CN111788301A - 靶向肿瘤细胞的经修饰的自然杀伤细胞和自然杀伤细胞系 - Google Patents

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Abstract

通过提供与肿瘤相关的MUC‑1抗原结合的能力，对NK细胞和NK细胞系进行修饰增加其对癌细胞的选择性。这种经修饰的NK细胞和NK细胞系的产生是通过基因修饰产生NK‑CAR，其可选地经进一步修饰增加对癌细胞的细胞毒性。

Description

靶向肿瘤细胞的经修饰的自然杀伤细胞和自然杀伤细胞系
技术领域
本发明涉及对自然杀伤(NK)细胞和NK细胞系进行修饰，以产生具有更多细胞毒性表型的衍生物。此外，本发明涉及产生经修饰的NK细胞和NK细胞系的方法，包含所述细胞和细胞系的组合物，以及所述细胞、细胞系和组合物在治疗癌症，特别是血癌中的用途。
背景技术
通常，免疫细胞需要靶细胞通过主要组织相容性复合物(MHC)呈递抗原，然后触发免疫响应，造成靶细胞死亡。这使未呈递MHC I类的癌细胞能够逃避大多数免疫响应。
然而，在不存在MHC I类表达的情况下，NK细胞能够识别癌细胞。因此，NK细胞在人体防御癌症中发挥着至关重要的作用。
另一方面，在某些情况下，通过表达与NK细胞膜上抑制受体结合的配体，癌细胞表现出抑制NK细胞的细胞毒活性的能力。抗癌性涉及这些因素与其他因素之间的平衡。
在这种情况下，细胞毒性是指免疫效应细胞，例如NK细胞，诱导癌细胞死亡的能力，例如，通过释放细胞溶解化合物或与癌细胞膜上的受体结合并诱导所述癌细胞凋亡。细胞毒性不仅受诱导细胞溶解化合物释放的信号的影响，而且还受抑制其释放的信号的影响。如上所述，细胞毒性的增加能更有效地杀伤癌细胞，随之癌细胞抑制NK的细胞毒性活性的机会也会更少。
急性髓性白血病(AML)是一种造血系统恶性肿瘤，涉及使骨髓发育的前体细胞，在90％成人和15-20％儿童的急性白血病中占据相当大的比重(Hurwitz,Mounce等，1995；Lowenberg,Downing等，1999)。尽管80％的患者通过标准化疗得到缓解(Hurwitz,Mounce等，1995；Ribeiro,Razzouk等，2005)，但是由于微小残留疾病变(MRD)的高复发率，存活率仍不能令人满意。五年存活率取决于年龄大小：儿童为60％(Rubnitz2012)，65岁以下的成年人为40％(Lowenberg,Downing等，1999)，65岁以上的成年人为10％(Ferrara和Schiffer2013)。如果患者有合适的造血细胞供体，这些结果可以得到改善，但许多人没有，这就突出了对替代治疗方法的需求。
NK细胞是细胞毒性淋巴细胞，具有不同于自然杀伤T(NK-T)细胞等的独特表型和效应子功能。例如，NK-T细胞同时表达CD3和T细胞抗原受体(TCR)，而NK细胞不表达。通常可发现，NK细胞表达标志物CD16和CD56，其中，CD16作为Fc受体并介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，这将在下文讨论。在这方面，KHYG-1(见下文)是一个明显的例外。
已建立了几种永久性NK细胞系，最值得注意的是NK-92，其源自表达典型NK细胞标志物(非霍奇金淋巴瘤患者，但CD16(Fcγ受体III)除外。NK-92已经进行了大量临床前试验，与激活的NK细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞相比，对多种肿瘤均表现出优异的裂解作用(Gong,Maki等，1994)。已经确定NK-92细胞对原发性AML的细胞毒性(Yan,Steinherz等，1998)。另一种NK细胞系KHYG-1已被确定为临床应用的潜在竞争者(Suck等，2005)，但据报道某些细胞毒性降低，因此不如NK-92受关注。
特异性癌症标志物的识别必将有助于对抗癌症。许多已知的癌症标志物的问题在于它们也可能在健康细胞上进行不同程度的表达，这就意味着“靶向”疗法不可避免地导致一定量的自身靶向。
嵌合抗原受体(CAR)是受体蛋白，最初是为了使T细胞具有靶向特定蛋白的能力而开发的。正在研究CAR在癌症治疗中的用途。WO 2016/201304、WO 2017/192440和WO 2017/017184描述了在NK细胞上使用CAR在癌症治疗中的可能性。
靶向粘蛋白-1(MUC-1)的CAR-T细胞由Posey等(2016)发现，但是这些细胞的使用受到限制，因为它们在激活时表现出交叉反应性，并且在循环时具有持久性。
已证明MUC-1在激活的T细胞上表达(Konowalchuk和Agrawal,细胞免疫(CellImmunol.)2012；272(2):193-9)，发现MUC-1抗体与T细胞结合并抑制T细胞(Agrawal和Longenecker,国际免疫学(Int Immunol.)2005年4月；17(4):391-9)。MUC-1抗体与T细胞的相互作用导致该靶点的作用中止(Maher等，致免疫的信(letter to Immunity)第45卷,第5期,第945-946页,2016年11月15日)。
因此，针对癌细胞，需要具有更高选择性的可替代的且优选改善的基于细胞的疗法。
本发明的一个目的是提供高选择性靶向癌细胞的NK细胞和NK细胞系，优选具有更多细胞毒性表型的NK细胞和NK细胞系。进一步目的是提供产生经修饰的NK细胞和NK细胞系的方法，包含该细胞或细胞系的组合物及其在癌症治疗中的用途。更具体的实施方式旨在为已确定的癌症提供治疗，例如，包括白血病的血癌等。具体实施方式旨在结合NK细胞和NK细胞系的两种或两种以上修饰，以进一步增强修饰细胞的细胞毒性。
发明内容
本文提供了具有更多细胞毒性表型的经修饰的NK细胞和NK细胞系，以及制备该细胞和细胞系的方法。还提供了经修饰的NK细胞和NK细胞系的组合物，以及所述组合物在治疗癌症中的用途。如上所述，本文中的细胞毒性是指杀伤肿瘤细胞。
本发明提供了与肿瘤相关的MUC-1结合的NK细胞和细胞系，以及利用例如基因工程修饰NK细胞和NK细胞系的方法，以为NK细胞和细胞系提供与肿瘤相关的MUC-1结合的能力。
根据本发明，进一步提供了使用该(经修饰的)NK细胞或细胞系治疗血癌等癌症的方法，通常和具体地，例如，作为KHYG-1细胞的衍生物，其中，该(经修饰的)NK细胞和细胞系经改造与肿瘤相关的MUC-1结合，并且除了不表达检查点抑制受体外，可选择地表达TRAIL配体变体和/或表达Fc受体。
