KR20230129979A - 수지상 세포 활성화 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

수지상 세포 활성화 키메라 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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KR20230129979A
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광동 산시 바이오테크놀로지 씨오., 엘티디
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Abstract

본 발명은 면역억제성 종양 환경에서 수지상 세포 (DC)를 활성화하기 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 또한, 본 발명은 CAR, 상기 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 CAR을 포함하는 조작된 세포를 포함하는 조성물, 및 이를 사용하는 방법도 제공한다.

Description

수지상 세포 활성화 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
관련 출원의 인용
본 출원은 2021년 1월 8일에 출원된 중국 특허 출원 202110022268.5호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 전문을 인용에 의해 본원에 포함시키고자 한다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 세포 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 면역 억제성 종양 미세환경에서 수지상 세포 (DC)를 활성화하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
선천성 면역계와 적응성 면역계 간의 주요 연결 고리로서, 수지상 세포 (DC)는 특히 종양 특이적 면역 반응을 촉발시키는데 있어서 (M. Hansen et al., The role of dendritic cells in cancer. Semin. Immunopathol. 39, 307-316 (2017)) T 세포 의존성 면역성을 활성화하는 주요 항원 제시 세포 (APC) 이다 (문헌 [R. M. Steinman, Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012)]; 및 [S. Puhr et al., Dendritic cell development-History, advances, and open questions. Semin. Immunol. 27, 388-396 (2015)]). 과거의 연구들에서, 종양 침윤성 수지상 세포 (TIDC)들은 통상적으로 T 세포의 침윤과 활성화를 억제하는 면역 억제성 종양 미세환경 또는 종양 면역 억제성 미세환경 (TIME)에서 미성숙하거나 제대로 기능하지 않는 표현형을 나타내고 있음이 밝혀졌다 (J. M. Tran Janco et al., Tumor-infiltrating dendritic cells in cancer pathogenesis. J. Immunol. 194, 2985-2991 (2015)).
수지상 세포에서 TIDC의 비정상적 거동, 예컨대 PD-L1 및 PD-L2의 siRNA 사일런싱을 구제하기 위한 여러가지 신호전달 경로들이 확인되었으나, 임상 용도에서의 큰 진전은 없었다 (문헌 [W. Hobo et al., siRNA silencing of PD-L1 and PD-L2 on dendritic cells augments expansion and function of minor istocompatibility antigen-specific CD8+ T cells. Blood 116, 4501-4511 (2010)]; [A. Harari et al., Antitumour dendritic cell vaccination in a priming and boosting approach. Nat. Rev. Drug Discovery 19, 635-652 (2020)]; 및 [Y. Ma et al., Dendritic Cells in the Cancer Microenvironment. J. Cancer 4, 36-44 (2013)]).
따라서, TIME에서 수지상 세포 (예를 들어, 종양 침윤성 수지상 세포)를 활성화시키기 위한 새로운 방법을 개발할 필요가 있는 실정이다.
한 양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 CAR이 (1) 세포외 항원 결합 도메인, (2) 막관통 도메인 및 (3) 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 CAR이 면역 억제성 종양 미세환경에서 수지상 세포를 활성화할 수 있는 것인, 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은 1) 면역 억제성 분자를 발현하고/하거나, 2) 면역 자극 사이토카인이 결핍된 종양 및/또는 종양 침윤성 면역 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), HLA 클래스 I, 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 CTLA-4 및/또는 PD-L1이다.
특정 실시형태에서, 면역 자극 사이토카인은 TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 종양은 CTLA4-Ig 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은 입양 세포 요법의 단일요법 (예를 들어, CAR-T 단일요법)에 대해 반응성이 좋지 않은 종양을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 RIG-1, NLRP10, DEC-205, BDCA-2, CD86, 4-1BBL, OX40L, CD40, IFNAR, TLR4, TNFR (예를 들어, TNFR2), CD80, CD40L, CD367 (DCIR), CD207 (Langerin), CD371 (DCAL-2, CLEC12a), CD204, CD36, IFNγR, Dectin-1 및 FcγR, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지상 세포 활성화 수용체의 세포질 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 Dectin-1의 세포질 도메인과 FcγR의 세포질 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, Dectin-1의 세포질 도메인과 FcγR의 세포질 도메인은 일렬로 (in tandem) 연결된다.
특정 실시형태에서, Dectin-1의 세포질 도메인은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, FcγR의 세포질 도메인은 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 4에 기재된 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 단쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다.
특정 실시형태에서, scFv는 종양 표면 마커 (예를 들어, 고형 종양 표면 마커)에 대해 특이적이다.
특정 실시형태에서, 종양 표면 마커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: EphA2, CD19, CD70, CD133, CD147, CD171, DLL3, EGFRvIII, 메소텔린, 강글리오사이드 GD2, FAP (섬유아세포 활성화 단백질), FBP (엽산 결합 단백질), Lewis Y, Claudin 18.2, IL13Rα2, HER2, MDC1, PMSA (전립선 막 특이적 항원), ROR1, B7-H3, CAIX, CD133, CD171, CEA, GPC3, MUC1, NKG2D.
특정 실시형태에서, CAR은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8 알파의 신호 펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, CD8 알파의 신호 펩타이드는 서열번호 5에 기재된 서열 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8 알파의 막관통 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, CD8 알파의 막관통 도메인은 서열번호 6에 기재된 서열 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포외 항원 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결된다.
특정 실시형태에서, 힌지 영역은 CD8 알파의 힌지 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, CD8 알파의 힌지 영역은 서열번호 7에 기재된 서열 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로서, 상기 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 CAR의 발현을 위한 적어도 하나의 조절 폴리뉴클레오타이드 성분에 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 벡터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 전이성 유전자 (transposon), 부위 지정 삽입 벡터 또는 자살 발현 벡터이다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 AAV 벡터이다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 세포를 제공한다.
특정 실시형태에서, 조작된 세포는 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포이다.
특정 실시형태에서, 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포는 말초 혈액 세포, 골수 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도형 만능 줄기 세포로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 조작된 세포를 생산하는 방법으로서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드의 발현에 적합한 조건 하에 본원에 제공된 벡터를 출발 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 출발 세포는 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포이다.
특정 실시형태에서, 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포는 말초 혈액 세포, 골수 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도형 만능 줄기 세포로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 방법에 의해 생체 외에서 제조된 세포의 군을 제공한다.
특정 실시형태에서, 세포군의 적어도 70%는 본원에 제공된 검출가능한 수준의 폴리펩타이드를 발현한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드, 또는 본원에 제공된 폴리펩타이드, 또는 본원에 제공된 벡터, 또는 본원에 제공된 조작된 세포의 군 또는 본원에 제공된 세포의 군, 및 (ii) 약제학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는데 있어서 입양세포 요법의 효능을 개선하는 방법으로서, 본원에 제공된 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 입양 세포 요법은 변형된 면역 세포의 입양 전달 (adoptive transfer)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 변형된 면역 세포의 군을 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 방법은 변형된 면역 세포의 군을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 변형된 면역 세포는 세포 표면 상에서 합성 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)가 발현된다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구이다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포이다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 자가유래성 또는 동종이계성이다.
특정 실시형태에서, 암은 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 눈암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 기관지폐포 세포 폐암, 중피종, 두경부암, 편평세포암종, 흑색종, 구강암, 난소암, 자궁경부암, 음경암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 육종, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 질암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고형암이다.
특정 실시형태에서, 암은 광범위 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 림프절외 NK/T 세포 림프종, HHV8 관련 원발성 삼출액 림프종, 형질모세포 림프종, 원발성 CNS 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 B 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 다발성 골수종 (MM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액암이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역 억제성 미세환경에서 면역 세포의 증식을 유도하는 방법, 면역 세포의 생존을 연장하는 방법 및/또는 면역 세포로부터 면역 자극 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 방법으로서, 상기 면역 억제성 미세환경과 본원에 제공된 조작된 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구이다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포이다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 자가유래성 또는 동종이계성이다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 미세환경은 면역 억제성 종양 미세환경이다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은 종양 및/또는 면역 억제성 분자를 발현하는 종양 침윤성 면역 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 CTLA-4 및/또는 PD-L1이다.
특정 실시형태에서, 종양은 CTLA4-Ig 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 자극 사이토카인은 TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 중 하나 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 질병 또는 병리학적 상태의 치료가 필요한 대상체에서 해당 질병 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법으로서, 본원에 제공된 치료적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 제2 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 제2 요법은 변형된 면역 세포의 군이다.
특정 실시형태에서, 제2 요법은 CAR-T 요법이다.
특정 실시형태에서, 질병은 암을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 수지상 세포를 활성화할 수 있는 CAR을 선택하는 방법을 제공한다:
(a) 면역 억제성 종양 미세환경을 포함하는 인간이 아닌 동물을 제공하는 단계,
(b) 후보 CAR을 발현하는 수지상 세포를 상기 인간이 아닌 동물에 투여하는 단계,
(c) 기준 수지상 세포와 비교하였을 때, 면역 억제성 종양 미세환경에 대한 침윤 개선, 생존율 개선 및 면역 세포 활성화 유도 기능 강화로부터 선택되는 수지상 세포 활성화를 위한 마커를 검출하는 단계, 및
(d) 수지상 세포를 활성화할 수 있는 CAR로서 후보 CAR을 선택하는 단계.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은 임상적으로 적절하다.
특정 실시형태에서, 인간이 아닌 동물은 인간 태아 흉선 및 자가유래성 인간 조혈 줄기 세포 (예를 들어, 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은 종양 및/또는 면역 억제성 분자를 발현하는 종양 침윤성 면역 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), HLA 클래스 I, 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 CTLA-4 및/또는 PD-L1이다.
특정 실시형태에서, 종양은 CTLA4-Ig 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구이다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포이다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 자가유래성 또는 동종이계성이다.
특정 실시형태에서, 면역 세포는 변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-T 세포) 또는 천연 면역 세포이다.
특정 실시형태에서, 변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)는 후보 CAR을 발현하는 수지상 세포와 함께 투여된다.
특정 실시형태에서, 인간이 아닌 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
본원에 포함된 첨부 도면들은 명세서의 일부를 구성한다. 본 도면들은 추가로, 작성된 명세서와 함께, 본 발명의 원리를 설명하고, 관련 기술(들)의 숙련자가 본 발명을 만들어 사용할 수 있게 하는 역할도 한다.
도 1은 CARDF가 THP-1 세포로부터 유래된 DC의 활성을 향상시켰음을 나타낸 것이다. 도 1a는 다양한 항-CD19 CAR 분자들의 개략도를 나타낸 것이다. 도 1b는 THP-1 세포주의 표면에서의 CARDF 발현을 유세포 분석법으로 측정한 것을 나타낸 것이다. CARDF는 단백질 L에 대한 결합으로 검출하였다. 도 1c는 CARDF+ THP-1 세포의 DC로의 분화 효율에 대한 유세포 분석을 나타낸 것이다. 도 1d는 공동 자극 분자인 CD80 및 CD86을 2일 동안 CD19+ H460 종양 세포와 함께 공동 배양한 후 대조군-DC 및 CARDF-DC에 의해 발현시킨 것을 나타낸 것이다. 도 1e는 CFSE로 표지된 CD3+ 1차 T 세포를 대조군-DC 또는 CARDF-DC와 3일간 공동 배양한 후 세포의 증식을 유세포 분석법으로 분석한 것을 나타낸 것이다. DC는 도 1d에 기술된 바와 같이 2일간 CD19+ H460 종양 세포에 의해 활성화시켰다. 우측의 히스토그램은 T 세포에서 CFSE의 중앙값 형광 강도 (MFI)를 나타낸 것이다. n=3. 도 1f는 H460 세포 표면의 CD19 발현을 유세포 분석법으로 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 1g는 CAR-T 세포 상의 항-CD19 CAR의 발현을 단백질 L 결합으로 분석하였음을 나타낸 것이다. n=3. 도 1h는 24시간 동안 대조군-DC 또는 CARDF-DC의 존재 하에 CD19+ H460 종양 세포에 대한 CAR-T 세포의 특이적 사멸 능력을 나타낸 것이다. n=3. 도 1i 및 1j는 IFN-γ (도 1i)의 수준을 ELISA에 의해 평가하였고, LDH (도 1j)를 도 1h의 공동 배양물의 상청액에서 CytoTox 96® Assay에 의해 분석하였음을 나타낸 것이다. n=3. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 통계: 일원 분산 분석, 브라운-포사이드 (Brown-Forsythe) 시험 + 터키 (Tukey)의 다중 비교 시험. n.d., 검출되지 않음; * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001, ns는 유의하지 않음을 나타냄.
도 2는 말초 단핵구로부터 유래된 CARDF-DC가 시험관 내에서 강력한 T 세포 활성화 활성을 나타냄을 보여주고 있다. 도 2a는 단핵구로부터 유래된 DC (Mo-DC)의 표면 상의 CARDF의 발현을 유세포 분석법에 의해 분석한 것을 나타낸 것이다. 공벡터 렌티바이러스로 형질도입된 모의 (Mock)-DC를 대조군으로 사용하였다. 도 2b는 LPS 및 TNF-α에 의해 자극한 후에 Mo-DC, 모의-DC 및 CARDF-DC에서 다양한 DC-특이적 마커들의 발현을 나타낸 것이다. n=3. 도 2c는 모의-DC 또는 CARDF-DC와 3일간 공동 배양한 후에, CellTrace-CFSE 희석에 의해 평가한, CD3+ 1차 T 세포의 증식을 분석한 것을 나타낸 것이다. DC는 48시간 동안 EPHA2+ A549에 미리 노출시켰다. 우측의 히스토그램은 T 세포의 CFSE의 MFI를 나타낸 것이다. n=3. 통계: 일원 분산 분석, 브라운-포사이드 시험 + 터키의 다중 비교 시험. 도 2d는 A549-CP 상의 PD-L1 발현을 유세포 분석법에 의해 분석하였고 CTLA4-Ig를 RT-qPCR에 의해 평가한 것을 나타낸 것이다. n=3. 통계: 독립표본 양측 스튜던트 t 검정. 도 2e는 A549-CP와 48시간 동안 공동 배양하기 전과 후에 모의-DC 및 CARDF-DC에서 활성화 마커의 표면 발현을 나타낸 것이다. n=3. 통계: 독립표본 양측 스튜던트 t 검정. 도 2f는 A549-CP의 존재 하에 모의-DC 또는 CARDF-DC와 4일간 공동 배양한 후에, CellTrace-CFSE 희석에 의해 평가한, CD3+ 1차 T 세포의 증식을 분석한 것을 나타낸 것이다. 우측의 히스토그램은 모든 T 세포들의 CFSE의 MFI를 나타낸 것이다. n=3. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 통계: 독립표본 양측 스튜던트 t 검정. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001.
도 3은 CARDF-DC가 시험관 내에서 A549CP 세포에 대한 CAR-T 세포의 세포독성을 활성시킴을 보여주는 것이다. 도 3a는 CAR-T 세포에서 CAR (scFv: 항-EphA2)의 발현을 나타낸 것이다. 도 3b는 A549 및 A549CP 상의 EphA2 발현을 유세포 분석법에 의해 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 3c는 24시간 동안 모의-DC 또는 CARDF-DC의 존재 하에 A549 및 A549CP 종양 세포에 대한 CAR-T 세포의 세포용해 능력을 나타낸 것이다. n=3. 도 3d는 (C)에서와 같이 A549CP 병태에서 CAR-T 세포에서의 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α 발현에 대한 RT-qPCR 분석을 나타낸 것이다. n=3. 도 3e는 도 3c 배양물의 CD8+ CAR-T 세포에서 IFN-γ+ 세포에 대한 유세포 분석을 나타낸 것이다. 도 3f 및 3g는 IFN-γ (도 3f)의 수준을 ELISA에 의해 평가하였고, LDH (도 3g)를 도 3c의 배양물에서 수집한 상청액에서 CytoTox 96® Assay에 의해 분석하였음을 나타낸 것이다. n=3. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=3. 통계: 일원 분산 분석, 브라운-포사이드 시험 + 터키의 다중 비교 시험. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001, ns는 유의하지 않음을 나타냄.
도 4는 CARDF-DC가 Car-T 세포를 활성화시켜 TIME을 갖는 고형 폐 종양을 제거함을 나타낸 것이다. 도 4a는 NSG 마우스에서 형성된 A549WT 및 A549CP 폐 종양을 CARDF-DC 및 Car-T 세포로 치료하기 위한 실험적 설계를 나타낸 것이다. 도 4b는 RT-qPCR로 평가한 A549WT 및 A549CP 종양에서의 면역 억제 유전자의 발현을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=3. 통계: 독립표본 양측 스튜던트 t 검정. 도 4c는 도 4a에 기술된 처리 후 17일째에 회수된 종양의 사진을 나타낸 것이다. 좌측: A549WT 종양, 우측: A549CP 종양. 도 4d는 (도 4c)에 나타낸 종양의 중량을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=5. 통계: 일원 분산 분석, 브라운-포사이드 시험 + 터키의 다중 비교 시험. 도 4e는 RT-qPCR에 의해 평가한 도 4에 나타난 회수된 A549CP 종양에서의 유전자 발현을 보여주는 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=5. 도 4f는 비장에서 총 T 세포, CD8+ T 세포, 수지상 세포, CD80+ 수지상 세포, CD86+ 수지상 세포의 백분율을 유세포 분석법에 의해 분석한 것을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=5. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001, ns는 유의하지 않음을 나타낸다.
도 5는 CARDF-DC가 Hu-마우스에서 형성된 폐 종양의 CAR-T 세포 매개형 퇴행을 촉진함을 나타낸 것이다. 도 5a는 Hu-마우스에서 형성된 A549 폐 종양을 치료하는 실험적 설계를 나타낸 것이다. 도 5b는 RT-qPCR에 의해 평가한 CAR-T 세포 처리 후 NSG 마우스 및 Hu-마우스의 폐 종양에서의 유전자 발현을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=3. 통계: 독립표본 양측 스튜던트 t 검정. 도 5c는 다양한 치료 후 종양의 부피를 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 통계: 이원 분산 분석 후 터키의 다중 비교 시험. 도 5d 및 5f는 접종 후 16일째에 회수된 종양의 사진 (도 5d)과 종양 중량 (도 5e)을 나타낸 것이다. 치료 과정은 도 5a에 나타내었다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 통계: 일원 분산 분석, 브라운-포사이드 시험 + 터키의 다중 비교 시험. 정상 T: n=4; CAR-T: n=6; 모의-DC: n=6; CARDF-DC: n=6. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001.
