果显示，与对照组相比，pCAR-Fcγ受体Ⅰ组的hIL-2、hIFN-γ和hTNF-α的表达量均有显著提高，提示Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞可联合曲妥珠单抗引发肿瘤杀伤细胞因子的释放，进一步发挥肿瘤杀伤作用。

实施例22 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与Her-2高表达肿瘤细胞和曲妥珠单抗共孵育后CD107a的流式检测结果

实验过程参考实施例12，靶细胞选择SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87、MDA-MB-231，检测结果如图25所示，从图中经过分析可以看出，较对照组，SK-BR-3、SK-OV-3实验组Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞表面CD107a的表达量分别提高了约10％、15％，说明曲妥珠单抗可以诱导Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞脱颗粒为具有杀伤功能的T淋巴细胞。

实施例23 Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞表面FasL以及Her-2高表达肿瘤细胞表面Fas的流式检测结果

Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞与SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87、MDA-MB-231和pembrolizumab共孵育24小时后，流式检测肿瘤细胞表面的Fas和T淋巴细胞表面的FasL。检测结果如图26所示，从图中经过分析可以看出，较对照组，SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87实验组Fcγ受体Ⅰ-T淋巴细胞表面的FasL的表达量分别提高了约39％、24％、22％，SK-BR-3、SK-OV-3、NCI-N87细胞表面Fas的表达量分别提高了约30％、25％和35％，提示Fcγ受体Ⅰ嵌合受体T淋巴细胞可能是通过Fas/FasL途径发挥肿瘤杀伤过程。

以上所述，仅仅是本公开的几个具体实施例，并非对本公开做任何形式的限制，虽然本公开以较佳实施例揭示如上技术内容，然而并非用以限制本公开，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本公开技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京融捷康生物科技有限公司

<120> 包含FcγRⅠ的嵌合抗原受体及其应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 277

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gln Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val

1 5 10 15

Ser Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His

20 25 30

Leu Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr

35 40 45

Gln Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp

50 55 60

Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro

65 70 75 80

Ile Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser

85 90 95

Arg Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp

100 105 110

Lys Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala

115 120 125

Phe Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn

130 135 140

Ile Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg

145 150 155 160

Tyr Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala

165 170 175

Pro Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu

180 185 190

Val Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu

195 200 205

Gln Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg

210 215 220

Asn Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser

225 230 235 240

Gly Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys

245 250 255

Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr

260 265 270

Pro Val Trp Phe His

275

<210> 2

<211> 45

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 3

<211> 68

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 4

<211> 42

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly

1 5 10 15

<210> 7

<211> 831

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

caagtggaca ccacaaaggc agtgatcact ttgcagcctc catgggtcag cgtgttccaa 60

gaggaaaccg taaccttgca ctgtgaggtg ctccatctgc ctgggagcag ctctacacag 120

tggtttctca atggcacagc cactcagacc tcgaccccca gctacagaat cacctctgcc 180

agtgtcaatg acagtggtga atacaggtgc cagagaggtc tctcagggcg aagtgacccc 240

atacagctgg aaatccacag aggctggcta ctactgcagg tctccagcag agtcttcacg 300

gaaggagaac ctctggcctt gaggtgtcat gcgtggaagg ataagctggt gtacaatgtg 360

ctttactatc gaaatggcaa agcctttaag tttttccact ggaattctaa cctcaccatt 420

ctgaaaacca acataagtca caatggcacc taccattgct caggcatggg aaagcatcgc 480

tacacatcag caggaatatc tgtcactgtg aaagagctat ttccagctcc agtgctgaat 540

gcatctgtga catccccact cctggagggg aatctggtca ccctgagctg tgaaacaaag 600

ttgctcttgc agaggcctgg tttgcagctt tacttctcct tctacatggg cagcaagacc 660

ctgcgaggca ggaacacatc ctctgaatac caaatactaa ctgctagaag agaagactct 720

gggttatact ggtgcgaggc tgccacagag gatggaaatg tccttaagcg cagccctgag 780

ttggagcttc aagtgcttgg cctccagtta ccaactcctg tctggtttca t 831

<210> 8

<211> 135

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 9

<211> 204

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

ttctgggtgc tggtcgttgt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgacagtg 60