根据本发明，具体可治疗的疾病包括癌症、实体癌和血癌，尤其是乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、白血病和特别是急性髓性白血病。特别是可以治疗人类的肿瘤和癌症。本文提及的肿瘤包括提及的赘生物。
具体实施方式
因此，本发明提供一种自然杀伤(NK)细胞或NK细胞系，其经基因修饰以增加其细胞毒性。
如以下在实施例中的详细描述，NK细胞和NK细胞系经基因修饰，以增加其抗癌的细胞毒活性。
本发明的NK细胞和NK细胞系还将被称为NK细胞(除非上下文另有要求)。
本发明的NK细胞或NK细胞系具有与肿瘤相关的粘蛋白-1(MUC-1)糖型结合的能力。此类糖型被认为是MUC-1抗原的非天然形式，并且可在癌症表面识别。因此，NK细胞和细胞系与异常糖基化MUC-1结合。
NK细胞或NK细胞系经基因修饰，以表达与肿瘤相关的MUC-1糖型结合的膜结合部分。
相对于与野生型MUC-1糖型，即非异常糖基化MUC-1的结合，经测量，以下实施例中所阐述的NK细胞与这些MUC-1糖型的结合优选地具有高亲和力。
结合亲和力可以根据本领域已知的任何合适的方法进行测量。优选地，使用表面等离振子共振、等温滴定量热法或ELISA测量结合亲和力。
优选的是，与表达野生型MUC-1的正常(非恶性)细胞的亲和力相比，经修饰的NK细胞对癌细胞上肿瘤相关的MUC-1的亲和力可至少增加10％、20％、50％，更优选地可至少增加100％。
与癌症相关的MUC-1糖型，即异常糖基化MUC-1的结合相比，本发明的NK细胞与野生型MUC-1的结合优选地具有低亲和力。
优选的是，与对表达异常糖基化MUC-1的癌细胞的亲和力相比，经修饰的NK细胞对正常细胞的亲和力至少降低10％、20％、50％，更优选地可至少降低100％。
优选的是，与经修饰的NK细胞对表达野生型MUC-1的正常细胞的亲和力相比，经修饰的NK细胞对癌细胞的亲和力至少增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍，更优选地至少增加1,000倍。
优选的是，与经修饰的NK细胞对异常糖基化癌细胞的亲和力相比，经修饰的NK细胞对表达野生型MUC-1的正常细胞的亲和力至少降低1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍，更优选地可至少降低1,000倍。
优选地，经修饰的NK细胞对异常糖基化MUC-1具有高亲和力，其中，“高亲和力”是指具有的亲和力足够高，可有效靶向癌细胞，但又足够低，可避免靶向正常的非异常糖基化MUC-1。
同样如以下实施例所述，膜结合部分是合适的模块化融合受体，其包括靶向序列(通常是抗体衍生的单链片段(scFv))和通常包括铰链(以克服空间位阻问题)、间隔区、跨膜元件和信号内域。通常，这些部分是嵌合抗原受体(CAR)。以下实施例使用源自IgD的铰链，其他铰链也适用，例如，CD8a。已知许多序列与异常糖基化MUC-1结合，并且可以用作靶向序列，此类序列包括5E5、SM3和HMFG2，并且适当地并入本发明的CAR中，优选地，CAR包括HMFG2序列。然而，靶向异常糖基化MUC-1的其他序列可以通过现有技术中已知的筛选方法进行鉴定，其中，高亲和力序列(如上所述)可以根据本发明产生MUC-1NK-CAR。
因此，本发明提供了一种NK细胞或NK细胞系，其经修饰以表达一种或多种CAR，相对于野生型MUC-1糖型，所述CAR与肿瘤相关的MUC-1糖型结合，并具有更高的亲和力。
与野生型或非异常MUC-1相比，癌症相关的糖型往往具有特征性表现，特别是某些抗原的含量较高。与野生型糖型相比，通过本发明的细胞和细胞系的结合特性靶向的MUC-1的特定糖型通常具有选自Tn、唾液酸化Tn(STn)、T和唾液酸化T(ST)聚糖的大量较短聚糖(Maher和Wilkie,癌症研究(Cancer Res),2009年6月1日,69(11),4559-4562；DOI:10.1158/0008-5472.CAN-09-0564)。
本发明的细胞和细胞系上的部分以较高或较低的亲和力与具有一种或多种或者所有这些较短聚糖的糖型结合。结合特异性异常糖基化MUC-1的特异性序列可以高亲和力，特异性地进行结合。可发现，与多个、优选地，与列出的所有肿瘤相关糖型结合，特异性稍低但又具有可接受的亲和力的序列在本发明中具有更广泛的用途。HMFG2scFv具有靶向唾液酸化T抗原以及Tn和唾液酸化Tn抗原的优点，5E5 scFv靶向后两者。
本发明的一个优点在于NK细胞和细胞系靶向癌症。无论是单独使用还是与其他治疗成分联合使用，或作为具有其他修饰的细胞/细胞系，所述细胞均可用于癌症治疗。迄今为止的体外数据表明，本发明实施例的细胞具有细胞毒性。
在相关的基于T细胞的疗法中，由于与肿瘤衍生的MUC-1相关的特异性糖基化模式，MUC-1先前被视为靶向T细胞作用的候选物。因此，开发了单克隆抗体(例如，5E5和HMFG2)以靶向这些癌症特异性糖型。US 8440798详述了单克隆抗体5E5。然后开发了T细胞嵌合抗原受体(T-CAR)以靶向肿瘤相关的MUC-1(Wilkie等，2008)。然而，不幸的是，与激活T细胞的交叉反应性和循环中T细胞的持久性使T-CAR MUC-1疗法出现问题，所以这种方法已不在临床上应用。
在本发明中，使用NK细胞，可选地允许发生这种自身靶向的风险，并进一步提供更多的元素来克服该风险。
尽管存在自身靶向作用的风险，即异常糖基化MUC-1也在患者T细胞、患者NK细胞或治疗性NK细胞本身上表达，所以这些细胞类型中的一种或多种可能被本发明的治疗性NK细胞破坏，本发明的治疗可以在减少暴露于治疗性NK细胞的持续时间的情况下进行，从而降低风险。通常，NK细胞在循环中不能长期存活，可能长达数周(尽管这有所不同)，从而降低自身靶向风险。本发明使用CAR-NK细胞，而不是在患者体内持续几个月甚至多月的T细胞，因此预计本发明的NK细胞的治疗指数会宽很多。因此，可达到可接受的治疗效果，且没有明显的副作用。
根据本发明，还可以对NK细胞或细胞系进行处理或预处理，使其无法分裂，这导致其在患者体内循环的寿命进一步缩短，例如，与T细胞相比，可进一步降低上述风险，并且还使其在患者体内形成肿瘤的倾向降低或不存在。这些特征会在下文更详细地进行描述。
根据本发明，NK细胞或细胞系可以单独或另外进行修饰，以减少或不存在异常糖基化MUC-1的表达。例如，本发明的细胞和细胞系可选地通过使用siRNA和CRISPR等基因修饰实现MUC-1敲低或敲除。
