JP7190096B2

JP7190096B2 - 遺伝子編集ｔ細胞及びその使用

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Publication number: JP7190096B2
Application number: JP2020537277A
Authority: JP
Inventors: ▲鵬▼▲飛▼ 袁; ▲飛▼ 王; 玲玲于; 曦董
Original assignee: Edigene Biotechnology Inc
Current assignee: Edigene Biotechnology Inc
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2022-12-15
Anticipated expiration: 2038-09-18
Also published as: WO2019052577A1; TW201920661A; EP3686275A4; JP2020534869A; CN111194350A; EP3686275A1; CN109517796A; US20200216805A1

Description

（相互参照）
本出願は、２０１７年９月１８日に提出された中国特許出願２０１７１０８４２２６４．５および２０１７１０８４１３２３．７の優先権を享有することを主張する。当該中国特許出願の開示内容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる。

本発明はＴ細胞に関し、特に、ユニバーサルＴ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴＣＲ－Ｔ細胞を含む、遺伝子編集された単一遺伝子、二重遺伝子、及び三重遺伝子ノックアウトＴ細胞、及びその調製方法と使用に関する。

悪性腫瘍は、体の健康と命の安全を深刻に脅かす疾患となっており、腫瘍の治癒はずっと人類の夢であった。近年来、腫瘍免疫療法は広範に注目されており、特にＣＡＲ－Ｔ（ＣｈｉｍｅｒｉｃＡｎｔｉｇｅｎＲｅｃｅｐｔｏｒＴＣｅｌｌｓ）技術の現れにより、腫瘍制御において画期的な発展が遂げられた。１９８９年にＣＡＲ－Ｔ技術が初めて適用され、２０１２年にペンシルベニア大学のＣａｒｌＪｕｎｅ教授が率いるチームによりＥｍｉｌｙＷｈｉｔｅｈｅａｄが治癒され、そして、２０１７年にＦＤＡ腫瘍薬物専門家諮問委員会（ＯＤＡＣ）が１０：０の圧倒的な投票結果で、若年性進行Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（ｒ／ｒＡｌｌ）の治療におけるノバルティスＣＡＲ－Ｔ薬ＣＴＬ０１９の使用を推奨・承認した。

一般的には、従来のＣＡＲ－Ｔ技術のＴ細胞は主に患者自身に由来し、ＧＭＰ環境下で、インビトロでＴ細胞の分離、活性化、ＣＡＲ導入、培養増殖を経て、最後に品質管理して患者の体内に再注入する。患者自身の状況の影響により、採血が不適切である、または採血してＴ細胞を単離した後に増殖が困難になる問題が起こる。患者の病状が危篤状態になった場合、Ｔ細胞の分離からＣＡＲ－Ｔの再注入まで、プロセス全体の待ち時間は、自体再注入のために面する重大な問題でもある。これらの問題は、ＣＡＲ－Ｔ技術の広範な応用を制限してしまう。そのため、現在、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の一つの重要な研究の方向は、健康な献血者のＴ細胞を使用して大量のＣＡＲ－Ｔ細胞を調製して患者の臨床使用を満足することである。この技術の確立は、ＣＡＲ－Ｔ療法のコストを大幅に削減し、均一に調製された細胞の品質をより確実に保証し、患者が必要な時にすぐにＣＡＲ－Ｔ細胞を取得して治療することができる。

本明細書全文でいくつかの文献が引用されている。ここで、各文献（いずれのジャーナル文章または要約、公開済みまたは未公開の特許出願、登録した特許、メーカーの仕様書、プロトコルなどを含む）は言及により本文に取り込まれる。しかしながら、ここに引用された文献が実際に本発明の既存技術であると認めるわけではない。

本発明は、本分野に存在する上記問題を解決するためになされた。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用してＴ細胞に対して単一遺伝子（ＴＲＡＣ、Ｂ２ＭまたはＰＤ－１）、二重遺伝子（ＴＲＡＣとＢ２Ｍ）、及び三重遺伝子（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ－１）ノックアウトを行い、ノックアウト効率はそれぞれ９０％（単一遺伝子）、８１％（二重遺伝子）、及び６７％（三重遺伝子）にも達している。これらの遺伝子編集されたＴ細胞は、異なる標的をターゲットとするＣＡＲまたはＴＣＲにユニバーサルＴ細胞を提供し、腫瘍及びウイルス感染性疾患（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）の治療における養子免疫と組み合わせた遺伝子編集技術を確立する方法を提供し、関連疾患の治療に関する研究に確かな技術基盤を築いた。それとともに、遺伝子改変されたＴ細胞（ユニバーサルＴ細胞、ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔを含む）は薬剤として、それを必要とする患者にいつでも使用できる。

従って、一の態様において、本発明は、遺伝子編集技術を利用し、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用してＴ細胞に対して効率的な単一遺伝子（ＴＲＡＣ、Ｂ２ＭまたはＰＤ－１）、二重遺伝子（ＴＲＡＣとＢ２Ｍ）、または三重遺伝子（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ－１）ノックアウトを行うことにより、ＴＣＲ、またはＴＣＲ／ＨＬＡ、またはＴＣＲ／ＨＬＡ／ＰＤ－１を発現しないユニバーサルＴ細胞を得る方法を提供している。それとともに、ユニバーサルＴ細胞を、必要なＣＡＲまたはＴＣＲにいつでも結合可能にさせ、ユニバーサルＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔを調製し、薬剤としてそれを必要とする患者にいつでも使用できる。さらに、新しい効果的な遺伝子標的の研究をサポートし、臨床免疫治療にタイムリー且つ効果的に応用できる。

一つの態様では、本発明は、Ｔ細胞中の
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域（配列番号２３に示される）、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域（配列番号２４に示される）、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域（配列番号２５に示される）、または２番染色体上の２４２７９５００９から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域（配列番号２６に示される）を遺伝子編集技術によって破壊することを含む、遺伝子改変Ｔ細胞の調製方法を提供する。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域、及びＰＤ－１ゲノム領域はいずれも編集された。一部の実施形態では、遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である。

一部の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞中の
（ｉ）配列番号２～５から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号６～１３から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号１４～２２から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＰＤ－１ゲノムの標的ヌクレオチド配列を遺伝子編集技術によって破壊することを含む、遺伝子改変Ｔ細胞の調製方法を提供する。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域、及びＰＤ－１ゲノム領域はいずれも編集された。一部の実施形態では、前記遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である。

一部の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞中の、
（ｉ）配列番号２または配列番号３から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号７または配列番号８から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号１４または配列番号１５から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＰＤ－１ゲノムの標的ヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって破壊することを含む、遺伝子改変Ｔ細胞の調製方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞中の、
（ｉ）配列番号２と相補的であるＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号８と相補的であるＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号１４と相補的であるＰＤ－１ゲノムの標的ヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって破壊することを含む、遺伝子改変Ｔ細胞の調製方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞中の、
（ｉ）配列番号２と相補的であるＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号８と相補的であるＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号１５と相補的であるＰＤ－１ゲノムの標的ヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって破壊することを含む、遺伝子改変Ｔ細胞の調製方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞中の、
（ｉ）配列番号３と相補的であるＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号７と相補的であるＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列、及び／または
（ｉｉｉ）配列番号１５と相補的であるＰＤ－１ゲノムの標的ヌクレオチド配列をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって破壊することを含む、遺伝子改変Ｔ細胞の調製方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２～５から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号６～１３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１４～２２から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２または配列番号３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号７または配列番号８から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１４または配列番号１５から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号８の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１５の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号８の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１４の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号３の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号７の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入し、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１５の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子改変Ｔ細胞を調製する方法を提供する。

一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡを単独に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを単独に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡを単独に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡとを同時に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡと、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを同時に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡと、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを同時に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡと、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを同時に当該Ｔ細胞に導入する。

一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを含む）は、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオ化により修飾されたものである。一部の実施形態では、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを含む）の５’末端の最初の１つ、２つ、及び／または３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾である。

一部の実施形態では、上記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを含む）をエレクトロポレーションによって前記Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、上記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを含む）と、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）とをエレクトロポレーションによって一緒にＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、前記エレクトロポレーション条件には、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかが含まれる。

一部の実施形態では、遺伝子編集されたＴ細胞から、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及び／またはＰＤ－１の発現量の低いＴ細胞をスクリーニングすることをさらに含む。例えば、遺伝子編集されたＴ細胞における前記ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、またはＰＤ－１の発現量は、遺伝子編集されていないＴ細胞における発現量の１／１０である。

一部の実施形態では、単一遺伝子ノックアウト効率（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、またはＰＤ－１）は８０％以上、例えば、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上である；二重遺伝子の同時ノックアウト効率（例えば、ＴＲＡＣとＢ２Ｍ）は６５％以上、例えば、６５％～１００％、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である；ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及びＰＤ－１遺伝子の同時ノックアウト効率が５０％以上、例えば、５５％～１００％、６０％～１００％、６５％～１００％、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、５５％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上である。ここで、すべての数字は、数字自体と当該数字の間のあらゆる整数と小数をカバーする。ここでいうノックアウト効率は、ＴＲＡＣ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、及びＰＤ－１遺伝子から選択されるいずれか一つがノックアウトされる、二つが同時にノックアウトされる、三つが同時にノックアウトされる場合のノックアウト効率をカバーする。

一部の実施形態では、前記Ｔ細胞は健康な被験者、腫瘍、またはウイルス感染患者（例えば、ＨＩＶ感染患者）に由来する。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞は、異なる分化段階の幹細胞、または前駆細胞から分化したＴ細胞である。

一つの態様では、本発明は、上記方法によって調製された、遺伝子改変されたＴ細胞に係る。

一つの態様では、本発明は、遺伝子改変されたＴ細胞であって、前記Ｔ細胞中の、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の１つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊され、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の１つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊され、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の１つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊された、遺伝子改変されたＴ細胞に係る。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞は、本願に記載のいずれかの方法によって調製されたものである。

一つの態様では、本発明は、遺伝子改変されたＴ細胞であって、前記Ｔ細胞中の、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域は、表Ｄと表Ｅに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域は、表Ｂと表Ｃに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域は、表Ｆに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域は、表Ｇに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有する、遺伝子改変されたＴ細胞に係る。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞は、本願に記載のいずれかの方法によって調製されたものである。

一つの態様では、本発明は、養子細胞治療Ｔ細胞の調製のための、上記遺伝子改変されたＴ細胞の使用に係る。一部の実施形態では、前記養子細胞治療Ｔ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞である。

一つの態様では、本発明は、キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードするヌクレオチド、もしくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ、engineered T cell receptor）またはそれをコードするヌクレオチドを上記いずれか一つの遺伝子改変されたＴ細胞に導入することを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法に係る。

一つの態様において、本発明は、
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域を破壊するように、１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノムを標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域を破壊するように、１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉｉ）ＰＤ－１ゲノム領域を破壊するように、２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｖ）キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードするヌクレオチド、もしくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む、ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法に係る。一部の実施形態では、前記方法は、ＣＡＳ９またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することをさらに含む。

一部の実施形態では、前記ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法はさらに、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２～５から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号６～１３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１４～２２から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｖ）キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードするヌクレオチド、もしくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、前記方法は、ＣＡＳ９またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することをさらに含む。

一部の実施形態では、前記ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法はさらに、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２または配列番号３から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号７または配列番号８から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１４または配列番号１５から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｖ）キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードするヌクレオチド、もしくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、前記方法は、ＣＡＳ９またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することをさらに含む。

一部の実施形態では、前記ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法はさらに、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号８の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１５の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｖ）キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードするヌクレオチド、もしくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、前記方法は、ＣＡＳ９またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することをさらに含む。

一部の実施形態では、前記ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法はさらに、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号８の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１４の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｖ）キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードするヌクレオチド、もしくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、前記方法は、ＣＡＳ９またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することをさらに含む。

一部の実施形態では、前記ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法はさらに、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号３の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号７の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１５の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｖ）キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードするヌクレオチド、もしくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、前記方法は、ＣＡＳ９またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入することをさらに含む。

一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡとＢ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡを同時にＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡを同時にＴ細胞に導入する。

一部の実施形態では、上記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを含む）をエレクトロポレーションによって前記Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、上記ｓｇＲＮＡ（ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとを含む）と、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）とをエレクトロポレーションによって一緒に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、前記エレクトロポレーション条件には、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかが含まれる。

一部の実施形態では、前記方法はさらに、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡとＣＡＲまたはそれをコードするヌクレオチド、若しくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドとを同時に当該Ｔ細胞に導入することを含む。

一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡより、ＣＡＲまたはそれをコードするヌクレオチド、若しくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドを先にＴ細胞に導入し、または、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡを導入した後に、ＣＡＲまたはそれをコードするヌクレオチド、若しくは遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれをコードするヌクレオチドを当該Ｔ細胞に導入する。

一つの態様において、本発明は、上記方法によって調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞に係る。

一つの態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する上記遺伝子改変されたＴ細胞を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞に係る。

一つの態様では、本発明は、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域は、表Ｄと表Ｅに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域は、表Ｂと表Ｃに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域は、表Ｆに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域は、表Ｇに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有する、ＣＡＲ－Ｔ細胞に係る。