도 6은 CARDF-DC가 Hu-마우스에서 형성된 폐 종양의 TIME을 염증유발 상태로 역전시킴을 나타낸 것이다. 도 6a는 비장 CD3+ T 세포에서 IFN-γ+ T 세포의 백분율을 유세포 분석법에 의해 분석한 것을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 정상 T의 경우, n=2; CAR-T, 모의-DC, CARDF-DC의 경우, n=3이다. 도 6b는 비장의 PD-1+ 및 TIM-3+ T 세포를 유세포 분석법에 의해 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 6c는 비장의 수지상 세포에 의해 발현된 CD86 및 MHC-II의 MFI를 유세포 분석법으로 분석한 것을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 정상 T의 경우, n=2; CAR-T, 모의-DC, CARDF-DC의 경우, n=3이다. 도 6d는 해부한 폐 종양에서 TNF-α, IL-2, CD86 및 IL-12B의 발현을 RT-qPCR로 평가한 것을 나타낸 것이다. 정규화는 도면에 나타내었다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 정상 T의 경우, n=2; CAR-T, 모의-DC, CARDF-DC의 경우, n=3이다. 도 6e는 도 6b에 나타낸 바와 같은 비장 CD3+ T 세포에서 PD-1+TIM-3+ T 세포의 백분율을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 정상 T의 경우, n=2; CAR-T, 모의-DC, CARDF-DC의 경우, n=3이다. 도 6f 및 6g는 해부한 폐 종양에서 PD-1, TIM-3, TGF-β (도 6f) 또는 CD206 및 CD163 (도 6g)의 발현을 RT-qPCR로 평가한 것을 나타낸 것이다. 정규화는 도면에 나타내었다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. 정상 T의 경우, n=2; CAR-T, 모의-DC, CARDF-DC의 경우, n=3이다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001.
도 7은 CARDF-DC가 확실한 폐 종양의 TIME에 저항하여 CAR-T 세포를 활성화할 수 있음을 나타낸 것이다. 도 7a는 A549 및 H460 종양 세포주에서의 PD-L1 발현을 유세포 분석법에 의해 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 7b는 Hu-마우스에서 형성된 A549 종양 및 H460 종양에서의 상대적인 유전자 발현을 RT-qPCR로 평가한 것을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=3. 도 7c는 H460 폐 종양 세포 상의 EphA2 발현을 유세포 분석법으로 검출한 것을 나타낸 것이다. 도 7d는 Hu-마우스에서 형성된 H460 종양의 CAR-T 및 DC 병용 요법의 개략적인 설계도를 나타낸 것이다. 도 7e는 종양 함유 Hu-마우스와 동일한 태아 조직으로 생성된 Hu-마우스로부터 유래된 DC 및 T 세포의 표면에서의 CAR (scFv: 항-EphA2) 발현을 나타낸 것이다. 도 7f는 다양한 처리 후 종양의 성장 곡선을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=6. 통계: 이원 분산 분석 후 터키의 다중 비교 시험. 도 7g는 종양에 침투하는 DC 상의 CD80 및 CD86의 MFI를 유세포 분석법으로 분석한 것을 나타낸 것이다. 데이터는 평균값 ± SD로 나타낸다. n=3. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001.
도 8a 및 도 8b는 THP-1 세포로부터 유래된 DC를 활성화하는 CAR의 스크리닝을 나타낸 것이다. 도 8a는 THP-1 세포 표면 상의 CAR (scFv: 항-CD19 및 제2세대 T 세포 활성화 도메인, 또는 TLR4 활성화 도메인, 또는 TNFR2 활성화 도메인)의 발현을 단백질 L에 대한 결합으로 측정한 것을 나타낸 것이다. 도 8b는 H460-CD19 종양 세포와 함께 2일간 공동 배양한 후 DC에서 공동 자극 분자 CD80 및 CD86의 발현을 나타낸 것이다.
도 9a와 도 9b는 항-EphA2 CAR 분자의 개략도를 나타낸 것이다. 도 9a는 DC에 대한 항-EphA2 CAR 작제물 (CARDF)을 함유하는 렌티바이러스 벡터의 도해를 나타낸 것이다. 도 9b는 T 세포에 대한 항-EphA2 CAR 작제물 (제2세대, B)을 함유하는 렌티바이러스 벡터의 도해를 나타낸 것이다.
도 10a는 본 발명에 사용된 항체를 나타낸 것이다.
도 10b는 본 발명에서 사용된 RT-qPCR용 프라이머 서열들을 나타낸 것이다.
본 발명을 더 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 실시형태들에 한정되지 않으며, 이에 따라 당연히 변형될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시형태들만을 설명하기 위한 목적인 것이지, 본 발명의 범위를 한정하려는 것이 아니기 때문에, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이라는 점도 이해해야 한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 과학 기술 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법과 재료들도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법과 재료들을 이제 설명한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물과 특허들은 각 개별 간행물 또는 특허가 인용에 의해 포함되도록 구체적이고도 개별적으로 나타낸 것처럼 본원에 인용에 의해 포함시키고, 해당 간행물이 언급된 것과 관련된 방법 및/또는 재료들을 개시 및 설명하기 위해 인용에 의해 본원에 포함시킨다. 어떤 간행물의 인용한 것은 그 간행물이 출원일 이전에 개시되었기 때문이지, 이로써 본 발명의 개시가 과거의 개시로 인하여 이러한 간행물을 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 간행물의 발행일은 실제 간행일과 다를 수 있기 때문에 독립적으로 확인해야 할 필요가 있을 수 있다.
본 명세서를 읽을 때 당업자에게 명백하듯이, 본원에 설명되어 예시된 개별적인 실시형태들은 각각, 본 발명의 범위와 개념으로부터 벗어남이 없이, 임의의 다른 여러 실시형태들의 특징들로부터 쉽게 분리되거나 이러한 특징들과 조합될 수 있는 뚜렷이 구분되는 구성요소와 특징들을 갖는다. 언급된 임의의 방법은 언급된 사건의 순서대로, 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서대로 수행될 수 있다.
정의
하기의 정의들을 제공하여 독자의 이해를 돕고자 한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 또는 의학 용어 또는 전문용어들은 당업계의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가지는 것으로 한다. 경우에 따라서는, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어들도 명확성 및/또는 즉각적인 참조를 위해 본원에 정의하기도 하는데, 본원에 이러한 정의를 포함시킨다고 해서 그 정의가 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 해당 용어의 정의와 실질적인 차이가 있는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 사용된 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시대상도 포함한다.
본 명세서에서 "~을 포함하다", "~을 포함한", "~을 포함하는", "~을 함유하다", "~을 함유하는" 등과 같은 용어들은 미국 특허법에서 부여되는 의미를 가지며; 이러한 용어들은 포괄적이거나, 또는 제한을 두지 않아서, 인용되지 않은 추가의 요소 또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. "~로 필수적으로 이루어지는" 및 "~로 필수적으로 이루어진다"와 같은 용어들은 미국 특허법에서 부여되는 의미를 가지며; 이러한 용어들은 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 성분 또는 단계들을 포함할 수 있다. "~로 이루어지다" 및 "~로 이루어진"이라는 용어들은 미국 특허법에서 부여되는 의미를 갖는데; 즉, 이러한 용어들은 제한을 두는 폐쇄형이다.
일련의 언급된 수치들이 있는 본 출원의 모든 경우에 있어서, 상기 언급된 수치들 중 임의의 수치는 수치 범위의 상한 또는 하한일 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명은 그러한 모든 수치 범위들, 즉 수치 상한과 수치 하한의 조합을 갖는 범위를 포함하고, 여기서 상한과 하한 각각에 대한 수치는 본원에 언급된 임의의 수치일 수 있음도 이해해야 한다. 본원에 제공된 범위들은 해당 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해한다. 예를 들어, 1-10의 경우, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 모든 값들과 적절한 분수값들도 포함하는 것으로 이해한다. 이와 유사하게, "적어도"로 한정된 범위에는 제시된 낮은 값과 이보다 높은 모든 수를 포함되는 것으로 이해한다.
본원에 사용된 "약"은 평균 표준 편차가 3 이내 또는 특정 분야에서의 표준 허용 오차 범위 이내를 포함하는 것으로 이해한다. 특정 실시형태에서, 약은 0.5 이하의 변동으로 이해한다.
본원에 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체"와 서로 교환하여 사용될 수 있는 용어 "CAR"은 조작된 수용체 또는 합성 수용체 또는 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 조작된 수용체 또는 합성 수용체는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인, 선택적으로 신호 펩타이드를 포함하는 세포외 도메인 (이들은 서로 결합되거나 서로 작동가능하게 연결된)을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 가장 일반적인 CAR은, 예를 들어 CD3-제타 막관통 및 엔도도메인에 융합된 단일클론 항체에서 유래된 단쇄 가변 단편 (scFv)을 들 수 있다. 이러한 CAR은 표적에 대한 scFv의 특이적 결합에 반응하여 제타 신호의 전송을 유도한다. CAR을 제조하는 방법은 공중이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013]; [Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011]; [Haso et al., (2013) Blood, 121, 1165-1174]; [Han et al., J. Hematol Oncol.6:47, 2013]; WO2012/079000; U.S. Pub.2012/0213783; 및 WO2013/059593 (상기 각 문헌들은 전문이 본원에 인용에 의해 포함됨)).
용어 "CAR-T 세포"와 서로 교환하여 사용될 수 있는 용어 "키메라 항원 수용체 T 세포"는 생물학적 방법 (예를 들어, 유전 공학)을 통해 T 세포 표면에서 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포 또는 이의 세포군을 의미한다. CAR-T 세포는 T 헬퍼 CD4+ 및/또는 T 효과기 CD8+ 세포일 수 있다. CAR-T는 표면 항원을 식별하여 면역 반응을 개시할 수 있다.
"항원"은 면역 반응을 촉발하는 분자를 가리킨다. 이 면역 반응은 체액성 반응이거나, 세포 매개성 반응이거나, 또는 양자 모두일 수도 있다. 통상의 기술자라면 누구나 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드들을 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명이 면역 반응을 유발하는 항원으로 작용하는 치료용 항체를 포함한다는 것은 자명하다.
"항체"는 항원과 결합하는 면역글로불린 (Ig) 계열의 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, IgG 유형의 자연 발생 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 사량체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (본원에서는 CL로 약칭함)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 보다 보존된 영역들이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR) (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 CDR, HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 중쇄 CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 본원에 개시된 항체에 대한 CDR 경계는 카바트 (Kabat), IMGT, 초티아 (Chothia) 또는 알-라지카니 (Al-Lazikani)의 관례에 의해 정의 혹은 확인될 수 있다 (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Marie-Paule Lefranc et al, Developmental and Comparative Immunology, 27: 55-77 (2003); Marie-Paule Lefranc et al, Immunome Research, 1(3), (2005); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (second edition), chapter 26, 481-514, (2015)). 각각의 VH 및 VL은 하기의 순서로 아미노-말단에서 카르복실-말단으로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.
본원에 사용된 "항원 결합 도메인"은 하나 이상의 CDR을 포함하는 온전한 항체의 일부로부터 형성된 항체 단편이나, 또는 항원에 결합할 수 있지만 온전한 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 가리킨다. 항원 결합 도메인의 예로는, 제한없이, 이원항체 (diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화 결합으로 안정화 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 이황화 결합으로 안정화된 이원항체 (ds diabody), 단쇄 항체 분자 (scFv), 단쇄 Fv-Fc 항체 (scFv-Fc), scFv 이량체 (2가 이원항체), 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 낙타화된 단일 도메인 항체, 나노항체, 도메인 항체 및 2가 도메인 항체를 포함한다. 항원 결합 도메인은 모체 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다.
"자가유래성 (Autologous)" 세포는 나중에 재도입될, 동일한 대상체에서 유래한 임의의 세포를 가리킨다.
"동종이계성 (Allogeneic)" 세포는 동일한 종의 서로 다른 대상체에서 유래한 임의의 세포들을 지칭한다.
면역 세포와 관련하여 사용되는 "효과기 세포"란 자극에 반응하여 효과기 기능을 수행하도록 활성화될 수 있는 세포를 가리킨다. 효과기 세포로는, 제한없이, NK 세포, 세포독성 T 세포 및 헬퍼 T 세포를 포함할 수 있다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 바람직한 생물학적 결과를 달성하기에 효과적인 본원에 기술된 세포, 조성물, 제제 또는 임의의 물질의 양을 의미한다. 상기 바람직한 생물학적 결과에는, 특정 BCR을 발현하는 B 세포 및 그로부터 생성된 항체의 제거를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 "동일성" 또는 "서열 동일성"의 백분율은 비교 창에서 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정되는데, 이때 상기 비교 창에서 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는 상기 두 서열의 최적 정렬을 위한 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하였을 때 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 상기 일치된 위치의 수를 비교 창의 총 위치 수로 나눈 후, 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
아미노산 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "보존적 치환"은 어떤 아미노산 잔기를 유사한 물리화학적 특성을 갖는 측쇄를 함유하는 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 가리킨다. 예를 들어, 보존적 치환은 소수성 측쇄가 있는 아미노산 잔기 (예: Met, Ala, Val, Leu 및 Ile)에서, 중성의 친수성 측쇄가 있는 잔기 (예: Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln)에서, 산성 측쇄가 있는 잔기 (예: Asp, Glu)에서, 염기성 측쇄가 있는 아미노산 (예: His, Lys 및 Arg)에서, 또는 방향족 측쇄가 있는 잔기 (예: Trp, Tyr 및 Phe)에서 이루어질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 보존적 치환은 일반적으로 단백질 입체형태 구조에 큰 변화를 일으키지 않으므로, 단백질의 생물학적 활성을 유지할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "기능적 형태"란 아미노산 서열 또는 화학 구조의 차이에도 불구하고 여전히 모체 분자의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는 모체 분자의 다른 형태들 (예: 변이체, 단편, 융합체, 유도체 및 모방체)를 가리킨다. 본원에 사용된 표현 "실질적인 생물학적 활성을 유지한다"라는 말은 모체 분자의 생물학적 활성의 적어도 일부 (예를 들어, 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상)를 나타내는 것을 의미한다. 모체 폴리펩타이드의 기능적 형태는 자연 발생적 변이 형태와 재조합 방법 또는 화학적 합성에 의해 얻어지는 것과 같은 비자연 발생적 형태를 모두 포함할 수 있다. 기능적 형태는 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"이란 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 기능적 관계를 의미한다. 본 발명의 CAR의 폴리펩타이드 사슬과 같은 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 내용에서, 상기 용어는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열이 이러한 세그먼트들에 의해 인코딩된 아미노산 서열들이 프레임 내에 유지되도록 연결되는 것을 의미한다. 전사 또는 번역 조절과 관련된 내용에서, 상기 용어는 코딩 서열에 대한 조절 서열의 기능적 관계, 예를 들어 전사를 조절하기 위해 코딩 서열에 대한 정확한 위치 및 배향의 프로모터를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 뉴클레오타이드의 사슬을 지칭한다. 또한, 이들은 (예컨대, 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 결합을 포함하는) 합성 및/또는 비자연 발생적 핵산 분자도 의미한다. 또한, 상기 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드도 지칭한다. 이 용어는 천연 뉴클레오타이드의 유사체를 포함하는 핵산도 망라한다. 또한, 이 용어는 합성 백본을 갖는 핵산 유사 구조도 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 특정 폴리뉴클레오타이드 서열은 명시적으로 나타낸 서열 뿐만 아니라, 이들의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축퇴성 코돈 치환 (degenerate codon substitutions)), 대립 형질, 동원체 (ortholog) 및 상보적 서열들도 암시적으로 망라한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성된다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 서로 교환하여 사용되어 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 또한, 상기 용어들은, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인위적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 자연 발생 아미노산 중합체 및 비자연 발생적 아미노산 중합체에도 적용된다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "scFv"와 서로 교환되어 사용되는 용어 "단쇄 가변 단편"은 서로 직접 연결되거나 펩타이드 링커 서열을 통해 연결된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 이루어진 조작된 항체를 지칭한다 (Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879 (1988)).
본원에서 사용된 용어 "T 세포 수용체" 또는 용어 "TCR 복합체"와 서로 교환하여 사용될 수 있는 용어 "TCR"은 천연 (또는 내인성) TCR 또는 조작된 TCR을 지칭한다. TCR은 항원의 단편들을 MHC 분자에 결합된 펩타이드로 인식하는 역할을 하는 T 세포 표면의 단백질 복합체를 가리킨다.
본원에 사용되는 용어 "벡터"는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 해당 단백질을 발현시키기 위해 작동가능하게 삽입될 수 있는 비히클을 의미한다. 벡터는 숙주 세포 내에서 운반하는 유전자 요소를 발현시키기 위해 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 벡터의 예로는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 P1 유래의 인공 염색체 (PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스 등을 포함한다. 벡터로 사용되는 동물 바이러스의 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 유두종바이러스, 파포바바이러스 (예를 들어, SV40)를 포함한다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선별가능한 요소 및 리포터 유전자를 포함하는, 발현 조절을 위한 다양한 요소들을 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 원점을 포함할 수 있다. 벡터는 바이러스 입자, 리포좀 또는 단백질 코팅을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포로의 진입을 돕는 물질들도 포함할 수 있다. 벡터는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터일 수 있다. 본 발명은 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 본원에 제공된 핵산 서열, 상기 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 프로모터(예를 들어, SV40, CMV, EF-1α), 및 적어도 하나의 선별 마커를 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)를 제공한다. 벡터의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 레트로바이러스 (렌티바이러스 포함), 아데노바이스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예: 단순 헤르페스 바이러스), 폭스바이러스, 바쿨로바이러스, 유두종바이러스, 파포바바이러스 (예: SV40), 람다 파지, 및 M13 파지, 플라스미드 pcDNA3.3, pMD18-T, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos 등을 포함한다.
본원에 사용되는 "숙주 세포"라는 말은 외인성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터가 도입된 세포를 의미한다.
"약제학적으로 허용가능한"이라는 용어는 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들) 및/또는 염이 일반적으로 해당 제제를 구성하는 다른 성분들과 화학적 및/또는 물리적으로 상용성이며, 이의 수용자와 생리학적으로 상용성임을 나타내는 말이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자"는 질병 또는 질환의 진단, 예후, 개선, 예방 및/또는 치료가 필요한, 인간 또는 포유동물 또는 영장류를 포함하는 인간이 아닌 동물을 지칭한다. 포유동물 대상체에는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원 동물, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 돼지, 소, 곰 등이 포함된다.
본원에 사용되는 질환을 "치료하는" 또는 질환의 "치료"라는 용어는 해당 질환을 예방 또는 완화시키는 것, 해당 질환의 발병 또는 발달 속도를 늦추는 것, 해당 질환이 발병할 위험을 감소시키는 것, 해당 질환과 관련된 증상의 발달을 저지하거나 지연시키는 것, 해당 질환과 관련된 증상의 감소 또는 종료, 해당 질환의 완전하거나 부분적인 퇴행 유도, 해당 질환의 치료, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
수지상 세포 (DC) 활성화 키메라 항원 수용체 (CAR)
본 발명은 면역 억제성 종양 미세환경 또는 종양 면역 억제성 미세환경 (TIME)에서 수지상 세포 (DC)를 활성화시킬 수 있는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 또는 RNA)를 제공한다. 용어 "면역 억제성 종양 미세환경" 및 용어 "TIME"은 서로 교환하여 사용될 수 있고, 이는 예를 들어 종양 세포, 종양 침윤성 면역 세포, 종양 관련 섬유아세포, 내피 세포, 및 조밀한 세포외 매트릭스와 함께 종양 면역 감시와 면역요법을 억제할 수 있는, 다양한 화학주성 및 염증성 또는 면역 자극성 사이토카인을 갖는 미세환경을 가리킨다 (문헌 [F. R. Balkwill et al., The tumor microenvironment at a glance. J. Cell Sci. 125, 5591-5596 (2012); M. Binnewies et al., Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med. 24, 541-550 (2018)]; [M. A.-M. Alireza Labani-Motlagh et al., The Tumor Microenvironment: A Milieu Hindering and Obstructing Antitumor Immune Responses. Front. Immunol. 11, 940 (2020)] 및 [L. Hui et al., Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil. Cancer Lett. 368, 7-13 (2015)]).
