CN117165529A

CN117165529A - 一种经过基因修饰的t细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117165529A
Application number: CN202210587087.1A
Authority: CN
Inventors: 张云龙; 周立; 吕璐璐
Original assignee: Heyuan Kanghua Pharmaceutical Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Heyuan Kanghua Pharmaceutical Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2022-05-27
Filing date: 2022-05-27
Publication date: 2023-12-05

Abstract

本发明提供了一种经过基因修饰的T细胞及其制备方法和应用，该经过基因修饰的T细胞，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因，从而使得T细胞的Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

Description

一种经过基因修饰的T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种经过基因修饰的T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

过继性细胞治疗(adoptive cell transfer,ACT)是全球范围内广受关注的一种免疫治疗技术，其包括CAR(嵌合抗原受体，Chimeric Antigen Receptor)-T细胞治疗药物、TCR(T细胞受体，T cell receptor)-T细胞治疗药物等。

CAR-T细胞治疗药物是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，CAR蛋白是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括靶向部分(例如，结合肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。TCR-T细胞治疗药物是指从对肿瘤有应答作用的T细胞中将TCR编码基因分离出来，然后将TCR基因导入普通T细胞并赋予普通T细胞肿瘤特异性杀伤能力。

以CAR-T细胞治疗药物为例，目前已批准上市的CAR-T细胞治疗药物，使用的都是自体T细胞体外转染、增殖后回输患者的自体CAR-T细胞药物，但自体CAR-T细胞药物存在以下的问题：自体T细胞不易在体外增殖、制备时间较长、制备过程复杂，需要运输到工厂，制备个体化CAR-T细胞。但若使用异体CAR-T细胞则需要免疫配型，而且也存在免疫排斥、GVHD等风险，因此尚未得到应用。若能制备通用型CAR-T细胞治疗药物使其具有患者人群普适性，就能够进行更大规模的工业化生产，获得标准化的通用型产品，同时，标准化的通用型CAR-T细胞治疗药物可被冷冻运往全球任何地方立即使用，即所谓的“即用型”。这种概念有望极大地缩短CAR-T制备流程以及降低生产成本，有望解决目前自体CAR-T细胞治疗中遇到的困难。

目前，通过基因编辑技术制备通用型CAR-T(Universal CAR-T，UCAR-T)成为可能，UCAR-T是一种同种异体CAR-T细胞疗法，这种方法借助基因编辑技术，不需要制备患者个体化CAR-T细胞，而是直接将来源于年轻健康供者的T细胞进行基因修饰。Cellectis公司开发的、使用TALEN技术的异体CAR-T细胞UCART19，已经成功治愈了一例复发性急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿，其定向敲除Trac基因(去除掉细胞本身的T细胞受体，防止发生GVHD)、CD52基因(使细胞对阿伦单抗耐药)，证明了基因编辑技术和CAR-T疗法结合的可能性。目前已有针对在UCAR-T细胞中敲除Trac、HLA、PD-1、LAG3、CTLA-4、B2M等靶点基因的报道。

但作为一种新的治疗尝试，UCAR-T技术中依然有一些问题需要解决，如：经基因组编辑敲除基因后，T细胞的增殖能力大幅度下降，而单个供者能够提供的T细胞是有限的，不同供者的T细胞又无法混合，因此基因编辑对T细胞增殖能力的影响制约着UCAR-T的产能。T细胞的增殖能力对于后续的治疗、整个疗法的成本、技术的产业化至关重要。因此，提高经过基因组编辑操作后T细胞的增殖能力至关重要。

发明内容

本申请提供了一种经过基因修饰的T细胞及其制备方法和应用，发明人分别进行了CAR-T细胞中的Trac基因/Socs1基因双敲除、Trac基因/Id3基因双敲除、Trac基因/Dnmt3a基因双敲除，获得了靶向BCMA的UCAR-T细胞。发明人还验证了相较于Trac基因/Id3基因双敲除CAR-T细胞、Trac基因/Dnmt3a基因双敲除CAR-T细胞以及Trac基因单敲除CAR-T细胞，Trac/Socs1双敲除CAR-T细胞的增殖能力强、CAR⁺细胞的比例高，并且经过多轮刺激后的持续增殖性强、细胞凋亡水平低、细胞耗竭水平低、杀伤效果也相当。

一种经过基因修饰的T细胞，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因，从而使得T细胞的Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

上述T细胞在某些实施方式中，T细胞来源于同种异体T淋巴细胞。

上述T细胞在某些实施方式中，T细胞来源于健康供者。

上述T细胞在某些实施方式中，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个。

上述T细胞在某些实施方式中，所述T细胞的染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个。

上述T细胞在某些实施方式中，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子。

上述T细胞在某些实施方式中，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种。

上述T细胞在某些实施方式中，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统。

上述T细胞在某些实施方式中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示。

上述T细胞在某些实施方式中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA的序列如SEQ ID NO:26所示。

上述T细胞在某些实施方式中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

上述T细胞在某些实施方式中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA的序列如SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示。

本申请还提供了一种经过基因修饰的T细胞的制备方法，其包括如下步骤：将基因编辑工具引入T细胞，其中所述基因编辑工具能够使T细胞的染色体14上Trac以及染色体16上Socs1两种靶基因不能正常表达。

上述制备方法在某些实施方式中，T细胞来源于同种异体T淋巴细胞。

上述制备方法在某些实施方式中，T细胞来源于健康供者。

上述制备方法在某些实施方式中，基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种。

上述制备方法在某些实施方式中，基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统。

上述制备方法在某些实施方式中，基因编辑工具通过对T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个进行基因编辑使Trac基因不能正常表达。

上述制备方法在某些实施方式中，基因编辑工具通过对T细胞的染色体16上Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个进行基因编辑使Socs1基因不能正常表达。

上述制备方法在某些实施方式中，基因编辑工具通过对T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子以及染色体16上Socs1基因的第1外显子进行基因编辑，使Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

上述制备方法在某些实施方式中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示。

上述制备方法在某些实施方式中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA的序列如SEQ ID NO:26所示。

上述制备方法在某些实施方式中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

上述制备方法在某些实施方式中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA的序列如SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示。

本申请还提供了一种经过基因修饰的T细胞，所述T细胞通过上述制备方法获得。

本申请还提供了一种上述经过基因修饰的T细胞在制备过继性免疫治疗用细胞中的应用，其中所述过继性免疫治疗用细胞为通用型嵌合抗原受体-T细胞(即CAR-T细胞)或通用型T细胞受体-T细胞(即TCR-T细胞)。

本申请还提供了一种通用型嵌合抗原受体-T细胞，所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因，从而使得嵌合抗原受体-T细胞的Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于同种异体T淋巴细胞。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于健康供者。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，嵌合抗原受体-T细胞的染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA的序列如SEQ ID NO:26所示。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA的序列如SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述胞外抗原识别结构域靶向CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述胞外抗原识别结构域靶向BCMA，抗BCMA胞外抗原识别结构域包括BCMA VH和BCMA VL，其中BCMA VH互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，BCMA VL互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述VH序列包括如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列，所述VL序列包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述胞外抗原识别结构域包括抗BCMA的scFv抗体。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述scFv抗体为人源化抗体。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述scFv抗体的序列如SEQID NO:9所示。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；可选地，所述铰链区来源于CD8α。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；可选地，所述跨膜区来源于CD8α。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，其中所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；可选地，还包括共刺激信号传导区。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，其中所述胞内信号传导区来源于CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CCD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种；可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3δ。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，其中所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上；可选地，所述共刺激信号传导区来源于4-1BB或CD28。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，还包含位于所述嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；可选地，其中所述引导肽来源于CD8α。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，BCMA CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，编码BCMA CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