一つの態様において、本発明は、遺伝子操作されたＴＣＲを発現する上記遺伝子改変されたＴ細胞を含む、ＴＣＲ－Ｔ細胞に係る。

一つの態様では、本発明は、
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域は、表Ｄと表Ｅに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域は、表Ｂと表Ｃに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、及び／または
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域は、表Ｆに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有し、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域は、表Ｇに記載のいずれか一つの遺伝子配列改変を有する、ＴＣＲ－Ｔ細胞に係る。

本発明の上記記載で言及されたＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域、ＰＤ－１ゲノム領域の位置情報は、データベース：ＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）の遺伝子の野生型の配列位置情報を参考にして確定された。当業者は、その他のデータベースを参考にして上記ゲノム領域の対応する位置情報を取得する方法を知っている。

一部の具体的な実施形態では、１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の野生型のヌクレオチド配列は、配列番号２３（ｔａｔｃｃａｇａａｃｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｃａｇｃｔｇａｇａｇａｃｔｃｔ）に示される。一部の具体的な実施形態では、１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の野生型のヌクレオチド配列は、配列番号２４（ａｔｇｔｃｔｃｇｃｔｃｃｇｔｇｇｃｃｔｔａｇｃｔｇｔｇｃｔｃｇｃｇｃｔａｃｔｃｔｃｔｃｔ）に示される。一部の具体的な実施形態では、２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域の野生型のヌクレオチド配列は、配列番号２５（ａｇｃｃｃａｇｔｔｇｔａｇｃａｃｃｇｃｃｃａｇａｃｇａｃｔｇｇｃｃａｇｇｇｃｇｃｃｔｇ）に示される。一部の具体的な実施形態では、２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の野生型のヌクレオチド配列は、配列番号２６（ｃａｇｔｔｔａｇｃａｃｇａａｇｃｔｃｔｃｃｇａｔｇｔｇｔｔｇｇａｇａａｇｃｔｇｃａｇｇ）に示される。

一つの態様において、本発明はさらに、上記遺伝子改変されたＴ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞を含む組成物（例えば、薬剤の組み合わせ）、キット、及び医療製品に係る。

一つの態様において、本発明は、有効量の上記ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞を被験者に投与することを含む、被験者の疾患を治療する方法に係る。一部の実施形態では、前記疾患は腫瘍である。一部の実施形態では、前記腫瘍は血液腫瘍である。一部の実施形態では、前記腫瘍はリンパ腫または白血病である。一部の実施形態では、前記ＣＡＲは、本明細書の表Ａに示される抗原（例えばＣＤ１９）などのような腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び／または腫瘍に関連する抗原（ＴＡＡ）を標的とする。

一つの態様において、本発明は、配列番号２～２２のいずれか一項を含むｓｇＲＮＡまたはそのベクターに係る。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは化学修飾されたものであり、前記化学修飾は、例えば、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオ化による修飾である。一部の実施形態では、化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／または３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾である。

化学修飾されたｓｇＲＮＡと化学修飾されていないｓｇＲＮＡを１回のエレクトロポレーションした後、対応する部位のノックアウト効率の比較を示す図である。図２Ａは、修飾された異なるｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウトツールとを組み合わせてＨＬＡにおけるＢ２Ｍをノックアウトし、ノックアウト後、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する各ｓｇＲＮＡのノックアウト効率を分析することを示す図である。図２Ｂおよび図２Ｃは、ＩＮＤＥＬ解析ソフトウェアを利用して、修飾された異なるｓｇＲＮＡによりＢ２Ｍ遺伝子がノックアウトされた後のＴ細胞ゲノムのＩＮＤＥＬ解析を行い、Ｔ細胞中でＩＮＤＥＬが発生する効率を得たことを示す図である。図２Ｄは、修飾された異なるｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウトツールとを組み合わせてＴＣＲにおけるＴＲＡＣをノックアウトし、ノックアウト後、ＴＲＡＣ遺伝子に対する各ｓｇＲＮＡのノックアウト効率を解析することを示す図である。図２Ｅ及び図２Ｆは、ＩＮＤＥＬ解析ソフトウェアを利用して、修飾された異なるｓｇＲＮＡによりＴＲＡＣ遺伝子がノックアウトされた後のＴ細胞ゲノムのＩＮＤＥＬ解析を行い、Ｔ細胞中でＩＮＤＥＬが発生する効率を得たことを示す図である。図２Ｇは、修飾された異なるｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウトツールとを組み合わせてＰＤ－１をノックアウトし、ノックアウト後、ＰＤ－１遺伝子に対する各ｓｇＲＮＡのノックアウト効率を解析することを示す図である。図２Ｈ、図２Ｉ及び図２Ｊは、ＩＮＤＥＬ解析ソフトウェアを利用して、修飾された異なるｓｇＲＮＡによりＰＤ－１遺伝子がノックアウトされた後のＴ細胞ゲノムのＩＮＤＥＬ解析を行い、Ｔ細胞中でＩＮＤＥＬが発生する効率を得たことを示す図である。図２Ａは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を利用し、修飾により最適化されたｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウトツールとの組み合わせを利用し、同じエレクトロポレーション条件下でＴ細胞中のＢ２Ｍをノックアウトし、ノックアウト後、解析した結果、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する各ｓｇＲＮＡのノックアウト効率はそれぞれ、Ｂ１：２７．８８％、Ｂ２：８６．１７％、Ｂ３：６４．６９％、Ｂ４：１．０６％、Ｂ５：２．９１％、Ｂ６：０．１７％、Ｂ７：４１．８７％、及びＢ８：３．１４％である。図に示すように、ノックアウト効率の良いｓｇＲＮＡを選択することができる。選択したｓｇＲＮＡに対して２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオによる最適化修飾を行い、効率的な二重／三重遺伝子ノックアウト（図３に示す）を可能にした。図２Ｂ及び図２Ｃは、ＩＮＤＥＬ解析ソフトウェアを利用して、異なるｓｇＲＮＡによりＢ２Ｍ遺伝子がノックアウトされた後のＴ細胞ゲノムのＩＮＤＥＬ解析を行い、Ｔ細胞中でＩＮＤＥＬが発生する効率を得たことを示す図である。図２Ｄは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を利用し、修飾により最適化されたｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウトツールとの組み合わせを利用し、同じエレクトロポレーション条件下でＴ細胞中のＴＲＡＣをノックアウトし、ノックアウト後、解析した結果、ＴＲＡＣ遺伝子に対する各ｓｇＲＮＡのノックアウト効率はそれぞれ、Ｔ２：７７．８４％、Ｔ３：８５．８６％、Ｔ４：２．５９％、及びＴ６：３４．７８％である。図に示すように、ノックアウト効率の良いｓｇＲＮＡを選択することができる。選択したｓｇＲＮＡに対して上記最適化修飾を行い、効率的な単一／二重／三重遺伝子ノックアウト（図３に示す）を可能にした。図２Ｅ及び図２Ｆは、ＩＮＤＥＬ解析ソフトウェアを利用して、異なるｓｇＲＮＡによりＴＲＡＣ遺伝子がノックアウトされた後のＴ細胞ゲノムのＩＮＤＥＬ解析を行い、Ｔ細胞中でＩＮＤＥＬが発生する効率を得たことを示す図である。図２Ｇは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を利用し、上記最適化修飾されたｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子ノックアウトツールとの組み合わせを利用し、同じエレクトロポレーション条件下でＴ細胞中のＰＤ－１をノックアウトし、ノックアウト後、解析した結果、ＰＤ－１遺伝子に対する各ｓｇＲＮＡのノックアウト効率はそれぞれ、Ｐ１：２１．１５％、Ｐ２：３６．９９％、Ｐ４：２３．０３％、Ｐ５：２５．６％、Ｐ６：３．１％、Ｐ７：２２．４９％、Ｐ８：２３．０７％、Ｐ９：３１．１８％、及びＰ１０：２４．４８％である。図に示すように、ノックアウト効率の良いｓｇＲＮＡを選択することができる。選択したｓｇＲＮＡに対して上記最適化修飾を行い、効率的な三重遺伝子ノックアウト（図３に示す）を可能にした。図２Ｈ、図２Ｉ及び図２Ｊは、ＩＮＤＥＬ解析ソフトウェアを利用して、異なるｓｇＲＮＡによりＰＤ－１遺伝子がノックアウトされた後のＴ細胞ゲノムのＩＮＤＥＬ解析を行い、Ｔ細胞中でＩＮＤＥＬが発生する効率を得たことを示す図である。最適化されたｓｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を利用し、Ｔ細胞に対してＴＲＡＣ、ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ（ＤｏｕｂｌｅＫｎｏｃｋ－Ｏｕｔ，ＤＫＯ）及びＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ／ＰＤ－１（ＴｒｉｐｌｅＫｎｏｃｋ－Ｏｕｔ，ＴＫＯ）ノックアウトをした結果の解析を示す図である。ｓｇＲＮＡを化学修飾してから、化学修飾されたｓｇＲＮＡとＣａｓ９を、さらに最適化されたエレクトロポレーション条件により、初代Ｔ細胞に送達して関連遺伝子ノックアウトを行った。その結果は図に示される。単一遺伝子、すなわち、ＴＲＡＣのノックアウト効率は９０．４２％に上昇し、二重遺伝子、すなわち、ＴＲＡＣとＢ２Ｍのノックアウト効率は８１．３９％に上昇し、三重遺伝子、すなわちＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ－１のノックアウト効率は６７．９１％（８２．７０％＋１５．７６％）＊６８．９８％）に上昇した。ＴＲＡＣ、ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ（ＤＫＯ）及びＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ／ＰＤ－１（ＴＫＯ）ノックアウトされたＴ細胞をスクリーニング及び精製した後の表現型解析を示す図である。後期の精製条件の最適化により、精製回数（４～５回）およびそれに対応する抗体量（３ｍｇ／ｍＬ）を増やした。その結果は図に示される。最適化された二重ノックアウト、すなわち、ＴＲＡＣとＢ２Ｍの二重遺伝子のノックアウトの純度は９９．７２％に上昇し、三重遺伝子、すなわち、ＴＲＡＣ、Ｂ２ＭおよびＰＤ－１のノックアウトの純度は９８．６２％に上昇した。ＴＲＡＣ－ｓｇＲＮＡ３（Ｔ２）、Ｂ２Ｍ－ｓｇＲＮＡ２（Ｂ３）、およびＰＤ－１－ｓｇＲＮＡ２（Ｐ２）のオフターゲット検出結果を示す図である。図は、ディープシーケンスおよびＩＮＤＥＬ解析ソフトウェアにより、Ｔ２、Ｂ３、Ｐ２ｓｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９との組み合わせによって編集されたＴ細胞におけるＩＮＤＥＬ効率を得たことを示す。最適化されたｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を利用して、Ｔ細胞に対してＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１ノックアウトした後の表現型、およびＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１ノックアウトしたＴ細胞をスクリーニングおよび精製した後の表現型の解析を示す図である。横軸はＣＳ３であり、縦軸はＴＣＲ、Ｂ２ＭおよびＰＤ－１である。Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲｎｅｇＣＡＲ－Ｔ、ＤＫＯＣＡＲ－Ｔ及びＴＫＯＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷機能の検証と結果の比較を示す図である。この実験では、ＲａｊｉおよびＫ５６２を標的細胞とし、Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ、ＤＫＯＣＡＲ－Ｔ及びＴＫＯＣＡＲ－Ｔをエフェクター細胞とし、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２５：１のエフェクター細胞と標的細胞との比率でインビトロ殺傷実験を行った。Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲｎｅｇＣＡＲ－Ｔ、ＤＫＯＣＡＲ－Ｔ及びＴＫＯＣＡＲ－Ｔサイトカイン放出を示す図である。この実験では、ＲａｊｉおよびＫ５６２を標的細胞とし、Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ、ＤＫＯＣＡＲ－Ｔ及びＴＫＯＣＡＲ－Ｔをエフェクター細胞とし、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、０．６２５：１のエフェクター細胞と標的細胞との比率でインビトロ共培養後、上澄みを取り、その中のＩＬ－２およびＩＦＮ－γを検出した。生理食塩水、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ^ｎｅｇＣＡＲ－Ｔ、ＤＫＯＣＡＲ－Ｔ（ＴＣＲ^ｎｅｇ＼Ｂ２Ｍ^ｎｅｇ－ＣＡＲ－Ｔ）およびＴＫＯＣＡＲ－Ｔ（ＴＣＲ^ｎｅｇ＼Ｂ２Ｍ^ｎｅｇ＼ＰＤ－１^ｎｅｇ－ＣＡＲ－Ｔ）細胞を注射した後、ＮＰＧマウス体内の腫瘍抑制および殺傷効果の比較を示す図である。図９Ａ及び図９Ｂは、５Ｘ１０＾５の腫瘍細胞／匹で尾静脈注射によりＮＳＧマウスに注射した後、生理食塩水群、Ｔ細胞群、ＴＣＲ／ＣＤ３^ｎｅｇ＼ＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞群、ＤＫＯＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞群およびＴＫＯＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞群の４つの群にランダムに分け、そして、５Ｘ１０＾６の対応する細胞を尾静脈注射により４つの群のマウスに注射し、生理食塩水群を対照群とした。プラチナエルマーイメージャーで取得した写真でマウスの体内腫瘍負荷を解析した。図９Ｃは、プラチナエルマーイメージャーで取得した写真によるマウスの体内腫瘍負荷の解析を示し、横軸はマウスの細胞飼育日数であり、縦軸は単位表面積の１秒あたりの輻射シグナルである。生理食塩水、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ^ｎｅｇＣＡＲ－Ｔ、ＤＫＯＣＡＲ－Ｔ（ＴＣＲ^ｎｅｇ＼Ｂ２Ｍ^ｎｅｇ－ＣＡＲ－Ｔ）およびＴＫＯＣＡＲ－Ｔ（ＴＣＲ^ｎｅｇ＼Ｂ２Ｍ^ｎｅｇ＼ＰＤ－１^ｎｅｇ－ＣＡＲ－Ｔ）の５つの群のマウスの生存率の比較を示す図である。横軸は、エフェクター細胞を注射した後のマウスの飼育日数であり、縦軸はマウスの生存率である。生理食塩水、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ^ｎｅｇＣＡＲ－Ｔ、ＤＫＯＣＡＲ－Ｔ（ＴＣＲ^ｎｅｇ＼Ｂ２Ｍ^ｎｅｇ－ＣＡＲ－Ｔ）およびＴＫＯＣＡＲ－Ｔ（ＴＣＲ^ｎｅｇ＼Ｂ２Ｍ^ｎｅｇ＼ＰＤ－１^ｎｅｇ－ＣＡＲ－Ｔ）細胞を注射した後、マウスの体重変化の結果の比較を示す図である。ＮＰＧマウスの体重をモニタリングし、横軸は、エフェクター細胞を注射した後のマウスの飼育日数であり、縦軸はマウスの体重百分比（ｎ＝４）である。