특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경 또는 TIME은 고형 종양 및/또는 면역 억제성 분자를 발현하는 종양 침윤성 면역 세포를 포함한다. 면역 억제성 분자는 PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), HLA 클래스 I, 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 CTLA-4 및/또는 PD-L1이다. 본원에서, 면역 억제성 분자와 관련하여 사용된 "~을 발현하는" 또는 "~을 발현하다"라는 말은, 면역 억제성 분자를 기준 수준보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 60배, 적어도 80배, 적어도 100배, 적어도 120배, 적어도 150배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배 또는 적어도 1000배 더 높은 수준으로 발현하는 것을 의미한다. 면역 억제성 분자의 발현과 관련하여 용어 "기준 수준"이라는 것은, 면역 결핍 동물 모델 (예: NSG 마우스)에서 야생형 종양 세포 (예를 들어, 야생형 A549 세포)에 의해 형성된 종양에서의 면역 억제성 분자의 발현 수준을 의미한다.
"CTLA-4"는 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4의 약자로 CD152로도 알려져 있으며, 이에 대한 보다 자세한 설명은, 예를 들어 문헌 [Kolar et al., (January 1, 2009) CTLA-4 (CD152) controls homeostasis and suppressive capacity of regulatory T cells in mice. Arthritis Rheum. 60 (1): 123-32]에서 찾아볼 수 있다. "PD-L1"은 예정된 세포사-리간드 1의 약자로 분화 클러스터 274 (CD274) 또는 B7 동족체 1 (B7-H1)로도 알려져 있으며, 이에 대한 보다 자세한 설명은, 예를 들어 문헌 [Dong H et al., B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nature Medicine. 5 (12): 1365-9, 1999]에서 찾아볼 수 있다.
CTLA-4와 PD-L1은 T 세포 활성을 억제하여 말초 내성을 유지하는데 있어서 중요한 면역 억제성 분자이다. CTLA-4는 T 세포 활성화를 위한 주요 공동 자극 경로인 CD28보다 더 높은 친화도로 CD80과 CD86에 결합한다. PD-L1은 T 세포 표면에서 발현되는 PD-1과 결합하여 T 세포 활성을 억제한다. PD-L1은 T 세포 무반응을 유지하고 자가면역을 예방하는데 중심적인 역할을 한다 (문헌 [Walker LSK et al., The enemy within: keeping self-reactive T cells at bay in the periphery. Nat Rev Immunol. 2002; 2:11-19.]; [Fife BT et al., Control of peripheral T-cell tolerance and autoimmunity via the CTLA-4 and PD-1 pathways. Immunological Reviews. 2008; 224:166-182.]; 및 [Keir ME et al., PD-1 and Its Ligands in Tolerance and Immunity. Annual Review of Immunology. 2008; 26:677-704].)
특정 실시형태에서, TIME 내의 종양은 CTLA-4-면역글로불린 융합 단백질 (CTLA4-Ig) 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함한다. CTLA4-Ig는 T 세포 매개성 면역 반응을 억제하기 위해 개발되었다 (Walker LSK et al., The enemy within: keeping self-reactive T cells at bay in the periphery. Nat Rev Immunol. 2002; 2:11-19.) 본원에서, CTLA4-Ig와 관련하여 사용된 "~을 발현하는" 또는 "~을 발현하다"라는 말은, CTLA4-Ig를 기준 수준보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 60배, 적어도 80배, 적어도 100배, 적어도 120배, 적어도 150배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배 또는 적어도 1000배 더 높은 수준으로 발현하는 것을 의미한다. CTLA4-Ig의 발현과 관련하여 용어 "기준 수준"은 야생형 종양 세포(예를 들어, 야생형 A549 세포)에서의 CTLA4-Ig의 발현 수준을 의미한다. 본원에서, PD-L1과 관련하여 사용된 "~을 발현하는" 또는 "~을 발현하다"라는 말은, PD-L1을 기준 수준보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 30배, 적어도 35배, 적어도 40배, 적어도 60배, 적어도 80배, 적어도 100배, 적어도 120배, 적어도 150배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배 또는 적어도 1000배 더 높은 수준으로 발현하는 것을 의미한다. PD-L1의 발현과 관련하여 용어 "기준 수준"은 야생형 종양 세포(예를 들어, 야생형 A549 세포)에서의 PD-L1의 발현 수준을 의미한다.
특정 실시형태에서, CTLA-4-Ig는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 8의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다. 특정 실시형태에서, PD-L1은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은 입양 세포 요법의 단일요법 (예를 들어, CAR-T 단일요법)에 대해 반응성이 좋지 않은 종양을 포함한다. 본원 및 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "좋지 않은 반응성"이란, 치료적 효과가 없는 것으로 알려진 대조군 치료와 비교하였을 때, 치료 (예: CAR-T 치료)의 유사한 (예를 들어, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만 또는 2% 미만의 더 나은 치료 효과, 바람직하게는 10% 미만 더 나은 치료 효과) 치료 효과로 감지될 수 있는, 반응성의 부재 혹은 감소를 의미한다.
수지상 세포는 미감작 T 세포를 시동하여 기억 반응을 재활성화할 수 있는 특화된 항원 제시 세포이다. 암에서, 수지상 세포는 종양 관련 항원 (TAA) 또는 신생항원의 교차 제시를 통해 T 세포 (예: 세포독성 CD8+ T 세포)를 활성화하여 더 강력한 항종양 반응을 유도할 수 있다. DC의 활성화는 제한없이 하기를 포함하는 다양한 매개변수들을 측정함으로써 분석할 수 있다: DC의 활성화 상태 및/또는 면역 세포 (예: T 세포, 마이크로파지)의 활성화 상태 (DC 활성화 마커 (예: CD80, CD86 및 MHC-II, CD83, CD54, CMRF-44, CMRF-56, III형 INF, IL-12, CXCL9/10, IRF8)의 발현 수준으로 나타낼 수 있음), 면역 세포 (예: T 세포)의 생존 및/또는 세포독성, 면역 세포 (예: T 세포)의 면역 자극성 사이토카인 (예: TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-16, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자)의 발현 (및/또는 분비), 면역 세포 (예: T 세포)의 면역 억제성 분자 (예: PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, KIR, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329))의 발현 수준, 및/또는 항염증성 대식세포 (예: M2 대식세포), 예컨대 CD206 및 CD163에 대한 마커의 발현 수준.
특정 실시형태에서, 수지상 세포의 활성화는 DC 활성화 마커 (예컨대 CD80, CD86 및/또는 MHC-II, CD83, CD54, CMRF-44, CMRF-56, III형 INF, IL-12, CXCL9/10, IRF8)의 발현 수준 증가, 면역 세포 (예: T 세포 (예컨대, CD8+ T 세포), DC)의 생존 증가, 면역 세포 (예: T 세포)의 면역 자극성 사이토카인 (예: TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 및/또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자)의 발현 (및/또는 분비) 증가, 면역 세포 (예: T 세포)의 면역 억제성 분자 (예: PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, KIR, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329))의 발현 감소, 및/또는 수지상 세포의 기준 상태 (예: 비활성화 상태)와 비교하였을 때 항염증성 대식세포 (예: M2 대식세포)에 대한 마커 (예: CD206 및 CD163)의 발현 수준 감소를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 DC 활성화 CAR은 다음을 포함한다: (1) 세포외 항원 결합 도메인, (2) 막관통 도메인 및 (3) 세포내 신호전달 도메인.
(1) 세포외 항원 결합 도메인
일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 인간 또는 인간화 항체 또는 이의 항체 단편을 포함한다. "인간 항체"라는 용어는, 전체 분자가 인간 기원이거나 또는 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 항체를 지칭한다. 용어 "인간화 항체"는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열 (예를 들어, CDR 서열)을 포함하는 항체를 가리킨다. 인간 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편은 다양한 방식으로, 예를 들어 재조합 방법을 통해 또는 인간 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 유전자로부터 유도된 항체를 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스의 관심대상 항원을 사용한 면역화를 통해서 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 제공된 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 단쇄 가변 단편 (scFv), Fv, Fab, (Fab)2, scFv, 나노항체, 비공유 또는 공유 결합된 리간드/수용체 도메인, 또는 항원 결합 도메인으로 기능하는 당업계에 공지된 임의의 대안적인 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 CAR의 세포외 항원 결합 도메인은 scFv이다. scFv는 종양 표면 마커, 예를 들어 고형 종양 표면 마커에 특이적일 수 있다. 특정 실시형태에서, 종양 표면 마커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: EphA2, CD19, CD70, CD117, CD133, CD147, CD171, DLL3, EGFRvIII, VGFR2, 메소텔린, 강글리오사이드 GD2, FAP (섬유아세포 활성화 단백질), FBP (엽산 결합 단백질), LMP1, Lewis Y, Claudin 18.2, IL13Rα2, HER2, MDC1, PMSA (전립선막 특이적 항원), ROR1, ROR2, B7-H3, CAIX, CD133, CD171, CEA, GPC3, MUC1, MUC16, MAGE-A1, MAGE-A4, TROP2, EpCAM, NKG2D, 중요한 정상 조직보다 종양 세포 표면에서 더 많이 농화된 것으로 밝혀진 기타 단백질들, 및 이들의 조합. 세포외 항원 결합 도메인은 TIME을 염증 유발성 상태로 전환함으로써 이익을 얻을 수 있는 질병에 대한 비종양 마커, 예를 들어 감염성 질병에 대한 마커에도 특이적일 수 있다.
일부 실시형태에서, scFv는 EphA2에 특이적이다. 특정 실시형태에서, scFv는 그의 VL 및 VH 영역 사이에 적어도 0, 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 아미노산 잔기로 된 펩타이드 링커를 포함한다. 링커 서열은 임의의 자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 링커는 서열번호 57 (GGGGSGGGGSGGGGS)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, scFv는 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, VH는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 10의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1); 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 11의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는 CDR2; 및 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 12의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는 CDR3를 포함한다. 일부 실시형태에서, VL은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 13의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는 중쇄 CDR1 (LCDR1); 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 14의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는 CDR2; 및 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 15의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는 CDR3를 포함한다.
특정 실시형태에서, scFv는 1) 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 11에 제시된 서열을 포함하는 HCDR2, 서열번호 12에 제시된 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 VH; 및 2) 서열번호 13에 제시된 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 14에 제시된 서열을 포함하는 LCDR2, 서열번호 15에 제시된 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, scFv는 VH 및 VL을 포함한다. 특정 실시형태에서, VH는 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다. 특정 실시형태에서, VL은 서열번호 17에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, scFv는 서열번호 16에 제시된 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 17에 제시된 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, scFv는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 EphA2-특이적 scFv를 발현하는 CAR-DC가 면역 억제 환경에서 폐 종양 부피를 크게 감소시킬 수 있음을 성공적으로 검증하였다. 그러나, 본원에 제공된 CAR-DC가 폐암 치료에만 사용될 수 있다는 것으로 이해되어서는 안된다. 당업자라면 누구나, 암, 전염병 또는 면역 질환과 같은 다양한 질병에 대해 확인된 마커들에 대한 기존의 지식을 고려하여, 관심대상 질병에 따라서 임의의 질병 마커에 특이적인 적절한 세포외 항원 결합 도메인을 본원에 제공된 CAR을 작제하는데 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 다양한 질병 마커들로는 상술한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
(2) 막관통 도메인
본원에 기술된 CAR의 막관통 도메인은, 이에 제한되지는 않지만, BAFFR, BLAME (SLAMF8), CD2, CD3 엡실론, CD4, CD5, CD8, CD9, CD11a (CD18, ITGAL, LFA-l), CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD19, CD22, CD27, CD28, CD29, CD33, CD37, CD40, CD45, CD49a, CD49d, CD49f, CD64, CD80, CD84, CD86, CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103, CD134, CD137 (4-1BB), CD150 (IPO-3, SLAMF1, SLAM), CD154, CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (Ly9), CD244 (2B4, SLAMF4), CD278 (ICOS), CEACAM1, CRT AM, GITR, HYEM (LIGHTR), IA4, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Rα, ITGA1, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIR, LTBR, OX40, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), PAG/Cbp, PSGL1, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAMF7, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, TNFR2, VLA1 및 VLA-6을 포함하는 임의의 막결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다.
한 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR은 CD8 알파의 막관통 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD8 알파의 막관통 도메인은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR의 막관통 도메인은, 예를 들어 주로 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함하는 합성 도메인이다. 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 CAR의 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막단백질의 막관통 도메인에 대한 결합을 피하도록 변형되거나 설계된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR은 CAR의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에 연결을 형성하는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 힌지 및/또는 막관통 도메인은 CAR의 세포외 항원 결합 도메인의 세포 표면 제시를 제공한다.
힌지 영역은, 이에 제한되지는 않지만, BAFFR, BLAME (SLAMF8), CD2, CD3 엡실론, CD4, CD5, CD8, CD9, CD11a (CD18, ITGAL, LFA-l), CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD19, CD22, CD27, CD28, CD29, CD33, CD37, CD40, CD45, CD49a, CD49d, CD49f, CD64, CD80, CD84, CD86, CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103, CD134, CD137 (4-1BB), CD150 (IPO-3, SLAMF1, SLAM), CD154, CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (Ly9), CD244 (2B4, SLAMF4), CD278 (ICOS), CEACAM1, CRT AM, GITR, HYEM (LIGHTR), IA4, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7Rα, ITGA1, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIR, LTBR, OX40, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), PAG/Cbp, PSGL1, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAMF7, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, TNFR2, VLA1 및 VLA-6을 포함하는 임의의 막결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 영역은 CD8 알파의 힌지 영역, 인간 면역글로불린 (Ig)의 힌지 영역, 또는 글리신-세린 풍부 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 CD8 알파의 힌지 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 힌지 영역은 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는다.
(3) 세포내 신호전달 도메인
본원에 기재된 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 배치된 면역 세포 (예를 들어, 수지상 세포)의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 면역 세포와 관련하여 사용되는 용어 "효과기 기능"이란 세포의 특화된 기능, 예를 들어 식세포 활성, 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 면역 억제성 종양 미세환경에서 수지상 세포를 활성화 (성숙 포함)할 수 있다. DC의 활성화는 다양한 자극들에 반응하는 많은 세포 표면 수용체, 예컨대 TLR4 (A. Iwasaki et al., Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004)), TNFR (L. M. Sedger et al., From mediators of cell death and inflammation to therapeutic giants - past, present and future. Cytokine Growth Factor Rev. 25, 453-472 (2014)), IFNγR (M. Z. Jianping Pan et al., Interferon-γ is an autocrine mediator for dendritic cell maturation. Immunol. Lett. 94, 141-151 (2004)), Dectin-1 (T. S. Helen S. et al., Differential utilization of CARD9 by Dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009)) 및 FcγR (M. Guilliams et al., The function of Fcγ receptors in dendritic cells and macrophages. Nat. Rev. Immunol. 14 , 94-108 (2014)., T. H. Flinsenberg, Fc receptor antigen targeting potentiates cross-presentation by human blood and lymphoid tissue BDCA-3 dendritic cells. Blood 120 , 26 (2012))에 의해 유도될 수 있다. 이러한 DC 활성화 수용체들은 자신의 세포질 도메인에 하나 이상의 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프 (ITAM)를 가지고 있어, 이로써 활성화 신호 캐스케이드를 촉발시켜 DC를 활성화한다. 본원에서 사용되는 용어 "세포질 도메인"이란 세포질 내부에 존재하는 단백질의 전장 도메인, 또는 이의 임의의 단편, 예를 들어, 길이가 전장 도메인의 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%인 단편을 의미한다.
본원에 기재된 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 RIG-1, NLRP10, DEC-205, BDCA-2, CD86, 4-1BBL, OX40L, CD40, IFNAR, TLR4, TNFR (예를 들어, TNFR2), IFNγR, Dectin-1 및 FcγR, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지상 세포 활성화 수용체의 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR의 세포내 신호전달 Dectin-1의 세포질 도메인 및 FcγR의 세포질 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, Dectin-1의 세포질 도메인과 FcγR의 세포질 도메인은 일렬로 연결된다. 특정 실시형태에서, Dectin-1의 세포질 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 FcγR의 세포질 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 업스트림 위치에 있다. 특정 실시형태에서, Dectin-1의 세포질 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 FcγR의 세포질 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 다운스트림 위치에 있다.
Dectin-1의 세포질 도메인은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, Dectin-1의 세포질 도메인은 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다. 특정 실시형태에서, Dectin-1의 세포질 도메인은 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
FcγR의 세포질 도메인은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, FcγR의 세포질 도메인은 서열번호 59 및/또는 서열번호 60에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, FcγR의 세포질 도메인은 서열번호 59 및/또는 서열번호 60에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 기술된 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 기술된 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 4에 제시된 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
(4) 공동 자극 신호전달 도메인
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동 자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 공동자극 신호전달 도메인은 공동 자극 분자의 세포내 도메인으로부터 유래한다.
공동 자극 분자의 예로는 B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), CD2, CD4, CD8 알파, CD8 베타, CD7, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD 18, CD 19,CD27, CD28, CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD83, CD84, CD96 (Tactile), CD100 (SEMA4D), CD103, CD 127, CD137(4-1BB), CD150 (SLAM, SLAMF1, IPO-3), CD160 (BY55), CD162 (SELPLG), CD226 (DNAM1), CD229 (Ly9), CD244 (SLAMF4, 2B4), CEACAM1, CRTAM, CDS, OX40, PD-l, ICOS, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, LAT, LFA-1, LIGHT, LTBR, NKG2C, NKG2D, NKp44, NKp30, NKp46, NKp80 (KLRF1), PAG/Cbp, PSGL1, SLAMF6 (NTB- A, Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNFR2, TRANCE/RANKL, VLA1, VLA-6, 이들의 임의의 유도체, 변이체 또는 단편, 동일한 기능적 능력을 갖는 공동 자극 분자의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 CAR의 공동 자극 신호전달 도메인은 공동 자극 분자인 CD137 (4-1BB), CD28, OX40 또는 ICOS의 세포내 도메인을 포함한다.
기타 영역
일부 실시형태에서, CAR은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 CD8 알파의 신호 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD8 알파의 신호 펩타이드는 서열번호 5의 서열, 또는 이의 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 이와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 이의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 보존적 치환을 갖는 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 갖는다.