本申请还提供了一种通用型嵌合抗原受体-T细胞的制备方法，其包括选自以下方法的一种：

1、制备嵌合抗原受体-T细胞后，将基因编辑工具引入嵌合抗原受体-T细胞，其中所述基因编辑工具能够使嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上Trac以及染色体16上Socs1两种靶基因不能正常表达；

2、将基因编辑工具引入T细胞，其中所述基因编辑工具能够使T细胞的染色体14上Trac以及染色体16上Socs1两种靶基因不能正常表达；以该经过基因修饰的T细胞制备嵌合抗原受体-T细胞。

上述制备方法在某些实施方式中，T细胞或嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于同种异体T淋巴细胞。

上述T细胞在某些实施方式中，T细胞或嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于健康供者。

上述制备方法在某些实施方式中，基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个进行基因编辑使Trac基因不能正常表达。

上述制备方法在某些实施方式中，基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体16上Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个进行基因编辑使Socs1基因不能正常表达。

上述制备方法在某些实施方式中，基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子以及染色体16上Socs1基因的第1外显子进行基因编辑，使Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

本申请还提供了一种通用型嵌合抗原受体-T细胞，所述通用型嵌合抗原受体-T细胞通过上述制备方法获得。

本申请还提供上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在制备药物中的应用。

上述应用在某些实施方式中，所述药物用于治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症。

上述应用在某些实施方式中，所述药物用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、多发性骨髓瘤(MM)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、骨肉瘤。

上述应用在某些实施方式中，所述药物为静脉注射剂。

本申请还提供了一种治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的上述通用型嵌合抗原受体-T细胞施用于具有治疗与上述抗原中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。

上述方法在某些实施方式中，与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、LewisY、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症包括：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、多发性骨髓瘤(MM)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、骨肉瘤。

上述方法在某些实施方式中，所述施用的方式为静脉注射。

上述方法在某些实施方式中，所述施用的方式为将有效量的通用型嵌合抗原受体-T细胞以单次注射或多次注射的方式施用于受试者。

上述方法在某些实施方式中，有效量的通用型嵌合抗原受体-T细胞为1×10⁵至1×10⁷个细胞/kg的计量。

本申请还提供了上述通用型嵌合抗原受体-T细胞，用于治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症包括：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、多发性骨髓瘤(MM)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、骨肉瘤。

本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述通用型嵌合抗原受体-T细胞和药学上可接受的辅料。

上述药物组合物在某些实施方式中，用于治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症。

上述药物组合物在某些实施方式中，用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、多发性骨髓瘤(MM)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、骨肉瘤。

上述药物组合物在某些实施方式中，药学上可接受的辅料包括保护剂。

上述药物组合物在某些实施方式中，药学上可接受的辅料包括细胞冻存液。

上述药物组合物在某些实施方式中，所述药物组合物为静脉注射剂。

本申请还提供上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

上述应用在某些实施方式中，与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症；可选地，所述癌症是多发性骨髓瘤；进一步可选地，所述癌症是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。

上述应用在某些实施方式中，所述药物为静脉注射剂。

本申请还提供了一种治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的上述通用型嵌合抗原受体-T细胞施用于具有治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。

上述方法在某些实施方式中，与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症；可选地，所述癌症是多发性骨髓瘤；进一步可选地，所述癌症是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。

上述方法在某些实施方式中，所述施用的方式为静脉注射。

本申请还提供了上述通用型嵌合抗原受体-T细胞，用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在某些实施方式中，与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症；可选地，所述癌症是多发性骨髓瘤；进一步可选地，所述癌症是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。

附图说明

图1表示了实施例1中的BCMA CAR-T细胞中的CAR构建结构；

图2表示了实施例2中各组细胞在完成敲除后的增殖情况；

图3表示了实施例2中各组细胞在完成敲除后12天细胞表面的CD3表达情况；

图4A表示了实施例2中各组细胞在完成敲除后12天细胞表面的CD45RA、CCR7的表达情况、图4B表示了实施例2中各组细胞在完成敲除后12天细胞表面的CD45RA、CD62L的表达情况；

图5表示了实施例3中各组BCMA UCART CAR⁺细胞在6轮抗原刺激后细胞增殖数量情况；

图6表示了实施例4中各组BCMA UCART细胞的细胞凋亡水平；

图7表示了实施例4中各组BCMA UCART细胞的PD-1表达情况；

图8表示了实施例5中各组BCMA UCART CAR⁺细胞在6轮抗原刺激后的体外杀伤情况。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本申请中，术语“基因编辑”、“基因编辑技术”具有本领域通常的含义，是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在该位点上剪断靶标DNA片段、敲入或敲除靶标基因片段。基因编辑技术作为一种分子生物学技术，能够实现对染色体的精确修改，从而改变细胞的已有功能。与基础研究常常使用的细胞系相比，T细胞作为一种原代细胞，除了无法长期增殖外，并不具有特殊性，同样可以应用基因编辑技术进行编辑。目前主要有3种基因编辑技术，分别为锌指核酸酶(zinc fingernuclease,ZFN)技术、转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease,TALEN)技术和RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶技术。与传统的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用到更多的物种和细胞上，效率更高，构建时间更短，成本更低。

在本申请中，术语“CRISPR/Cas技术”、“CRISPR/Cas系统”具有本领域通常的含义，其全名为常间回文重复序列丛集及其关联蛋白(clusterd regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR-associated proteins)，是目前发现的存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种后天免疫系统，可以定向切割外来的基因片段。目前已发现不同类型的CRISPR/Cas系统，其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(guide RNA,gRNA)为核心组成。与较早的ZFN技术和TALEN技术相比，CRISPR/Cas具有以下优点：低脱靶率、高效、经济实惠、应用范围广。另外，也有文献报道CRISPR杂合RNA-DNA(chRDNA)引导技术与全RNA引导技术相比，可显著提高Cas9蛋白的特异性，从而在细胞中实现高水平的预期基因组编辑，最大限度的减少脱靶时间。

在本申请中，术语“锌指核酸酶技术”、“锌指核酸酶系统”具有本领域通常的含义，锌指核酸酶技术的核心设计思想是把两个有特定功能的结构域-即一个特异性识别模块和一个功能模块，进行了巧妙的嵌合。最经典的锌指核酸酶是将一个非特异性的核酸内切酶Fok I与含有锌指的结构域进行融合，含有锌指的结构域可以识别特定的DNA序列。

在本申请中，术语“转录激活因子样效应核酸酶技术”、“转录激活因子样效应核酸酶系统”具有本领域通常的含义，TALE效应因子最初是作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的。研究者通过将Fok I核酸酶与一段人造具有序列特异性结合能力的TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因编辑功能的强大工具，即TALEN蛋白。典型的TALEN蛋白由一个包含核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的N端结构域，一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有Fok I核酸内切酶功能的C端结构域组成。TALEN技术的核心原理就是在同一个TALEN蛋白上有序地实现引导进入细胞核、靶位点DNA的特异性识别和靶位点DNA的切割这三个不同的功能。

在本申请中，术语“基因不能正常表达”具有本领域通常的含义，基因表达是指将来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程，基因表达产物通常是指蛋白质。

在本申请中，术语“GVHD(graft-versus-host disease)”具有本领域通常的含义，一般是指移植物抗宿主病，是由于在移植后，异体供者移植物中的T淋巴细胞经受者发动的一系列“细胞因子风暴”刺激，大大增强了其对受者抗原的免疫反应和以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标。