定義
本出願で使用されたように、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」は遺伝子編集技術であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのような、自然に存在するまたは人工的に設計された様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むが、これらに限られていない。自然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＮａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｓｙｓｔｅｍ）は、細菌と古細菌が長期的な進化中に形成した適応性免疫防御であり、侵入するウイルスおよび外因性ＤＮＡと対抗することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の作動原理は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄｅｒｉｖｅｄＲＮＡ）が塩基対を通してｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇＲＮＡ）と結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体は、ヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質をガイドしてｃｒＲＮＡとペアになっている配列標的部位で二本鎖ＤＮＡを切断する。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを人工的に設計することにより、ガイド作用を有するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ）を改変形成し、Ｃａｓ９がＤＮＡを部位特異的に切断することをガイドするようにすることができる。ＲＮＡ指向性ｄｓＤＮＡ結合タンパク質として、Ｃａｓ９エフェクターヌクレアーゼは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質に共局在化することができるため、巨大な改変可能性を有する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、クラス１、クラス２、またはクラス３のＣａｓタンパク質が使用可能である。本発明の一部の実施形態では、前記方法にはＣａｓ９が使用される。その他の適用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、国際公開第２０１３／１７６７７２号、国際公開第２０１４／０６５５９６、国際公開第２０１４／０１８４２３、米国特許第８，６９７，３５９号明細書に記載されているシステムと方法を含むが、これらに限られていない。

本発明において、「ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ」と「ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅＲＮＡ）」、または、「シングルガイドＲＮＡ」、「合成されたガイドＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」は、置き換えて使用できる。本発明のｓｇＲＮＡは、目標配列を標的とするガイド配列（ｇｕｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。

「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」は、ＣＤ３と結合してＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成する、すべてのＴ細胞の表面上の特徴的なマーカーである。ＴＣＲはαとβとの２つのペプチド鎖からなり、各ペプチド鎖はさらに、可変領域（Ｖ領域）、定常領域（Ｃ領域）、膜貫通領域、及び細胞質領域に分けられる。ＴＣＲ分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、その抗原特異性はＶ領域に存在する。Ｖ領域（Ｖα、Ｖβ）にはそれぞれ３つの超可変領域、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３があり、その中で、ＣＤＲ３の変異が最も大きくて、ＴＣＲの抗原結合特異性を直接に決定する。ＴＣＲがＭＨＣ－抗原ペプチド複合体を認識する時、ＣＤＲ１とＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子抗原結合溝の側壁を認識して結合し、ＣＤＲ３は抗原ペプチドに直接に結合する。ＴＣＲは、ＴＣＲ１とＴＣＲ２との２類に分けられ、ＴＣＲ１は、γとδとの２つの鎖で構成され、ＴＣＲ２は、αとβとの２つの鎖で構成される。末梢血では、Ｔ細胞の９０％～９５％はＴＣＲ２を発現し、いずれのＴ細胞は、ＴＣＲ２とＴＣＲ１のいずれか１つのみを発現する。

「β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）」は、細胞表面のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のβ鎖（軽鎖）部分であり、分子量が１１８００であり、９９個のアミノ酸からなる単鎖ポリペプチドである。

「プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）」は、アポトーシスマウスのＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４．１１から最初にクローンされた２６８アミノ酸残基の膜タンパク質である。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の組み合わせにより、Ｔ細胞のプログラム細胞死が起動され、これによって、腫瘍細胞が免疫逃避するので、重要な免疫抑制分子である。

本出願で使用されるように、「Ｉｎｄｅｌ」は、挿入／欠失、すなわち、突然変異の挿入と欠失と呼ばれる。

「移植片対宿主反応（ＧＶＨＤ）」とは、ドナーと受容体の間に免疫遺伝学的差異が存在するため、例えば、一方で、免疫活性を有するドナーのＴリンパ球のようなドナー細胞が受容体である患者の体内に入ってある程度までに増殖した後、受容体である患者の正常な細胞または組織を標的と誤認して攻撃して起こった反応を指す。もう一方では、異系細胞として、受容体体内の正常な免疫系は、それらをクリアして「宿主対移植片反応（（ＨＶＧＲ）」を起こすこともある。

ＨＶＧＲとＧＶＨＲの関連遺伝子は、ＴＣＲ、ＨＬＡ分子の関連遺伝子を含み、これらの遺伝子から同時にノックアウトされたＴリンパ球を同種異系患者に再注入する時、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こさないため、「ユニバーサルＴ細胞」と呼ばれることができる。例えば、単一のＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＣＲα鎖をコードする遺伝子と、ＴＣＲβをコードする２つのＴＲＢＣ遺伝子とから形成された完全且つ機能的なＴＣＲ複合体であり、ＴＲＡＣをノックアウトするとＴＣＲの不活性化を引き起こす可能性があり、Ｂ２ＭはＭＨＣ｜関連遺伝子である。これら２つの遺伝子が同時にノックアウトされたＴリンパ球は、同種異系患者に再注入する時に移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすことはない。

「ＣＡＲ－Ｔ」は「キラメ抗原受容体Ｔ細胞」の短縮形であり、キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）はＣＡＲ－Ｔのコアコンポーネントであり、ＨＬＡに依存しない方法で標的細胞（例えば、腫瘍）の抗原を認識する能力をＴ細胞に付与し、これによって、ＣＡＲにより改変されたＴ細胞は、自然のＴ細胞の表面上の受容体ＴＣＲよりも広い範囲の目標を認識することができる。一部の実施形態では、腫瘍を標的とするＣＡＲの設計には、１つの腫瘍関連抗原（ｔｕｍоｒ－ａｓｓоｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ、ＴＡＡ）結合領域（例えば、通常はモノクローナル抗体の抗原結合領域に由来するｓｃＦＶセグメント）、１つの細胞外ヒンジ領域、１つの膜貫通領域、及び１つの細胞内シグナル領域を含む。目標抗原の選択は、ＣＡＲの特異性と有効性、および遺伝子改変されたＴ細胞自体の安全性にとって肝心な決定要素である。

「ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞」とは、特異的な標的細胞（例えば、腫瘍）に関連するマーカーを標的とし、細胞表面のＴＣＲとＭＨＣの機能が不活性化になり、同種異系細胞治療によって引き起こされる免疫拒絶反応を低くすることができるＣＡＲ－Ｔ細胞をいう。

自己細胞のＣＡＲ－Ｔ治療では、採血して患者自身のＴリンパ球を分離する必要があり、一方、患者自身の病状およびＴリンパ球の状態が異なるため、ＣＡＲ－Ｔの製造過程に影響を与える要因が多くて製造を標準化できず、安全性を影響する。もう一方、一部の患者の自己Ｔリンパ球は、化学療法後の活性と数量が不十分であり、あるいは腫瘍環境の影響を受けてＴリンパ球の活性と増殖能力が制限されてしまい、このような細胞はＣＡＲ－Ｔの調製時にとても困難であり、治療の安全性と有効性も影響される。あるいは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製過程では、突然の状況が発生して、準備された細胞をタイムリーに患者に再注入することができない場合、治療効果に影響を与えてしまい、甚だしきに至っては自己Ｔリンパ球の状態によって影響されて一部の腫瘍患者は自己ＣＡＲ－Ｔ細胞の養子治療を受け入れなくなる。同種異系治療に使用可能なユニバーサルＣＡＲ－ＴまたはユニバーサルＴリンパ球は、上記状況において大きな優勢を持っている。

ＴＣＲ－Ｔ（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）キメラ－Ｔ細胞）とは、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＣＲ）、または人工Ｔ細胞受容体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌＴＣＲ）を発現するＴ細胞のことである。遺伝子操作されたＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体は遺伝子改変され、目的抗原を標的とする構造をもつようになるとともに、ＴＣＲシグナル伝達経路のドメインおよび／またはアクセサリー分子も保持されている。一部の実施形態では、ＴＣＲ－ＴはＴＣＲシグナル伝達経路中のすべてのアクセサリー分子を保持しているので、少量の抗原で刺激すると、完全に活性化された状態が発生し、標的細胞に殺傷効果をもたらす。ＣＡＲ－Ｔと比べて、これらのＴＣＲ－ＴはＴＣＲシグナル伝達経路上のすべてのアクセサリー分子を保持して適用したため、低濃度、低コピー数の抗原に対するＴＣＲ－Ｔの認識感度は、一部のＣＡＲ－Ｔより高く、治療の潜在力が非常に大きい。

一部の実施形態では、ＴＣＲ－Ｔ細胞は、部分的な遺伝子改変によって対応する抗原（例えば、ＴＡＡ）に対するＴＣＲの親和性を改善したため、「遺伝子改変されたＴＣＲ」の技術は、「親和性が増強されたＴＣＲ」の技術（Ａｆｆｉｎｉｔｙ－ＥｎｈａｎｃｅｄＴＣＲ）とも呼ばれる。例えば、『Ｎａｔｕｒｅ－Ｍｅｄｉｃａｌ』誌で報道されたＡｄａｐｔｉｍｍｕｎｅ社が共同で開発した「遺伝子改変されたＴＣＲ」には、いくつかの主要なアミノ酸を改変した後、これらの遺伝子改変されたＴＣＲは、一般的な癌ＴＡＡ、ＮＹ－ＥＳＯ－１との親和性を大幅に高めた。これによって、多発性骨髄腫（ＭｕｌｔｉｐｌｅＭｙｅｌｏｍａ）などのＮＹ－ＥＳＯ－１の過剰発現が伴われる癌を攻撃するために使用することができる。

養子細胞療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅｃｅｌｌｕｌａｒｔｈｅｒａｐｙ，ＡＣＴ）、腫瘍養子免疫療法（Ｔｕｍｏｒａｄｏｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）のような養子免疫療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）とは、免疫細胞をインビトロで処理し、例えば、特異的な抗原を加えて免疫細胞により発現される分子を改変し、またはサイトカインを利用してそれを刺激するなどの方法を利用して、特異性の高い標的細胞（例えば、腫瘍）殺傷性免疫エフェクター細胞をスクリーニングして大量に増殖させ、そして患者に注入して標的細胞（例えば、腫瘍）を殺す治療方法であり、受動免疫療法である。

Ｔ細胞を効率的に編集する方法
本発明は一つの態様では、Ｔ細胞中の：（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域（例えば、配列番号２３に示される）、（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域（例えば、配列番号２４に示される）、及び／または（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域（例えば、配列番号２５に示される）、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域（例えば、配列番号２６に示される）を遺伝子編集技術によって破壊することを含む、遺伝子編集Ｔ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）の調製方法を提供する。一部の実施形態では、この方法の遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域、またはＰＤ－１ゲノム領域は編集された。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域とＢ２Ｍゲノム領域はいずれも編集された。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域とＰＤ－１ゲノム領域はいずれも編集された。一部の実施形態では、前記Ｂ２Ｍゲノム領域とＰＤ－１ゲノム領域はいずれも編集された。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域、及びＰＤ－１ゲノム領域はいずれも編集された。

一部の実施形態では、Ｔ細胞中の：（ｉ）配列番号２～５から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号６～１４から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列、及び／または（ｉｉｉ）配列番号１５～２２から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＰＤ－１ゲノムの標的ヌクレオチド配列を遺伝子編集技術によって破壊することを含む、遺伝子編集Ｔ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）の調製方法が提供される。一部の実施形態では、この方法の遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域、またはＰＤ－１ゲノム領域は編集された。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域とＢ２Ｍゲノム領域はいずれも編集された。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域とＰＤ－１ゲノム領域はいずれも編集された。一部の実施形態では、前記Ｂ２Ｍゲノム領域とＰＤ－１ゲノム領域はいずれも編集された。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣゲノム領域、Ｂ２Ｍゲノム領域、及びＰＤ－１ゲノム領域はいずれも編集された。

一部の実施形態では、Ｔ細胞のＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍおよび／またはＰＤ－１遺伝子を破壊するように、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入することを含む、遺伝子編集Ｔ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）の調製方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｃａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む。

一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＴＣＲ２のαおよび／またはβ鎖の定常領域をコードする遺伝子を標的とし、それによってＴ細胞の表面上のＴＣＲの構造を破壊し、当該分子に機能を失わせる。