인간 고형 종양은 복잡하고도 이질적인 TIME을 발달시켜 면역치료를 회피한다. 기존의 면역치료 (예: CAR-T 세포 요법)은 고형 종양에 효과적이지 않다. 종양 침윤성 면역 억제 DC는 TIME에 상당히 기여한다. 상술한 바와 같은 DC 활성화 CAR은 TIME을 방해하고, TIME을 염증성 상태로 전환하며, 조작된 면역 세포 (예: CAR-T 세포)의 세포독성과 생존을 강화하고, TIME을 갖는 고형 종양을 제거하는 조작된 면역 세포 (예: CAR-T 세포)의 효능을 크게 증진시킬 수 있다.
벡터
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다. CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 서로 다른 유형의 벡터들, 예를 들어 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터, 코스미드, 전이성 유전자, 부위 지정 삽입 벡터 (예를 들어, CRISPR, 아연 핑커 뉴클레아제, TALEN), 시험관 내 전사된 RNA 또는 자살 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 DNA 또는 RNA이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 DNA 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 바이러스)이다. 발현 DNA 벡터가 세포로 일시적으로 도입되는 경우, CAR의 mRNA는 숙주 세포에서 전사될 것이다. DNA 벡터와 mRNA는 세포 분열로 희석되기 때문에, CAR의 발현은 영구적이지 않다. 한 실시형태에서, DNA 벡터는 CAR의 일시적 발현 형태로서 세포에 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 (AAV), 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스에서 유래될 수 있다. 유용한 바이러스 벡터는 일반적으로 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 원점, 프로모터, 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선별 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 숙주 세포, 예를 들어 숙주 T 세포에서 CAR의 안정한 발현을 유도하는 비증식성 세포의 게놈으로 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 장기간의 안정하게 통합시키는데 특히 유용하다. 일부 실시형태에서, 벡터는 Addgene의 lenti-Cas9 벡터이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 RNA (예를 들어, mRNA)이다. RNA는 세포 분열로 희석되기 때문에, RNA의 발현은 영구적이지 않다. 한 실시형태에서, 시험관내 전사된 RNA CAR은 일시적 발현의 형태로서 세포에 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터는 전이성 유전자 기반의 발현 벡터이다. 전이성 유전자는 게놈 내에서 그 위치를 변경할 수 있는 DNA 서열이다. 전이성 유전자 시스템에서, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 전이성 유전자의 이동을 매개하는 유전자 전이 효소에 의해 인식될 수 있는 말단 반복 서열에 측접 (flanked) 된다. 유전자 전이 효소는 CAR과 동일한 벡터에 인코딩되거나, 또는 별도의 벡터에 인코딩되는 단백질로서 함께 전달될 수 있다. 전이성 유전자 시스템의 비제한적인 예로는 잠자는 숲속의 미녀 (Sleeping Beauty), Piggybac, 개구리 왕자 (Frog Prince) 및 백마탄 왕자 (Prince Charming)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 CAR의 발현을 위한 벡터에서 적어도 하나의 조절 폴리뉴클레오타이드 요소에 작동가능하게 연결된다. 일반적인 벡터는 다양한 조절 폴리뉴클레오타이드 요소들, 예를 들어 삽입된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 요소 (예: 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터), 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 요소 (예: 복제 원점), 및 벡터의 숙주 게놈으로의 통합을 조절하는 요소 (예를 들어, 전이성 유전자의 말단 반복 서열)을 포함한다. CAR의 발현은 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 프로모터에 작동가능하게 연결하고 해당 작제물을 벡터에 도입함으로써 달성될 수 있다. 항시성 프로모터 (예: CMV 프로모터, SV40 프로모터 및 MMTV 프로모터) 또는 유도성 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터 및 프로게스테론 프로모터)가 모두 본 발명에서 고려된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이고, 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소 (cis-acting elements)를 포함하며; 다른 발현 요소들은 숙주 세포에 의해 또는 시험관 내 발현 시스템에서 공급될 수 있다.
CAR의 발현을 평가하기 위해, 벡터는 해당 벡터가 도입되는 세포의 식별과 선택을 위한 선별가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 양자 모두를 포함할 수도 있다. 유용한 선별 마커로는, 예를 들어 neo 등과 같은 항생제 내성 유전자를 포함한다. 유용한 리포터로는, 예를 들어 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비형 알칼리 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함한다.
안정성 및/또는 번역 효율성을 촉진하는 능력이 있는 화학 구조체들도 RNA에 사용될 수 있다. 형질감염에 사용하기 위한 RNA 생성 방법은, 특별히 설계된 프라이머를 사용한 주형의 시험관내 전사 (IVT) 후 polyA 부가를 수반하여, 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 발현시킬 핵산, 및 일반적으로 50-2000개의 염기 길이인 polyA 꼬리를 함유하는 작제물을 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 RNA는 다양한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다.
RNA는, 여러가지 임의 다수의 방법들, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 전기천공 또는 Gene Pulser II (BioRad, 콜로라도주 덴버 소재), Multiporator (Eppendort, 독일 함부르크 소재), 리포펙션을 이용한 양이온성 리포좀 매개형 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩타이드 매개형 형질감염, 또는 바이올리스틱 (biolistic) 입자 전달 시스템, 예컨대 "유전자 총"을 포함하지만 이에 제한되지 않는 가용 방법을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다.
벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 물리적, 화학적 또는 생물학적 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 물리적 방법들로는 인산칼슘 침전법, 리포펙션, 유전자 총법 (particle bombardment), 미세주입법, 전기천공법 등을 포함한다. 생물학적 방법으로는 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 유전자를 삽입하기 위한 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 화학적 방법으로는 고분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드성 분산 시스템, 및 수중유형 에멀젼, 미셀, 혼합형 미셀 및 리포좀을 비롯한 지질 기반 시스템을 포함한다.
세포
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 CAR을 포함하거나 발현하는 조작된 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 조작된 세포는 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 CAR 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함한다. 본원에서 제공된 조작된 세포는 하나 이상 (예를 들어, 1, 2, 3개, 또는 그 이상)의 CAR을 포함하거나 발현할 수 있다. 하나 이상의 CAR은 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조작된 세포는 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포이다. 본원에서 사용되는 용어 "수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포"는 천연 또는 변형된 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포를 의미한다.
세포의 공급원
본원에서 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)는 대상체, 예를 들어 인간 대상체로부터 분리한 면역 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 관심대상 대상체, 예컨대 특정 질병 또는 질환이 있는 것으로 의심되는 대상체, 특정 질병 또는 질환에 대한 소인이 있는 것으로 의심되는 대상체, 특정 질병 또는 질환에 대한 치료를 받을 것이거나, 해당 치료를 받고 있거나, 또는 해당 치료를 받은 적이 있는 대상체, 건강한 지원자 또는 건강한 기증자인 대상체로부터 얻을 수 있거나, 또는 혈액 은행으로부터도 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 CAR-T 요법과 같은 면역치료에 대한 반응성이 좋지 않은 암 대상체로부터 얻는다.
해당 세포는 관심 대상체에 대하여 자가유래성 또는 동종이계성일 수 있다. 동종이계성 기증자 세포는 인간-백혈구-항원 (HLA)에 적합하지 않을 수 있으므로, 동종이계성 세포를 처리해서 면역원성을 감소시킬 수 있다.
면역 세포는 혈액, 제대혈, 비장, 흉선, 림프절, 흉막 삼출액, 비장 조직, 종양 및 골수를 포함하나 이에 제한되지 않는 대상체 내에 존재하는 임의의 위치로부터 수집할 수 있다. 분리된 면역 세포들은 직접 사용하거나, 또는 예컨대 냉동에 의해 일정 기간 동안 보관할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 세포는 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포를 조작하여 얻는다. 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포는 당업자에게 공지된 임의의 다수의 기술, 예컨대 성분채집술을 사용하여 대상체로부터 수집된한 혈액으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포는 말초 혈액 세포 (예를 들어, 단핵구와 같은 말초 혈액 단핵 세포), 골수 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래된다.
수지상 세포의 존재는 앞서 설명한 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는, 면역 화학, 면역표현형 분석, 유세포 분석법, Elispot 분석, 고전적인 사량체 염색 및 세포내 사이토카인 염색과 같은 기술을 사용하여 검출될 수 있는, CD11c, CD80, CD86, MHC/HLA 분자 및/또는 CCR7 분자의 발현을 측정하여 확인할 수 있다.
CAR-DC의 제조 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 CAR을 발현하는 조작된 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 당업계에 공지된 CAR-T 세포를 제조하는 수많은 방법들도 CAR-DC에 적용될 수 있다. CAR-T 세포를 제조하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Zhang et al., Engineering CAR-T cells, Biomarker Research (2017) 5:22]에 설명되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 폴리뉴클레오타이드의 발현에 적절한 조건 하에 본원에 제공된 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 출발 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 본원에 제공되는 방법은 출발 세포 (즉, 공급원의 세포)를 얻는 단계, 상기 출발 세포를 배양 (증식, 선택적으로 성숙 포함)하는 단계, 및 상기 세포들을 유전적으로 변형시키는 단계로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 출발 세포는 상술한 바와 같은 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포일 수 있다.
DC 또는 이의 전구체 또는 전구 세포를 유전적으로 변형시키는 단계는 실질적으로 동종인 DC의 개체군을 본원에 제공된 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 형질도입함으로써 달성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드를 DC에 도입한다. 예를 들어, 본원에 제공되는 폴리뉴클레오타이드는 렌티바이러스 벡터로 클로닝될 수 있고, 발현은 그의 내인성 프로모터로부터, 렌티바이러스의 긴 말단 반복부로부터, 또는 관심대상 표적 세포 유형에 특이적인 프로모터로부터 유도될 수 있다. 바이러스 벡터를 전달하기 위한 통상적인 전달 방법에는, 이에 제한되지는 않지만, 전기천공법, 미세주사법, 유전자총 및 마그네토펙션 (magnetofection)이 포함된다. 본원에 개시된 CAR의 배치는 임의의 내인성 유전자 자리에 행해질 수 있다.
비-바이러스 접근법도 DC 또는 이의 전구체 또는 전구 세포의 유전적 변형을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 리포펙션의 존재 하에 핵산을 투여함으로써 (Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989)), 시알로로소뮤코이드폴리라이신 접합에 의해 (Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989)), 또는 외과적 조건 하에서 미세주입에 의해 (Wolff et al., Science 247:1465, 1990)) DC 또는 이의 전구체 또는 전구 세포로 도입될 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 방법으로는 인산칼슘, DEAE 덱스트란, 전기천공법 및 원형질체 융합을 사용한 시험관내 형질감염을 포함한다. 리포좀도 DNA를 세포에 전달하는데 잠재적으로 유익할 수 있다. 대상체의 질환이 있는 조직에 정상 유전자를 이식하는 작업은, 정상 핵산을 생체 외에서 배양가능한 세포 유형 (예: 자가유래성 또는 이종성 1차 세포 또는 이의 자손)으로 전달하여 달성될 수 있으며, 그 후에 해당 세포 (또는 그의 후손)를 표적 조직에 주사하거나 전신 주사한다. 재조합 수용체는 유전자 전이 효소 또는 표적화 뉴클레아제 (예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 TALE 뉴클레아제, CRISPR)를 사용하여 유도되거나 얻어질 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 조작된 세포는, 투여 전에 본원에 제공된 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 DC로 형질감염시킴으로써 제조된다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 조작된 세포는, 예를 들어 바이러스 벡터를 통해, 본원에 제공된 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 DC의 전구체 또는 전구 세포를 형질감염시킨 후 상기 형질감염된 세포를 DC로 분화시킴으로써 제조될 수 있다. 본원에 제공되는 조작된 세포는 세포 표면에서 CAR의 개선된 발현을 나타낸다. DC의 전구체 또는 전구 세포는 말초 혈액 세포 (예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포, 예컨대 단핵구, 예를 들어 THP-1 세포, 말초 단핵구), 골수 세포로부터 유래할 수 있다. DC의 전구체 또는 전구 세포는 배아 줄기 세포 또는 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)일 수도 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 방법에 의해 생체 외에서 제조된 세포의 군도 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포군의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%는 본원에 제공된 검출가능한 수준의 CAR 폴리펩타이드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 세포군의 적어도 85%는 본원에 제공된 검출가능한 수준의 CAR 폴리펩타이드를 발현한다.
DC 활성화 CAR의 선별 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 DC를 활성화할 수 있는 CAR을 선별하는 방법도 제공한다. 본원에 제공된 방법은 면역 억제성 종양 미세환경을 포함하는 인간이 아닌 동물을 제공하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은 임상적으로 적절하다. 본원에 사용된, 면역 억제성 종양 미세환경 또는 TIME과 관련하여 "임상적으로 적절한"이라는 용어는 하기 특징들 중 하나 이상을 특징으로 하는 면역 억제성 종양 미세환경을 지칭한다: 1) 저산소성 및 산성, 2) 음성 면역 조절 세포, 예컨대 조절 T 세포, 면역 억제성 DC 세포, 종양 관련 대식세포 및 종양 관련 섬유아세포가 풍부함, 3) 면역 억제성 분자, 예컨대 PD-1, TIM3, TIGIT, LAG3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), HLA 클래스 I, 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47의 과발현; 및 4) 종양 침윤성 면역 세포 (예를 들어, 면역 효과기 세포)의 활성을 억제할 수 있음.
특정 실시형태에서, 인간이 아닌 동물 (예를 들어, 마우스) 모델은 인간 태아 흉선 및 자가유래성의 인간 조혈 줄기 세포 (예를 들어, 자가유래성의 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포, 예를 들어 자가유래성의 인간 태아 간 CD34+ 조혈 줄기 세포)를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "자가유래성"은 인간 조혈 줄기 세포와 인간 태아 흉선이 동일한 태아 공급원으로부터 생성된 것을 지칭할 수 있다. 특정 실시형태에서, 인간이 아닌 동물 (예를 들어, 마우스) 모델에 약 1×105 내지 약 5×105 개의 자가유래성의 인간 조혈 줄기 세포 (예를 들어, 자가유래성의 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포, 예를 들어 자가유래성의 인간 태아 간 CD34+ 조혈 줄기 세포)를 주사한다. 특정 실시형태에서, 인간이 아닌 동물 (예를 들어, 마우스) 모델은 T 세포 (예를 들어, CD3+ T 세포), B 세포 (예를 들어, CD19+ B 세포) 및 선택적으로 수지상 세포 (DC)와 같은 인간 림프조혈 세포를 포함하는 지속적인 인간 면역 시스템을 포함하여, 이로써 인간 흉선 환경 내에서 자가유래성의 인간 백혈구 항원 (HLA)의 존재 하에 정상적인 인간 T 세포 성숙이 가능하다. 특정 실시형태에서, 인간이 아닌 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
특정 실시형태에서, 인간이 아닌 동물은 면역 억제성 미세환경, 예를 들어 면역 억제성 종양 미세환경을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은 종양 및/또는 면역 억제성 분자를 발현하는 종양 침윤성 면역 세포를 포함한다. 면역 억제성 분자는 PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), HLA 클래스 I, 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 CTLA-4 및/또는 PD-L1이다. 특정 실시형태에서, 종양은 CTLA4-Ig 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함한다.
본원에 제공된 방법은, 후보 CAR을 발현하는 수지상 세포를 상술한 인간이 아닌 동물에게 투여하는 단계, 예로서 기준 DC와 비교하였을 때 면역 억제성 종양 미세환경에 대한 침윤 개선, 생존 개선, 및/또는 면역 세포 (예: T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구)의 활성화를 유도하는 기능의 향상을 포함하는 수지상 세포 활성화에 대한 마커를 검출하는 단계, 및 후보 CAR을, DC를 활성화할 수 있는 CAR로서 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포이다. 특정 실시형태에서, 면역 세포는 자가유래성 또는 동종이계성이다. 특정 실시형태에서, 면역 세포는 변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-T 세포) 또는 천연 면역 세포이다. 특정 실시형태에서, 변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)는 후보 CAR을 발현하는 수지상 세포와 함께 투여된다.
임상적으로 적절한 TIME을 갖는 인간이 아닌 동물과 관련하여 DC 활성화 CAR을 선택하는 방법은 임상적으로 보다 적절한 DC 활성화 CAR 또는 CAR-DC를 제공한다. 다시 말해서, 본원에 제공된 방법에 의해 선별된 DC 활성화 CAR 또는 CAR-DC는 동물 모델에서 DC를 활성화할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 동물 모델들에 비해 인간 환자의 종양 미세환경의 증가된 복잡성과 이질성으로 인해서 지금까지 기존의 동물로는 달성할 수 없었던 임상 환경 하에서도 DC를 활성화할 것으로 기대할 수 있다.
약제학적 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 약제학적 조성물도 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 CAR 및 약제학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 약제학적 조성물도 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 약제학적 조성물도 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)의 개체군 및 약제학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 약제학적 조성물도 제공한다. 본원에 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적 용도로 제제화된 조성물을 의미한다.
"약제학적으로 허용가능한"이라는 용어는 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들) 및/또는 염이 일반적으로 해당 제제를 구성하는 다른 성분들과 화학적 및/또는 물리적으로 상용성이며, 이의 수용자와 생리학적으로 상용성임을 나타내는 말이다.
"약제학적으로 허용가능한 매질"은 대상체에게 생물학적으로 허용가능하고 무독성인, 활성 성분 이외의 약제학적 제제 중의 성분을 지칭한다. 본원에 개시된 약제학적 조성물에 사용하기 위한 약제학적으로 허용가능한 매질은, 예를 들어 약제학적으로 허용가능한 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 또는 비수성 비히클, 항균제, 완충제, 항산화제, 등장화제, 현탁제/분배제, 봉쇄제 또는 킬레이트화제, 희석제, 보조제, 부형제 또는 무독성 보조 물질, 또는 이들의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington, The Science And Practice of Pharmacy (21st ed. 2005)] 참조). 간략히 설명하면, 조작된 세포 또는 이의 개체군은 사용 또는 보관 전에 적절한 배지와 혼합한다. 적절한 약제학적으로 허용가능한 매질은 일반적으로 하기에 도움을 주는 불활성 물질을 포함한다: 1) 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것, 2) 약제학적 조성물을 전달가능한 제제로 가공하는 것, 및/또는 3) 투여 전에 약제학적 조성물을 보관하는 것. 특정 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 매질은 해당 제제의 형태, 점조도, 점도, pH, 약동학 및/또는 용해도를 안정화, 최적화 또는 변경할 수 있는 제제들을 포함한다. 이러한 제제에는, 제한 없이, 완충제, 습윤제, 유화제, 희석제, 캡슐화제 및 피부 침투 증강제, 예를 들어 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 아르기닌, 수크로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 소르비톨, 덱스트란, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 및 이들의 조합을 포함한다.