在优选的实施方式中，细胞系是KHYG-1细胞系的衍生物。在试验中，我们确定该细胞系不表达异常糖基化MUC-1，从而避免了自身靶向作用。
本发明的NK细胞和细胞系用于治疗患者的癌症。所述癌症通常是实体癌，例如，乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌，可能是血癌，特别是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤(SMM)、活动性骨髓瘤和轻链骨髓瘤的血癌，尤其是白血病或多发性骨髓瘤。
优选地，本发明的NK细胞和NK细胞系用于治疗对NK细胞介导的细胞毒性具有固有抗性的癌症。
NK细胞抗性癌症在本领域众所周知(Pardoll,D.M.免疫(Immunity)(2015)42:605-606)。癌细胞对NK细胞介导的杀伤的敏感性由许多因素决定。正负信号之间存在着平衡，主要通过NK细胞上的膜受体与癌细胞上的配体相互作用进行传递。通常，这些受体的配体表达的平衡决定了癌症是否对NK细胞杀伤敏感或具有抗性(Yokoyama,W.M.免疫学研究(Immunol Res)(2005)32:317-325)。
癌症对NK细胞介导的细胞毒性的敏感性通常被理解为以下类别之一：高度抗性、抗性、敏感和高度敏感。在实验室中，通过细胞毒性试验，可以筛选癌细胞对NK细胞介导的细胞毒性的敏感性。然后将每个类别理解为在以特定效靶(E：T)比和特定时间暴露于NK细胞时对应的被杀伤的癌细胞百分比。
在本发明的实施例中，如果在以高达5：1的E：T比用NK细胞孵育长达15小时后，25％或以下的癌细胞被杀伤，则认为癌症对NK细胞介导的杀伤具有高度抗性。优选地，NK细胞是KHYG-1细胞。
在本发明的实施例中，如果在以高达5：1的E：T比用NK细胞孵育长达15小时后，50％或以下的癌细胞被杀伤，则认为癌症对NK细胞介导的杀伤具有抗性。优选地，NK细胞是KHYG-1细胞。
在本发明的实施例中，如果在以高达5：1的E：T比用NK细胞孵育长达15小时后，50％以上的癌细胞被杀伤，则认为癌症对NK细胞介导的杀伤敏感。优选地，NK细胞是KHYG-1细胞。
在本发明的实施例中，如果在以高达5：1的E：T比用NK细胞孵育长达15小时后，75％或以上的癌细胞被杀伤，则认为癌症对NK细胞介导的杀伤高度敏感。优选地，NK细胞是KHYG-1细胞。
在制备NK细胞时，基因修饰可以发生在细胞分化为NK细胞之前，例如，可以对多能干细胞(如iPSC)进行基因修饰，然后分化产生细胞毒性增加的经基因修饰的CAR NK细胞。
在本发明的某些实施方式中，提供了NK细胞，其经进一步修饰可使检查点抑制受体功能降低或不存在。与靶向肿瘤相关的MUC-1的联合可以特别有效地治疗实体瘤，特别是卵巢癌、乳腺癌和/或结肠直肠癌。可以产生一个或多个检查点抑制受体被敲除的NK细胞。优选地，这些受体是特异性检查点抑制受体。仍优选地，这些检查点抑制受体是CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和/或TIM-3中的一种，多种或全部。在其他实施方式中，提供了NK细胞，其中一个或多个抑制受体信号传导途径被敲除或表现出功能降低，结果仍然是使抑制受体功能降低或不存在。例如，由SHP-1、SHP-2和/或SHIP介导的信号传导途径通过细胞的基因修饰而被敲除。
优选的是，由于NK细胞激活后检查点抑制受体的表达，与其他抑制受体相比，检查点抑制受体的功能降低。正常或“经典”抑制受体，如大多数KIR家族、NKG2A和LIR-2，与MHCI类结合，因此主要参与减少自身靶向的问题。因此，优选地，敲除检查点抑制受体。根据本发明，这些受体的功能降低或不存在可防止癌细胞抑制免疫效应子功能(如果受体功能完全，则可能发生这种情况)。因此，本发明这些实施方式的关键优势在于NK细胞不易被癌细胞抑制其细胞毒性活性。因此，它们可用于癌症治疗。
如本文所用，提及抑制受体通常是指在免疫效应细胞，例如，NK细胞，的质膜上表达的受体，因此，与其互补配体结合产生的细胞内信号负责降低所述免疫效应细胞的细胞毒性。这些抑制受体在免疫效应细胞的“静止”和“激活”状态下表达，并且通常与为免疫系统提供“自身耐受性”机制相关，从而抑制对机体细胞和组织的细胞毒性的响应。例如，抑制受体家族“KIR”，其在NK细胞上表达，并识别在机体健康细胞上表达的MHC I类。
同样如本文所用，检查点抑制受体通常被认为是上述抑制受体的子集。然而，与其他抑制受体不同，检查点抑制受体在免疫效应细胞，例如NK细胞的长期激活和细胞毒性过程中以较高水平进行表达。这种现象可用于抑制例如炎症部位的慢性细胞毒性。例如，检查点抑制受体PD-1、CTLA-4和CD96，均在NK细胞上进行表达。
因此，本发明还提供了一种NK细胞，其与异常糖基化MUC-1结合，并且还缺失对选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG-3)、CD279(PD-1)、CD328(SIGLEC7)、SIGLEC9、TIGIT和TIM-3中的检查点抑制受体进行编码的基因。
缺失的基因可以是指全部或部分缺失、突变或导致无功能基因产物表达的其他方式。在实施方式中，NK细胞缺失对两个或两个以上抑制受体进行编码的基因。
更具体的实施方式包括缺失对选自CD96(TACTILE)、CD152(CTLA4)、CD328(SIGLEC7)和CD279(PD-1)，特别是CD96或CD328中的检查点抑制受体进行编码的基因的NK细胞。
在以下实施例中描述的一个具体实施方式中，本发明的NK细胞对表达siglec配体的癌症具有细胞毒性，对于此类癌症，优选本发明中其SIGLEC9和/或特别是SIGLEC7降低或不存在的NK细胞。
在本发明的其他实施方式中，提供NK细胞，其与异常糖基化MUC-1结合并且表达TRAIL配体，或优选地，表达突变型(变体)TRAIL配体。所得的NK细胞表现出增加与TRAIL受体的结合，因此，对癌症，特别是具体为卵巢癌、乳腺癌和结肠直肠癌的实体癌，以及具体为白血病的血癌的细胞毒性增加。具有这种联合活性的NK细胞还可以有效减少癌症转移。
与野生型TRAIL与诱饵受体的结合相比，TRAIL突变型/变体对“诱饵”受体的亲和力更低(或实际上无亲和力)。此类诱饵受体代表一类TRAIL受体，其与TRAIL配体结合，但不具备启动细胞死亡的能力，并且，在某些情况下，具有拮抗死亡信号传导途径的作用。突变型/变体TRAIL配体可以根据WO 2009/077857制备。