在本申请中，术语“Trac基因”具有本领域通常的含义，是指T细胞受体α链恒定区。T细胞受体(TCR)识别抗原的信号主要通过TCR-CD3复合体(包括TCR的α链、β链、CD3γ、CD3δ等)，TCR由α链和β链组成，翻译的α链和β链组装成异二聚体后，与多个CD3亚型分子结合；在细胞中，如果不能与CD3分子形成完整的复合物，则多余TCR会被降解。将Trac基因敲除后，将影响TCR-CD3复合体的形成，意味着T细胞表面的T细胞受体会被清除，避免了移植物抗宿主反应(GVHD)的发生。

细胞因子信号传导抑制因子1(Suppressor of Cytokine Signaling 1，SOCS1)是SOCS家族的细胞因子信号通路负调控因子之一，在细胞因子信号转到通路调节适应症和先天免疫中具有重要作用。最近，Aurelien等人在Science immunology刊物中报道，SOCS1是CD4 T细胞在肿瘤抗原反复刺激下增殖的负调控因子。敲除SOCS1后，在体外体内能显著增加CD4⁺T细胞的增殖能力。

ID3基因编码的蛋白质是一个螺旋环螺旋(hlh)蛋白，可以与其他hlh蛋白形成异二聚体。2021年底，Charly R.Good等人在Cell刊物上发表文章认为ID3是CAR-T细胞耗竭的正调控因子，敲除ID3能显著增加CAR-T细胞的持续性。

DNMT3A是一个DNA甲基化转移酶。DNA甲基化作为一种重要的表观修饰，参与多种生物学过程，如异染色质形成、基因印记、X染色体失活、转座原件沉默等，近年来的研究也表明DNA甲基化异常与癌症发生密切相关，DNA甲基化紊乱成为癌症的一个新特征。BrookePrinzing等人最近在Cancer杂志上报道，敲除DNMT3A的表达能提供CART细胞的持续性。

在本申请中，术语“嵌合抗原受体”(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括胞外抗原识别结构域(例如，结合肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。CAR-T(ChimericAntigen Receptor T)细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。

在本申请中，术语“胞外抗原识别结构域”是指抗原识别结构域(AntigenRecognition Domain，ARD)。CAR细胞治疗产品(如CAR-T细胞)之所以能特异性识别和/或结合到肿瘤细胞表达的靶抗原，依赖于胞外抗原识别结构域，到目前为止，抗原识别结构域从抗体的单链可变区(Single Chain Variable Fragment，缩写为scFv)、或者从受体配体相互作用、TCR模拟物、可变的淋巴细胞受体(Variable Lymphocyte Receptors，VLR)衍生而来。到目前为止，最为常见的来源就是抗体的scFv段，scFv包括抗体重链可变区和轻链可变区，二者之间由一段肽链连接，如：由18个氨基酸组成的连接序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG。抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。

本申请中，术语“特异性识别和/或结合”是指CAR和特异性靶标之间的识别和/或结合，是以比CAR结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标。

在本申请中，术语“铰链区”是指作用于胞外抗原识别结构域与跨膜结构域之间的连接段，这个区域通过给予抗原识别结构域一定的活动范围，允许CAR识别抗原。目前使用的铰链区主要来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种。此外，典型的铰链区还包含一些残基，这些残基参与CAR二聚化，有助于增强抗原的敏感性。

在本申请中，“跨膜区”是指连接着CAR结构的细胞内和细胞外成分的跨膜结构域。不同的跨膜结构域可以一定程度上影响CAR的表达和稳定性，但是并不直接参与信号传递，通过相互作用可以提高下游信号传递。所述跨膜区可以来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种。

在本申请内，术语“细胞内结构域”包括胞内信号传导区，还可以包括共刺激信号传导区。

在本申请中，术语“胞内信号传导区”是指负责表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。所述胞内信号传导区可以来源于CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CCD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种。

在本申请中，术语“共刺激信号传导区”之所以存在，是因为除了抗原特异性信号的刺激之外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。在一些实施例中，CAR还可以包括一个或多个共刺激信号传导区，其中，共刺激信号传导区可以来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上。

在本申请中，术语“引导肽”，是指胞外抗原识别结构域(如scFv序列)前的短肽，其作用是引导细胞内合成的重组蛋白质输出到细胞外。常用的引导肽有人CD8α信号肽，或者人GM-CSF受体α信号肽。

在本申请中，术语“scFv”是指这样的抗体片段——其是包含通过接头(linker)连接的重链可变区(variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(variableregionof light chain，VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。scFv优选是由一条核苷酸链编码的氨基酸序列。本发明使用的scFv可通过单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是公知的(参见例如，Sambrook分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)。所述修饰优选在核酸水平上进行。上述scFv还可以包括其衍生物。scFv能够表达为单链多肽。scFv保留了其所源自的完整抗体的特异性。轻链和重链可以为任何顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保留scFv对靶抗原的特异性即可。

在本申请中，术语“嵌合抗原受体-T细胞”通常是指将嵌合抗原受体(chimericantigen receptor,CAR)转入T细胞后所形成的CAR-T细胞，该细胞利用抗原抗体结合机制与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而激活T细胞，特异性识别并杀伤肿瘤(Jackson H Jet al.,Nature reviews Clinical oncology,2016,13(6):370-383)。CAR-T细胞识别肿瘤抗原不受人白细胞抗原(HLA)限制，能有效避免肿瘤细胞通过下调主要组织相容性复合体(MHC)分子表达而产生的免疫逃逸(Fesnak A D et al.,Nature Reviews Cancer,2016,16(9):566-581)。

在本申请中，术语“T细胞受体-T细胞”通常是指通过T细胞受体(T cellreceptor,TCR)转入T细胞后所形成的TCR-T细胞，该TCR-T细胞加强了T细胞针对肿瘤细胞的特异性识别过程，而且提高了T淋巴细胞对于肿瘤细胞的亲和力，使得原来无肿瘤识别能力的T细胞能够有效地识别并杀伤肿瘤细胞。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指适合施用于患者的药物组合物，其可以包含本申请所述的免疫效应细胞，还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料，如：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括保护剂，如：细胞冻存液。在一些实施例中，本申请的药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞。

在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、马、猪、牛、羊或猴。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下本领域技术人员可接受的波动范围，如：在±0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％的范围内变动。

经过基因修饰的T细胞及其制备方法和应用

一方面，本申请提供一种经过基因修饰的T细胞，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因，从而使得T细胞的Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

在一些实施例中，T细胞来源于同种异体T淋巴细胞。

在一些实施例中，T细胞来源于健康供者。

在一些实施例中，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个。

在一些实施例中，所述T细胞的染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个。

在一些实施例中，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子。

在一些实施例中，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种。

在一些实施例中，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统。

在一些实施例中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示。

在一些实施例中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA的序列如SEQ ID NO:26所示。

在一些实施例中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

在一些实施例中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA的序列如SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示。

另一方面，本申请还提供了一种经过基因修饰的T细胞的制备方法，其包括如下步骤：将基因编辑工具引入T细胞，其中所述基因编辑工具能够使T细胞的染色体14上Trac以及染色体16上Socs1两种靶基因不能正常表达。

在一些实施例中，T细胞来源于同种异体T淋巴细胞。

在一些实施例中，T细胞来源于健康供者。

在一些实施例中，基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种。

在一些实施例中，基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统。

在一些实施例中，基因编辑工具通过对T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个进行基因编辑使Trac基因不能正常表达。

在一些实施例中，基因编辑工具通过对T细胞的染色体16上Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个进行基因编辑使Socs1基因不能正常表达。