gccttcatca tcttttgggt gaggagcaag cggagcagac tgctgcacag cgactacatg 120

aacatgaccc cccggaggcc tggccccacc cggaagcact accagcccta cgcccctccc 180

agggatttcg ccgcctaccg gagc 204

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 11

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atggg 45

<210> 13

<211> 559

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln

1 5 10 15

Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser

20 25 30

Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu

35 40 45

Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln

50 55 60

Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile

85 90 95

Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg

100 105 110

Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys

115 120 125

Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe

130 135 140

Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile

145 150 155 160

Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr

165 170 175

Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro

180 185 190

Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val

195 200 205

Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln

210 215 220

Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn

225 230 235 240

Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly

245 250 255

Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg

260 265 270

Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro

275 280 285

Val Trp Phe His Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

290 295 300

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

305 310 315 320

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

325 330 335

Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

340 345 350

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

355 360 365

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

370 375 380

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

385 390 395 400

Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

405 410 415

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

420 425 430

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

435 440 445

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

450 455 460

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

465 470 475 480

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

485 490 495

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

500 505 510

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

515 520 525

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

530 535 540

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

545 550 555

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，其包含A）FcγRⅠ胞外区，B）铰链区，C）跨膜域和D）胞内信号传导区；

所述嵌合抗原受体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。

2.分离的核酸分子，其为DNA或RNA，能够表达得到权利要求1所述的嵌合受体。

3.含有权利要求2所述核酸分子的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，所述载体选自逆转录病毒载体、腺病毒、腺病毒相关病毒或CRISPR/CAS质粒。

5.根据权利要求4所述的载体，所述逆转录病毒载体为慢病毒载体。

6.根据权利要求4所述的载体，所述CRISPR/CAS质粒选自CRISPR/CAS-1、CRISPR/CAS-2、CRISPR/CAS-3、CRISPR/CAS-5、CRISPR/CAS-7、CRISPR/CAS-9、CRISPR/CAS-10中的任一种。

7.表达嵌合受体的细胞，其由宿主细胞被权利要求3-6任一项所述的载体所转化；所述宿主细胞为T细胞。

8.制备权利要求7所述的表达嵌合受体的细胞的体外方法，其包括：

a)提供权利要求2中所提及的核苷酸序列，并将所述核苷酸序列按顺序拼接得到用于表达嵌合受体的嵌合核酸片段；

b)将所述嵌合核酸片段连接入权利要求3-6任一项所述载体；

c)将所述载体转染入权利要求7所述的宿主细胞并表达出嵌合受体。

9.根据权利要求8所述的方法，在步骤c）中，转染的MOI=40~60。

10.根据权利要求8所述的方法，转染时加入polybrene，加入的浓度为6~10 微克/毫升。

11.根据权利要求8所述的方法，在步骤c）中，所述宿主细胞选自 T细胞，在 T 细胞活化30~42h后进行第一次转染，在活化42~54h后进行第二次转染。

12.组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂以及权利要求7所述的表达嵌合受体的细胞。

13.权利要求7所述的表达嵌合受体的细胞或权利要求12所述的组合物在制备用于预防和/或治疗和/或辅助治疗疾病药物中的应用；其中所述疾病由于病毒或异常细胞导致。

14.根据权利要求13所述的应用，所述异常细胞包括肿瘤细胞，所述肿瘤包括：骨、骨连接、血液、毛细血管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、睾丸、输精管、阴茎、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、外阴部、阴囊、静脉、眼、耳、鼻、舌、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、淋巴结、淋巴管、胸腺、肝、胆、胰腺、腮腺、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、舌下腺、性腺、舌下腺中任一处病变生成的肿瘤。

15.根据权利要求13所述的应用，所述病毒选自腺病毒科(adenoviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、星状病毒科(astroviridae)、本雅病毒科(bunyaviridae)、D型肝炎病毒(hepatitis delta virus)、小RNA病毒科(picornaviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、肝炎病毒科(hepeviridae)、单分子负链RNA病毒目(mononegavirales)、网巢病毒目(nidovirales)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、细小病毒科(parvoviridae)、反转录病毒科(retroviridae)或披膜病毒科(togaviridae)中的一种或多种。