예시적인 약제학적으로 허용가능한 매질로는, 당 (예: 락토스, 글루코스 및 수크로스), 전분 (예: 옥수수 전분 및 감자 전분), 셀룰로오스 및이의 유도체 (예: 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트), 분말 트래거캔스, 맥아, 젤라틴, 윤활제 (예: 스테아린산마그네슘, 라우릴황산나트륨 및 탈크), 부형제 (예: 코코아 버터 및 좌제 왁스), 오일 (예: 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유, 글리콜 (예: 프로필렌 글리콜), 폴리올 (예: 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)), 에스테르 (예: 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트), 아가, 완충제 (예: 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄), 알긴산, 발열원이 없는 물, 등장성 식염수, 링거액, 에틸 알코올, pH 완충액, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리무수물, 증량제 (예: 폴리펩타이드 및 아미노산, 혈청 알코올 (예: 에탄올), (멸균) 인산염 완충 식염수, 링거액, 덱스트로스액, 및 약제학적 제제에 사용되는 기타 무독성 상용 물질을 포함한다.
본원에 제공되는 약제학적 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 유도 및/또는 강화하고/하거나, 신생물, 병원체 감염 또는 감염성 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 대상체에게 전신적으로 또는 직접적으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물을 관심대상 종양 또는 장기에 직접 주사한다. 다른 실시형태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은, 예를 들어 순환계 (예를 들어, 종양 맥관구조)에 투여함으로써 관심대상 장기에 간접적으로 투여된다.
본원에 제공되는 약제학적 조성물은 적어도 약 1×105, 약 2×105, 약 3×105, 약 4×105 또는 약 5×105 개의 조작된 세포 (예: CAR-DC)의 군을 포함할 수 있다. 당업자라면 누구나 익히 알려진 다양한 방법들, 예를 들어 형광 활성화 세포 분류법 (FACS)을 사용하여 한 개체군에서 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)의 백분율을 쉽게 결정할 수 있다. 한 개체군에서 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)의 백분율 ("순도"라고도 칭함)의 적절한 범위는 약 50% 내지 약 55%, 약 55% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 65%, 약 65% 내지 70%, 약 70% 내지 약 75%, 약 75% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 100%일 수 있다.
특정 실시형태에서, 수용자는 체중 1kg당 적어도 1×103 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 5×103 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 1×104 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 5×104 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 1×105 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 5×105 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 1×106 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 5×106 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 1×107 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 5×107 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 1×108 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 2×108 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 3×108 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 4×108 개의 세포, 체중 1kg당 적어도 5×108 개의 세포, 또는 체중 1kg당 적어도 6×108 개의 세포를 투여받는다. 당업자라면 누구나, 본원에 제공된 약제학적 조성물의 용량을 수용자의 다양한 요인들, 예컨대 신장, 연령, 성별, 체중 및 상태에 기초하여 결정할 수 있음을 이해할 것이다. 용량은 본 발명과 당해 분야의 지식으로부터 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 당업자라면 누구나, 본원에 제공된 조작된 세포의 수와 본 발명의 방법에서 투여될 조성물 중 선택적 첨가제, 비히클, 매질 및/또는 담체의 양을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, 첨가제가 존재하는 경우, 이는 인산염 완충 식염수 중 0.001 내지 50% (중량) 용액의 양으로 존재하고, 활성 성분 (예를 들어, 본원에 제공되는 변형/재조합 세포)은 마이크로그램 내지 밀리그램의 정도, 예컨대 약 0.0001 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 1 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 0.05 중량% 또는 약 0.001 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5 중량%로 존재한다. 적절한 동물 모델 (예: 마우스)에서 치사량 (LD)과 LD50을 결정하는 것과 같이, 특정 용량의 독성을 결정하는 것이 바람직할 것이다. 또한, 적절한 반응을 유도하는 조성물(들)의 투여 시기를 결정하는 것도 바람직할 것이다. 이러한 결정은 당업자의 지식과 본 발명으로부터 과도한 실험을 필요로 하지 않는다.
본원에 제공되는 약제학적 조성물은, 예를 들어 주사 (예컨대, 전신 주사, 국부 주사, 정맥내 주사, 림프내 주사) 또는 카테터에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 피하, 피내, 종양내, 골수내 또는 복강내로 투여될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다. 투여는 자가유래성 또는 이종성일 수 있다. 예를 들어, 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)는 한 대상체의 출발 세포를 변형하여 얻어서 동일한 대상체 또는 다른 대상체에게 투여할 수 있다. 본원에 제공되는 약제학적 조성물은 투여를 위한 단위 주사 제형 (예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀젼)으로 제제화될 수 있다. 본원에 제공되는 약제학적 조성물의 투여는 단회 투여로서, 또는 해당 치료의 시간 경과에 따라, 예컨대 매일, 매주, 격주 또는 매월 수행할 수 있다. 본원에 제공되는 약제학적 조성물은 또 다른 제제, 예컨대 화학요법제, 또 다른 형태의 면역 요법 (예를 들어, CAR-T 요법) 또는 방사선 요법과 함께 (예컨대, 그 전에, 후에 또는 동시에) 투여될 수 있다. 동시 투여는 별도의 조성물의 투여를 통해 이루질 수 있는데, 이때 각 조성물은 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)와 또 다른 제제, 예컨대 화학요법제, 또 다른 형태의 면역 요법 (예를 들어, CAR-T 요법), 또는 방사선 요법을 포함한다. 동시 투여는 하나의 조성물의 투여를 통해 이루질 수 있는데, 이때 상기 조성물은 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)와 또 다른 제제, 예컨대 화학요법제, 또 다른 형태의 면역 요법 (예를 들어, CAR-T 요법), 또는 방사선 요법을 포함한다.
키트
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)를 포함하는 키트도 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 CAR-DC를 생성하는데 사용하기 위한 본원에 제공된 폴리펩타이드, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 포함하는 키트도 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 키트는 해당 키트의 사용을 위한 서면 설명서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 설명서는 임상 연구, 주의 사항, 경고 사항 및/또는 참고 사항 중 적어도 하나를 포함한다. 상기 설명서는 (존재하는 경우) 용기에 직접 인쇄되거나, 또는 해당 용기에 부착되는 라벨로서, 또는 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 폴더로서 해당 용기 내에 또는 해당 용기와 함께 제공될 수 있다. 적절한 용기로는, 예를 들어 병, 주사기, 바이알 및 시험관이 포함된다. 이러한 용기들은 플라스틱 또는 유리와 같은 다양한 재료들로 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, 용기는 본원에 제공된 약제학적 조성물을 보유하고 있어 멸균 접근 포트를 가진다.
특정 실시형태에서, 키트는 상술한 약제학적으로 허용가능한 매질을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 키트는 상업적으로 바람직하거나 사용자 친화적인 다른 재료들, 예컨대 다른 희석제, 완충제, 바늘, 필터, 주사기, 및 사용 지침을 담은 포장 삽지를 추가로 포함한다.
사용 방법
본 발명은 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)의 다양한 용도도 제공한다.
일반적인 용도
한 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 치료적 유효량의 조작된 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 질병 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 질병 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법은 대상체로부터 분리되거나 iPSC로부터 유도된 세포 (예컨대, 말초 혈액 세포, 골수 세포, 배아 줄기 세포)로부터 분리되거나 유도된 DC를 제공하는 단계, 본원에 제공된 CAR을 발현하도록 DC를 조작하는 단계, 및 상기 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)를 상기 대상체에게 다시 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 질병 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법은 DC의 전구체 또는 전구 세포 (예를 들어, 말초 혈액 세포, 골수 세포, 배아 줄기 세포 또는 iPSC)를 제공하는 단계, 본원에 제공된 CAR을 발현하도록 상기 전구체 또는 전구 세포를 조작하는 단계, 및 상기 분화 및 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)를 상기 대상체에게 다시 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 질병 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법은 DC의 전구체 또는 전구 세포 (예를 들어, 말초 혈액 세포, 골수 세포, 배아 줄기 세포 또는 iPSC)를 제공하는 단계, 본원에 제공된 CAR을 발현하도록 상기 전구체 또는 전구 세포를 조작하는 단계, 상기 조작된 전구체 또는 전구 세포를 본원에 제공된 CAR을 발현하는 DC로 분화시키는 단계, 및 상기 본원에 제공된 CAR을 발현하는 DC (예를 들어, CAR-DC)를 상기 대상체에게 다시 주입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 질병은 암이다.
일부 실시형태에서, 암은 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 눈암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 기관지폐포 세포 폐암, 중피종, 두경부암, 편평세포암종, 흑색종, 구강암, 난소암, 자궁경부암, 음경암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 육종, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 질암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고형암이다. 일부 실시형태에서, 암은 광범위 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 림프절외 NK/T 세포 림프종, HHV8 관련 원발성 삼출액 림프종, 형질모세포 림프종, 원발성 CNS 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 B 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 다발성 골수종 (MM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액암이다.
일부 실시형태에서, 암에 걸린 대상체는 암 치료 (예를 들어, 면역요법)에 잘 반응하지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "면역요법"은 암과 같은 질병에 대항하기 위해 면역계를 자극하거나 일반적인 방식으로 면역계를 강화시키는 치료의 유형을 가리킨다. 면역요법에는 항종양 효과를 직간접적으로 매개할 수 있어 온전한 숙주 면역계에 반드시 의존할 필요가 없는, 종양 면역 반응성이 확립된 제제 (예컨대, 효과기 세포 등)를 전달하는 수동 면역요법이 포함된다 (예컨대, 항체 요법 또는 CAR-T 세포 요법). 면역요법은 능동 면역요법을 추가로 포함할 수 있는데, 이 능동 면역요법에서의 치료는 면역 반응 조절제의 투여로 질병에 걸린 세포에 대해 반응하는 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극에 의존한다.
면역요법의 예로는 체크포인트 조절제, 입양 세포 전달, 사이토카인, 종양용해성 바이러스 및 치료용 백신이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
체크포인트 조절제는 면역계 공격을 피하는 암세포의 능력을 방해하고, 면역계가 종양에 더 강력하게 반응하도록 도울 수 있다. 면역 체크포인트 분자는 공동 자극 신호를 매개하여 면역 반응을 증강시키거나, 또는 공동 억제 신호를 매개하여 면역 반응을 억제할 수 있다. 체크포인트 조절제의 예로는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, TIM-3, LAG3, A2AR, CD160, 2B4, TGF-β, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, OX40, CD2, CD27, CD28, CD30, CD40, CD47, CD122, ICAM-1, IDO, NKG2C, SLAMF7, SIGLEC7, NKp80, CD160, B7-H3, LFA-1, 1COS, 4-1BB, GITR, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21, CD3, CD16 및 CD83의 조절자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 면역 체크포인트 조절제는 PD-1/PD-L1 축 억제제를 포함한다.
입양 세포 전달은 암과 싸우는 T 세포의 선천적인 능력을 증강시키려는 치료이다. 이 치료에서, 환자에게서 T 세포를 채취하여 시험관 내에서 증식 및 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, T 세포를 시험관 내에서 CAR-T 세포로 변형시킨다. 암에 대해 가장 활성을 갖는 T 세포 또는 CAR-T 세포를 2 내지 8주간 시험관 내에서 대규모 뱃치로 배양한다. 이 기간 동안, 환자는 신체의 면역력을 감소시키기 위해 화학요법 및 방사선 요법과 같은 치료를 받게될 것이다. 이러한 치료 후, 시험관 내 배양된 T 세포 또는 CAR-T 세포를 환자에게 다시 제공한다. 특정 실시형태에서, 면역요법은 CAR-T 요법이다.
TIME의 저해
한 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 CAR-DC 또는 이의 개체군을 사용하여 TIME을 저해 (예를 들어, TIME을 염증성 상태로 전환)시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 면역 억제성 미세환경에서 면역 세포의 증식을 유도하는 방법, 면역 세포의 생존을 연장하는 방법 및/또는 면역 세포로부터 면역 자극 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 방법을 제공한다. 면역 자극 사이토카인은 TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 중 하나 이상일 수 있다. 본 방법은 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)와 면역 억제성 미세환경을 접촉시키는 단계를 포함한다. 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구일 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포이다. 특정 실시형태에서, 면역 세포는 변형되지 않은 면역 세포이다. 특정 실시형태에서, 면역 세포는 변형된 면역 세포이다. 비변형 또는 변형 면역 세포는 자가유래성 또는 동종이계성일 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 면역 세포는 CAR-T 세포이다. 특정 실시형태에서, CAR-T 세포는 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)와 동일한 공급원 (예를 들어, 대상체의 말초 혈액)으로부터 유래된다.
특정 실시형태에서, 면역 억제성 미세환경은 면역 억제성 종양 미세환경이다. 면역 억제성 종양 미세환경은 "수지상 세포 (DC) 활성화 키메라 항원 수용체 (CAR)"라는 표제의 섹션에 설명해 놓았다. 특정 실시형태에서, 면역 억제성 종양 미세환경은, 종양 및/또는 예를 들어 PD-1, TIM3, TIGIT, LAG3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR(CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및CD47로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 억제성 분자를 발현하는 종양 침윤성 면역 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 억제성 분자는 CTLA-4 및/또는 PD-L1이다. 특정 실시형태에서, 종양은 CTLA4-Ig 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함한다.
입양 세포 요법 (예: CAR-T 요법)의 효능 개선
또 다른 양태에서, 본 발명은 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는데 있어서 입양 세포 요법의 효능을 개선하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본원에 제공된 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 본 방법은 변형된 면역 세포의 군을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
입양 세포 요법은 세포 표면 상에서 변형된 면역 세포, 예컨대 합성 수용체 (예: CAR 또는 TCR)를 발현하는 면역 세포의 입양 전달을 포함한다. 변형된 면역 세포는 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구일 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포이다. 변형된 면역 세포는 자가유래성 또는 동종이계성일 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 면역 세포는 CAR-T 세포이다. 특정 실시형태에서, CAR-T 세포는 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)와 동일한 공급원 (예를 들어, 대상체의 말초 혈액)으로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 암은 고형 종양 또는 상술한 바와 같은 혈액암이다.
일부 실시형태에서, 암에 걸린 대상체는 상술한 바와 같은 암 치료 (예를 들어, 면역요법)에 잘 반응하지 않는다.
병용 요법
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC) 및 제2 제제를 사용하는 병용 요법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 제2 제제는 상술한 바와 같은 변형된 면역 세포, 예컨대 CAR-T 세포의 군이다. 특정 실시형태에서, CAR-T 세포는 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)와 동일한 공급원 (예를 들어, 대상체의 말초 혈액)으로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 병용 요법에 제공되는 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC) 및 CAR-T 세포의 비율은 약 1:1 내지 1:10의 범위이다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)와 CAR-T 세포는 동일한 약제학적 조성물 중에 존재한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)와 CAR-T 세포는 별도의 두 약제학적 조성물 중에 존재한다. 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)는 CAR-T 세포의 투여 전, 그의 투여와 동시에 또는 그의 투여 후에 이를 필요로 하는 대상체에게 투여한다.
특정 실시형태에서, 제2 제제는 면역억제 경로를 억제하는 제제, 이에 제한되지는 않지만, TGF-b, 인터루킨 10 (IL-10), 아데노신, VEGF, 인돌아민 2,3 디옥시게나제 1 (IDO1), 인돌아민 2,3-디옥시게나제 2 (IDO2), 트립토판 2-3-디옥시게나제 (TDO), 락테이트, 저산소증, 아르기나제 및 프로스타글란딘 E2의 억제제이다. 제2 제제는 T 세포 체크포인트 억제제, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 항-CTLA4 항체 (예: 이필리무맙), 항-PD1 항체 (예: 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 세미플리맙), 항-PD-L1 항체 (예: 아테졸리무맙, 아벨루맙, 더발루맙), 항-PD-L2 항체, 항-BTLA 항체, 항-LAG3 항체, 항-TIM3 항체, 항-VISTA 항체, 항-TIGIT 항체 및 항-KIR 항체일 수 있다.
특정 실시형태에서, 제2 제제는 CD28, ICOS, OX-40, CD27, 4-1BB, CD137, GITR 및 HVEM을 자극하는 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 T 세포 작용제이다. 특정 실시형태에서, 제2 제제는 랍도바이러스, 레트로바이러스, 파라믹소바이러스, 피코르나바이러스, 레오바이러스, 파르보바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는 치료용의 종양용해성 바이러스이다.
특정 실시형태에서, 제2 제제는 TLR3, TLR4, TLR7 및 TLR9 작용제를 포함하나 이에 제한되지 않는 톨-유사 수용체 작용제와 같은 면역자극제이다. 특정 실시형태에서, 제2 제제는 인터페론 유전자 작용제에 대한 자극제 (STING), 예컨대 사이클릭 GMP-AMP 신타제 (cGAS)이다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 CAR-DC 또는 CAR-DC의 군은 임의 수의 관련 치료 방식 (예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 사이토카인, 또는 수지상 세포 또는 T-세포 증식과 지속성을 향상시키며 Flt3L, IL-2, IL-7 및 IL-15 또는 이의 유사체를 포함하나 이에 제한되지 않는, CAR-DC 내에서 유래한 사이토카인의 발현을 이용한 치료)과 함께 (이러한 방식 전에, 이러한 방식과 동시에 또는 그 후에) 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 치료 방법은 조작된 세포의 투여와 관련된 부작용을 감소시키거나 개선하는 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 부작용으로는 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 및 적혈구 포식성 림프조직구증 (HLH, 대식세포 활성화 증후군 (MAS)이라고도 함)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 부작용을 치료하기 위해 투여되는 제제로는 가용성 인자를 중화시키는 제제, 예컨대 IFN-감마, IFN-알파, IL-2 및 IL-6을 포함한다. 예시적인 제제로는, 이제 제한되지는 않지만, TNF-알파의 억제제 (예를 들어, 엔타너셉트) 및 IL-6의 억제제 (예를 들어, 토실리주맙)를 포함한다.