在一些实施例中，基因编辑工具通过对T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子以及染色体16上Socs1基因的第1外显子进行基因编辑，使Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

CRISPR/Cas系统主要包括两个元件：Cas9核酸内切酶和向导RNA(sgRNA)。sgRNA能够识别靶DNA序列中保守的前间区序列邻近基序(PAM)，sgRNA通过与Cas9蛋白结合，引导Cas9核酸内切酶定点切割靶向DNA。如果sgRNA与基因组上其它位置(非靶序列)结合，便会引起脱靶效应，sgRNA的设计与选择是CRISPR-Cas9技术的精髓，也是实验是否成功的关键一步，它决定了Cas9的靶向性和特异性。

本发明参照sgRNA的设计原则，并根据具体的试验结果获得了：针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示；针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA靶向序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID:14所示。如下面的实施例所验证的，采用上述sgRNA，Trac基因的敲除效率高达95.2％，Socs1基因的敲除效率可以达到80％左右。这说明，本发明针对Trac基因的第1外显子和针对Socs1基因的第1外显子所设计的sgRNA具有较好的靶向性和特异性。

再一方面，本申请还提供了一种经过基因修饰的T细胞，所述T细胞通过上述制备方法获得。

再一方面，本申请还提供了一种上述经过基因修饰的T细胞在制备过继性免疫治疗用细胞中的应用，其中所述过继性免疫治疗用细胞为通用型嵌合抗原受体-T细胞(即CAR-T细胞)或通用型T细胞受体-T细胞(即TCR-T细胞)。

通用型嵌合抗原受体-T细胞及其制备方法

一方面，本申请提供了一种通用型嵌合抗原受体-T细胞，所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因，从而使得嵌合抗原受体-T细胞的Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

在一些实施例中，嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于同种异体T淋巴细胞。

在一些实施例中，嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于健康供者。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子。

在一些实施例中，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统。

在一些实施例中，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示。

在一些实施例中，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA靶向序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体包含胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。

在一些实施例中，所述胞外抗原识别结构域靶向CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上。

在一些实施例中，所述胞外抗原识别结构域靶向BCMA，抗BCMA胞外抗原识别结构域包括BCMA VH和BCMA VL，其中BCMA VH互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，BCMA VL互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述VH序列包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述VL序列包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述胞外抗原识别结构域包括抗BCMA的scFv抗体。

在一些实施例中，所述scFv抗体为人源化抗体。

在一些实施例中，所述scFv抗体的序列如SEQ ID NO:9所示。

在一些实施例中，所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；可选地，所述铰链区来源于CD8α。

在一些实施例中，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；可选地，所述跨膜区来源于CD8α。

在一些实施例中，其中所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；可选地，还包括共刺激信号传导区。

在一些实施例中，其中所述胞内信号传导区来源于CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CCD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种；可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3δ。

在一些实施例中，其中所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上；可选地，所述共刺激信号传导区来源于4-1BB或CD28。

在一些实施例中，还包含位于所述嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；可选地，其中所述引导肽来源于CD8α。

在一些实施例中，BCMA CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

在一些实施例中，编码BCMA CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

另一方面，本申请还提供了一种通用型嵌合抗原受体-T细胞的制备方法，其包括选自以下方法的一种：

在一些实施例中，T细胞或嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于同种异体T淋巴细胞。

在一些实施例中，T细胞或嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于健康供者。

在一些实施例中，基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统。

在一些实施例中，基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个进行基因编辑使Trac基因不能正常表达。

在一些实施例中，基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体16上Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个进行基因编辑使Socs1基因不能正常表达。

在一些实施例中，基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子以及染色体16上Socs1基因的第1外显子进行基因编辑，使Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

再一方面，本申请还提供了一种通用型嵌合抗原受体-T细胞，所述通用型嵌合抗原受体-T细胞通过上述制备方法获得。

通用型嵌合抗原受体-T细胞的应用

一方面，本申请提供上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在制备药物中的应用。

在一些实施例中，所述药物用于治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、LewisY、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症。

在一些实施例中，所述药物用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、多发性骨髓瘤(MM)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、骨肉瘤。

在一些实施例中，所述药物为静脉注射剂。

再一方面，本申请还提供了一种治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、LewisY、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的上述通用型嵌合抗原受体-T细胞施用于具有治疗与上述抗原中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。

在一些实施例中，与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症包括：急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、多发性骨髓瘤(MM)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、骨肉瘤。

在一些实施例中，所述施用的方式为静脉注射。

在一些实施例中，所述施用的方式为将有效量的通用型嵌合抗原受体-T细胞以单次注射或多次注射的方式施用于受试者。

在一些实施例中，有效量的通用型嵌合抗原受体-T细胞为1×10⁵至1×10⁷个细胞/kg的计量。

再一方面，本申请还提供了上述通用型嵌合抗原受体-T细胞，用于治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症。

另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包括上述通用型嵌合抗原受体-T细胞和药学上可接受的辅料。

在一些实施例中，所述药物组合物用于治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症。

在一些实施例中，所述药物组合物用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、多发性骨髓瘤(MM)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、骨肉瘤。

在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括保护剂。

在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括细胞冻存液。

在一些实施例中，药物组合物为静脉注射剂。

在另一方面，本申请还提供上述通用型嵌合抗原受体-T细胞在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

在一些实施例中，与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症；可选地，所述癌症是多发性骨髓瘤；进一步可选地，所述癌症是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。

在一些实施例中，所述药物为静脉注射剂。

在另一方面，本申请还提供了一种治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的上述通用型嵌合抗原受体-T细胞施用于具有治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。

在一些实施例中，所述施用的方式为静脉注射。

在一些实施例中，针对不同的适应症，给药剂量可以不同；针对病情严重程度不同的患者，给药剂量也可以不同。施用剂量范围可以是1×10⁵个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg至1×10⁷个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg，例如，1×10⁵个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg至1×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg至1×10⁷个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、0.5×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、0.6×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、0.7×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、0.8×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、0.9×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.0×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.1×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.2×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.3×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.4×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.5×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.6×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.7×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.8×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、1.9×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg、2.0×10⁶个通用型嵌合抗原受体-T细胞/kg。

在另一方面，本申请还提供了上述通用型嵌合抗原受体-T细胞，用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的经过基因修饰的T细胞、制备方法和应用等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press。

实施例1、BCMA CAR-T细胞的制备

我们已有1条BCMA特异性的scFv序列(其VH CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示，其VL CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示，其VH氨基酸序列如SEQ ID:7所示，其VL氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)。在构建CAR结构时，我们采用CD8α引导链为信号肽，以BCMA scFv为胞外肿瘤抗原识别区域，铰链区和跨膜区采用CD8α的结构，以4-1BB为胞内共刺激信号，CD3δ为T细胞激活信号，CAR结构示意图如图1所示，BCMA CAR-T细胞的制备方法如下：

1、慢病毒载体的构建

人工合成编码如上述SEQ ID NO:10 CAR结构片段的核苷酸序列(如SEQ ID NO:11所示)，并将其构建到经过改造的空慢病毒载体(厂家：SBI公司，货号：CD500-CD800，如WO2021/121227中实施例1记载的进行改造)中获得CAR表达载体，随后将CAR表达载体和三种包装质粒一起转染293T细胞，经过收集纯化之后得到有功能性的慢病毒载体。三种包装质粒分别是pMD2.0G(购自Biovector公司，产品号Biovector012259)，pMDLg-pRRE(购自Biovector公司，产品号Biovector012251)，pRSV-Rev(购自Biovector公司，产品号Biovector012253)。