一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする遺伝子を標的とし、例えば、Ｂ２Ｍタンパク質をコードする遺伝子の最初のエクソン領域を標的とし、それによってＢ２Ｍの構造を破壊し、当該分子に機能を失わせる。

一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ＰＤ－１をコードする遺伝子を標的とし、例えば、ＰＤ－１タンパク質をコードする遺伝子の最初のエクソン領域を標的とし、それによってＰＤ－１の構造を破壊し、当該分子に機能を失わせる。

一部の実施形態では、（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２～５から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号６～１４から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または（ｉｉｉ）前記ＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１５～２２から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入することを含む、遺伝子編集Ｔ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）の調製方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｃａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む。

一部の実施形態では、本発明は、ＴＲＡＣを標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入することに係る。本発明の一部の実施形態では、本発明は、Ｂ２Ｍを標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入することに係る。本発明の一部の実施形態では、本発明は、ＰＤ－１を標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入することに係る。一部の実施形態では、この方法は、Ｃａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む。

一部の実施形態では、本発明は、ＴＲＡＣを標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡ、及び／または、Ｂ２Ｍを標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡ、及び／または、ＰＤ－１を標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することに係る。

一部の実施形態では、本発明は、ＴＲＡＣを標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡと、Ｂ２Ｍを標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡと、ＰＤ－１を標的とする表２に示すものから選択されるいずれか一つのｓｇＲＮＡとをＴ細胞に導入することに係る。一部の実施形態では、この方法は、Ｃａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む。

本発明の一部の実施形態では、（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、ＴＲＡＣ－ｓｇ３ｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、Ｂ２Ｍ－ｓｇ２ｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び、（ｉｉｉ）前記ＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、ＰＤ－１－ｓｇ２ｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入することを含む、ユニバーサルＴ細胞を調製する方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｃａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む。

本発明の一部の実施形態では、（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２または３の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号７または１１から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び、（ｉｉｉ）前記ＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１４または１５から選択される配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入することを含む、ユニバーサルＴ細胞を調製する方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｃａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドをＴ細胞に導入することを含む。

一部の実施形態では、上記ｓｇＲＮＡは、化学修飾されたものである。例えば、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたものである。一部の実施形態では、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／または３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾である。

一般に、ｓｇＲＮＡの中のガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有し、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合をガイドする任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列およびそれに対応する標的配列間の相補程度は約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７．５％以上、９９％以上またはそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－ＷｈｅｅｌｅｒＴｒａｎｓｆｏｒｍに基づいたアルゴリズム（例えば、ＢｕｒｒｏｗｓＷｈｅｅｌｅｒＡｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｉＸ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（ＮｏｖｏｃｒａｆｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））、ＳＯＡＰ（ｓоａｐ．ｇｅｎоｍｉｃｓ．оｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約７５未満、７０未満、６５未満、６０未満、５５未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１２未満、またはそれより少ないヌクレオチドであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列の配列特異的結合をガイドするガイド配列の能力は、任意の適切な測定方法により評価することができる。例えば、対応する標的配列を有する宿主細胞に、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するには十分なＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネント（テストされるガイド配列を含む）を提供してもよく、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列コンポーネントをコードするベクターを使用してトランスフェクションし、そして標的配列内の優先的な切断を評価することで行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管内で、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体（テストされるガイド配列と、ガイド配列と異なる対照ガイド配列とを含む）のコンポーネントを提供し、標的配列へのテストと対照ガイド配列の結合または切断率を比較して評価することができる。また、当業者に既知の他の測定方法を使用して上記測定と評価を行うことができる。

一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＣａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をエレクトロポレーションによってＴ細胞に導入する。例えば、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１８０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓのエレクトロポレーション条件でＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドをエレクトロポレーションによって一緒にＴ細胞に導入する。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドはｍＲＮＡであり、例えば、ＡＲＣＡキャップを含むｍＲＮＡである。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターにある。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドは、例えば、配列番号１の配列を含む。一部の実施形態では、前記ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドは同一のベクターにある。

一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡを同時にＴ細胞に導入する。具体的な実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡを同時にＴ細胞に導入する場合、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡのそれぞれの量は、互いに近いか、同等であってもよい。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡは任意の適切な順で一つずつＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、及びＣａｓ９をコードするヌクレオチドを同時にＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及び／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡより、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドを先にＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドまたはＣａｓ９タンパク質を含む。

一部の実施形態では、Ｔ細胞は健康なヒトに由来する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は患者に由来し、例えば、化学療法または放射線療法を受ける前の癌患者などの癌患者である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、臍帯血、骨髄、または末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）などに由来する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は幹細胞に由来し、例えば、各分化段階の造血幹細胞に由来する。本出願に記載の調製方法は、例えば、ＰＢＭＣまたは幹細胞にＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＰＤ－１をノックアウトし、さらに培養・分化し、及び／または対応する遺伝子改変されたＴ細胞を精製することに使用することができる。

既存技術と比べて、本発明のＴ細胞遺伝子ノックアウト方法によって、高い遺伝子ノックアウト効率が得られ、例えば、単一遺伝子（ＴＲＡＣ）、二重遺伝子（ＴＲＡＣとＢ２Ｍ）、及び三重遺伝子（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及びＰＤ－１）ノックアウトのノックアウト効率はそれぞれ、少なくとも９０％、８１％、及び６７％に達している。

「ノックアウト効率」は、遺伝子レベルで遺伝子ノックアウトのＩＮＤＥＬが発生した効率を用いて表すことができる。また、細胞レベルで、その遺伝子ノックアウトによって遺伝子によって発現されたタンパク質が消失する、または有意に減少する細胞の百分比を用いて表すこともできる。本発明において、「ノックアウト効率」とは、後者に基づいて算出したノックアウト効率をいう。高いノックアウト効率が目標細胞の収量を増加させ、生産コストおよび治療コストを削減できることは、当業者が理解することができる。

一部の実施形態では、遺伝子編集されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）をさらにスクリーニングしてより高純度の単一遺伝子（ＴＲＡＣ）、二重遺伝子（ＴＲＡＣとＢ２Ｍ）、及び三重遺伝子（ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及びＰＤ－１）ノックアウトＴ細胞を取得する。例えば、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＰＤ－１の発現量の低い遺伝子編集されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）をＦＡＣＳでスクリーニングすることができる。

一部の実施形態では、本発明のユニバーサルＴ細胞のＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはＰＤ－１遺伝子はノックアウトされる。

一部の具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子はノックアウトされる。Ｂ２Ｍおよび／またはＰＤ－１のコード領域はノックアウトされる。ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ－１は、すべてノックアウトされてもよいし、３つの中の１つ、または２つがノックアウトされてもよい。

一部の具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子はノックアウトされる。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＴＣＲのα鎖定常コード領域の遺伝子は、前記細胞導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ２、３、４、６分子の１つ（表２参照）およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域の遺伝子は、細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ２とＣａｓ９分子またはＴＲＡＣ－ｓｇ３とＣａｓ９分子によりノックアウトされる。

別の一部の具体的な実施形態では、前記ＨＬＡの定常コード領域Ｂ２Ｍ遺伝子はノックアウトされる。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＢ２Ｍ定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＢ２Ｍ－ｓｇの１～８分子の１つ（表２参照）およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。好ましくは、前記Ｂ２Ｍの定常コード領域の遺伝子は、細胞に導入されたＢ２Ｍ－ｓｇ２またはＢ２Ｍ－ｓｇ６およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。

別の一部の具体的な実施形態では、前記ＰＤ－１の定常コード領域の遺伝子はノックアウトされる。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＰＤ－１定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＰＤ－１－ｓｇ１～２、ＰＤ－１－ｓｇ４～１０分子の１つ（表２参照）およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。好ましくは、前記ＰＤ－１の定常コード領域の遺伝子は、細胞に導入されたＰＤ－１－ｓｇ１またはＰＤ－１－ｓｇ２およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。

別の一部の具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子およびＢ２Ｍ遺伝子はノックアウトされる。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＴＲＡＣおよびＢ２Ｍ遺伝子は、前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ３およびＢ２Ｍ－ｓｇ２分子（表２参照）およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。

別の一部の具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、およびＰＤ－１の定常コード領域の遺伝子はノックアウトされる。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＴＣＲ、ＨＬＡ、およびＰＤ－１定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ３、Ｂ２Ｍ－ｓｇ２、およびＰＤ－１－ｓｇ２分子（表２参照）およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。具体的な実施形態では、本発明のＴＣＲ、ＨＬＡ、およびＰＤ－１定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ２、Ｂ２Ｍ－ｓｇ６、およびＰＤ－１－ｓｇ１分子（表２参照）およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。具体的な実施形態では、本発明のＴＣＲ、ＨＬＡ、およびＰＤ－１定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ２、Ｂ２Ｍ－ｓｇ６、およびＰＤ－１－ｓｇ２分子（表２参照）およびＣａｓ９分子によりノックアウトされる。

一部の実施形態では、本発明は、
ｓｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子をＴ細胞に導入するステップを含む、Ｔ細胞を効率的に編集する方法を提供する。

一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子は、ＴＣＲからのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、およびＰＤ－１の定常コード領域の遺伝子標的領域に相補的な標的ドメインを含む。

一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子は、ノックアウトされる遺伝子の標的領域に相補的な標的ドメインを含む核酸配列を指し、標的ＤＮＡ配列を認識でき、Ｃａｓ９分子による標的部位の切断をガイドでき、対応する部位のノックアウトをワンステップで効率的に実現できる（ノックアウト効率は８５％以上である）。

一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子に含まれる標的ドメインの配列は、表２の中の１つに示されている。

一部の好ましい実施形態では、前記標的ドメインの配列は、Ｔ２、Ｂ３およびＰ１に示されている。

一部の好ましい実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーション技術によってＴ細胞に導入する。

一部の具体的な実施形態では、上記方法で使用されるＴ細胞は、健康なヒト、例えば、健康な成人の末梢血、または自然に出産した健康なヒトの臍帯血に由来する。

一部の実施形態では、本発明の第三態様は、特定の修飾後、高い編集効率を有するｓｇＲＮＡ配列（表２）を提供する。

一部の具体的な実施形態では、化学方法でｓｇＲＮＡを合成して修飾し、これによって、ｓｇＲＮＡは、通常のインビトロ転写（ＩＶＴ）によって得られたｓｇＲＮＡよりも安定且つ高い編集効率を有する。好ましくは、エレクトロポレーション方法を利用してＴ細胞を１回エレクトロポレーションし、化学的に合成して修飾されたｓｇＲＮＡ遺伝子編集効率は、通常のＩＶＴによって得られたｓｇＲＮＡの１０倍以上である。

一部の実施形態では、疾患（例えば、腫瘍）を治療する薬剤を調製するための、本発明に記載のユニバーサルＴ細胞の使用が提供される。

一部の具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子、ＨＬＡの定常コード領域のＢ２Ｍ遺伝子、およびＰＤ－１の定常コード領域の遺伝子はノックアウトされる。例えば、具体的な実施形態では、本発明のＴＣＲのα鎖定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ２分子により、本発明のＢ２Ｍ定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＢ２Ｍ－ｓｇ６分子により、本発明のＰＤ－１定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＰＤ－１－ｓｇ１分子（表２参照）およびＣａｓ９分子により、好ましくは、前記ＴＣＲのα鎖定常コード領域遺伝子は、前記細胞に導入されたＴＲＡＣ－ｓｇ２により、Ｂ２Ｍ定常コード領域遺伝子は細胞に導入されたＢ２Ｍ－ｓｇ６により、ＰＤ－１定常コード領域遺伝子は、細胞に導入されたＰＤ－１－ｓｇ１分子およびＣａｓ９分子によりそれぞれノックアウトされる。

効率的に編集されたＴ細胞またはユニバーサルＴ細胞
本発明は、本発明の上記方法によって調製されたＴＲＡＣ単一遺伝子ノックアウトＴ細胞（ＴＲＡＣ^{ｎｅｇａｔｉｖｅ}）、ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ二重遺伝子ノックアウト（ＤＫＯ）Ｔ細胞、およびＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ／ＰＤ－１三重遺伝子ノックアウト（ＴＫＯ）Ｔ細胞に係る。

既存技術と比べて、本発明の単一遺伝子ノックアウトＴ細胞（ＴＲＡＣ^{ｎｅｇａｔｉｖｅ}）、ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ二重遺伝子ノックアウト（ＤＫＯ）Ｔ細胞、およびＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ／ＰＤ－１三重遺伝子ノックアウト（ＴＫＯ）Ｔ細胞の遺伝子ノックアウト効率は大幅に向上した。

本発明により調製された単一遺伝子ノックアウトＴ細胞（ＴＲＡＣ^{ｎｅｇａｔｉｖｅ}）、ＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ二重遺伝子ノックアウト（ＤＫＯ）Ｔ細胞、およびＴＲＡＣ／Ｂ２Ｍ／ＰＤ－１三重遺伝子ノックアウト（ＴＫＯ）Ｔ細胞は、Ｔ細胞よりさらに改変された前駆細胞として、またはユニバーサルＴ細胞として、ＣＡＲ－Ｔ細胞やＴＣＲ－Ｔ細胞など、さまざまな遺伝子修飾されたＴ細胞を調製するために使用できる。