실시예
본 발명을 특정 실시형태들 (이들 중 일부는 바람직한 실시형태임)을 참조하여 구체적으로 도시하여 설명하였지만, 당업자라면 누구나 본원에 개시된 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 그 형태와 세부사항을 다양하게 변형시킬 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1
DC를 특이적으로 활성화하는 CAR 제조
T 세포와 DC 활성화와 관련된 명확한 경로가 있기 때문에, 우리는 CAR-T 세포의 전형적인 CAR 분자가 DC를 활성화하지 못할 것이라 추론하였다 (도 1a, 도 8a 및 도 8b). 따라서, 우리는 DC 활성화 경로를 포함하는 새로운 CAR들, 예컨대 TLR4, TNFR2, Dectin-1 및 FcγR에 대하여 평가하였다. 먼저, 우리는 사이토카인 혼합액 (cocktail)을 사용하여 기능적 DC로 분화될 수 있는 인간 단핵구성 백혈병 세포주인 THP-1 세포에서 유래한 DC에서 항인간 CD19 scFv와 TLR4, TNFR2, Dectin-1 및 FcγR의 세포내 활성화 도메인으로 이루어진 CAR 구조체를 시험하였다 (C. Berges et al., A cell line model for the differentiation of human dendritic cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333, 896-907 (2005)). TLR4 또는 TNFR2 꼬리가 있는 CAR은 DC를 효과적으로 활성화시킬 수 없었는데, 이는 TLR4 또는 TNFR 꼬리 단독에 의해 제공되는 자극 신호가 DC 활성화에 충분하지 않음을 의미한다 (도 8a 및 도 8b). THP-1 세포에서 Dectin1 및 FcRγ의 세포질 꼬리의 일렬상 융합을 갖는 항-인간 CD19 scFv로 이루어진 CAR의 발현은 CARDF-DC로 나타낸 DC로의 분화에 영향을 미치지 않았다 (도 1, b와 c). CARDF-DC와 대조군인 THP-1에서 유래된 DC를 H460-CD19에 노출시킨 경우 (도 1f), CARDF-DC는 대조군 DC들에 비해서 공동 자극 분자 (CD80 및 CD86)를 더 높은 수준으로 발현하였다 (도 1d). 또한, CARDF-DC는 대조군 DC들보다 동종이계성 T 세포의 더 견실한 증식을 유도할 수 있었다 (도 1e). CARDF-DC가 CAR-T 세포의 기능을 활성화할 수 있는지의 여부를 알아보기 위해, CARDF-DC 또는 대조군 DC의 존재 하에 2세대 항-CD19 CAR-T 세포를 H460-CD19 종양 세포와 함께 배양하였다 (도 1, a와 g). CAR-T 세포는 대조군 DC보다 CARDF-DC의 존재 하에 CD19+ H460 종양 세포에 더 높은 세포독성을 부여하였다 (도 1h). 또한, CARDF-DC는, 대조군 DC와 비교하였을 때, CAR-T 세포에서 더 높은 IFN-γ 발현 수준과 종양 세포에 의한 젖산 탈수소효소 (LDH)의 방출을 유도하였다 (도 1, i와 j). 이러한 데이터는 CARDF가 DC의 활성을 증강시켜 CAR-T 세포를 활성화할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 2
CARDF는 정상적인 말초 단핵구에서 유도된 DC를 활성화할 수 있다
THP-1 세포에서 유도된 DC에서 CARDF의 결과를 확인하기 위해, 우리는 임상 용도로 사용하는 DC의 통상적인 공급원인 말초 단핵구 (Mo-DC)에서 유도된 정상 DC에 대한 CARDF 발현의 영향을 조사하였다 (J. Constantino et al., Antitumor dendritic cell-based vaccines: lessons from 20 years of clinical trials and future perspectives. Transl. Res. 168, 74-95 (2016)). 건강한 기증자의 PBMC에서 정제된 단핵구를 CARDF를 발현하는 렌티바이러스로 형질도입하여 DC로 분화되도록 유도하였다 (도 2a). CARDF의 발현은 Mo-DC의 분화 및 성숙에 영향을 미치지 않았으며, DC 마커인 CD11C, CD80, CD86, HLA-ABC 및 HLA-DR은 대조군 DC와 유사한 표면 발현 수준을 나타냈다 (도 2b). 조작되지 않은 고형 종양에 특이적이지 않은 항-CD19 scFv CAR을 사용하는 대신에, 우리는 다수 유형의 고형 종양에서 많이 발현되는 EphA2에 대한 항체 scFv (도 9a)를 사용하였다 (J. Wykosky et al., The EphA2 receptor and ephrinA1 ligand in solid tumors: function and therapeutic targeting. Mol. Cancer Res. 6, 1795-1806 (2008); J. M. Brannan et al., EphA2 in the early pathogenesis and progression of non-small cell lung cancer. Cancer Prev. Res. 2, 1039-1049 (2009); V. M. Youngblood et al., The Ephrin-A1/EPHA2 Signaling Axis Regulates Glutamine Metabolism in HER2-Positive Breast Cancer. Cancer Res. 76, 1825-1836 (2016); M. Tandon et al., Emerging strategies for EphA2 receptor targeting for cancer therapeutics. Expert Opin Ther Targets. 15, 31-51 (2011)). 항-EphA2 CARDF-DC가 CD3+ T 세포의 증식을 향상시킬 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 우리는 CFSF로 표지된 T 세포를, EphA2를 발현하는 인간 페암 A549 세포에 48시간 동안 미리 노출시켰던 CARDF Mo-DC 또는 대조군 Mo-DC와 함께 배양하였다. CARDF-DC는 대조군인 Mo-DC보다 더 강력하게 T 세포 증식을 유도할 수 있었다 (도 2c). 요약하면, 우리의 연구 결과는 CARDF가 종양 항원의 자극에 반응하여 Mo-DC를 활성화할 수 있음을 시사하고 있다.
효과기 T 세포를 억제하여 종양 성장을 촉진하기 위해, 과거의 연구 결과들은 TIME 내의 면역억제성 TIDC가 고형 종양 세포의 표면에서 PD-L1 및 CTLA4의 발현에 의해 유도될 수 있음을 보여주었다 (J. M. Tran Janco, P. Lamichhane et al., Tumor-infiltrating dendritic cells in cancer pathogenesis. J. Immunol. 194, 2985-2991 (2015); C. Fu et al., Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Front Immunol. 9, 3059 (2018); C. Pfirschke et al., Tumor Microenvironment: No Effector T Cells without Dendritic Cells. Cancer cell 31, 614-615 (2017); R. A. Belderbos et al., Enhancing Dendritic Cell Therapy in Solid Tumors with Immunomodulating Conventional Treatment. Mol. Ther. Oncolytics 13, 67-81 (2019)). CTLA4-Ig 및 PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 Mo-DC의 활성화 상태를 평가하기 위해, 우리는 과거 설명된 바와 같이 발현 카세트를 HPRT 유전자 자리에 녹인 (knock-in)시켜 CTLA4-Ig 및 PD-L1 (A549-CP)을 과발현하는 인간 폐암 세포 A549를 작제하였다 (Rong Z et al., An Effective Approach to Prevent Immune Rejection of Human ESC-Derived Allografts. Cell Stem Cell 14, 121-130 (2014)). 대조군 A549 세포에 비해, CP의 발현은 A549-CP 종양 세포에서 훨씬 더 많았다 (도 2d). CARDF-DC 또는 대조군 Mo-DC를 A549-CP 세포와 48시간 동안 공동 배양하였던 경우, CARDF-DC는 대조군 Mo-DC보다 훨씬 더 높은 수준의 CD80, HLA-ABC 및 HLA-DR을 발현하였다 (도 2e). CARDF-DC와 대조군 Mo-DC를 48시간 동안 A549-CP에 미리 노출시켰던 경우, CARDF-DC는 대조군 Mo-DC보다 더 강력하게 T 세포를 활성화할 수 있었다 (도 2f). 따라서, CARDF는 DC를 활성화시켜 종양 세포 유도형 면역 억제에 저항해 T 세포를 효과적으로 활성화할 수 있다.
실시예 3
CARDF-DC는 시험관 내에서 CAR-T 세포의 세포독성을 활성화한다
CARDF-DC가 종양 세포에 대한 CAR-T 세포의 세포독성을 증가시키는지의 여부를 조사하기 위해, 우리는 동일한 Mo-DC 기증자의 T 세포를 사용하여 항-EphA2 CAR-T 세포를 생성하였다. CAR-T 세포의 표면에서 CAR의 발현과 A549 및 A549-CP 종양 세포의 표면에서 EphA2의 발현을 확인하였다 (도 3, a와 b; 도 9b). 대조군 Mo-DC 또는 CARDF-DC에 의해 활성화된 CAR-T 세포의 세포독성 활성을 조사하기 위해, A549 및 A549-CP 세포를 CAR-T 세포 및 DC와 공동 배양하였다. 대조군 Mo-DC와 비교하였을 때, CARDF-DC는 A549 세포에 대한 CAR-T 세포의 세포독성 활성을 크게 증가시켰다 (도 3c). A549-CP 세포에 대한 CAR-T 세포의 세포용해 활성은 A549 세포에 비해 감소하였는데, 이는 CP의 발현이 CAR-T 세포의 세포용해 활성을 억제하였음을 시사하는 것이다. 이와는 대조적으로, 종양 세포에서 CP의 발현에 의한 CAR-T 세포의 세포용해 활성의 이러한 억제는 CARDF-DC에 의해 역전되었다 (도 3c). 이러한 결과와 일관되게, 대조군 Mo-DC와 비교하였을 때, CARDF-DC와 CAR-T 세포의 공동 배양은 CAR-T 세포에 의해 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α의 발현을 증가시켰고 (도 3d), IFN-γ+ CAR-T 세포의 백분율 뿐만 아니라 상청액에서 IFN-γ 및 LDH의 수준도 증가시켰다 (도 3, e 내지 g). 따라서, CARDF-DC는 CP 매개형 면역 억제에 저항하여 CAR-T 세포의 세포용해 활성을 활성화할 수 있다.
실시예 4
CARDF-DC는 TIME에 저항성이 있어 생체 내에서 CAR-T 세포의 항종양 활성을 활성화시킨다
생체 내에서 CAR-T 세포에 대한 CARDF-DC의 영향을 조사하기 위해, 우리는 면역결핍된 NOD/SCID/IL-2γ-/- (NSG) 마우스에 A549-WT 및 A549-CP 종양 세포를 각각 피하 주사하였다. 종양이 만져질 정도의 크기가 되면, 1×107 개의 CAR-T 세포와 5×106 개의 대조군 Mo-DC 또는 CARDF-DC를 각각 정맥내로 수혈하였다 (도 4a). A549 종양과는 대조적으로, A549-CP 종양은 임상적으로 적절한 TIME을 발달시켰다 (도 4b). CAR-T 세포가 TIME을 갖는 고형 종양에서 빠르게 고갈된다는 과거 연구 결과와 일관되게 (J. L.-M. Chen et al., NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solid tumours. Nature 567, 530-534 (2019); J. Li et al., Chimeric antigen receptor T cell (CAR-T) immunotherapy for solid tumors: lessons learned and strategies for moving forward. J Hematol Oncol. 11, 22 (2018)), CAR-T 세포는 A549-WT 종양은 효과적으로 제거했으나 A549-CP 종양은 그렇게 하지 못했다 (도 4c). CARDF-DC와 조합된 CAR-T 세포는 CAR-T 세포 단독 처리에 비해 A549-CP 종양 부담을 효율적으로 감소시켰다 (도 4, c와 d). 또한, CARDF-DC는 생체 내에서 CD8+ T 세포를 비롯한 T 세포의 생존을 크게 연장시켰고, DC 자체의 생존과 활성화도 촉진하였다 (도 4, e와 f). 또한, 우리는 CARDF-DC 처리군의 종양에서 CD11C 및 CD80이 더 높은 수준으로 발현되는 것도 감지하였는데 (도 4e), 이는 CARDF-DC가 대조군 Mo-DC보다 CP를 과발현하는 종양에 더 잘 침투하거나 거기서 더 오래 생존할 수 있음을 시사하는 것이다. 요약하면, 이러한 데이터는 CARDF-DC가 TIME에 저항하여 CAR-T 세포의 생존과 활성을 촉진해 고형 종양을 억제할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5
CARDF-DC는 Hu-마우스에서 TIME을 역전시켜 CAR-T 세포를 활성화하여 고형 종양을 제거한다
면역계와 종양 간의 상호작용은 TIME의 형성에 중요한 역할을 한다(M. Binnewies et al., Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nat Med. 24, 541-550 (2018)). 따라서, 우리는 과거 설명된 바와 같이 인간 고형 종양이 인간화된 마우스의 면역계에서 임상적으로 적절한 TIME을 발달시켰던 HuS 모델을 사용하여 (Q. Li, et al., Developing Covalent Protein Drugs via Proximity-Enabled Reactive Therapeutics. Cell 182, 85-97.e16 (2020)), 고형 종양의 TIME을 역전시키는데 있어서 CARDF-DC의 활성을 추가로 평가하였다 (도 5a). CARDF-DC 및 CAR-T 세포는 동일한 기증자의 조직으로 확립된 Hu-마우스의 골수 세포와 T 세포에서 유래하였으며, 이들은 인간 폐 종양을 접종하여 HuS 모델을 확립하는 데에도 사용하였다. 따라서, HuS 마우스의 CARDF-DC, CAR-T 세포와 면역계는 모두 동일한 기증자로부터 유래하였다. 예상대로, 대조군 Mo-DC의 존재 또는 부재 하의 CAR-T 세포는 임상적으로 적절한 TIME을 발달시키는 HuS 마우스에서 형성된 인간 폐 종양을 억제하는데 실패하였다 (도 5, b 내지 e). 이와는 대조적으로, CARDF-DC와 조합된 CAR-T 세포는 동일한 뱃치의 Hu-마우스에서 형성된 인간 폐 종양의 성장을 효율적으로 억제하였다 (도 5, c 내지 e). 따라서, CARDF-DC는 임상적으로 적절한 TIME에 저항하여 CAR-T 세포의 항종양 활성을 활성화할 수 있다.
CARDF-DC가 고형 종양의 TIME을 염증유발 상태로 전환하여 T 세포를 활성화시킬 수 있다는 가설을 시험하기 위해, 우리는 말초 및 종양에서 T 세포의 활성화 상태를 조사하였다. CARDF-DC는 비장에서 IFN-γ+ T 세포의 백분율을 증가시켰고 (도 6a), 비장 T 세포에서 억제성 표면 수용체 PD-1와 TIM-3의 발현을 감소시켰다 (도 6, b와 e). 또한, CARDF-DC는 비장 DC에서 DC 활성화 마커인 CD86 및 MHC-II의 발현을 증가시켰다 (도 6c). 따라서, CARDF-DC는 전신 면역계를 활성화시키는 것으로 나타났다. CARDF-DC가 고형 종양의 TIME을 염증유발 상태로 전환할 수 있다는 개념을 뒷받침하는 것으로, CARDF-DC는 TNF-α, IL-2, CD86, IL-12B의 종양 내 발현을 증가시켰고 (도 6d), 면역 체크포인트 분자인 PD-1, TIM-3, TGF-β (도 6f) 및 M2 대식세포 마커인 CD206, CD163 (도 6g)의 발현을 감소시켰다. 이러한 데이터는 CARDF-DC가 TIME을 염증유발 상태로 역전시켜 고형 종양에 대한 면역력을 활성화시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 6
CARDF-DC는 서로 다른 TIME에서 균일한 T 세포 활성화 활성을 갖는다
고형 종양은 TIME에 있어서 이질적이다 (V. Thorsson et al., The Immune Landscape of Cancer. Immunity 48, 812-830 e814 (2018)). CARDF-DC가 다른 고형 종양들의 TIME을 염증유발 상태로 역전시킬 수 있다는 가설을 시험하기 위해, 우리는 Hu-마우스에서 PD-L1을 더 높은 수준으로 발현하고 임상적으로 적절한 TIME도 형성하는, 또 다른 인간 폐암 세포주 H460을 사용하였다 (도 7, a와 b). 상기 종양 세포들은 EphA2를 발현하는 것으로 확인되었다 (도 7c). Hu-마우스에서 A549에 의해 형성된 폐 종양에서의 상기 결과들과 일관되게, CARDF-DC는 CAR-T 세포의 항종양 활성을 효율적으로 구제하였고, HuS-마우스에서 H460 세포에 의해 형성된 고형 종양을 억제하였다 (도 7, d 내지 f). CARDF-DC는 대조군 DC보다 더 효율적으로 H460 종양에 침투하거나 더 오래 생존할 수 있었다 (도 7g). 따라서, 이러한 데이터는 고형 종양의 이질적인 TIME에서의 면역 억제를 역전시키는 CARDF-DC의 균일한 T 세포 활성화 능력을 보여주는 것이다.
실시예 7
논의
혈액 악성종양을 치료하기 위한 CAR-T 세포 요법의 뛰어난 효능에도 불구하고, 고형 종양의 면역요법은 면역 억제성 미세환경 (TIME)의 존재로 인해서 여전히 어려운 과제로 남아있다. 따라서, 고형 종양 면역요법의 효능을 향상시키기 위해서는 TIME을 저해시키는 전략을 개발하는 것이 중요하다. 면역 억제성 TIDC가 세포독성 T 세포 기능을 억제하고 면역 억제성 조절 T 세포를 촉진함으로써 TIME을 확립하는데 중요한 역할을 한다는 것은 잘 알려져 사실이다 (J. M. Tran Janco et al., Tumor-infiltrating dendritic cells in cancer pathogenesis. J. Immunol. 194, 2985-2991 (2015)). 이 목표를 달성하기 위해, 우리는 DC가 종양 세포를 특이적으로 표적화하여 TIME을 맞닥드린 후에도 활성화된 상태를 유지할 수 있도록 하는 CAR-DC 전략을 개발하였다. 이와 관련하여, 우리는 DC가 T 세포에 대한 표준 CAR이 TIME을 맞닥드린 후에 DC를 활성화하지 못함을 보여주려 한다. DC를 특이적으로 활성화시키기 위해, 우리는 다양한 DC 활성화 도메인으로 구성된 세포내 도메인을 갖는 DC 활성화 CAR 분자를 설계하였다. DC 활성화 도메인의 다양한 조합으로 CAR을 시험한 후, 우리는 탠덤 결찰 Dectin1과 FcRγ의 세포질 꼬리의 일렬 결찰이 이들이 TIME을 맞닥드린 후에 DC를 효과적으로 활성화할 수 있음을 발견하였다.
종양 면역요법 연구에 있어서 주요 병목현상 중 하나는 면역요법의 효능을 평가하기 위한 임상적으로 적절한 생체 내 모델이 부족하다는 점이다 (P. S. Hegde et al., Top 10 Challenges in Cancer Immunotherapy. Immunity 52, 17-35 (2020)). 예를 들어, 면역결핍 마우스에서 확립된 고형 종양은 TIME을 발달시키는데 실패하였는데, 이로써 이 모델에서는 CAR-T 세포에 의한 고형 종양의 효율적인 제거가 가능하다. 이러한 병목현상을 해결하기 위해, 임상적으로 적절한 TIME을 갖는 인간 고형 종양을 발달시키는 2가지 인간화된 마우스 모델을 개발하였다. 먼저, 면역결핍 마우스에서 CTLA4-Ig/PD-L1을 과발현하는 인간 종양 세포에 의한 고형 종양의 형성은 면역 억제성 미세환경을 발달시켰다. 둘째, 고형 종양 TIME의 이질성을 되풀이하기 위해, 인간화된 마우스의 면역계에서 인간 종양 세포에 의한 고형 종양의 형성은 임상적으로 적절한 TIME을 발달시킨다. 이러한 모델을 사용하여, 우리는 인간 CAR-DC가 CAR-T 세포를 촉진하여 임상적으로 적절한 TIME을 포함하는 고형 종양을 억제할 수 있음을 입증하고 있다. 이러한 내용과 관련하여, 이것은 CAR-DC가 TIME을 염증유발 상태로 역전시키고 CAR-T 세포의 항종양 활성을 활성화시켜 고형 종양을 억제할 수 있음을 보여주는 첫 번째 보고서이다.