2、通过慢病毒转导的方式制备BCMA CAR-T细胞

转导实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行，简述转导步骤如下：

1)分选T细胞

从人单采血细胞中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)，然后用EasySep Human Tcell Isolation Kit试剂盒(Stem cell)从PBMC细胞中分选获得T细胞。

2)对T细胞进行激活处理

将分离的T细胞用完全淋巴细胞培养液(X-VIVO15培养基+终浓度5ng/ml IL-15+终浓度10ng/ml IL-7)进行重悬，使终浓度为(1～2)×10⁶个细胞/ml，并加入1～2μl的CD3/CD28磁珠(Cytocares)刺激，混匀后置于培养箱培养，培养条件为37℃+5％CO₂，培养时间至少24小时。

3)慢病毒转导T细胞

向激活培养的T细胞中按MOI＝3缓慢加入慢病毒载体，混匀后放入二氧化碳继续培养，培养条件为37℃+5％CO₂，培养时间2天后用于Universal CAR-T细胞(本申请中简称为UCAR-T)的制备。

实施例2、UCAR-T细胞的制备及增殖培养

为了防止发生GVHD，我们选择定向敲除TRAC基因以除掉细胞本身的T细胞受体，同时考虑到敲除TRAC基因后，CAR-T细胞的增殖能力可能大幅度下降，本申请希望考察在除了敲除Trac基因以外，还同时敲除选自衰老相关基因Socs1、Id3、Dnmt3a中的一个基因以后，UCAR-T细胞在增殖、表型、杀伤等各方面的变化，从而确定敲除不同基因对CAR-T细胞的影响。

1、转导T细胞2天后，进行目标基因敲除：

选择采用CRISPR-Cas系统对目标基因进行敲除，在本试验中针对Trac基因第1外显子上如SEQ ID NO:12所示的靶序列设计了与之反向互补的sgRNA；针对Socs1基因第1外显子上如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的2条靶序列分别设计了与之反向互补的sgRNA；针对Id3基因第1外显子上如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的2条靶序列分别设计了与之反向互补的sgRNA；针对Dnmt3a基因第19外显子上如SEQ ID NO:17所示的1条靶序列设计了与之反向互补的sgRNA；sgRNA和Cas9蛋白的摩尔比为2.5:1(Cas9蛋白的用量为3ug)，进行电击基因敲除以获得UCAR-T细胞。基因敲除试验分为以下7组，分别为：

1、仅敲除Trac基因组(本申请中称为TRAC ko组)；

2、敲除Trac基因和Socs1基因的第一组(本申请中称为TRAC/SOCS1-1 ko组)；

3、敲除Trac基因和Socs1基因的第二组(本申请中称为TRAC/SOCS1-2 ko组)；

4、敲除Trac基因和Id3基因的第一组(本申请中称为TRAC/ID3-1 ko组)；

5、敲除Trac基因和Id3基因的第二组(本申请中称为TRAC/ID3-2 ko组)；

6、敲除Trac基因和Dnmt3a基因组(本申请中称为TRAC/DNMT3A ko组)；

7、未进行任何敲除组(NoEP组)。

除NoEP组外，各组靶基因和靶序列的情况如表1所示：

表1、各组靶基因及靶序列

2、Trac/Socs1双敲除细胞在所有UCAR-T组中具有最好的增殖能力

在完成电击敲除后，分别将各组细胞加入含有终浓度10ng/ml IL7和终浓度5ng/ml IL15的X-VIVO培养基中，在二氧化碳培养箱中进行培养，并分别在敲除后第5天、第7天、第10天、第12天检测敲除后细胞数量和活率，具体结果如表2和图2所示：相较于TRAC ko组，TRAC/SOCS1-1 ko组、TRAC/SOCS1-2 ko组、TRAC/ID3-1 ko组、TRAC/ID3-2 ko组、TRAC/DNMT3A ko组这5个进行了基因双敲除的组的细胞密度和细胞活率都获得了不同程度的提高，尤其是在电击第12天后，双敲除各组的细胞密度和细胞活率都显著高于TRAC ko组。尤其是，TRAC/SOCS1-1 ko组、TRAC/SOCS1-2 ko组在电击后第12天的细胞数量可以达到110million/ml以上，不仅显著高于TRAC ko组在电击后第12天的细胞数量(46.20million/ml)，也显著高于TRAC/ID3-1 ko组(57.92million/ml)、TRAC/ID3-2 ko组(64.32million/ml)、TRAC/DNMT3A ko组(70.08million/ml)，电击12天后TRAC/SOCS1-1 ko组、TRAC/SOCS1-2 ko组的细胞活率也略高于TRAC ko组，细胞活率可以达到96％以上。

表2、敲除后检测细胞数量和活率

3、Trac/Socs1双敲除细胞的敲除效率高

1)选择APC荧光标记的CD3抗原(购自Biolegend)对电击后12天的细胞进行染色，通过流式细胞术检测各组细胞表面CD3的表达情况以确定各组对Trac基因的敲除情况(因为如果没有敲除Trac基因会形成TCR-CD3复合体)，各组细胞中CD3的表达情况如图3所示：从图3中可以看出，各敲除组Trac基因的敲除效果都较好，TRAC ko组、TRAC/SOCS1-1 ko组、TRAC/SOCS1-2 ko组、TRAC/ID3-1 ko组、TRAC/ID3-2 ko组的CD3+细胞比例都小于10％，TRAC/DNMT3A ko组的CD3+细胞比例为12.23％，尤其是TRAC/SOCS1-1 ko组、TRAC/SOCS1-2ko组的CD3+细胞比例都小于2％，从蛋白水平说明Trac基因的敲除效果好。

2)通过基因水平检测各组细胞目标基因的敲除情况

由于SOCS1、ID3、DNMT3A均为胞质内表达的蛋白，而不是细胞表面表达的蛋白，从而无法使用流式细胞术进行分析，因此在基因水平检测Socs1基因、Id3基因、Dnmt3a基因的敲除情况。基因编辑后第7天，利用人基因组提取试剂盒提取以上7个组的基因组DNA，Nanodrop定量都在90ng/ul以上；另外，我们在sgRNA序列的上下游设计引物，按照如表3所示的PCR扩增体系、表4所示的PCR扩增上下游引物对基因组DNA进行扩增，从而将发生indel的基因扩增出来，然后进行一代测序并通过TIDE软件分析敲除效率，结果如表5所示。

表3、PCR扩增体系

表4、PCR扩增引物序列

表5、基因编辑后第7天对基因敲除效率TIDE分析结果

由于各个双敲除组中Trac基因的敲除情况已经通过如图3所示流式细胞术进行了检测，因此未采用TIDE分析软件检测各双敲组中Trac基因的敲除情况，但对TRAC ko组中Trac基因的敲除除了使用流式细胞术以外，也使用了TIDE分析软件进行了验证。如表5所示，TRAC ko组中Trac基因的敲除效率为95.2％，也与采用流式细胞术检测的CD3^-细胞比例96.46％相互印证。另外，从表5中可以看出：TRAC/SOCS1-1ko组、TRAC/SOCS1-2 ko组、TRAC/ID3-1 ko组中除了Trac基因以外的Socs1基因、Id3基因的敲除效率也较高，可以达到80％左右。