本発明の一部の実施形態では、Ｔ細胞中の：（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域の１つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊され、（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域の１つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊され、及び／または（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域の１つ以上の部位が遺伝子編集技術によって破壊される、遺伝子改変されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）が提供される。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞は、（ｉ）配列番号２～５から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＴＲＡＣゲノムの標的ヌクレオチド配列が遺伝子編集技術によって破壊され、（ｉｉ）配列番号６～１４から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＢ２Ｍゲノムの標的ヌクレオチド配列が遺伝子編集技術によって破壊され、及び／または（ｉｉｉ）配列番号１５～２２から選択されるいずれか一つの配列と相補的であるＰＤ－１ゲノムの標的ヌクレオチド配列が遺伝子編集技術によって破壊される。

本発明の一部の実施形態では、Ｔ細胞において、（ｉ）そのＴＲＡＣゲノム領域は、表Ｄと表Ｅに記載のいずれか一つの配列を含み、（ｉｉ）そのＢ２Ｍゲノム領域は、表Ｂと表Ｃに記載のいずれか一つの配列を含み、及び／または（ｉｉｉ）そのＰＤ－１ゲノム領域は、表Ｆまたは表Ｇに記載のいずれか一つの配列を含む、遺伝子改変されたＴ細胞（ユニバーサルＴ細胞）が提供される。

本発明は一つの態様において、その遺伝子改変されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）、ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはＴＣＲ－Ｔ細胞を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。

さらに、本発明は一つの態様において、本発明に記載の遺伝子改変されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）を含むキットまたは製品を提供する。このキットまたは製品は、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ－Ｔ、またはその他の養子細胞治療組成物の調製に使用できる。

ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法
本発明は一つの態様において、ＣＡＲ－Ｔ細胞（例えば、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞）を調製する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＡＲまたはそれをコードするヌクレオチドまたはベクターを本発明に記載のいずれかの遺伝子改変されたＴ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）に導入することを含む。

一部の実施形態では、
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域を破壊するように、１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノムを標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域を破壊するように、１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉｉ）ＰＤ－１ゲノム領域を破壊するように、２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｖ）キラメ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードする核酸を当該Ｔ細胞に導入することを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法が提供される。

ＣＡＲまたはそれをコードする核酸、およびＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡおよび／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、およびＣＡＲまたはそれをコードするヌクレオチドは、任意の適切な順序でＴ細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡおよび／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、およびＣＡＲまたはそれをコードするヌクレオチドを同時に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡおよび／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡより、ＣＡＲまたはそれをコードするヌクレオチドを先に当該Ｔ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＣＡＲまたはそれをコードするヌクレオチドを、遺伝子編集されたＴ細胞に導入し、そのＴ細胞のＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍおよび／またはＰＤ－１ゲノム領域はすでに編集によって破壊された。一部の実施形態では、この方法はさらに、Ｃａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドを前記ｓｇＲＮＡと一緒に当該Ｔ細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、本発明のユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞によって発現されるＣＡＲは、Ｔ細胞がヒト白血球抗原‐非依存的な方法で細胞表面抗原を認識して殺傷の役割を発揮するようにすることができる限り、本分野の既知の任意のＣＡＲであってもよい。例えば、米国発明特許出願ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１に開示されているＣＡＲを使用することができ、本発明の具体的な実施形態で使用されるＣＡＲは、当該発明特許出願の公開明細書（ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１）を参照することができる。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＡＲは、下記の腫瘍と関連抗原に対応する表Ａに記載されている抗原を認識するＣＡＲである。

一部の実施形態では、本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞で発現されるＣＡＲは、順に接続されるシグナルペプチド、細胞外結合領域、ヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞内シグナル領域を含む。本文で使用される用語の「シグナルペプチド」とは、新しく合成したタンパク質の分泌経路への移動をガイドする短い（例えば、５～３０のアミノ酸長）ペプチド鎖をいう。本発明では、人体内の様々なタンパク質のシグナルペプチド、例えば、体内で分泌されるサイトカインタンパク質や白血球分化抗原（ＣＤ分子）のシグナルペプチドを使用することができる。

一部の実施形態では、前記シグナルペプチドはＣＤ８シグナルペプチドであり、例えば、そのアミノ酸配列は、発明特許出願ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１に示されている通りである。

一部の実施形態では、前記ヒンジ領域は、異なる抗体または抗原受容体のヒンジ領域、特にＣＤ分子のヒンジ領域を使用することができる。一つの具体的な実施形態では、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８またはＣＤ２８などのタンパク質のヒンジ領域から選択することができる。ＣＤ８またはＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面の自然なマーカーである。

本発明では、人体におけるタンパク質の様々な膜貫通領域、特に異なる抗原受容体の膜貫通領域を使用することができる。好ましく使用される膜貫通領域は、ＣＤ分子の膜貫通領域である。一実施形態では、前記膜貫通領域は、ＣＤ８またはＣＤ２８または４－１ＢＢなどのタンパク質の膜貫通領域から選択されていてもよい。

一部の実施形態では、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域（ＣＤ８－ｈｉｎｇｅ）であり、そのアミノ酸配列は、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６３５号明細書Ａ１に示されている通りである。

前記「細胞外結合領域」とは、標的抗原を特異的に認識する領域を含む。一部の実施形態では、当該細胞外結合領域は、標的腫瘍細胞表面抗原を特異的に認識する領域を含む。例えば、この領域は、ｓｃＦｖまたはその他の抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。本文で使用される用語の「ｓｃＦｖ」とは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）によって接続される重鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｏｆｈｅａｖｙｃｈａｉｎ，ＶＨ）と軽鎖可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ，ＶＬ）の組換えタンパク質をいい、リンカーによってこの２つのドメインが関連し、最終的に抗原結合部位を形成する。ｓｃＦｖは通常、ひとつのヌクレオチド鎖によってコードされるアミノ酸配列である。上記ｓｃＦｖはさらにその誘導体を含むことができる。

本発明で使用されるＣＡＲおよびその様々なドメインは、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組換え、および／またはその他の修飾方法など、本分野で既知の通常技術を単独または組み合わせて使用することによりさらに修飾することができる。ある抗体のアミノ酸配列に基づいてそのＤＮＡ配列にそのような修飾を導入する方法は、当業者にとって公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．参照）。この修飾は好ましくは核酸レベルで行われる。

本文で使用される用語の「特異的認識」とは、本発明の抗原認識領域が、目的抗原以外のいかなるポリペプチドと交差反応しない、または基本的に交差反応しないことを意味する。その特異性の程度は、イムノブロッティング、イムノアフィニティークロマトグラフィー、フローサイトメトリーなどを含むが、これらに限られていない免疫学的技術によって判断することができる。

一部の実施形態では、前記細胞外結合領域は、ｓｃＦｖのような、ＣＤ１９、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＣＤ７またはＣＤ１３８などを特異的に認識する抗原結合領域を含む。

一部の実施形態では、前記細胞外結合領域は、ＣＤ１９を特異的に認識するヒト化改変されたｓｃＦｖを含む。一部の実施形態では、当該ＣＤ１９を特異的に認識するｓｃＦｖのアミノ酸配列は、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６３５号明細書Ａ１に示されている通りである。

本発明において、人体における各種のタンパク質の細胞内シグナル領域、特に各種の異なる抗原受容体の細胞内シグナル領域を使用することができる。好ましく使用される細胞内シグナル領域は、ＣＤ分子の細胞内シグナル領域である。具体的な実施形態では、前記細胞内シグナル領域は、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４タンパク質の細胞内シグナル領域、およびそれらの組み合わせから選択されることができる。ＣＤ３分子は５つのサブユニットからなり、その中で、ＣＤ３ζサブユニット（ＣＤ３ｚｅｔａとも呼ばれ、ζと略称する）は３つのＩＴＡＭモチーフを含み、このモチーフは、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体における重要なシグナル変換領域である。ＦｃεＲＩγは主にマスト細胞と好塩基球の表面に分布しており、構造、分布および機能ではＣＤ３ζと類似しているＩＴＡＭモチーフを含む。また、前述のように、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４は、共刺激シグナル分子であり、それぞれのリガンドに結合した後、その細胞内シグナルセグメントの共刺激効果により、Ｔ細胞の継続的な増殖を引き起こし、Ｔ細胞がＩＬ－２とＩＦＮ－γなどのサイトカインを分泌するレベルを上昇させることができるとともに、ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ生存サイクルと抗腫瘍効果を改善することができる。

一部の実施形態では、ＴＣＲ単独で生成したシグナルは、自然なＴ細胞を完全に活性化するのに十分ではなく、ＴＣＲによる抗原依存の初期活性化の配列（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）、および抗原非依存的な方法で作用して共刺激シグナルを提供する配列（共刺激ドメイン）が必要である。一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の初期活性化を刺激的または抑制的に調節する。刺激的に作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）と呼ばれるシグナル伝達モチーフを含んでもよい。本発明に適するＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例として、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄが挙げられる。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、修飾されたＩＴＡＭドメインを含み、例えば、自然のＩＴＡＭドメインと比較して活性が変更（例えば、増加または低下）した突然変異ＩＴＡＭドメイン、または短く切断されたＩＴＡＭの一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。

共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲの中の、共刺激分子細胞内ドメインを含む部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。これらの分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原‐１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。

一部の実施形態では、本発明はＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、例えば、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法を提供し、この方法は、下記のステップを含む：
１）ｓｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子をＴ細胞に導入するステップ；
一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子は、ＴＣＲからのα鎖定常コード領域（すなわち、ＴＲＡＣ）遺伝子、ＨＬＡ定常コード領域Ｂ２Ｍ遺伝子、およびＰＤ－１の定常コード領域の遺伝子標的領域に相補的な標的ドメインを含む。
２）ＣＡＲ分子を前記Ｔ細胞に導入するステップ；
一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子は、ノックアウトされる遺伝子の標的領域に相補的な標的ドメインを含む核酸配列を指し、標的ＤＮＡ配列を認識でき、Ｃａｓ９分子による標的部位の切断をガイドでき、対応する部位のノックアウトをワンステップで効率的に実現できる（ノックアウト効率は８５％以上である）。

一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９ｍＲＮＡを指し、ｓｇＲＮＡのガイドの下で標的部位を切断することができる。

一部の具体的な実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子に含まれる標的ドメインの配列は、表２の中の１つに示されている。

一部の好ましい実施形態では、前記標的ドメインの配列は、Ｔ２、Ｂ３およびＰ１に示されている（表２）。

一部の好ましい実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーション技術によって前記Ｔ細胞に導入する。

一部の実施形態では、前記ＣＡＲ分子を、例えば、レンチウイルストランスフェクション技術によって前記Ｔ細胞に導入する。

一部の具体的な実施形態では、健康なヒト、例えば、健康な人の末梢血または臍帯血に由来するＴ細胞を単離および／活性化するステップを含む。好ましくは、その方法は、上記ステップ２）の後に、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞を選別するステップをさらに含む。より好ましくは、選別後、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞、たとえな、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞、を機能的に検証する。

一部の実施形態では、本発明は、疾患（例えば、腫瘍）の治療における上記ＣＡＲ－Ｔ細胞の使用を提供する。

本発明は一つの態様において、有効量の本発明に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を被験者に投与することを含む、被験者の疾患を治療する方法を提供する。本発明に記載の治療方法は、癌とＨＩＶ／ＡＩＤＳを含むが、これらに限られていない。一部の実施形態では、前記疾患は腫瘍であり、リンパ腫または白血病のような血液腫瘍を含む。一部の実施形態では、前記ＣＡＲは表Ａに示す抗原を標的とし、その疾患は、表Ａにおける当該標的抗原に対応する腫瘍である。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞は被験者から得られたものではなく、例えば、前記Ｔ細胞は、健康なドナーに由来することができる。

本発明に係るＣＡＲ－Ｔ細胞は、静脈注入経路など、細胞成分を含む医薬品を投与するために従来使用されている経路を通じて、それを必要とする被験者に投与されることができる。投与量は、被験者の病状および一般的な健康状況に基づいて具体的に決定することができる。

ＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法
本発明は、ＴＣＲ－Ｔ細胞とも呼ばれる、遺伝子操作されたＴＣＲを発現するＴ細胞を提供する。本発明はまた、遺伝子操作されたＴＣＲまたはそれをコードするヌクレオチドまたはベクターを本発明に記載のいずれかの遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、ユニバーサルＴ細胞）に導入することを含む、ＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法を提供する。

一部の実施形態では、
（ｉ）ＴＲＡＣゲノム領域を破壊するように、１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノムを標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉ）Ｂ２Ｍゲノム領域を破壊するように、１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び／または
（ｉｉｉ）ＰＤ－１ゲノム領域を破壊するように、２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、または２番染色体上の２４２７９５００９番目から２４２７９５０５１番目のＰＤ－１ゲノム領域を標的とするｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｖ）遺伝子操作されたＴＣＲまたはそれをコードする核酸をＴ細胞に導入することを含む、ＴＣＲ－Ｔ細胞の調製方法が提供される。

ＴＣＲまたはそれをコードする核酸、およびＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡおよび／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、およびＴＣＲまたはそれをコードするヌクレオチドは、任意の適切な順序でＴ細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡおよび／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡ、およびＴＣＲまたはそれをコードするヌクレオチドを同時にＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡおよび／またはＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡより、ＴＣＲまたはそれをコードする核酸を先にＴ細胞に導入する。一部の実施形態では、ＴＣＲまたはそれをコードするヌクレオチドを、遺伝子編集されたＴ細胞に導入し、そのＴ細胞のＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍおよび／またはＰＤ－１ゲノム領域はすでに編集によって破壊された。一部の実施形態では、この方法はさらに、Ｃａｓ９またはそれをコードするヌクレオチドを前記ｓｇＲＮＡと一緒に当該Ｔ細胞に導入することを含む。