突变型/变体可分别增加对DR4和DR5等TRAIL受体的亲和力。通常已知野生型TRAIL对DR4的KD为>2nM，对DR5为>5nM，对诱饵受体DcR1为>20nM(WO2009/077857；通过表面等离振子共振测量)，或对DR4为约50-100nM，对DR5为1-10nM，对DcR1为175-225nM(Truneh,A.等，2000；通过等温滴定热法和ELISA法测量)。因此，对DR4增加的亲和力分别定义为KD＜2nM或＜50nM，而对DR5增加的亲和力分别定义为KD＜5nM或＜1nM。对诱饵受体DcR1减少的亲和力分别适当地定义为KD>50nM或>225nM。在任何情况下，TRAIL变体/突变型表现出的亲和力增加或减少均相对于野生型TRAIL表现出的基线亲和力。与野生型TRAIL表现出的亲和力相比，其亲和力优选地至少增加10％、25％、50％，更优选可至少增加100％。
与对DR4、DcR1和DcR2的亲和力相比，TRAIL变体优选地增加对DR5的亲和力。优选地，与对DR4、DcR1和DcR2中的一种或多种相比，对DR5的亲和力至少增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍或甚至1,000倍或更高。更优选地，与对DR4、DcR1和DcR2中的至少两种和优选的全部的亲和力相比，对DR5的亲和力至少增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、甚至1,000倍或更高。
与对野生型TRAIL的亲和力相比，TRAIL变体优选增加对DR4和DR5中的一种或两种的亲和力。优选地，与对野生型TRAIL相比，对DR4和/或DR5的亲和力至少增加1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍或甚至1,000倍或更高。
如上所述，高亲和力TRAIL变体增加对TRAIL死亡受体的亲和力。
进一步的具体实施方式包括表达突变型TRAIL配体的NK细胞，其对TRAIL诱饵受体的亲和力减少或无亲和力。进一步的具体实施方式包括表达突变型TRAIL配体的NK细胞，其对TRAIL诱饵受体的亲和力减少或无亲和力，对DR4和/或DR5的亲和力增加。
通过向患者施用能够上调癌细胞上TRAIL死亡受体表达的制剂，可选地增强了使用表达TRAIL或TRAIL变体的经修饰的NK细胞治疗癌症的能力。可以在施用经修饰的NK细胞之前，与其联合用药或之后施用该制剂。然而，优选地在施用经修饰的NK细胞之前施用所述制剂。所述制剂上调DR5在癌细胞上的表达。所述制剂可选地是化疗药物，例如，蛋白酶体抑制剂，其中一种是硼替佐米，以能够上调癌症上DR5表达的低剂量给药。DR5诱导剂还包括吉非替尼、荜茇酰胺、多柔比星、α-生育酚琥珀酸酯和HDAC抑制剂。
优选使用CAR实现与异常糖基化MUC-1的结合。本发明的细胞或系中使用的CAR包括或与之连接的一个或多个NK细胞共刺激域，例如，CD28、CD134/OX40、4-1BB/CD137、CD3ζ/CD247、DAP12或DAP10。因此，变体与其靶细胞上的受体的结合可推动靶细胞内的凋亡信号，并刺激NK细胞中的细胞毒性信号。在以下实施例中，CAR包括CD28、OX40和CD3ζ。
根据本发明的进一步优选实施方式，提供了NK细胞，其表达与异常糖基化MUC-1结合的CAR，检查点抑制受体功能降低并且还表达突变型TRAIL配体，如以上关于各NK细胞修饰的详细描述。
本发明的可选特征包括对上述NK细胞和NK细胞系提供进一步修饰，其中，例如，Fc受体(其可以是包括亚型和衍生物的CD16、CD32或CD64)在细胞表面表达。在使用中，这些细胞表现出增强对抗体包被的癌细胞的识别，并改进细胞毒性响应的激活。
本发明的进一步可选特征包括使经修饰的NK细胞和NK细胞系经适应更好地向机体的特定靶区域归巢。本发明的NK细胞可以靶向特定的癌细胞位置。在治疗血癌的优选实施方式中，本发明的NK效应子适合向骨髓归巢。特异性NK细胞经岩藻糖基化和/或唾液酸化进行修饰以向骨髓归巢。这可以通过对NK细胞进行基因修饰，分别表达合适的岩藻糖基转移酶和/或唾液酸转移酶来实现。通过破坏肿瘤脉管系统，例如节拍化疗，或使用靶向血管生成的药物(Melero等，2014)使NK细胞通过癌细胞血管的浸润正常化，也可增加NK效应细胞归巢至肿瘤部位的可能性。
本发明的又一可选特征是提供了经修饰的NK细胞和NK细胞系，增加了其在培养基中快速生长和增殖的内在能力。这可以通过例如转染细胞以过表达诱导生长的细胞因子IL-2和IL-15来实现。而且，这种可选的改变提供了经济有效的替代方案，可连续地向生长培养基中补充细胞因子。这些细胞可用作中间体，制备大量细胞，以在治疗应用(如前所述包括照射等治疗以防止在患者体内分裂)之前进行后续处理(例如，降低其分裂能力)。
本发明进一步提供了制备经修饰的NK细胞或NK细胞系的方法，所述方法包括对本文所述的细胞或细胞系进行基因修饰，以表达与异常糖基化MUC-1结合的CAR。
上文和下文中所述的经修饰的NK细胞、NK细胞系及其组合物适用于治疗癌症，特别是人类癌症，例如，治疗血细胞癌或实体癌。NK细胞及其衍生物优选人类NK细胞。对于人类治疗，优选使用人类NK细胞。本发明还提供了治疗人类癌症的方法，包括施用有效量的细胞或细胞系或者组合物。
本领域技术人员会知道各种施用途径，将活性制剂及其组合输送给有需要的患者。本发明的实施方式用于血癌治疗。经修饰的NK细胞和/或NK细胞系的施用可以是全身或局部性，如通过腹腔途径。
在其他实施方式中，活性制剂被更直接地施用。因此，可以直接瘤内施用，特别适用于实体瘤。
通常，NK细胞适用于本发明的方法、用途和组合物。根据本文某些实施例中使用的细胞，NK细胞可以是从癌细胞系中获得的NK细胞。有利地，优选地从血癌细胞系中获得NK细胞，优选地，所述NK细胞经处理以降低其致瘤性，例如，通过使其死亡和/或无法分裂，并可用于本发明的方法中以治疗血癌。
为了使衍生自癌症的NK细胞更易于用于治疗用途，通常以某种方式对其进行处理或预处理，以减少或消除其在患者体内形成肿瘤的倾向。实施例中使用的经修饰的特异性NK细胞系具有安全性，因为它们已无法分裂；它们经受照射，保持其杀伤能力，但在大约3-4天之内死亡。因此，特异性细胞和细胞系无法增殖，例如，照射的结果。用于本文方法中的潜在NK细胞的处理包括照射以防止其在体内分裂和形成肿瘤，以及基因修饰以降低致瘤性，例如，插入编码可被激活的自杀基因的序列以防止细胞在体内分裂并形成肿瘤。自杀基因可以通过外源性(例如，循环中的)制剂启动，然后在表达该基因的细胞中引起细胞死亡。进一步替代方案是使用靶向治疗特异性NK细胞的单克隆抗体。例如，CD52在KHYG-1细胞上表达，单克隆抗体与该标志物的结合可以导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和KHYG-1细胞死亡。