4、Trac/Socs1双敲除细胞更年轻

选择PerCP荧光标记的CD45RA抗体(购自Biolegend)、PE标记的CCR7抗体(购自Biolegend)、FITC荧光标记的CD62L抗体(购自Biolegend)对电击敲除后12天的细胞进行染色，通过流式细胞术检测各组细胞表面CD45RA、CCR7、CD62L的表达情况以确定各组T细胞中心记忆细胞的情况，其中：CD45RA是T细胞的一个标志物，CCR7是一种趋化因子受体，通常用CD45RA^-CCR7⁺表示中心记忆T细胞；CD62L是一种淋巴结归巢受体，其参与初始T细胞的再循环。各组细胞中CD45RA、CCR7的表达情况如图4A所示，CD45RA、CD62L的表达情况如图4B所示：TRAC/SOCS1-1 ko组、TRAC/SOCS1-2 ko组中的CD45RA^-CCR7⁺细胞和CD45RA^-CD62L⁺细胞比例最多，说明Trac/Socs1双敲除细胞更年轻。

5、以APC荧光标记的CD3抗体(购自Biolegend)和FITC荧光标记的BCMA抗体(购自Biolegend)对电击后12天的TRAC/SOCS1-1 ko组、TRAC/SOCS1-2 ko组中细胞进行染色，通过流式细胞术检测各组细胞表面的CD3和BCMA CAR表达情况，其中：TRAC/SOCS1-1 ko组中的CD3+细胞为1.03％、BCMA CAR+表达率高达95.93％；TRAC/SOCS1-2 ko组也有相似结论，说明进行TRAC/SOCS1双敲除细胞的CAR+表达率也很高。

实施例3、BCMA UCAR-T细胞的持续增殖性

抗原刺激可以激活CAR-T细胞使CAR-T细胞增殖，而T细胞的持续激活会导致细胞耗竭，耗竭的T细胞的增殖能力和效应功能都会有所下降，我们通过检测UCAR-T细胞在多轮抗原(使用MM.1S肿瘤细胞作为抗原)刺激实验后UCAR-T细胞中CAR⁺细胞的增殖情况以验证其持续增殖性。

选择实施例2中获得的TRAC ko组、TRAC/SOCS1-2 ko组、TRAC/ID3-2 ko组、TRAC/DNMT3A ko组这四组细胞进行多轮刺激，多轮刺激的试验步骤如下：每孔中UCART CAR⁺(使用FITC荧光标记的BCMA抗体对多轮刺激后获得的细胞进行染色，通过流式细胞术中BCMA抗体的染色情况区分各组细胞中CAR+细胞数量，并作为细胞计数的依据)细胞数量为0.15million，MM.1S的细胞为0.3million，即将各组CAR⁺细胞分别与阳性靶细胞按照效靶比1:2在24孔板中进行共培养，在24孔板中混匀，补充X-VIVO培养基到两毫升，每个样本重复三个孔，共培养72h后，采用固定体积流式细胞术检测各组细胞的CAR⁺细胞数量(试验方法：使用FITC荧光标记的BCMA抗体、APC荧光标记的CD45抗体对多轮刺激后获得的细胞进行染色，其中：MM.1S肿瘤细胞是CD45^-、T细胞是CD45⁺，因而我们可以通过流式细胞术中CD45抗体的染色情况区分MM.1S肿瘤细胞和T细胞，再通过BCMA抗体的染色情况获得CAR阳性细胞数量。)。

分别计算第2、4、6轮抗原刺激后，各组UCART细胞中CAR⁺细胞数量，其结果如图5所示：在第2轮刺激结束后，各组UCAR-T CAR⁺细胞数量相近，在第4轮刺激结束后，各组UCAR-TCAR⁺细胞数量均大大增加，在第6轮刺激后，TRAC/SOCS1-2 ko组的UCAR-T CAR⁺细胞数量显著多余其他3组。

实施例4、持续增殖后的UCAR-T细胞的凋亡水平和UCAR-T细胞表面免疫检查点蛋白的表达率

1)持续增殖后的UCAR-T细胞的凋亡水平

有研究表明，抗原刺激之后的CAR-T细胞增殖会受到细胞凋亡的影响。在结束实施例3中的多轮抗原刺激之后，我们也检测了各组UCART细胞的凋亡水平。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜磷脂双分子层的内侧，细胞发生凋亡早期，磷脂酰丝氨酸会由细胞膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲合力，被用于检测细胞凋亡。7-AAD染色液为Annexin V鉴定凋亡和坏死细胞辅助试剂，7-AAD可与双链DNA特异性结合，并产生强烈的荧光，正常情况下无法透过细胞膜；但由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，7-AAD可进入细胞内对DNA进行染色，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

在实施例3中6轮抗原刺激试验结束后2天，各组UCAR-T细胞样品进行染色：用荧光标记的Annexin V(BioLegend Cat.No.640920)、7-AAD染色液(购自Bilegend)和FITC标记的BCMA抗原(购自Biolegend)对细胞进行染色，通过流式细胞术进行检测分析。

检测结果如图6所示：各组中未被Annexin V和7-AAD任意一种染色的细胞比例分别为TRAC ko组26.06％，TRAC/SOCS1-2 ko组54.55％，TRAC/ID3-2 ko组25.62％，TRAC/DNMT3A ko组16.91％，即TRAC/SOCS1-2 ko组中未被Annexin V和7-AAD任意一种染色的比例显著高于其他组，是其他几组的2倍以上，体现了TRAC/SOCS1-2 ko组的UCAR-T细胞凋亡水平最低。

2)持续增殖后的UCAR-T细胞表面免疫检查点蛋白的表达率

在实施例3中6轮抗原刺激试验结束后，我们还检测了免疫检查点蛋白PD-1在各组UCAR-T细胞表面的表达情况，该蛋白也可以作为细胞耗竭的标记，耗竭的T细胞中这些免疫检查点基因的表达水平会上调。我们用荧光标记的PD1抗体(BioLegend Cat.No.329914)和BCMA抗原(同实施例2)对细胞进行染色，通过流式细胞术进行检测分析。

检测结果如图7所示：TRAC/SOCS1-2 ko组的PD1表达量显著低于其他组，也体现了TRAC/SOCS1-2 ko组的细胞耗竭水平最低。

综上，在6轮抗原刺激试验后，TRAC/SOCS1-2 ko组的UCAR-T状态也是最好，细胞凋亡水平最低、细胞耗竭水平最低。

实施例5、多轮刺激后BCMA UCAR-T细胞的杀伤试验

选择实施例3中经过6轮抗原刺激试验的各组UCAR-T细胞作为效应细胞，选择MM.1S、K562、K562-BCMA作为靶细胞，各个靶细胞都带有稳定表达的外源荧光素酶基因；其中：MM.1S为内源性表达BCMA的多发性骨髓瘤细胞、K562为阴性对照细胞、K562-BCMA为外源表达BCMA的阳性对照细胞，设置效靶比3:1。每种靶细胞用X-VIVO培养基重悬，调整靶细胞密度为0.2×10⁶/ml，50ul/检测孔；按照CAR⁺细胞计数加入相应的各组UCAR-T效应细胞，用X-VIVO培养基悬浮UCAR-T细胞，通过补足X-VIVO培养基，使所有检测孔的终体积为100ul。将96孔板置于培养箱中，孵育共培养5小时后，由于每种靶细胞都表达荧光素酶，其可以催化luciferin氧化oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。因此向每个检测孔中加入100ul Steady Glo原液，避光，摇床孵育15min后，用PerkinElmer luc检测仪，读取荧光释放值。检测结果如图8所示：在效靶比3：1时，各组细胞对MM.1S的体外杀伤效果相似，都具有较好的细胞杀伤能力；各组细胞对阴性对照细胞K562均没有明显体外杀伤效果，各组细胞对阳性对照细胞K562-BCMA的体外杀伤效果类似。