一部の実施形態では、本発明のＴＣＲ－Ｔ細胞によって発現される遺伝子操作されたＴＣＲは、Ｔ細胞がヒト白血球抗原‐非依存的な方法で細胞表面抗原を認識して殺傷の役割を発揮するようにすることができる限り、本分野の既知の任意の遺伝子操作されたＴＣＲであってもよい。例えば、本発明のＴＣＲ－Ｔ細胞における遺伝子操作されたＴＣＲは、表Ａに記載されている抗原を認識する遺伝子操作されたＴＣＲであってもよい。

本文で使用されているように、「遺伝子操作改変されたＴＣＲ分子」、「遺伝子操作されたＴＣＲ分子」、または「人工ＴＣＲ分子」は、ＴＣＲを構成する様々なポリペプチドに由来する組換えポリペプチドを含み、この組換えポリペプチドは一般にｉ）標的細胞上の表面抗原に結合することができ、ｉｉ）Ｔ細胞の中または表面上に共局在化した場合、完全なＴＣＲ複合体のその他のポリペプチド成分と相互作用することができる。

具体的な実施形態では、本発明の遺伝子操作されたＴＣＲは、抗原結合ドメインとも呼ばれる標的特異的結合要素を含む。選択可能な抗原結合ドメインは、たとえば特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとしての標的抗原を認識する。具体的な実施形態では、前記標的抗原は、例えば、上記表Ａの抗原である。具体的な実施形態では、前記標的抗原は、例えば、ウイルス感染、自己免疫疾患などに関連する標的抗原である。遺伝子工学による操作によって、抗原結合ドメインを、ＴＣＲを構成する様々なポリペプチドと組み合わせることができ、これによって、ＴＣＲを介したＴ細胞応答を注目される抗原に対するものにすることができる。

具体的な実施形態では、本発明の遺伝子操作されたＴＣＲは膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然源または組換え源に由来することができる。供給源が天然源である場合、ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来することができる。一つの態様では、膜貫通ドメインは、遺伝子操作されたＴＣＲが標的に結合すれば、細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。本発明に特に適する膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体α、β、またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通ドメインを含むことができる。

場合によって、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質に由来するヒンジを通して遺伝子操作されたＴＣＲの細胞外領域、例えば、遺伝子操作されたＴＣＲの抗原結合ドメインに接続することができる。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジなどのようなヒト免疫グロブリン（Ｔｇ）ヒンジであってもよい。

具体的な実施形態では、本発明の遺伝子操作されたＴＣＲは、膜貫通ドメインと細胞質領域を接続するリンカーを含む。任意に、リンカーは、長さが２～５０アミノ酸の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーである。グリシン‐セリンペアは、特に適切なリンカーを提供する。

具体的な実施形態では、本発明の遺伝子操作されたＴＣＲは、細胞質ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは一般的に、遺伝子操作されたＴＣＲが導入された免疫細胞の少なくとも１つの正常なエフェクター機能の活性化を担当する。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性または補助活性であってもよい。したがって、用語の「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、タンパク質内の、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に専門的な機能を実行するようにガイドする部分を指す。通常は、完全な細胞内シグナル伝達ドメインを使用することができるが、多くの場合、完全鎖を使用する必要はなく、短く切断された部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の代わりにこの短く切断された部分を使用することができる。よって、用語の細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短く切断された部分を含もうとする。

ある実施形態では、前記遺伝子操作されたＴＣＲ分子は、遺伝子操作されたＴＣＲαとＴＣＲβ鎖を含む。ある実施形態では、前記遺伝子操作されたＴＣＲ分子は、Ｔ細胞に発現されるＣＤ３分子とζ鎖および／またはその他の共刺激分子に結合する。

一部の実施形態では、本発明は、疾患（例えば、腫瘍）の治療における上記ＴＣＲ－Ｔ細胞の使用を提供する。

本発明は一つの態様において、有効量の本発明に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞を被験者に投与することを含む、被験者の疾患を治療する方法を提供する。本発明に記載の治療方法は、癌とＨＩＶ／ＡＩＤＳを含むが、これらに限られていない。一部の実施形態では、前記疾患は腫瘍であり、リンパ腫または白血病のような血液腫瘍を含む。一部の実施形態では、前記遺伝子操作されたＴＣＲは表Ａに示す抗原を標的とし、その疾患は、当該標的抗原に対応する表Ａの腫瘍である。一部の実施形態では、前記Ｔ細胞は被験者から得られたものではなく、例えば、前記Ｔ細胞は、健康なドナーに由来することができる。

本発明に係るＴＣＲ－Ｔ細胞は、静脈注入経路など、細胞成分を含む医薬品を投与するために従来使用されている経路を通じて、それを必要とする被験者に投与されることができる。投与量は、被験者の病状および一般的な健康状況に基づいて具体的に決定することができる。

Ｔ細胞源
増殖と遺伝子修飾をする前に、被験者からＴ細胞源が得られる。用語の「被験者」は、免疫応答を誘発することができる生物（例えば、哺乳動物）を含もうとする。被験者の例には、ヒトが含まれている。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍など、さまざまなソースから取得可能である。本発明のＴ細胞はまた、各分化段階にある造血幹細胞に由来することができる。方向性分化培養条件下で、造血幹細胞はＴ細胞に分化する。本発明のある態様では、本分野で獲得可能な複数のＴ細胞株を使用することができる。

本発明のある態様では、Ｔ細胞は、熟練技術者に既知の様々な技術、例えば、ＦｉｃｏｌｌＴＭを利用して被験者から採取された血液から単離して得てもよいし、アフェレーシス（ａｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって個体の循環血液から細胞を得てもよい。アフェレーシスの産物は通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、血小板を含むリンパ球を含む。一つの態様では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して血漿部分を除去し、後続の加工ステップのために細胞を適切な緩衝液または媒質に入れてもよい。

赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ^ＴＭ勾配遠心分離または向流遠心分離によって単球をパニングして枯渇させ、末梢血リンパ球からＴ細胞を分離することができる。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの特定のＴ細胞サブセットは、陽性または陰性選択技術によってさらに分離することができる。例えば、一つの態様では、Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ^ＴＭＭ－４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）結合ビーズと一緒に、所望のＴ細胞に対して陽性選択するのに十分な時間でインキュベーションすることで分離する。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を腫瘍組織から分離することができる。

ｓｇＲＮＡ
本発明の一つの態様では、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、およびＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡが提供される。前記ｓｇＲＮＡは、配列番号２～２２から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは化学修飾されたものである。

本発明はさらに、本発明に係るｓｇＲＮＡまたはそのベクターを含む、ｓｇＲＮＡ組成物、キットまたは製品を含む。一部の実施形態では、そのキットは、ｉ）配列番号２～５から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号６～１４から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡ、及び／または（ｉｉｉ）配列番号１５～２２から選択されるいずれか一つの配列を含むｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、そのキットは、（ｉ）配列番号３の配列を含むｓｇＲＮＡ、（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むｓｇＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）配列番号７の配列を含むｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態では、そのキットはさらに、Ｃａｓ６をコードする核酸またはそのベクターを含む。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは化学修飾されたものである。

一部の実施形態では、本発明のＴ細胞遺伝子改変方法は、化学修飾されたｓｇＲＮＡを使用する。本発明者らが使用した化学修飾されたｓｇＲＮＡは、以下の２つの利点を有すると考えられる。第一に、ｓｇＲＮＡは一本鎖ＲＮＡであり、半減期が非常に短いため、細胞に入ると急速に分解する（最長１２時間）が、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとが結合して遺伝子編集の役割を発揮するには少なくとも４８時間がかかる。そのため、化学修飾されたｓｇＲＮＡは細胞に入った後、安定して発現し、Ｃａｓ９タンパク質に結合した後、効率的にゲノムを遺伝子編集してＩｎｄｅｌｓを生成することができる。第二に、未修飾のｓｇＲＮＡは細胞膜を透過する能力が低く、細胞または組織に効果的に入って対応する機能を発揮することができない。化学修飾されたｓｇＲＮＡは細胞膜を透過する能力が一般的に強化されている。本発明において、本分野で常用の化学修飾方法を使用することができ、ｓｇＲＮＡの安定性（半減期を延長する）と細胞膜への侵入能力を向上させることができる限り、いずれも使用できる。実施例に使用されている具体的な化学修飾の他に、例えば、ＤｅｌｅａｖｅｙＧＦ１，ＤａｍｈａＭＪ．Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｆｏｒｔａｒｇｅｔｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＣｈｅｍＢｉｏｌ．２０１２Ａｕｇ２４；１９（８）：９３７－５４、およびＨｅｎｄｅｌｅｔａｌ．ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｇｕｉｄｅＲＮＡｓｅｎｈａｎｃｅＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｈｕｍａｎｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｓｅｐ；３３（９）：９８５－９８９の文献に報告された化学修飾方法など、その他の修飾方法を含む。

本発明において、化学修飾されたｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９コード遺伝子を共にエレクトロポレーションによってＴ細胞に導入し、効率的な遺伝子編集効率（例えば、Ｉｎｄｅｌｓ％で表される）を生成し、ｓｇＲＮＡの化学修飾は本発明の肝心な要素の一つである。実施例のデータによって、Ｃａｓ９ｍＲＮＡと一緒にエレクトロポレーションしたのは、化学修飾されていないｓｇＲＮＡである場合、そのＩｎｄｅｌｓ効率は、化学修飾されたｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションした時に得られたＩｎｄｅｌｓ効率よりはるかに低いことは示されている。

次は具体的な実施例により本発明の内容を説明する。以下の具体的な実施例は、例示のみを目的としており、本発明の内容が具体的な実施例に限定されることを意味するものではないことを理解されたい。

実施例１：ユニバーサルＴ細胞の調製
１．健康なドナーのＴ細胞の単離と活性化
健康なドナーからの臍帯血の採取：血液バンクから臍帯血を採取した後、４℃の冷蔵庫に一時に保管し、２４時間以内に、Ｔ細胞単離のために、恒温装置を備えた輸送車を介してＧＭＰラブに輸送した。
１．１臍帯血単球の調製：ステップ（１）で輸送された臍帯血に生理食塩水をピペットで吸い取って加え、臍帯血と生理食塩水を１：１（Ｖ／Ｖ）に希釈し、血球希釈液をリンパ球分離チューブにゆっくり加え、８００ｇで２０分間遠心分離した後、リンパ球分離液の上にある白い膜層の細胞を吸い取り、新しい５０ｍｌ遠心分離チューブに移し、Ｔ細胞培養培地を加え、４００ｇで５分間遠心分離してから上澄みを捨て、遠心分離チューブの底部の細胞ペレットを残して末梢血単球を得た。

１．２Ｔ細胞の単離と活性化：得られた臍帯血単球をセルカウンターでカウントした後、Ｔ細胞選別を行った。具体的なステップは下記通りである：
１．２．１．細胞ペレットをＥａｓｙｂｕｆｆｅｒ（メーカー：ＳｔｅｍＣｅｌｌ、型番：１６Ｆ７２３３１）で密度が５＊１０^７／ｍｌになるように調整し、５ｍｌピペットを使用して細胞を５ｍｌフローチューブに移した；
１．２．２．Ｔ細胞単離試薬を添加し、濃度は５０ｕｌ／ｍｌとし、添加した後、室温で５分間インキュベーションした；
１．２．３．選別磁気ビーズを加え、３０秒以内に磁気ビーズを均一に混合し、仕上げ濃度は４０μｌ／ｍｌであった；
１．２．４．Ｅａｓｙｂｕｆｆｅｒを使用して細胞液を２．５ｍｌに補足し、その後直接に磁気カラム上に置き、３分間後に、細胞を１５ｍｌ遠心分離チューブに注ぎ、Ｔ細胞を得た；
１．２．５．選別後、１０００μｌのピペットで均一に混合してカウントし、遠心分離（４００Ｇ、５分間）して上澄みを除去し、Ｔ細胞ピペットを得た。
Ｔ細胞の培養培地にＴ細胞ピペットを再懸濁した。そして、１：１の比率でＴ細胞活性化因子を添加し、この時、Ｔ細胞は活性化状態にあり、Ｔ細胞をインキュベーターに入れて増殖培養を続けた。