如Suck等人在2006年发表的文章中所讨论，使用γ射线血液辐照仪(Gammacell3000Elan)可轻松地对衍生自癌症的NK细胞和细胞系进行照射。铯-137的来源用于控制照射剂量，例如，1Gy和50Gy之间的剂量反应曲线可用于确定消除细胞增殖能力的最佳剂量，同时保持增加细胞毒性的益处。这可以通过在进行各剂量的照射后分析细胞的细胞毒性来实现。
与公认的自体或MHC匹配T细胞方法相比，将经照射的NK细胞系在过继细胞免疫疗法中具有明显的优势。首先，使用具有高度增殖性的NK细胞系意味着经修饰的NK细胞系可以更容易地在商业水平上实现扩增。然后，可以在向患者施用细胞之前，对经修饰的NK细胞系进行照射。这些被照射的细胞保留了其有用的细胞毒性、寿命有限，而且与经修饰的T细胞不同，不会长时间循环而导致持续的副作用。
另外，使用同种异体修饰的NK细胞和NK细胞系意味着患者体内表达MHC I类的细胞不能以与自体NK细胞毒性响应相同的方式抑制NK细胞毒性响应。使用同种异体NK细胞和细胞系杀伤癌细胞受益于前述GVL效应，与T细胞不同，同种异体NK细胞和细胞系不会刺激GVHD发作，使其成为通过过继细胞免疫疗法治疗癌症的首选。
在本发明的另一方面，提供了一种在确定是否继续使用上述和下述的MUC-1NK-CAR治疗癌症之前，评估癌症对NK细胞介导的细胞毒性的敏感性的方法。
因此，提供了一种方法，其包括以下步骤：(1)从患者体内分离出一种或多种癌细胞，(2)测量NK细胞对一种或多种癌细胞的特异性细胞毒性百分比，从而确定一种或多种癌细胞是否对NK细胞具有抗性，(3)根据步骤(2)的结果决定是否治疗癌症，其特征在于，如果一种或多种癌细胞具有NK细胞抗性，则进行癌症治疗。
优选地，将NK细胞抗性定义为特异性细胞毒性百分数为50％或以下。
优选地，本发明的MUC-1NK-CAR用于治疗本身对NK细胞介导的细胞毒性具有抗性的患者癌症。
实施方式
根据本发明，提供以下实施方式：
1.一种自然杀伤(NK)细胞或NK细胞系，其经修饰与肿瘤相关的粘蛋白-1(MUC-1)糖型结合。
2.根据实施方式1的NK细胞或NK细胞系，其中，相对于野生型MUC-1糖型，所述NK细胞或NK细胞系经基因修饰以表达与肿瘤相关的MUC-1糖型结合的膜结合部分，并具有高亲和力。
3.根据实施方式2的NK细胞或NK细胞系，其中，所述膜结合部分是嵌合抗原受体(CAR)。
4.根据实施方式3的NK细胞或NK细胞系，其中，所述CAR包括HMFG2序列。
5.根据前述实施方式中任一项的NK细胞或NK细胞系，其中，与野生型糖型相比，所述肿瘤相关的MUC-1糖型包括选自Tn、唾液酸化Tn(STn)、T和唾液酸化T(ST)聚糖的大量较短聚糖。
6.根据前述实施方式中任一项的NK细胞或细胞系，其在患者体内形成肿瘤的倾向降低或不存在。
7.根据实施方式6的NK细胞或NK细胞系，其已无法分裂，例如，通过照射。
8.根据前述实施方式中任一项的NK细胞或细胞系，其经修饰减少或不存在异常糖基化MUC-1的表达。
9.根据前述实施方式中任一项的NK细胞或NK细胞系，其经进一步修饰以表达突变型TRAIL配体，与野生型TRAIL相比，所述突变型TRAIL配体对一种或多种TRAIL死亡受体具有高亲和力。
10.根据实施方式9的NK细胞或NK细胞系，其中，所述突变型TRAIL配体包括D269H/E195R突变。
11.根据前述实施方式中任一项的NK细胞或NK细胞系，其经进一步修饰以去除一个或多个检查点抑制受体的功能。
12.根据前述实施方式中任一项的NK细胞或NK细胞系，其中，所述细胞系是KHYG-1细胞系的衍生物。
13根据前述实施方式中任一项的NK细胞或NK细胞系在治疗患者癌症中的用途。
14.根据实施方式13的NK细胞或NK细胞系的用途，其中，所述癌症是实体癌，例如，乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌。
15.根据实施方式14的NK细胞或NK细胞系的用途，其中，所述癌症是血癌，例如，急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤(SMM)、活动性骨髓瘤和轻链骨髓瘤。
实施例
现在，本发明对NK细胞系KHYG-1衍生物的产生进行更详细具体的描述，其经修饰通过与异常糖基化MUC-1结合的能力表现出更高的细胞毒性活性。
现在结合附图用具体实施方式阐述本发明，其中：
图1显示了MUC-1嵌合抗原受体(CAR)的基因序列结构；
图2显示了用于在KHYG-1细胞中表达CAR的Lenti-EF1a-MUC1-CAR的载体图；
图3a、3b和3c显示了使用MUC-1CAR-NK细胞杀伤不同乳腺癌细胞；
图4显示了使用MUC-1CAR-NK细胞以5：1的效靶比杀伤MDA-MB-453乳腺癌细胞。
DNA、RNA和氨基酸序列如下所示，其中：
SEQ ID NO：1是MUC-1CAR DNA序列；
SEQ ID NO：2是MUC-1CAR肽序列；
SEQ ID NO：3是用于MUC-1结合的24-mer肽染色序列。
SEQ ID NO：1
ATGTGGCAACTGCTGCTGCCTACAGCTCTGCTGCTTCTGGTGTCCGCCGATATCGTGGTCACACAAGAGAGCGCCCTGACCACCTCTCCTGGCGAAACAGTGACCCTGACCTGCAGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCACAAGCAACTACGCCAACTGGGTGCAAGAGAAGCCCGATCACCTGTTCACAGGCCTGATCGGCGGCACAAACAATAGAGCACCTGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGATCTCTGATCGGAGACAAGGCCGCACTGACAATCACAGGCGCCCAGACAGAGGACGAGGCCATCTACTTTTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCACTGGGTTTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTGGGATCTGAAGGTGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGAGGTTCTGAAGTTCAGCTGCAACAATCTGGCGGCGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTATGAAGCTGAGCTGTGTGGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATGAACTGGGTCCGACAGAGCCCCGAGAAAGGCCTGGAATGGGTTGCCGAGATCAGACTGAAGTCCAACAATTACGCCACACACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAGCAGCGTGTACCTCCAGATGAACAACCTGAGAGCCGAGGACACCGGCATCTACTACTGCACCTTCGGCAACAGCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCCAGCACCTTCACCTGTTTTGTCGTGGGCAGCGACCTGAAGGATGCCCACCTGACATGGGAAGTCGCCGGCAAAGTTCCTACCGGTGGCGTGGAAGAAGGCCTGCTGGAAAGACACAGCAACGGCAGCCAGAGCCAGCACAGCAGACTGACACTGCCTAGAAGCCTGTGGAATGCCGGCACCAGCGTGACCTGCACACTGAATCATCCTAGCCTGCCTCCACAGAGACTGATGGCCCTGAGAGAACCTGCTGCTCAGGCCCCTGTGAAGCTGTCCCTGAATCTGCTCGCCAGCAGCGATCCTCCTGAAGCCGCCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCAAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGACAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACTTTTGGGTGCTCGTGGTTGTTGGCGGAGTGCTGGCCTGTTACAGCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCAGACGGGACCAAAGACTGCCTCCTGACGCTCACAAACCTCCAGGCGGCGGAAGCTTCAGGACCCCTATCCAAGAAGAACAGGCTGACGCCCACAGCACCCTGGCCAAGATCCGCGTGAAGTTCTCCAGATCCGCCGACGCTCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGAAAGCCCCAGCGGAGAAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTGCCTCCA
SEQ ID NO：2
MWQLLLPTALLLLVSADIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSTFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAANVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
SEQ ID NO：3
TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP
MUC1嵌合抗原受体的预期分子量为813个氨基酸＝89.6kDa，其中MUC1 CAR的单链可变片段和激活结构域的序列如下：
序列位置 序列类型 碱基对长度
1 信号肽 48bp
2 VL(可变区轻链) 336bp
3 (G4S)3接头序列 45bp
4 VH(可变区重链) 351bp
5 IgD铰链 309bp
6 IgG1 Fc+铰链 699bp
7 CD28 204bp
8 OX40 111bp
9 CD3ζ 336bp
对于抑制受体功能的敲除/敲低以及突变体TRAIL的敲入的相关实例，可参考WO2017/017184，其内容通过引用结合在本文中。
实施例1–编码MUC-1-CAR的慢病毒质粒
将编码衍生自识别肿瘤相关的抗原MUC-1(SEQ ID NO：1)的HMFG2克隆的单链可变片段(scFv)的DNA核苷酸克隆至pCDCAR1-GFP载体中。该scFv序列之后是另一个基于免疫球蛋白的铰链区，以克服MUC-1位阻。铰链区之后是CD28、OX40和CD3ζ的共刺激激活结构域，以便为NK细胞的细胞毒性提供激活信号，从而触发MUC-1阳性肿瘤细胞的细胞溶解。在嵌合抗原受体(CAR)蛋白(SEQ ID NO：2)之后，选择性标志物增强型绿色荧光蛋白(EGFP)位于T2A序列的下游，将CAR和EGFP分开。将该序列克隆至pCDCAR1-GFP载体的EcoRI和XbaI限制性位点之间(见图1和2)。
将150μl的小瓶大肠杆菌感受态在冰上解冻。同时，将未标记的试管在冰上冷却。一旦最后一个晶体融化，立即将50μl细胞与1μl适当的稀释质粒溶液(5ng/μl)一起转移至各冷却的试管中。然后将试管在冰上放置30分钟。将试管浸入42℃的水浴中30秒，然后使其在冰上冷却5分钟，对细胞进行热休克。向各试管中加入950μl室温LB肉汤，然后轻摇试管形成均匀的混合物。将试管在培养箱(37℃)中的振荡器上(250rpm)放置1小时。然后，将50μl各质粒溶液加入其相应的含有氨苄青霉素的琼脂平板中。将平板倒置于培养箱中过夜储存，以使含有质粒的细菌生长并形成单个菌落(14-16小时)。从其中一个平板选取菌落。使用高压灭菌的移液器吸头，采集菌落并将其涂抹在相应培养管的内表面。然后将试管放置在培养箱(37℃)中的振荡器上(125rpm)过夜，最长达16小时。根据生产商的说明书分离质粒DNA。利用限制性酶进行限制性消化以验证质粒。将细菌培养物(2.5ml)加入含有氨苄青霉素的247.5ml LB肉汤中。然后将250ml细菌溶液分装至50ml试管，于-20℃保存。