고형 종양의 이질성을 고려할 때, CAR-DC가 다양한 유형의 인간 고형 종양의 TIME을 역전시킬 수 있는지의 여부를 조사하는 것이 중요할 것이다. 또한, 이 전략의 한 가지 잠재적인 한계는 암 환자는 수차례의 화학요법 또는 방사선요법 후에 건강한 DC가 충분히 남아있지 않을 수도 있다는 점이다. 이러한 문제점은 환자의 유도형 만능 줄기 세포로부터 기능적 DC를 유도하는 최근의 진전된 기술에 의해 완화될 수 있다 (D. Todorova et al., hESC-derived immune suppressive dendritic cells induce immune tolerance of parental hESC-derived allografts. EBioMedicine 62, 103120 (2020); S. Senju et al., Generation of dendritic cells and macrophages from human induced pluripotent stem cells aiming at cell therapy. Gene Ther. 18, 874-883 (2011); S. Sontag et al., Modelling IRF8 Deficient Human Hematopoiesis and Dendritic Cell Development with Engineered iPS Cells. Stem cells 35, 898-908 (2017)). CAR-DC가 면역 억제성 TIME을 염증유발 상태로 역전시키는 능력을 기초로, CAR-DC와 다른 면역요법들의 조합을 조사하여 악성 고형 종양을 치료하는 것은 흥미로울 것이다. 예를 들어, CAR-DC는 자연 살해 세포의 항종양 활동과 고형 종양의 작은 일부에만 효과적인 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1 항체를 촉진할 수 있다 (T. Walzer et al., Natural-killer cells and dendritic cells: "l'union fait la force". Blood 106, 2252-2258 (2005); E. Mamessier et al., Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J. Clin. Invest. 121, 3609-3622 (2011); K. Foley et al., Current progress in immunotherapy for pancreatic cancer. Cancer lett. 381, 244-251 (2016); J. S. O'Donnell et al., Resistance to PD1/PDL1 checkpoint inhibition. Cancer Treat. Rev. 52, 71-81 (2017)67-70). 본원에 사용된 임상적으로 적절한 TIME을 갖는 새로운 인간화된 고형 종양 모델은 이러한 병용 면역요법의 효능을 평가하는데 이상적인 플랫폼을 제공할 것이다. 요약하면, CAR-DC 접근법은 TIME을 극복하여 악성 고형 종양의 면역요법의 결과를 좌우하는 유망하고 보편적인 전략이 될 수 있다.
실시예 8
재료 및 방법
연구 설계
나타낸 결과들은 평균값 + 표준 편차이다. 독립적인 실험 반복 횟수는 도면의 범례에 표시하였다. 종양 성장의 생체내 실험을 위해, 동물들을 처리 및 측정 전, 예를 들어 종양 중량과 부피 측정, RT-qPCR 분석, 유세포 분석 또는 ELISA 측정 전에 맹검 하에 처리군들로 나누었다. 원시 데이터는 데이터 파일 S1에 포함되어 있다.
동물 연구
NOD/SCID/IL-2γ-/- (NSG) 마우스는 Nanjing Model biology Company에서 구입하였다. 본 연구에 사용된 NSG 마우스와 Hu-마우스는 병원균이 없는 동물 실험 시설에서 보관하였다. 모든 동물 실험은 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 승인을 받았다.
키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 작제
2세대 CAR 항-CD19 및 항-EphA2의 구조는 CD8 리더 서열과 scFv, CD8 막관통 도메인, 및 4-1BB 및 CD3ξ 세포내 도메인으로 구성된다. DC CAR을 생성하기 위해, TLR4(NM_138554.5), TNFR2(NM_001066.3) 및 Dectin1(NM_197947), FcRγ(NM_004106)의 세포질 내 서열을 증폭시켜 2세대 CAR 내의 4-1BB 및 CD3ξ 세포내 도메인의 영역을 대체하였다. 모든 서열들은 IGene company (광저우)에서 최적화 및 합성되었다. 그런 다음, Cas9 영역을 대체하여 발현 카세트를 상기 렌티-Cas9 벡터 (Addgene)에 클로닝하였다.
1차 세포 및 세포주 배양
PBMC (LDEBIO Cat#1501)로부터 분리된 단핵구로부터 DC를 생성하였다. 간략히 설명하면, 항-CD14 마이크로비드 (Miltenyi Biotech Cat# 130-050-201) 및 autoMACS Pro 분리기 장치를 사용하여 단핵구를 분리하였다. 그런 다음, 단핵구를 10% FBS (Gibco), 100 단위/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 (Thermo Fisher Scientific)이 보충된 RPMI 1640 (Corning) 중의 GM-CSF (100 ng/ml; PeproTech Cat# 300-03) 및 IL-4 (100 ng/ml; PeproTech Cat# 200-04)로 5-6일간 배양하여 미성숙 DC를 생성하였다. 사이토카인은 2-3일마다 보충하였다. DC의 성숙은 TNF-α (10 ng/ml; PeproTech Cat# 300-01A) 및 LPS (3 ㎍/ml; Sigma-Aldrich Cat# L4391)로 24시간 동안 수행하였다.
1차 T 세포는 항-CD3 마이크로비드 (Miltenyi Biotech Cat# 130-050-101)를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리해서 10% FBS, 2 mM의 L-글루타민 (Thermo Fisher Scientific), 1% 페니실린-스트렙토마이신, 2-머캅토에탄올 (25 μM, Gibco) 및 100 U/ml의 인간 IL-2 (PeproTech Cat# AF-200-02-500)로 보충된 RPMI 1640 중에서 보관하였다.
A549 (Cat# ATCC® CCL-185™)와 H460 (Cat# ATCC® HTB-177™)은 모두 ATCC (미국 버지니아주 머내서스 소재)에서 구입하였다. A549-CP 작제는 과거 설명된 대로 수행하였다 (60). H460-CD19는 렌티바이러스를 사용하여 H460의 표면에 인간 CD19를 과발현시켜 작제하였다. THP-1 세포주 (Cat# ATCC® TIB-202™)는 만성 골수성 백혈병 환자에서 유래한 확립된 백혈병 세포주이다. 상기 세포들은 모두 10% FBS, 2 mM의 L-글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 25 μM의 2-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640 중에서 배양하였다. 293FT 세포 (Thermo Scientific Cat# R70007)를 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM, Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다. 상기 세포주들은 세포가 완전한 전면생장에 도달했을 때 적절한 비율로 0.25% 트립신-EDTA (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 계대배양하였다. 모든 세포들은 5% CO2, 암실 습도 37℃의 항온배양기에서 배양하였다.
Mo-DC의 형질도입
형질도입 전, 인간 단핵구를 웰당 2-5×105 개의 세포/400 uL의 분화 배지 (100 ng/ml의 GM-CSF와 100 ng/ml의 IL-4가 보충된 RPMI1640 완전 배지)의 밀도로 24-웰 초저부착 (ultra-low attachment) 조직 배양 플레이트로 옮겼다. 렌티바이러스 양은 qPCR 렌티바이러스 적정 (역가) 키트 (ABM Cat# LV900-iC)로 계산하였다. 적정된 렌티바이러스 스톡을 37℃에서 해동하여 MOI 100으로 형질도입을 수행하였다. 분화 배지에서 적절한 부피의 바이러스 농축물을 6 ug/ml의 프로타민 설페이트 (Sigma-Aldrich Cat# 1578612-2)와 혼합하여 웰당 총 부피가 500 ul가 되도록 하였다. 37℃에서 12시간 항온배양 후, 추가로 500 ul의 분화 배지를 각 웰에 첨가하였다. 대부분의 배양 배지를 형질도입하고 24시간 후에 흡인하였고, 세포들을 PBS로 2회 세척한 후, 분화 배지에서 추가로 배양하였다. 5일째에, Mo-DC를 차후 공동 배양 실험을 위해 수집하거나, 또는 TNF-α (10 ng/ml; PeproTech) 및 LPS (3 ㎍/ml; Sigma-Aldrich)에 의해 24~48시간 동안 직접 성숙시켰다.
iPSC의 형질도입
본 발명의 조작된 세포 (예를 들어, CAR-DC)는 본원에 제공된 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터)를 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에 형질감염시켜 안정한 CAR 발현 세포주 (예를 들어, CARDF-hiPSC)를 제조함으로써도 제조될 수 있다. hiPSC는 불멸 증식하여 다양한 조직 세포들로 분화할 수 있는 능력을 지니고 있어, 질병의 세포 치료에 큰 잠재력을 가지고 있다. 본 발명에서는 OP9 기질세포 영양법 (Nat Protoc. 2011 March; 6(3): 296-313. doi: 10.1038/nprot. 2010.184)은 hiPSC의 DC로의 분화를 유도하는데 바람직하게 사용된다. 본 발명에서, hiPSC에서 처음 분화된 세포의 수는 바람직하게는 1×106 내지 1.5×106 개이고, 첫 배지는 바람직하게는 20% 소태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 MEM-α의 완전 배지이다. DC 세포 분화의 전 과정은 바람직하게는 약 31일 내지 38일이 소요된다. 본 발명의 CARDF-hiPSC는 대규모로 분화를 유도하여 균질한 CARDF-DC를 생성할 수 있다. hiPSC에서 유도된 CARDF-DC는, 상술한 바와 같이, TIME을 저해시키고, TIME을 염증유발 상태로 전환하며, 면역 억제성 종양 미세환경에서 DC를 활성화할 수 있는 등의 기능을 보유할 것으로 예상된다.
CAR-T 세포의 제조
1차 CD3+ T 세포를 PBMC로부터 분리한 뒤, 제조업체의 지침에 따라 인간 T 세포 활성화 키트로 활성화시켰다. 간략하게 설명하면, 12-웰 플레이트를 3 ug/mL의 PBS로 희석된 항-CD3 항체 (BD Cat# 555329; RRID:AB_395736)로 4℃에서 밤새 코팅하고, 다음날 상기 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, T 세포를 해동하여 T 세포 배지에서 1 ug/mL의 항-CD28 항체 (BD Cat# 555725; RRID:AB_396068)와 함께 플레이트로 옮겼다. 활성화는 2일간 지속되었고, 3일째에 활성화된 T 세포를 수확하여 나타낸 T-CAR 작제물을 발현하는 렌티바이러스로 감염시켰다. 간략히 설명하면, 형질도입 전에 T 세포를 웰당 5×105 개의 세포/400 uL의 T 세포 배지의 밀도로 24-웰 조직 배양 플레이트로 옮겼다. 적정된 렌티바이러스 스톡을 37℃에서 해동하여 MOI 10으로 형질도입을 수행하였다. 배지에서 적절한 부피의 바이러스 농축물을 10 ug/ml의 폴리브렌 (Sigma-Aldrich Cat# TR-1003-G)과 혼합하여 웰당 총 부피가 500 ul가 되도록 하였다. 37℃에서 12시간 항온배양 후, 추가로 500 ul의 배지를 각 웰에 첨가하였다. 형질도입 24시간 후, 세포를 수집하고, PBS로 2회 세척한 후, T 세포 배지에 재현탁하여 증식을 위한 배양을 계속하였다. 사멸 분석 당일에 (활성화 이후 거의 10일째), 세포를 수집하여 유세포 분석기로 분석한 후, 혈구계산기를 사용하여 세포수를 확인하였다.
시험관 내 T 세포 증식 분석
제조업체의 지침에 따라 1차 CD3+ T 세포를 CellTrace-CFSE (Life Technologies Cat# 65-0850-84)로 염색하였다. 본 실험에서, DC를 암 표적 (H460-CD19 세포, A549 세포 또는 A549-CP 세포)과 함께 48-웰 플레이트에서 1:1 비율로 48시간 동안 사전 배양한 다음, 1차 T 세포 (DC:T 세포=1:5)를 상기 공동 배양물에 첨가하였다. 다른 실험에서는, DC와 T 세포를 암 표적과 함께 동시에 배양하였다 (0일째). 구체적으로 명시하지 않는 한, 표적:DC:T 세포=1:1:5의 비율을 각각의 세포 공동 배양 조건에서 수행하였다. CD3+ T 생세포를 게이팅하는 유세포 분석법을 사용하여 증식을 분석하였다.
시험관 내 DC 및 종양 세포 공동 배양 분석
1×106 개의 H460-CD19 세포, A549 세포 또는 A549-CP 세포를 THP-1 또는 단핵구로부터 유래된 1×106 개의 모의-DC 또는 CAR-DC와 함께 6-웰 플레이트에서 공동 배양하고, 공동 배양 48시간 후에, 세포들을 37℃에서 5분간 0.25% 트립신-EDTA로 처리하고, PBS로 세척한 후, 상기 세포들을 형광색소가 접합된 항체 CD11C, CD80, CD86, HLA-ABC, HLA-DR로 직접 염색하여 유세포 분석기로 분석하였다.
시험관 내 사멸 분석
CD19 표적
대략 1×104 개의 H460 세포와 1×104 개의 H460-CD19 세포 (표적 세포)를 48-웰 플레이트의 각 웰의 200 ul의 RPMI1640 완전 배지에서 플레이팅하였고, 100 ul의 RPMI1640 배지 중 2×104 개의 WT-DC 또는 CARDF-DC (자극기 세포)를 상응하는 웰에 첨가의 각 웰에 첨가하였으며, 100 ul의 RPMI1640 배지 중 105 개의 CAR-T 세포 (효과기 세포)를 상응하는 웰에 첨가하였다. 부족한 웰들에서는 400 ul까지 배지를 계속 보충한다. 24시간 동안 항온배양한 후, 나머지 세포들은 유세포 분석을 위해 수집하고 후속 분석을 위해서 배양 상청액을 수집하였다. 특이적 세포용해의 백분율을 다음과 같이 각 웰에 대해 계산하였다: 특이적 용해율 (%) = (%CD19 (종양 세포 단독)-%CD19 (사멸군))/ CD19% (종양 세포 단독)×100%.
EphA2 표적
대략 1×104 개의 H460 세포와 1×104 개의 H460-CD19 세포 (표적 세포)를 48-웰 플레이트의 각 웰의 200 ul의 RPMI1640 완전 배지에서 플레이팅하였고, 100 ul의 RPMI1640 배지 중 2×104 개의 WT-DC 또는 CARDF-DC (자극기 세포)를 상응하는 웰에 첨가의 각 웰에 첨가하였으며, 100 ul의 RPMI1640 배지 중 105 개의 CAR-T 세포 (효과기 세포)를 상응하는 웰에 첨가하였다. 부족한 웰들에서는 400 ul까지 배지를 계속 보충한다. 12시간, 24시간 동안 항온배양한 후, 나머지 세포들은 유세포 분석을 위해 수집하고 후속 분석을 위해서 배양 상청액을 수집하였다.
IFN-γ 염색
A549-CP 종양 세포의 시험관내 사멸 분석 후, 잔류 세포들을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 세포내 염색 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 염색하였다. 간략하게 설명하면, 얼음 위에서 세포들을 200 ul의 고정/투과 완충액을 사용하여 20분간 고정 및 투과화시킨 다음, 1X 세척 완충액으로 2회 세척하였다. 세포들을 IFN-γ-BV650, CD3-V450, CD8-PE로 4℃에서 30분 동안 세척 완충액 중에서 염색한 다음, 유세포 분석 전에 1X 세척 완충액으로 2회 세척하였다.
IFN-γ 및 LDH 분석
시험관내 사멸 분석의 배양 상청액을 수집하고, 제조업체의 지침에 따라 ELISA 키트 (Invitrogen Cat# 88-7316-76)로 사이토카인 IFN-γ 수준을, 그리고 CytoTox96® 비방사성 세포독성 분석 (Promega Cat# G1780)으로 LDH 수준에 대해 시험하였다. 예비 실험에 따라 상청액을 1:50 또는 1:100으로 희석하였다.
NSG 마우스 연구에서 종양 이종이식 모델
A549WT 및 A549-CP 종양 모델은 6주령의 NSG 마우스의 양 옆구리에 100 ㎕의 PBS 중의 1.5×106 개의 세포를 피하 주사하여 만들었다. 본 실험에서, T 세포와 DC를, 500 ㎕의 PBS 중의 5x106 개의 DC 및 1x107 개의 CAR-T 세포의 정맥내 주사를 통해서 종양 면역유발 후 5일 및 14일째에 주입하였다. 종양의 부피는 캘리퍼 측량으로 측정하여 다음 공식을 사용해 계산하였다: 부피 (mm3) = 1/2×D×d2 (여기서, D는 종양의 장축이고, d는 종양의 단축임). 마우스를 안락사시켰을 때, 모든 종양들을 수집하여, 무게를 잰 후, 사진을 찍었다. 또한, 마우스의 비장과 혈액을 수집, 분리하여 단일 세포로 가공처리한 뒤, 나타낸 형광색소 접하된 항체로 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다.
Hu-마우스 연구에서 종양 이종이식 모델
Hu-마우스 생성에 대한 자세한 설명은, 예를 들어 문헌 [Rong Z et al., An Effective Approach to Prevent Immune Rejection of Human ESC-Derived Allografts. Cell Stem Cell 14, 121-130 (2014)]에서 찾아볼 수 있다. Hu-마우스 유래의 DC는 공개된 프로토콜에 따라 골수 세포로부터 분화 생성시켰다. 간략하게 설명하면, Hu-마우스의 대퇴골과 경골을 멸균 가위로 적출하여 70% 알코올에 3분간 담근 후, 매우 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음, 멸균 주사기 (26 게이지 바늘)를 사용하여 골수 세포를 씻어 냈다. 골수 세포를 재현탁시키고, 70 μm의 나일론 메쉬를 통과시킨 다음, 적혈구를 Lyse 완충액 (BD Bioscience)으로 용해시켰다. 잔류 세포들을 PBS로 2회 세척하여 계수하고, 20 ng/ml의 인간 GM-CSF 및 5 ng/ml의 인간 IL-4로 보충된 완전 RPMI-1640 배지를 사용하여 1×106 개의 세포/ml로 조정하였다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 3 ml의 세포 현탁액을 옮긴다. 상기 플레이트들을 부드럽게 휘저어 돌리고, 배지의 절반을 흡인한 후, GM-CSF 및 IL-4를 함유하는 새로운 배지를 첨가함으로써 배양 배지를 2일마다 교체하였다. 배양 9일 후, 세포들을 수집 및 세척하고, 항-인간 CD11C 항체로 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다. CARDF 형질도입을 위해, 형질도입 전에 미성숙 BM-DC를 웰당 50×105 내지 10×105 개의 세포/분화 배지 1 ml (20 ng/ml의 GM-CSF와 5 ng/ml의 IL-4가 보충된 RPMI1640 완전 배지)의 밀도로 24-웰 조직 배양 플레이트로 옮겼다. 적정된 렌티바이러스 스톡을 37℃에서 해동하여 MOI 100으로 형질도입을 수행하였다. 바이러스 농축물을 분화 배지 중에서 6 ug/ml의 프로타민 설페이트와 혼합한다. 37℃에서 12시간 항온배양 후, 추가로 1 ml의 분화 배지를 각 웰에 첨가하였다. 대부분의 배양 배지를 형질도입하고 24시간 후에 흡인하였고, 세포들을 PBS로 2회 세척한 후, 사용할 때까지 분화 배지에서 추가로 배양하였다.