综上，在体外药效学检测中表明，相较于Trac基因和Id3基因双敲除UCAR-T细胞、Trac基因和Dnmt3a基因双敲除UCAR-T细胞以及Trac基因单敲除UCAR-T细胞，Trac基因和Socs1基因双敲除的UCAR-T细胞具有最好的增殖能力，经过相同时间的培养能获得更多数量的UCAR-T细胞；并且电击后12天，Trac基因和Socs1基因双敲除的UCAR-T细胞中CAR+细胞的比例高达95.93％。进一步地，经过多轮刺激后Trac基因和Socs1基因双敲除的UCAR-T细胞中CAR+细胞数量显著高于Trac基因和Id3基因双敲除UCAR-T细胞、Trac基因和Dnmt3a基因双敲除UCAR-T细胞以及Trac基因单敲除UCAR-T细胞；另外，经过多轮刺激后，Trac基因和Socs1基因双敲除的UCAR-T细胞的状态也是最好的，细胞凋亡水平低、细胞耗竭水平最低，Trac基因和Socs1基因双敲除的UCAR-T CAR+细胞具有不逊色的细胞杀伤能力。

序列描述

SEQ ID NO:1---BCMA scFv VH CDR1；

SEQ ID NO:2---BCMA scFv VH CDR2；

SEQ ID NO:3---BCMA scFv VH CDR3；

SEQ ID NO:4---BCMA scFv VL CDR1；

SEQ ID NO:5---BCMA scFv VL CDR2；

SEQ ID NO:6---BCMA scFv VL CDR3；

SEQ ID NO:7---BCMA scFv VH氨基酸序列；

SEQ ID NO:8---BCMA scFv VL氨基酸序列；

SEQ ID NO:9---BCMA scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO:10---BCMA CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO:11---编码BCMA CAR氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO:12---Trac基因的靶序列；

SEQ ID NO:13---Socs1基因的靶序列1；

SEQ ID NO:14---Socs1基因的靶序列2；

SEQ ID NO:15---Id3基因的靶序列1；

SEQ ID NO:16---Id3基因的靶序列2；

SEQ ID NO:17---Dnmt3a基因的靶序列；

SEQ ID NO:18---针对Trac基因敲除后设计的PCR上游引物；

SEQ ID NO:19---针对Trac基因敲除后设计的PCR下游引物；

SEQ ID NO:20---针对Sosc1基因敲除后设计的PCR上游引物；

SEQ ID NO:21---针对Sosc1基因敲除后设计的PCR下游引物；

SEQ ID NO:22---针对Id3基因敲除后设计的PCR上游引物；

SEQ ID NO:23---针对Id3基因敲除后设计的PCR下游引物；

SEQ ID NO:24---针对Dnmt-3a基因敲除后设计的PCR上游引物；

SEQ ID NO:25---针对Dnmt-3a基因敲除后设计的PCR下游引物；

SEQ ID NO:26---针对Trac基因的靶序列的sgRNA；

SEQ ID NO:27---针对Socs1基因的靶序列1的sgRNA；

SEQ ID NO:28---针对Socs1基因的靶序列2的sgRNA；

SEQ ID NO:29---针对Id3基因的靶序列1的sgRNA；

SEQ ID NO:30---针对Id3基因的靶序列2的sgRNA；

SEQ ID NO:31---针对Dnmt3a基因的靶序列的sgRNA。

序列表

<110> 合源康华医药科技（北京）有限公司

<120> 一种经过基因修饰的T细胞及其制备方法和应用

<130> CP1220527/CB

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv VH CDR1序列

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr His

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv VH CDR2序列

<400> 2

Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv VH CDR3序列

<400> 3

Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Val Ile Asp Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv VL CDR1序列

<400> 4

Pro Ser Val Tyr Asn Asn Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv VL CDR2序列

<400> 5

Glu Thr Ser

1

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv VL CDR3序列

<400> 6

Ala Gly Thr Tyr Val Ser Gly Asp Arg Arg Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv VH氨基酸序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

His Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Leu Asp Tyr Val Ile Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv VL氨基酸序列

<400> 8

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Thr Tyr Val Ser Gly

85 90 95

Asp Arg Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 9

<211> 241

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA scFv氨基酸序列

<400> 9

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Thr Tyr Val Ser Gly

85 90 95

Asp Arg Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr His Met Thr

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile

165 170 175

Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu

210 215 220

Asp Tyr Val Ile Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 10

<211> 485

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> BCMA CAR氨基酸序列

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly

100 105 110

Thr Tyr Val Ser Gly Asp Arg Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

145 150 155 160

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser

165 170 175

Thr Tyr His Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

180 185 190

Trp Ile Gly Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

195 200 205

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe

225 230 235 240

Cys Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Val Ile Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 11

<211> 1458

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 编码BCMA CAR氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 11

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggagatcg tgatgaccca gtccccaagt acactgagcg cctccgtggg cgaccgcgtg 120

atcataaact gtcaaagctc accctctgtt tacaacaatt acctgtcttg gtatcaacag 180

aagcccggta aggcccccaa actgctcatt tacgagacat ccaccctggc atccggggtg 240

ccaagccgct tctccgggag tgggtctggc gccgagttca ccctgaccat atcttccctg 300

cagcccgacg acttcgcaac gtactattgc gccggaacct atgtaagtgg ggatagacgc 360

gccttcgggc agggcacgaa gttgaccgtg ctgggcggag ggggctcagg aggtggcggt 420

agcggaggag gcggctcaga agtgcagctg gtggagtccg gcggtggact ggtgcaaccg 480

ggaggctcac tcagattgtc atgcaccgcc tctggcttta gtctctccac ctatcatatg 540

acttgggtga ggcaggcacc cggcaagggc ctggaatgga tcggcgtgat ctcttccagc 600

ggtagcacct attacgcctc ttgggcgaag ggcaggttta ccatcagccg cgacaacagc 660

aagaataccg tttacctgca gatgaatagc ctgagggccg aagacacggc ggtctatttc 720

tgtgcacggg accttgacta cgttattgac ctgtggggcc ctgggaccct cgtaactgtg 780

agcagcacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 840

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 900

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 960

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1020

atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1080

tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1140

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440

gccctgcccc ctcgctaa 1458

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> Trac基因的靶序列

<400> 12

tgtaccagct gagagactct 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> Socs1基因的靶序列1

<400> 13

acgagcatcc gcgtgcactt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> Socs1基因的靶序列2

<400> 14

ttagcgtgaa gatggcctcg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> Id3基因的靶序列1

<400> 15

agaggcactc agcttagcca 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> Id3基因的靶序列2

<400> 16

gtcggaacgc agtctggcca 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> Dnmt3a基因的靶序列

<400> 17

tgggccgcgc atcatgcagg 20

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Trac基因敲除后设计的PCR上游引物

<400> 18

tagtcccagt ccatcacgag 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Trac基因敲除后设计的PCR下游引物

<400> 19

tctcctgcca ccttctcttc 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Sosc1基因敲除后设计的PCR上游引物

<400> 20

acttggtgct ccgtgctc 18

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Sosc1基因敲除后设计的PCR下游引物

<400> 21

agcagctcga agaggcagt 19

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Id3基因敲除后设计的PCR上游引物

<400> 22

ctttctcttt ggggcacctc t 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Id3基因敲除后设计的PCR下游引物

<400> 23

actccaggac ttgccgttta 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Dnmt-3a基因敲除后设计的PCR上游引物