从-20℃冰箱中取出装有细菌细胞团块的已标记的50ml试管，并在实验台上解冻几分钟。将第一细胞团块进行涡旋，并重悬于12ml含有RNase A的重悬缓冲液中。将12ml裂解缓冲液加入悬浮液中。将悬浮液倒置混合，然后在室温下孵育5分钟。向各悬浮液中加入12ml中和缓冲液，然后倒置试管，直至样品从蓝色变为无色。将粗裂解物在冰上孵育5分钟。将柱过滤器插入NucleoBond Xtra柱中，然后将15ml平衡缓冲液施加到每个柱滤器的边缘，以确保润湿整个柱及其周围。通过重力流将柱清空倒入柱架下方的水池中。将裂解物倒入其指定的柱过滤器中。用5ml过滤器洗涤缓冲液清洗柱过滤器，确保上述将缓冲液施加到过滤器的漏斗形边缘。然后通过重力流将柱清空。移除柱过滤器并丢弃。用35ml的清洗缓冲液清洗NucleoBond Xtra柱，然后通过重力流将其清空。为清洗所述柱，将缓冲液直接轻轻吸液至中心，而不是边缘。然后重复该清洗步骤。将15ml试管置于各柱下方以收集洗脱液。用5ml的洗脱缓冲液从所述柱上洗脱质粒DNA。将3.5ml的室温异丙醇吸液至各15ml的试管中，以沉淀洗脱的质粒DNA。然后彻底涡旋试管。在小心吸出上清液之前，将试管在4℃下以4,500rpm离心40分钟。将2ml无内毒素的室温70％乙醇加入到各沉淀中。然后将试管在室温下以4500×g离心10分钟。使用移液管去除各试管中的乙醇，并于室温下在通风橱中干燥，直至团块从轻度不透明变为更透明的玻璃状外观。然后使用Nanodrop分光光度计测量DNA浓度，并将DNA团块溶解在400μl的H2O-EF中。
实施例2–MUC-1CAR质粒对KHYG-1细胞的核转染
在T25烧瓶中进行核转染前一天，将KHYG-1细胞以1：1传代(5ml细胞+5ml培养基)，同时细胞处于对数生长期。使用Lonza Nucleofection试剂盒T(目录号：VCA-1002)；一个核转染样品包含100μl核转染溶液(标准比色皿)和2×106个细胞。核转染溶液包含新鲜配制的18μl补充剂和82μl Nulceofector溶液(每个样品)，并在37℃孵育10分钟。
将溶液T加热至室温。于37℃在15ml试管(无抗生素)中制备新鲜的12ml等份培养基(CM)，其包含2.4ml FBS、9.6ml RPMI 1640和补充剂6μl IL-2(RPMI1640+20％FBS+500IU/ml IL-2)。将4ml CM等分到T25烧瓶中，并将平板在湿润的37℃培养箱中预孵育20分钟。在15ml试管中进行10ml细胞培养，并计数细胞以确定细胞密度。将2×106样品分配至15ml试管中，并以1,000rpm离心5分钟(acc.9/decc.7)。完全丢弃上清液，因此没有残留的培养基覆盖细胞团块。将细胞团块重悬于100μl室温的Nucleofector溶液(见上文)中，使最终浓度为2×106个细胞/100μl。避免将细胞悬浮液在Nucleofector溶液中保存超过5分钟，因为这会降低细胞活力和基因转移效率。向各试管中加入0.2-2μg Lenti-EF1a-MUC1-CAR质粒DNA。然后将样品转移至Amaxa认证的比色皿中，确保样品覆盖比色皿的底部，以避免在移液时出现气泡。用蓝帽封闭比色皿，并选择Nucleofector程序A-024将比色皿插入比色皿支架，然后按下“x”按钮启动程序(注：也可以使用程序U-001)。为避免损坏细胞，程序完成后立即将样品从比色皿中取出(显示屏显示“OK”)。将预热的培养基加入到比色皿中，并将样品转移到一个T25烧瓶中。按下“X”按钮以重置Nucleofector。将细胞在湿润的37℃/5％CO2培养箱中培养48小时。加入2-4ml新鲜培养基(RPMI1640+10％FBS+100IU/ml IL-2)，再将细胞孵育24-96小时以实现最佳蛋白质表达(注：每24小时使用显微镜检查细胞的状态和状况)。在核转染后72至240小时之间进行流式细胞分析。
MUC-1CAR质粒以EGFP作为选择标志物。因此，可以通过估计GFP阳性KHYG-1细胞的数量来确定表达MUC-1CAR的KHYG-1细胞。
0.5ml细胞悬浮液(1×105个细胞)以1,200rpm离心5min。弃去上清液，然后加入1ml FACS缓冲液，并再次以1,200rpm离心5min。将细胞重悬于最终体积为200μl FACS缓冲液中。
然后使用488nm激光使用流式细胞仪分析细胞，并在FACS Canto A上使用530/30的检测滤光片进行分析-存在阳性细胞证明转染成功。
实施例3–MUC-1CAR-KHYG-1细胞对血癌细胞的杀伤
在14小时试验中，以0.125：1、0.25：1、0.5：1、1：1和2：1的效靶(E：T)比使用U266和RPMI-8226靶多发性骨髓瘤细胞(预筛选FACS，确认靶标上的MUC-1表达；RPMI-8226也表达siglec配体)测量NK细胞的细胞毒性，每100μl含40,000个靶肿瘤细胞，并接种在96孔平底板中。离心空白转染的KHYG-1细胞或MUC-1-CAR转染的KHYG-1细胞，弃去上清液。将细胞重悬于1ml新鲜培养基(RPMI1640+10％FBS+100IU/ml IL-2)中并计数。然后KHYG-1细胞达到的最终浓度为800,000个细胞/100μl，并与肿瘤细胞结合，最终体积为200μl。最终反应中的IL-2浓度为50IU/ml IL-2。然后将平板在37℃和5％CO2下孵育14小时。
通过流式细胞术确定NK细胞诱导的靶细胞死亡。使用Eppendorf repeater装置将200μl FACS缓冲液预装至FACS管中，然后以2,000rpm离心3分钟。倒置弃去上清液，然后在干燥的干净纸上吸干。利用涡旋将细胞重悬于试管中。加入4μl稀释的CD2BV421抗体，并在冰上避光孵育20分钟。使用Eppendorf repeater装置加入200μl FACS缓冲液，然后以2,000rmp旋转3分钟，倒置弃去上清液，然后在干燥的干净纸上吸干。利用涡旋将细胞重悬于试管中。使用Eppendorf repeater装置将200μl FACS缓冲液加入到30个试管中。向各试管加入2μl碘化丙啶，等待2-3分钟，并使用流式细胞仪分析各试管。
使用405nm激光和450/50检测器测量KHYG1细胞上的CD2表达，同时通过488nm激光和FACS Canto II上的585/42检测滤光片激发细胞对碘化丙啶进行测量。
结果证实，与不表达CAR的KHYG-1细胞相比，MUC-1CAR KHYG-1细胞对U266和RPMI8226靶标的细胞毒性增加。
实施例4–MUC-1CAR-KHYG-1细胞对乳腺癌细胞的杀伤
MUC-1在乳腺癌细胞上的表达