２．エレクトロポレーション条件の最適化
上記培養したＴ細胞を５０ｍｌの遠心分離チューブに収集し、３００ｇで７分間遠心分離し、上澄みを捨て、ＤＰＢＳ溶液（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、型番：１９２４２９４）で２回洗浄し、そしてエレクトロポレーション試薬を用いて細胞密度を２．５×１０^７細胞／ｍＬに調整した。ＨＩＳＣＲＩＢＥ^ＴＭＴ７ＡＲＣＡｍＲＮＡＫｉｔ（テール付き）（メーカー：ＮＥＢ、型番：ｃａｔ＃Ｅ２０６０Ｓ）を使用して調製したＧＦＰｍＲＮＡ（具体的なステップについて３．３を参照）をＴ細胞と均一に混合し、その最終濃度が１００μＬ当たり２．５×１０^６細胞と６μｇのＧＦＰｍＲＮＡを含むようにした。エレクトロポレーターＢＴＸＡｇｉｌｅｐｕｌｓｅＭＡＸ（メーカー：ＢＴＸ、型番：４７－０２００ＮＩＮＴ）を使用してＧＦＰｍＲＮＡをＴ細胞に導入した。電圧とパルス時間の変更によってそれぞれエレクトロポレーションシステムを最適化し、表１に示すように、電圧は１８０ボルトから４００ボルトに順次増加し、パルス時間は２ｍｓから０．５ｍｓに順次に減少した。細胞の成長状態を毎日観察し、エレクトロポレーションされたＴ細胞を１日おきに数えて液を補充し、フローサイトメトリー（メーカー：ＡＣＥＡ、型番：ＡＣＥＡＮｏｖｏＣｙｔｅ）を使用して遺伝子編集されたＴ細胞に対して表現型解析を行った結果、表１に示すように、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓのエレクトロポレーション条件下で、細胞生存率とＧＦＰエレクトロポレーション効率が最も良かった。

３．Ｔ細胞の遺伝子ノックアウト
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を利用して、ステップ１．２で得られたＴ細胞におけるＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－１遺伝子をノックアウトした。具体的なステップは下記通りである：
３．１ＴＣＲのα鎖定常コード領域（すなわちＴＲＡＣ）遺伝子、ＨＬＡ定常コード領域Ｂ２Ｍ遺伝子、およびＰＤ－１の定常コード領域遺伝子に対するｓｇＲＮＡ設計およびプラスミド構築。
ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ－１コード領域のすべてのコード配列について設計したｓｇＲＮＡは、いずれもＣＲＩＳＰＲＲＧＥＮＴｏｏｌｓによって設計され、最高のスコアに従って選択されたｓｇＲＮＡ配列を表２に示す。

ここで、ＴはＴＲＡＣに対するｓｇＲＮＡ配列を表し、ＰはＰＤ－１コード領域に対するｓｇＲＮＡ配列を表し、ＢはＢ２Ｍに対するｓｇＲＮＡ配列を表す。
３．２化学方法でｓｇＲＮＡを２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾し、ノックアウト効率と安定性の高いｓｇＲＮＡを調製した。
３．３Ｃａｓ９プラスミドとＧＦＰプラスミドを取り、Ｘｂａｌ（メーカー：ＮＥＢ、型番：ｃａｔ＃Ｒ０１４５Ｓ）、ｃｕｔｓｍａｒｔｂｕｆｆｅｒ（メーカー：ＮＥＢ、型番：ｃａｔ＃Ｂ７２０４ｓ）で酵素消化して線形化させ、５０μｌ反応系は下記通りである：

３７℃で４時間水浴し、酵素の消化産物２μｌを、電圧が１１０Ｕとしたアガロースゲル電気泳動に３０分間かけ、ゲルイメージャーで単一のバンドが観察され、これは、酵素消化が完了し、すべてのプラスミドが線形化されたことを示している。
上記反応生成物を取り、洗浄し精製した。
精製された生成物を取り、ＨＩＳＣＲＩＢＥ^ＴＭＴ７ＡＲＣＡｍＲＮＡＫｉｔ（メーカー：ＮＥＢ、型番：ｃａｔ＃Ｅ２０６０Ｓ）を用いてインビトロ転写（すなわちＩＶＴ）を行い、２０μｌシステムは下記通りである：

上記反応系をＰＣＲ機において３７℃で４時間反応させた。４時間後、２μｌのＤＮａｓｅ１を反応系に加え、３７℃で２０分間反応させた。
上記反応生成物を取り、次の操作をした：

上記反応系をＰＣＲ機において２時間反応させた。
上記反応生成物を洗浄し精製して、後ほどの使用のために‐８０度の冷蔵庫に置いた。

３．４エレクトロポレーション技術を利用して、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡをＴ細胞に導入し、抗原スクリーニングの原理を利用して、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ１陰性およびＣＤ４とＣＤ８陽性なＴ細胞をスクリーニングしてユニバーサルＴ細胞を得た。
上記細胞を取り、ＴＩＡＮａｍｐＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＫｉｔ（メーカー：ＴＩＡＮＧＥＮ、型番：ｃａｔ＃ＤＰ３０４－０３）を用いて細胞ゲノムを抽出した。合成プライマーを利用して、上記抽出された細胞ゲノムを取り、２＊ＥｓａｙＴａｑＳｕｐｅｒＭｉｘ（＋ｄｙｅ）（メーカー：ＴＲＡＮＳ、型番：Ｃｏｄｅ＃ＡＳ１１１）を用いて、ＴＲＡＣ、Ｂ２ＭおよびＰＤ－１の、対応するｓｇＲＮＡを含むゲノム領域をそれぞれＰＣＲで増幅し、５０μｌ反応系は下記通りである：

反応条件は下記通りである：
９５℃ ３分間
９５℃ ３０秒３５サイクル
Ｖａｒｉａｂｌｅ３０秒
７２℃

３．５反応後のＰＣＲ生成物を取り、Ｓａｎｇｅｒシーケンスを行い、ＴＣＲ、ＨＬＡ、ＰＤ－１のノックアウト効率を分子レベルで検証した。その結果は図２Ａ～図２Ｊに示す。このシステムでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を利用して、ＴＣＲのＴＲＡＣ遺伝子、ＨＬＡのＢ２Ｍ遺伝子、ＰＤ－１の定常コード領域をうまく編集することができ、挿入変異と欠失変異を含み、どちらもフレームシフト変異を引き起こし（詳細は下記表Ｂ～Ｇを参照）、遺伝子レベルでＴＣＲ、ＨＬＡ、ＰＤ－１の発現を抑制した。

３．６同時に、ＴＲＡＣ－ｓｇ３（Ｔ２、Ｔ３）、Ｂ２Ｍ－ｓｇ２（Ｂ２、Ｂ３）およびＰＤ－１－ｓｇ２（Ｐ１、Ｐ２）のヒトゲノム全体の潜在的なオフターゲット部位を予測し、予測されたその他の遺伝子発現を影響し得るオフターゲット部位について増幅解析を行った。その目的は、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－１のノックアウトがオフターゲット（оｆｆ‐ｔａｒｇｅｔ）の非特異的遺伝子のノックアウトを導入しなかったことを分子レベルで確認することである。結果を表３と図５に示す。

表３から、ＴＲＡＣ、Ｂ２ＭおよびＰＤ－１の遺伝子は何ら変異もしなかったことが分かる。これは、当該システムが遺伝子編集特異性に対する要求を満たしたことを示している。
上記結果から分かるように、ＴＲＡＣ－ｓｇ２（Ｔ２）、ＴＲＡＣ－ｓｇ３（Ｔ３）、Ｂ２Ｍ－ｓｇ２（Ｂ２）、Ｂ２Ｍ－ｓｇ３（Ｂ３）、およびＰＤ－１－ｓｇ１（Ｐ１）、ＰＤ－１－ｓｇ２（Ｐ２）をｓｇＲＮＡとしてＴ細胞の遺伝子編集を完了させてからスクリーニングして得られたユニバーサルＴ細胞の中のＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－１遺伝子は完全にノックアウトされたと共に、潜在的なオフターゲット部位での遺伝子変異が見つからなかった。

４．遺伝子編集Ｔ細胞の増殖
選別されたＴ細胞をサイトカインによって活性化させ、Ｔ細胞培養培地で細胞密度を１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。７２時間後、細胞の状態を観察し、細胞懸濁液を収集し、３００ｇで７分間遠心分離し、上澄みを捨て、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で２回洗浄し、そしてエレクトロポレーション試薬培地で細胞密度を２．５×１０^７細胞／ｍＬに調整した。ＨＩＳＣＲＩＢＥ^ＴＭＴ７ＡＲＣＡｍＲＮＡＫｉｔ（メーカー：ＮＥＢ、型番：ｃａｔ＃Ｅ２０６０Ｓ）を使用して調製したＣａｓ９ｍＲＮＡおよび合成されたｓｇＲＮＡをＴ細胞とＲＮＡと均一に混合し、最終濃度が１００μＬ当たり２．５×１０^６細胞と８μｇのＲＮＡ（Ｃａｓ９ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡをそれぞれ４μｇ含む）を含むようにした。そして、エレクトロポレーターＢＴＸＡｇｉｌｅｐｕｌｓｅＭＡＸを使用してＲＮＡをＴ細胞に導入して培養した。細胞の成長状態を毎日観察し、１日おきに細胞を数えて液を補充し、遺伝子編集されたＴ細胞に対して表現型解析を行った結果、表３に示すように、ＴＣＲのみをノックアウトする効率は約９０．４２％であり、ＴＣＲおよびＢ２Ｍ（ＤＫＯ）をノックアウトする効率は約８１．３９％であり、三つの遺伝子を同時にノックアウト（ＴＫＯ）する効率は６７．９１と高かった。細胞培養の８日後、得られたＴ細胞に対して品質管理モニタリングをした。

５．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集効率の検出
細胞培養の８日目にサンプリングし、ヒトゲノム抽出キット（メーカー：ＴＩＡＮＧＥＮ、型番：ｃａｔ＃ＤＰ３０４－０３）を利用してサンプルからゲノムを抽出すると共に、対応するシーケンシングプライマーを設計し、ＰＣＲ技術を用いて目的フラグメントを調製し、目的フラグメントと、対応するプライマーとに対してｓｉｎｇｅｒシーケンシングをした。ＴＩＤＥソフトウェアを使用してシーケンシング結果を解析し、その結果を図２Ａ、２Ｄ、２Ｇに示す。好ましく選択されたｓｇＲＮＡは、対応する遺伝子を効率的にノックアウトすることができる。

６．目的細胞のスクリーニング
ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１陰性、ＣＤ４とＣＤ８陽性なＴ細胞を下記の方法でスクリーニングした。
免疫磁気ビーズを利用してＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１陰性かつＣＤ４とＣＤ８陽性なＴ細胞をスクリーニングし、編集されたＴ細胞の状態をＴ細胞生存率によってモニタリングした。

第１ステップでは、１２～１４日目に、エレクトロポレーションされたＴ細胞を収集し、４００Ｇで５分間遠心分離し、上澄みを捨て、Ｅａｓｙｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を１×１０^８／ｍｌにメスアップしてから、細胞を５ｍｌフローチューブに移した。スクリーニング試薬を利用して、Ｔ細胞中の、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－１細胞を依然として発現している細胞を除去し、スクリーニングして最終的な製品、すなわちユニバーサルＴ細胞を得た。

第２ステップでは、少量のＴ細胞を取ってフローサイトメトリー検出をすると共に、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１細胞表面のバイオマーカーを染色した。ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１の陽性率は１％未満である場合、次のステップに進むことができる。本実施例では、図４に示すように、ＴＣＲ陽性率は１％であり、ＴＣＲとＢ２ＭＤＫＯのＴ細胞陽性率は０．７９％未満であり、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ－１ＴＫＯのＴ細胞陽性率は１％未満である。表４に示すように、精製後のＴ細胞生存率は明らかな影響を受けておらず、すべて８５％以上であった。

７．オフターゲット解析
７．１．１×１０^６のＴ細胞を収集し、ゲノムを抽出した（メーカー：ＱＩＡＧＥＮ、型番：Ｃａｔ＃６９５０４）。
７．２．抽出されたゲノムをインビトロでＣａｓ９消化反応させた。
Ｃａｓ９インビトロ消化反応系は下記通りである：

７．３．ピペットチップでピペットし、穏やかに混合したあと、３７℃で１５分間インキュベーションした；
７．４．１μｌのプロテイナーゼＫ（メーカー：Ｔｉａｎｇｅｎ、型番：Ｃａｔ＃ＲＴ４０３）を加え、穏やかに混合した後、室温で１０分間インキュベーションした；
７．５．５ｕｌのサンプルを取ってゲル電気泳動を行い、Ｃａｓ９インビトロ消化反応の効果を検出した；
７．６．残りのサンプルについてヒトゲノムリシーケンスをした。
その結果は図５に示され、オフターゲット現象は見つからなかった。

実施例２：ユニバーサルＴ細胞の調製
ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞の調製と増殖
選別されたＴ細胞をサイトカインによって活性化させ、Ｔ細胞培養培地を利用して細胞密度を１×１０^６細胞／ｍＬに調整した。７２時間後、細胞の状態を観察し、細胞懸濁液を収集し、３００ｇで７分間遠心分離し、上澄みを捨て、ＤＰＢＳ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、型番：１９２４２９４）で２回洗浄し、そしてエレクトロポレーション試薬培地で細胞密度を２．５×１０^７細胞／ｍＬに調整した。ＨＩＳＣＲＩＢＥ^ＴＭＴ７ＡＲＣＡｍＲＮＡＫｉｔ（テール付き）（メーカー：ＮＥＢ、型番：ｃａｔ＃Ｅ２０６０Ｓ）を使用して調製したＣａｓ９ｍＲＮＡおよび合成されたｓｇＲＮＡをＴ細胞とＲＮＡと均一に混合し、最終濃度が１００μＬ当たり２．５×１０^６細胞と８μｇのＲＮＡ（Ｃａｓ９ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡをそれぞれ４μｇ含む）を含むようにした。そして、エレクトロポレーターＢＴＸＡｇｉｌｅｐｕｌｓｅＭＡＸを使用してＲＮＡをＴ細胞に導入して培養した。細胞の成長状態を毎日観察し、１日おきに細胞をカウントして液を補充し、５日目にＭＯＩ＝２－１０の比率で、ＣＡＲ（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）、ＣＤ８ａｌｐｈａヒンジ領域（ＣＤ８ａｌｐｈａｈｉｎｇｅ）、ＣＤ８膜貫通領域（ＣＤ８ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄоｍａｉｎ）、４－１１ＢＢシグナル領域（４－１１ＢＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｏｍａｉｎ）およびＣＤ３ｚｅｔａを含み、具体的な構造についてＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１を参照）がパッケージングされたレンチウイルスを加えた。

ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞のスクリーニング
ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１陰性、ＣＤ４とＣＤ８陽性なＴ細胞を下記の方法でスクリーニングした。
免疫磁気ビーズを利用してＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１陰性、かつＣＤ４とＣＤ８陽性なＴ細胞をスクリーニングし、編集されたＴ細胞の状態をＴ細胞生存率によってモニタリングした。具体的なステップは下記通りである：

第１ステップでは、１２～１４日目に、エレクトロポレーションされたＴ細胞を収集し、４００Ｇで５分間遠心分離し、上澄みを捨て、Ｅａｓｙｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を１×１０^８／ｍｌにメスアップしてから、細胞を５ｍｌフローチューブに移した。スクリーニングビーズを利用して、Ｔ細胞中の、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、ＰＤ－１細胞を依然として発現している細胞を除去し、スクリーニングして最終的な製品、すなわちユニバーサルＴ細胞を得た。

第２ステップでは、少量のＴ細胞を取ってフローサイトメトリー検出をすると共に、ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１細胞表面のバイオマーカーを染色した。ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍおよび／またはＰＤ－１の陽性率は１％未満である場合、次のステップに進むことができる。本実施例では、表５と図６に示すように、ＴＣＲ陽性率は１％であり、ＴＣＲとＢ２ＭＤＫＯのＴ細胞陽性率は０．７９％未満であり、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、およびＰＤ－１ＴＫＯのＴ細胞陽性率は１％未満である。精製後のＴ細胞生存率は明らかな影響を受けておらず、すべて８５％以上であった。

実施例３：ユニバーサルＣＡＲ－Ｔの機能検証
実施例２で得られたユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞（すなわち、エフェクター細胞）の、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病細胞に対する殺傷効果が観察された。
一、特異的腫瘍細胞に対するインビトロ殺傷効果
本発明の実験ステップは下記通りである：

ステップ１：標的細胞の標識
ＣＥＬＬＴＲＡＣＥ^ＴＭＦａｒＲｅｄＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫｉｔ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、型番：１８８８５６９）を用いて標的細胞（ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞Ｒａｊｉ、Ｋ５６２、すべての細胞はＡＴＣＣに由来）を標識した。
１．ＣＥＬＬＴＲＡＣＥＴＭＦａｒＲｅｄＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎを再蒸留水で１ｍｍоｌの溶液に希釈した；
２．１×１０^６個の標的細胞を取り、４００ｇで５分間遠心分離して上澄みを除去した；
３．１μｌのＣＥＬＬＴＲＡＣＥＴＭＦａｒＲｅｄＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ溶液を加え、３７℃の暗所で２０分間インキュベーションした；
４．細胞をＴ細胞培養培地に加え、３７℃で５分間インキュベーションした；
５．４００ｇで５分間遠心分離した後、上澄みを除去し、標識を完了した。

ステップ２：標的細胞に対するエフェクター細胞の殺傷の検出
標識された標的細胞を２×１０^５個の細胞／ｍＬの密度でＲ１６４０＋１０％ＦＢＳ培養液で再懸濁し、５００μＬを取って４８ウェルプレートに加えた。適切なエフェクター細胞と標的細胞との比率（２．５：１、１．２５：１、０．６：１）で、各ウェルに５００μｌのエフェクター細胞を加えると共に、Ｔ細胞と健康なヒト臍帯血ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｔ細胞培養の２日目に、ＣＡＲ（具体的な構造について、ＵＳ２０１４０２７１６３５Ａ１を参照）がパッケージングされているレンチウイルスをＭＯＩ（感染多重度）＝２～１０の比率で加えて得られたＣＡＲ－Ｔ）を対照細胞として、各群に３つが平行し、個別の標的細胞群を設計し、その死亡率を検出した。３７℃、５％ＣＯ２で１２～１６時間培養し、４００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを取り、１５０μｌのＤＰＢＳ（メーカー：Ｇｉｂｃｏ、型番：１９２４２９４）で再懸濁した。ＰＩ（メーカー：Ｓｉｇｍａ；型番：Ｐ４１７０）で染色した後、フローサイトメトリーで標的細胞の死亡率を検出した。その結果を図７に示す。その他のＣＡＲ－Ｔ細胞と比べて、ユニバーサルＣＡＲ－Ｔ細胞は、特異的細胞に対する殺傷効果が基本的に同じであり、効果はＴ細胞よりも優れている。また、非特異的な標的細胞に対して殺傷効果はほとんどない。

ステップ３：ＥＬＩＳＡによるサイトカイン放出の検出
標識された標的細胞を２×１０^５個の細胞／ｍＬの密度でＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳで再懸濁し、５００μＬを取って４８ウェルプレートに加えた。適切なエフェクター細胞と標的細胞との比率（１０：１）で、各ウェルに５００μｌのエフェクター細胞を加えると共に、Ｔ細胞と健康なヒト臍帯血ＣＡＲ－Ｔ細胞を対照細胞として、各群に３つが平行し、個別の標的細胞群を設計した。３７℃、５％ＣＯ２で１２～１６時間培養し、各ウェルから１００μｌの培養上澄みを取り、４００ｇで５分間遠心分離して細胞ペレットを除去し、上澄みを取ってからＬＥＧＥＮＤＭＡＸ^ＴＭＨｕｍａｎＩＬ－２／ＩＦＮ－ｇａｍａ（メーカー：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、型番：４３１８０７、４３０１０８）キットを用いて、プロトコルに従ってサイトカイン放出を検出した。

得られた結果は図８に示す。図８から分かるように、Ｒａｊｉ細胞に対するユニバーサルＣＡＲ－Ｔの殺傷能力は、通常のＣＡＲ－Ｔの殺傷能力と基本的に同じか、通常のＣＡＲ－Ｔの殺傷能力よりわずかに優れており、特にＴＣＲ^ｎｅｇＣＡＲ－ＴＩＦＮ－ｒの放出量は、通常のＣＡＲ－Ｔよりはるかに高く、どちらもＫ５６２に対する殺傷力が低いため、サイトカイン放出は比較的に少ない。

二、特異的腫瘍細胞に対するユニバーサルＣＡＲ－Ｔのインビボでの殺傷効果
１．細胞株：人リンパ腫細胞株
Ｒａｊｉ^{ｔｇ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰ）}／Ｂｃｇｅｎ細胞は、ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫細胞株であり、そのＣＤ１９発現は陽性であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的細胞とすることができる。Ｒａｊｉ^{ｌｕｃ－ＧＦＰ}は修飾されてＧＦＰとｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを同時に発現する。尾静脈注射によってマウスのヒトリンパ腫モデルを構築することができ、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔＤ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、ＰｏｔａｓｓｉｕｍＳａｌｔ（メーカー：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、型番：１２２７９９）と小動物ライブイメージャーの協働で呈する蛍光を通して腫瘍形成面積を統計することができる。

２．Ｒａｊｉ^{ｔｇ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰ）}／Ｂｃｇｅｎ細胞培養
Ｒａｊｉ^{ｔｇ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰ）}／Ｂｃｇｅｎ細胞株は懸濁細胞株であり、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で急速に増殖できる。細胞密度が２～３×１０^６／ｍＬの場合、継代が必要である。継代時に、細胞懸濁液を遠心分離チューブに入れ、３００ｇで６分間遠心分離し、上澄みを捨てた。細胞密度を１×１０^６細胞／ｍｌに調整し、培養を続けた。正常な成長条件では、一日おきに継代し、細胞密度を０．８～１×１０^６細胞／ｍＬに維持すればよい。

３．マウスのモデリング
７～１０週齢のＮＰＧメスマウス２５匹に、腫瘍細胞（Ｒａｊｉ^{ｔｇ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰ）}／Ｂｃｇｅｎ）５×１０^５細胞／匹で尾静脈注射により１回注射し、一日おきに体重を計り、毎日１回観察し、腫瘍細胞を播種してから３～５日後、ＸｅｎｏＬｉｇｈｔＤ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、ＰｏｔａｓｓｉｕｍＳａｌｔ（メーカー：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、型番：１２２７９９）と小動物ライブイメージャーの協働で呈する腫瘍形成面積および腫瘍の濃縮程度を指標としてランダムに６つの群、すなわち、生理食塩水群、Ｔ細胞群、ＣＡＲ－Ｔ細胞群、ＴＣＲ^ｎｅｇＣＡＲ－Ｔ群、ＤＫＯ－ＣＡＲ－Ｔ群、ＴＫＯ－ＣＡＲ－Ｔ群に分けた。

４．マウスリンパ腫モデルの薬剤投与
モデルを構築した日をＤ０として記録した。尾静脈注射によって生理食塩水２００μＬ、ヒトＴ細胞２００μＬ（合計２×１０^６細胞／匹）、ＣＡＲ－Ｔ細胞２００μＬ（合計２×１０^６細胞／匹）、ＴＣＲ^ｎｅｇＣＡＲ－Ｔ細胞２００μＬ（合計２×１０^６細胞／匹）、ＤＫＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞２００μＬ（合計２×１０^６細胞／匹）、ＴＫＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞２００μＬ（合計２×１０^６細胞／匹）を細胞に注射し、すべてのマウスに単回投与を行った。その結果を図９Ａ～９Ｃおよび図１０に示す。図から分かるように、本発明によって提供されるユニバーサルＣＡＲ－Ｔは、初期段階では腫瘍細胞を抑制および殺傷する良好な効果を有し、ＣＡＲ－Ｔ細胞とほぼ同じであり、後期段階では、一般的なＣＡＲ－Ｔより、腫瘍細胞に対する抑制効果が明らかである。

５．投与後のマウスモニタリング
マウスの体重、皮膚の完全度、毛髪、精神状態、活動頻度、および活動協調度などを含み、投与後のマウスに対して毎日モニタリングし、２日ごとにマウスの体重を記録し、連続して３７日間観察した。腫瘍面積の消去および腫瘍濃縮の低減をエフェクター細胞の機能の評価指標として、皮膚完全度、毛髪、精神状態、活動頻度および活動協調度によってユニバーサルＣＡＲ－Ｔの安全性を評価した。図１１に示すように、マウスの体重は低減していなく、皮膚の毛髪は完全であり、精神的に活発であり、活動も協調しており、ＧＶＨＤ応答はなかった。

Claims

Ｔ細胞中の
（ｉ）１４番染色体上の２３０１６４４８番目から２３０１６４９０番目のＴＲＡＣゲノム領域、
（ｉｉ）１５番染色体上の４５００３７４５番目から４５００３７８８番目のＢ２Ｍゲノム領域、及び
（ｉｉｉ）２番染色体上の２４２８００９３６番目から２４２８００９７８番目のＰＤ－１ゲノム領域、
をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術によってインビトロで破壊することを含み、
（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノム領域の標的ヌクレオチド配列は、配列番号２の配列と相補的であり、
（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノム領域の標的ヌクレオチド配列は、配列番号８の配列と相補的であり、及び
（ｉｉｉ）前記ＰＤ－１ゲノム領域の標的ヌクレオチド配列は、配列番号１５の配列と相補的である、
遺伝子改変Ｔ細胞の調製方法。
（ｉ）前記ＴＲＡＣゲノム領域の編集を実現するように、配列番号２の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、
（ｉｉ）前記Ｂ２Ｍゲノム領域の編集を実現するように、配列番号８の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、及び
（ｉｉｉ）前記ＰＤ－１ゲノム領域の編集を実現するように、配列番号１５の配列を含むｓｇＲＮＡをＴ細胞に導入すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ、Ｂ２Ｍを標的とするｓｇＲＮＡ、及びＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡを同時に当該Ｔ細胞に導入することを含む、請求項２に記載の方法。
前記ｓｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたものである、請求項３に記載の方法。
前記修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、または３つの塩基、または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾である、請求項４に記載の方法。
前記ｓｇＲＮＡとＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を一緒に当該Ｔ細胞に導入する、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列とをエレクトロポレーションによって一緒に当該Ｔ細胞に導入し、前記エレクトロポレーションの条件には、１５０～２５０Ｖ、０．５～２ｍｓ；１５０Ｖ、２ｍｓ；１６０Ｖ、２ｍｓ；１７０Ｖ、２ｍｓ；１８０Ｖ、２ｍｓ；１９０Ｖ、１ｍｓ；２００Ｖ、１ｍｓ；２１０Ｖ、１ｍｓ；２２０Ｖ、１ｍｓ；２３０Ｖ、１ｍｓ；２４０Ｖ、１ｍｓ；及び２５０Ｖ、０．５ｍｓから選択されるいずれかが含まれる、請求項６に記載の方法。
遺伝子編集されたＴ細胞から、ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及び／またはＰＤ－１の発現量の低いＴ細胞をスクリーニングすることをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
ＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ、及びＰＤ－１遺伝子の同時ノックアウト効率が６５％以上である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
Ｔ細胞は健康な被験者に由来する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。