<400> 24

ccctgcaatg acctctccat 20

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Dnmt-3a基因敲除后设计的PCR下游引物

<400> 25

gacaggtcct tcaaccccg 19

<210> 26

<211> 20

<212> RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Trac基因的靶序列的sgRNA

<400> 26

agagucucuc agcugguaca 20

<210> 27

<211> 20

<212> RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Socs1基因的靶序列1的sgRNA

<400> 27

aagugcacgc ggaugcucgu 20

<210> 28

<211> 20

<212> RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Socs1基因的靶序列2的sgRNA

<400> 28

cgaggccauc uucacgcuaa 20

<210> 29

<211> 20

<212> RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对 Id3基因的靶序列1的sgRNA

<400> 29

uggcuaagcu gagugccucu 20

<210> 30

<211> 20

<212> RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对Id3基因的靶序列2的sgRNA

<400> 30

uggccagacu gcguuccgac 20

<210> 31

<211> 20

<212> RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<220>

<223> 针对 Dnmt3a基因的靶序列的sgRNA

<400> 31

ccugcaugau gcgcggccca 20

Claims

1.一种经过基因修饰的T细胞，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因，从而使得T细胞的Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

2.根据权利要求1所述的T细胞，其中所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个；和/或

其中所述T细胞的染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个；

可选地，所述T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子。

3.根据权利要求1或2所述的T细胞，其中T细胞来源于同种异体T淋巴细胞；

可选地，T细胞来源于健康供者。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的T细胞，其中基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种；

可选地，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统；

进一步可选地，针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示；和/或

进一步可选地，针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

5.一种经过基因修饰的T细胞的制备方法，其包括如下步骤：

将基因编辑工具引入T细胞，其中所述基因编辑工具能够使T细胞的染色体14上Trac以及染色体16上Socs1两种靶基因不能正常表达。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中T细胞来源于同种异体T淋巴细胞；

可选地，T细胞来源于健康供者。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其中基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种。

可选地，基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其中基因编辑工具通过对T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个进行基因编辑使Trac基因不能正常表达；和/或

其中基因编辑工具通过对T细胞的染色体16上Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个进行基因编辑使Socs1基因不能正常表达；

可选地，基因编辑工具通过对T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子以及染色体16上Socs1基因的第1外显子进行基因编辑，使Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法，其中针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示；和/或

其中针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQID NO:13或SEQ ID NO:14所示。

10.一种经过基因修改的T细胞，其通过权利要求5-9中任一项所述的制备方法获得。

11.权利要求1-4和10中任一项所述的经过基因修饰的T细胞在制备过继性免疫治疗用细胞中的应用，其中所述过继性免疫治疗用细胞为通用型嵌合抗原受体-T细胞(即CAR-T细胞)或通用型T细胞受体-T细胞(即TCR-T细胞)。

12.一种通用型嵌合抗原受体-T细胞，其中所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因，从而使得嵌合抗原受体-T细胞的Trac基因和Socs1基因不能正常表达；

可选地，所述嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于同种异体T淋巴细胞；

进一步可选地，所述嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于健康供者。

13.根据权利要求12所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞，其中所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个；和/或

其中所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个；

可选地，所述嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上具有经过基因编辑的Trac基因的第1外显子且染色体16上具有经过基因编辑的Socs1基因的第1外显子。

14.根据权利要求12或13所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞，其中基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种；

可选地，基因编辑所采用的工具选自CRISPR/Cas系统；

15.根据权利权利要求12-14中任一项所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞，其中嵌合抗原受体包含胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域；

可选地，所述胞外抗原识别结构域靶向CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRvIII、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、CD70、CD171、PSMA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2中的一种、两种或三种以上；

进一步可选地，所述胞外抗原识别结构域靶向BCMA，抗BCMA胞外抗原识别结构域包括BCMA VH和BCMA VL，其中BCMA VH互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括如SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，BCMA VL互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

更进一步可选地，所述BCMA VH序列包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述BCMAVL序列包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

16.根据权利要求15所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞，其中所述胞外抗原识别结构域包括抗BCMA的scFv抗体；

可选地，所述scFv抗体为人源化抗体；

进一步可选地，所述scFv抗体的序列如SEQ ID NO:9所示。

17.根据权利要求15所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞，其中所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；可选地，所述铰链区来源于CD8α；和/或

其中所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；可选地，所述跨膜区来源于CD8α。

18.根据权利要求15所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞，其中所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；可选地，还包括共刺激信号传导区；

进一步可选地，其中所述胞内信号传导区来源于CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CCD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种；可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3δ；和/或

进一步可选地，其中所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上；可选地，所述共刺激信号传导区来源于4-1BB或CD28。

19.根据权利要求15-18中任一项所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞，还包含位于嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；可选地，其中所述引导肽来源于CD8α。

20.一种通用型嵌合抗原受体-T细胞的制备方法，其包括选自以下方法的一种：

2、将基因编辑工具引入T细胞，其中所述基因编辑工具能够使T细胞的染色体14上Trac以及染色体16上Socs1两种靶基因不能正常表达；以经过基因修饰的T细胞制备嵌合抗原受体-T细胞。

21.根据权利要求20所述的制备方法，其中T细胞或嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于同种异体T淋巴细胞；

可选地，T细胞或嵌合抗原受体-T细胞中的T细胞来源于健康供者。

22.根据权利要求20或21所述的制备方法，其中基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶系统、转录激活因子样效应核酸酶系统中的一种；

可选地，基因编辑工具选自CRISPR/Cas系统。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的制备方法，其中基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子、第4外显子中的一个或多个进行基因编辑使Trac基因不能正常表达；和/或

基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体16上Socs1基因的第1外显子、第2外显子中的一个或多个进行基因编辑使Socs1基因不能正常表达；

可选地，基因编辑工具通过对T细胞或嵌合抗原受体-T细胞的染色体14上Trac基因的第1外显子以及染色体16上Socs1基因的第1外显子进行基因编辑，使Trac基因和Socs1基因不能正常表达。

24.根据权利要求20-23中任一项所述的制备方法，其中针对Trac基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ ID NO:12所示；和/或

针对Socs1基因的第1外显子的CRISPR/Cas系统中sgRNA或chRDNA靶向序列如SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14所示。

25.一种通用型嵌合抗原受体-T细胞，其通过权利要求20-24中任一项所述的制备方法获得。

26.权利要求12-19和25中任一项所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞在制备药物中的应用；

可选地，所述药物用于治疗与CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、SLAMF7、CD5、CD7、CLL1、EGFR、EGFRv III、CEA、MUC1、MUC16、EphA2、IL13Rα2、CD70、CD171、PSMA、PSCA、ROR1、VEGFR2、cMet、FAP、GPC3、Claudin18.2、CD138、NKG2D、CD38、CD44v6、Lewis Y、mesothelin、HER2、GD2、L1-CAM、FR、CAIX中的一种、两种或三种以上的表达相关的疾病或病症；

进一步可选地，所述药物用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓性白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、多发性骨髓瘤(MM)、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肝癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、骨肉瘤。

27.根据权利要求26所述的应用，其中所述药物为静脉注射剂。

28.一种药物组合物，其包括权利要求12-19和25中任一项所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞和药学上可接受的辅料；

可选地，药学上可接受的辅料包括保护剂；

进一步优选地，药学上可接受的辅料包括细胞冻存液；

更进一步优选地，所述药物组合物为静脉注射剂。

29.权利要求12-19和25中任一项所述的通用型嵌合抗原受体-T细胞在制备药物中的应用，可选地，所述药物用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

30.根据权利要求29所述的应用，其中与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症；可选地，所述癌症是多发性骨髓瘤；进一步可选地，所述癌症是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。

31.根据权利要求29或30所述的应用，其中所述药物为静脉注射剂。