采用流式细胞术分析乳腺癌细胞系HCC-1954、MDA-MB-1954和ZR-75-1上MUC-1的表达。简言之，将细胞在冰上用抗-MUC1(克隆：HMFG2)-AF647(目录号：BD 566590)染色25分钟，随后在FACS Canto II上使用633/660/20测量MUC-1表达。表达分析表明，尽管表达水平不同，所有乳腺癌细胞系在细胞表面均有MUC-1的表达。因此，MUC-1代表本发明的MUC-1NK-CAR的合适候选靶抗原。
MUC-1CAR转染NK细胞
在Trilink Biotech，使用体外转录(IVT)合成MUC-1CAR的mRNA。从mRNA构建体中排除EGFP序列，以减少mRNA大小而不损害CAR活性。
用12.5μg表达mRNA的MUC-1CAR电穿孔KHYG-1细胞。将KHYG-1细胞进行空白电穿孔以用作对照。将两个样品孵育24小时，实现MUC-1CAR构建体的蛋白表达。24小时后，将细胞用24-mer肽序列(TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP-OH)染色，并与5(6)羧基荧光素(JPT肽溶液)结合30分钟；该肽序列与MUC-1CAR特异性结合。电穿孔后，86％的KHYG-1细胞呈MUC-1CAR表达阳性。电穿孔后24小时，电穿孔的空白KHYG-1细胞显示MUC-1CAR+细胞<1％。因此，表明MUC-1CAR在NK细胞中表达成功。
MUC-1NK-CAR对乳腺癌细胞的细胞毒性
在96孔平底板中以200μl最终体积进行NK细胞的细胞毒性试验。共培养14小时后，收获细胞并用CD2-BV-421抗体(BD生物科学(BD Biosciences))染色30分钟，以区分CD2阴性乳腺癌细胞和CD2阴性KHYG-1细胞。通过加入1.5μl的100μg/ml碘化丙啶溶液，细胞在冰上孵育细胞2分钟，然后进行流式细胞术分析，以分析细胞死亡。
在与MUC-1NK-CAR和一组乳腺癌细胞系共培养后，观察到与电穿孔的空白KHYG-1相比，MUC-1NK-CAR对NK细胞抗性乳腺癌细胞系(HCC-1954和MDA-MB-453)的细胞毒性更大。该观察结果在多个效靶(E：T)比下有效(见图3a、3b和4)。
本发明的MUC-1NK-CAR与对照细胞(电穿孔的空白KHYG-1)对ZR-75-1细胞的细胞毒性没有差异。该观察结果可以解释为ZR-75-1细胞已经对NK细胞介导的杀伤敏感，如图3c所示。数据表示14小时细胞毒性共培养试验。对CD2阴性乳腺癌细胞进行设门后，使用碘化丙啶通过流式细胞术确定NK细胞诱导的肿瘤溶解。
因此，表明本发明的MUC-1NK-CAR在杀伤多种癌症类型方面特别有效，特别是在癌症对NK细胞介导的细胞毒性具有固有抗性的情况下。
因此，本发明提供了NK细胞和细胞系，及其产生，以及在血癌治疗中的用途。

Claims (17)

1.一种自然杀伤(NK)细胞或NK细胞系，其经修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，相对于野生型粘蛋白-1(MUC-1)糖型，所述CAR与肿瘤相关的MUC-1糖型结合，并具有更高的亲和力。
2.根据权利要求1所述的NK细胞或NK细胞系，其中，相对于野生型MUC-1糖型，所述CAR与肿瘤相关的MUC-1糖型结合，亲和力至少增加10％。
3.根据权利要求1或2所述的NK细胞或NK细胞系，其中，所述CAR包含HMFG2序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其中，与野生型糖型相比，所述肿瘤相关的MUC-1糖型包含选自Tn、唾液酸化Tn(STn)、T和唾液酸化T(ST)聚糖的大量较短聚糖。
5.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系，其在患者体内形成肿瘤的倾向降低或不存在。
6.根据权利要求5所述的NK细胞或NK细胞系，其已无法分裂，例如，通过照射。
7.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或细胞系，其经修饰以减少或不存在异常糖基化MUC-1的表达。
8.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其经进一步修饰以表达突变型TRAIL配体，与野生型TRAIL相比，所述突变型TRAIL配体对一种或多种TRAIL死亡受体具有高亲和力。
9.根据权利要求8所述的NK细胞或NK细胞系，其中，所述突变型TRAIL配体包括D269H/E195R突变。
10.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其经进一步修饰以去除一个或多个检查点抑制受体的功能。
11.根据前述权利要求中任一项所述的NK细胞或NK细胞系，其中，所述细胞系是KHYG-1细胞系的衍生物。
12.如前述权利要求中任一项所述的NK细胞或NK细胞系在治疗患者癌症中的用途。
13.根据权利要求12所述的NK细胞或NK细胞系的用途，其中，所述癌症是实体癌，例如，乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌。
14.根据权利要求13所述的NK细胞或NK细胞系的用途，其中，所述癌症是血癌，例如，急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤、包括T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤、无症状骨髓瘤、冒烟型多发性骨髓瘤(SMM)、活动性骨髓瘤和轻链骨髓瘤。
15.一种确定患者癌症是否进行治疗的方法，包括以下步骤：(1)从患者体内分离出一种或多种癌细胞，(2)测量NK细胞对一种或多种癌细胞的特异性细胞毒性百分比，从而确定一种或多种癌细胞是否对NK细胞具有抗性，(3)根据步骤(2)的结果决定是否治疗癌症，其特征在于，如果一种或多种癌细胞具有NK细胞抗性，则进行癌症治疗。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，如果NK细胞对一种或多种癌细胞的特异性细胞毒性的百分比为50％或以下，则确定所述癌症具有NK抗性。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中，所述癌症治疗包括施用根据权利要求1-14中任一项所述的NK细胞或NK细胞系。
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