Hu-마우스의 T 세포는 비장 세포로부터 분리하여 생성하였다. 간략히 설명하면, Hu-마우스의 비장을 멸균 핀셋으로 적출하여 매우 차가운 PBS에 3분간 담근 후, 주사기 바닥을 사용하여 70 μm의 나일론 메쉬 표면에 분쇄하였다. 단일 세포들을 메쉬를 통해 플러슁하고 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 적혈구를 용해시켰다. T 세포를 항-인간 CD3 자성 마이크로비드로 분리한 후, 100 U/ml의 인간 IL-2를 첨가한 RPMI 1640 완전 배지에서 보관하였다. CAR-T 세포를 상기 언급한 대로 제조하였다.
Matrigel을 첨가한 100 ㎕의 PBS 중 1.5×106 개의 A549 세포를 Hu-마우스의 양 옆구리에 피하 접종하였다. 8일 후에, 종양이 있는 Hu-마우스를 무작위로 4개의 코호트로 나누었다. 본 실험에서, 400 ㎕의 PBS 중의 3×106 개의 DC 및 1×107 개의 CAR-T 세포를 사용해 DC 및 T 세포를 꼬리 정맥내 주사를 통해 주입하였다. Matrigel을 첨가한 100 ㎕의 PBS 중 2×106 개의 H460 세포를 Hu-마우스의 양 옆구리에 피하 접종하였다. 13일 후에, 종양이 있는 Hu-마우스를 무작위로 4개의 코호트로 나누었다. 본 실험에서, 400 ㎕의 PBS 중의 3×106 개의 DC 및 1×107 개의 CAR-T 세포를 사용해 DC 및 T 세포를 꼬리 정맥내 주사를 통해 주입하였다. 종양의 부피는 캘리퍼 측량으로 측정하여 다음 공식을 사용해 계산하였다: 부피 (mm3) = 1/2×D×d2 (여기서, D는 종양의 장축이고, d는 종양의 단축임). 마우스를 안락사시켰을 때, 분석을 위해 종양, 비장, 골수 및 혈액을 수집하였다.
종양 조직의 소화 및 염색
Hu-마우스 한마리에 이식했던 수확된 한쌍의 종양을 혼합하고, 패치로 절단하여 조직 소화 효소 용액 [100 Kunitz 단위의 DNaseI (STEM CELL Cat# 07900), 8 Wunsch 단위의 Liberase™ TM (Sigma Cat# LIBTM-RO) (8 U/mL) 및 20 μM의 HEPES (GIBCO)를 포함하는 배지 199 (GIBCO)에서 Liberase™ TH (Sigma Cat# LIBTH-RO)(8 U/mL)]를 사용하여 분해하였다. 37℃, 150 rpm에서 1.5시간 동안 진탕한 후, 10% FBS를 포함하는 5 mL의 RPMI-1640을 첨가하여 소화를 중지시켰다. 이어서, 현탁액을 40 μm의 세포 스트레이터 (Corning)를 통해 여과하고 획득한 세포들은 유세포 분석을 위해 항체 염색하였다.
유세포 분석
모든 유세포 분석은 LSR Fortessa (BD Biosciences)에 의해 수행하였다. 흐름 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, 미국 오리건주 애슐랜드 소재)를 사용하여 분석하였다. 관련 샘플 게이팅은 확장된 데이터 수치로 제공하였다. 형광색소가 접합된 항체 APC-CD45, PE-CD11C, FITC-CD80, BV605-CD86, PE-cy7-CD83, APC-HLA-ABC, BV510-HLA-DR, V450-CD3, PE-cy7-CD3, BV421-TIM-3, PE-PD-1, PE-CD8, BV650-IFNγ, BV421-IFNγ, FITC-PDL1, Percp-cy5.5-CD19, PE-cy5-스트렙타비딘, APC-스트렙타비딘은 BD Sciences에서 구입하였고, FITC-TIM-3은 Miltenyi Biotech에서, 비오틴-단백질 L은 GenScript에서, PE-EphA2는 BioLegend에서 구입하였다. 수지상 세포 염색 분석을 위해, FcR 차단 시약 (Miltenyi Biotech)을 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 표면 마커 염색을 위해, 세포들을 스핀다운시키고 FACS 완충액(PBS+1% FBS+ 2 mM의 EDTA) 중에서 4℃로 30분간 제조업체의 지침에 따라 희석된 항체로 염색한 후, PBS로 2회 세척한 즉시 유세포 분석기로 분석하였다. 단백질 L 염색은 제조업체의 지침에 따르면 2차 항체 염색이 필요하였다. 항체에 관한 세부적인 사항은 도 10a를 참조한다.
통계 분석
통계 분석은 적절한 통계적 비교, 예컨대 독립표본 양측 t-검정 + 웰치 (Welch)의 보정, 일원 분산분석 ANOVA + 터키 (Tukey)의 다중 비교 시험, 이원 분산분석 ANOVA 이후 필요에 따라 Prism7 (GraphPad 소프트웨어)에 의한 터키의 다중 비교 시험을 사용하여 수행하였다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. P ≤ 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 9
보충 자료
재료 및 방법:
THP-1 세포 형질도입 및 DC로의 분화
간략히 설명하면, 형질도입 전에 THP-1 세포를 웰당 5×105 개의 세포/400 uL의 RPMI1640 완전 배지의 밀도로 24-웰 조직 배양 플레이트로 옮겼다. 적정된 렌티바이러스 스톡을 37℃에서 해동하여 MOI 10으로 형질도입을 수행하였다. RPMI1640 완전 배지에서 적절한 부피의 바이러스 농축물을 6 ug/ml의 프로타민 설페이트와 혼합하여 웰당 총 부피가 500 ul가 되도록 하였다. 37℃에서 12시간 항온배양 후, 추가로 500 ul의 배지를 각 웰에 첨가하였다. 대부분의 배양 배지를 형질도입하고 24시간 후에 흡인하였고, 세포들을 PBS로 2회 세척한 후, 추가로 배양하였다. 3일째에, 세포들을 수집하여 유세포 분석기로 형질도입 효율을 분석하였다.
THP-1 또는 CAR+ THP-1 세포를 수확하여 RPMI1640 완전 배지 중에 2×105 개의 세포/ml의 밀도로 재현탁시킨 다음, 3 ml의 모든 세포 현탁액을 6-웰 플레이트 중의 한 웰로 옮겼다. 재조합 인간 GM-CSF (100 ng/ml)와 재조합 인간 IL-4 (100 ng/ml)를 배양 배지 중에 포함시켜 DC 분화를 자극시킨다. 배양 배지를 2일 내지 3일마다 신선한 사이토카인이 보충된 배지로 교체하였다. 사이토카인의 존재 하에서의 DC 분화는 추가의 실험 전 적어도 7일 내지 10일간 지속되었다.
렌티바이러스 제조
렌티바이러스 패키징을 위한 플라스미드 DNA를 제조업체의 지침에 따라 NucleoBond Xtra Midi EF 키트 (Takara Bio Cat# 740420.50)로 정제하였다. PEI 패키징 방법은 Addgene의 렌티바이러스 제조 프로토콜에 따르되 약간 변형시켜 수행하였다. 간략하게 설명하면, 293FT 패키징 세포를 1:3 희석 비율로 15cm 디쉬에 플레이팅하고, 다음 날 전면생장율이 90%에 도달하면, 배지를 형질감염 1시간 전에 교체하고, 2개의 패키징 플라스미드 psPAX2 (AddgeneCat# 12260)와 pMD2.G (AddgeneCat# 12259)를 표적 플라스미드와 함께 Opti-MEM (Gibco) + 1 mg/ml의 PEI 중에서 DNA:PEI 비율 1:3-1:4로 희석하였다. 실온에서 20분 항온배양 후, 플라스미드 혼합물을 세포에 천천히 첨가하고 배지를 형질감염 8시간 후 완전 DMEM 배지로 교체하였다. 렌티-X 농축기 (Takara Bio Cat# 631232)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 형질감염 48-72시간 후에 렌티바이러스 입자들을 수확하였다. 요약하면, 수집된 배지를 1500 g으로 15분간 원심분리하고 상청액을 1/3 부피의 렌티-X 농축기를 사용하여 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 4℃에서 45분간 3000 rpm으로 원심분리한 후, 바이러스 펠릿을 0.6-0.8 ml의 차가운 PBS에 재현탁하고, 분취하여 -80℃로 보관하였다.
정량적 PCR 분석
과거 설명된 바와 같이 Trizol 시약 (TaKaRa)을 사용하여 세포 또는 종양 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 PrimeScript RT 시약 키트 (TaKaRa Cat# RR047A)를 사용하여 1 ㎍의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 제조업체의 지침에 따라 TB Green 시약 (TaKaRa Cat# RR820A)과 함께 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems) 및 Roche System (Lifescience)을 사용하여 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 프라이머 서열은 도 10b에 도시하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
SEQUENCE LISTING <110> Shenzhen FrontierGate Biotechnology Co., LTD Guangdong SanSci Biotechnology Co.，LTD <120> DENDRITIC CELL ACTIVATING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND USES THEREOF <130> 082971-8001WO01 <150> 202110022268.5 <151> 2021-01-08 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Arg Trp Pro Pro Ser Ala Ala Cys Ser Gly Lys Glu Ser Val Val Ala 1 5 10 15 Ile Arg Thr Asn Ser Gln Ser Asp Phe His Leu Gln Thr Tyr Gly Asp 20 25 30 Glu Asp Leu Asn Glu Leu Asp Pro His Tyr Glu Met 35 40 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 2 Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys 1 5 10 15 Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr 20 25 30 Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln 35 40 <210> 3 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 Arg Trp Pro Pro Ser Ala Ala Cys Ser Gly Lys Glu Ser Val Val Ala 1 5 10 15 Ile Arg Thr Asn Ser Gln Ser Asp Phe His Leu Gln Thr Tyr Gly Asp 20 25 30 Glu Asp Leu Asn Glu Leu Asp Pro His Tyr Glu Met Arg Leu Lys Ile 35 40 45 Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val 50 55 60 Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys 65 70 75 80 His Glu Lys Pro Pro Gln 85 <210> 4 <211> 258 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 4 cgctggcctc cttctgcagc ttgttcggga aaagagtcag ttgttgctat aaggaccaat 60 agccaatctg acttccactt acaaacttat ggagatgaag atttgaatga attagatcct 120 cattatgaaa tgcgactgaa gatccaagtg cgaaaggcag ctataaccag ctatgagaaa 180 tcagatggtg tttacacggg cctgagcacc aggaaccagg agacttacga gactctgaag 240 catgagaaac caccacag 258 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 7 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 8 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 8 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 180 185 190 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 255 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 260 265 270 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 275 280 285 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 315 320 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 9 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 10 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 11 Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 12 Glu Ala Ile Phe Thr His 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 13 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr His Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 14 Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 15 Leu Lys Tyr Asn Val Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 16 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 16 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 17 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 His Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Val Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 18 Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn 145 150 155 160 Asn Tyr His Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile 195 200 205 Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Val Phe 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 19 cagagcctcg cctttgccga tc 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 20 catccatggt gagctggcgg cg 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 21 ggggcaagat ggtaatgaag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 22 ccaggatact gagggcatgt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 23 gcacttcctc cagaggtttg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 24 tcaccaggat gctcacattt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 25 gctgcacttt ggagtgatcg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 26 tcactcgggg ttcgagaaga 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 27 cccagcatct gcaaagctc 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 28 gtcaatgtac agctgccgca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 29 ggcttttcag ctctgcatcg 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 cgctacatct gaatgacctg c 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 31 tctgagcaga ccctggtaca 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 32 gcaaggtaat gggggtcaca 20 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 33 ccaaccacag cttcatgtgt c 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 34 aaagcagtag gtcaggcagc 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 35 acgacgtttc catcagcttg t 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 36 tccaaggaat gtggtctggg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 37 tacccaccgc catactacct 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 38 ctcagggtct tcgtggctca 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 39 ccattccgct aggaaagaca a 21 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 40 cctgtgttct 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60 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 60 Tyr Glu Thr Leu 1

Claims (78)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 CAR이 (1) 세포외 항원 결합 도메인, (2) 막관통 도메인 및 (3) 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 상기 CAR이 면역 억제성 종양 미세환경에서 수지상 세포를 활성화할 수 있는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 억제성 종양 미세환경이 1) 면역 억제성 분자를 발현하고/하거나, 2) 면역 자극 사이토카인이 결핍된 종양 및/또는 종양 침윤성 면역 세포를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 면역 억제성 분자가 PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), HLA 클래스 I, 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 면역 억제성 분자가 CTLA-4 및/또는 PD-L1인 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제2항에 있어서, 상기 면역 자극 사이토카인이 TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제2항에 있어서, 상기 종양이 CTLA4-Ig 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 면역 억제성 종양 미세환경이 입양 세포 요법의 단일요법 (예를 들어, CAR-T 단일요법)에 대해 반응성이 좋지 않은 종양을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 RIG-1, NLRP10, DEC-205, BDCA-2, CD86, 4-1BBL, OX40L, CD40, IFNAR, TLR4, TNFR (예를 들어, TNFR2), CD80, CD40L, CD367 (DCIR), CD207 (Langerin), CD371 (DCAL-2, CLEC12a), CD204, CD36, IFNγR, Dectin-1 및 FcγR, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지상 세포 활성화 수용체의 세포질 도메인을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 Dectin-1의 세포질 도메인과 FcγR의 세포질 도메인을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 Dectin-1의 세포질 도메인과 FcγR의 세포질 도메인이 일렬로 (in tandem) 연결되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 Dectin-1의 세포질 도메인이 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 FcγR의 세포질 도메인이 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인이 서열번호 4에 기재된 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열, 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인이 단쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 scFv가 종양 표면 마커 (예를 들어, 고형 종양 표면 마커)에 특이적인 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 종양 표면 마커가 EphA2, CD19, CD70, CD133, CD147, CD171, DLL3, EGFRvIII, 메소텔린, 강글리오사이드 GD2, FAP (섬유아세포 활성화 단백질), FBP (엽산 결합 단백질), Lewis Y, Claudin 18.2, IL13Rα2, HER2, MDC1, PMSA (전립선막 특이적 항원), ROR1, B7-H3, CAIX, CD133, CD171, CEA, GPC3, MUC1 및 NKG2D로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 신호 펩타이드가 CD8 알파의 신호 펩타이드를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 CD8 알파의 신호 펩타이드가 서열번호 5에 기재된 서열 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인이 CD8 알파의 막관통 도메인을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 CD8 알파의 막관통 도메인이 서열번호 6에 기재된 서열 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 항원 결합 도메인이 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 힌지 영역이 CD8 알파의 힌지 영역을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 CD8 알파의 힌지 영역이 서열번호 7에 기재된 서열 또는 이의 임의의 기능적 형태를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 또는 RNA인, 폴리뉴클레오타이드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로서, 상기 CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 해당 CAR의 발현을 위해 적어도 하나의 조절 폴리뉴클레오타이드 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 것인, 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 전이성 유전자 (transposon), 부위 지정 삽입 벡터 또는 자살 발현 벡터인 것인, 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 AAV 벡터인 것인, 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 것인, 벡터.
  32. 제27항의 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 세포.
  33. 제32항에 있어서, 상기 조작된 세포가 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포인 것인, 조작된 세포.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포가 말초 혈액 세포, 골수 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도형 만능 줄기 세포로부터 유래되는 것인, 조작된 세포.
  35. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드의 발현에 적절한 조건 하에 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터를 출발 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조작된 세포를 제조하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 출발 세포가 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포인 것인, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 수지상 세포 또는 이의 전구체 또는 전구 세포가 말초 혈액 세포, 골수 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도형 만능 줄기 세포로부터 유래되는 것인, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생체 외에서 제조된 세포군.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포군의 적어도 70%가 검출가능한 수준의 제27항의 폴리펩타이드를 발현하는 것인, 세포군.
  40. 약제학적 조성물로서, (i) 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드, 또는 제27항의 폴리펩타이드, 또는 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조작된 세포의 군, 또는 제38항 또는 제39항의 세포군, 및 (ii) 약제학적으로 허용가능한 매질을 포함하는, 약제학적 조성물.
  41. 암 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는데 있어서 입양 세포 요법의 효능을 개선하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제40항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 입양 세포 요법이 변형된 면역 세포의 입양 전달을 포함하는 것인, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 변형된 면역 세포군을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 방법이 변형된 면역 세포군을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포는 세포 표면 상에 합성 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)가 발현되는 것인, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구인 것인, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 면역 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포인 것인, 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 자가유래성 또는 동종이계성인 것인, 방법.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 눈암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 기관지폐포 세포 폐암, 중피종, 두경부암, 편평세포암종, 흑색종, 구강암, 난소암, 자궁경부암, 음경암, 전립선암, 췌장암, 피부암, 육종, 고환암, 갑상선암, 자궁암 및 질암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고형암인 것인, 방법.
  50. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 광범위 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 림프절외 NK/T 세포 림프종, HHV8 관련 원발성 삼출액 림프종, 형질모세포 림프종, 원발성 CNS 림프종, 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구가 풍부한 B 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 및 다발성 골수종 (MM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액암인 것인, 방법.
  51. 면역 억제성 미세환경에서 면역 세포의 증식을 유도하고, 면역 세포의 생존을 연장하고/하거나, 면역 세포로부터 면역 자극 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 방법으로서, 상기 면역 억제성 미세환경과 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조작된 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구인 것인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 면역 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포인 것인, 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 자가유래성 또는 동종이계성인 것인, 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 억제성 미세환경이 면역 억제성 종양 미세환경인 것인, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 면역 억제성 종양 미세환경이 종양 및/또는 면역 억제성 분자를 발현하는 종양 침윤성 면역 세포를 포함하는 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 면역 억제성 분자가 PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 면역 억제성 분자가 CTLA-4 및/또는 PD-L1인 것인, 방법.
  59. 제56항에 있어서, 상기 종양이 CTLA4-Ig 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함하는 것인, 방법.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 자극 사이토카인이 TNF-α, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 중 하나 이상인 것인, 방법.
  61. 질병 또는 병리학적 상태의 치료가 필요한 대상체에서 해당 질병 또는 병리학적 상태를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제40항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 제2 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 제2 요법이 변형된 면역 세포의 군인 것인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 제2 요법이 CAR-T 요법인 것인, 방법.
  65. 제61항에 있어서, 상기 질병이 암을 포함하는 것인, 방법.
  66. 하기 단계를 포함하는, 수지상 세포를 활성화할 수 있는 CAR을 선별하는 방법:
    (a) 면역 억제성 종양 미세환경을 포함하는 인간이 아닌 동물을 제공하는 단계,
    (b) 후보 CAR을 발현하는 수지상 세포를 상기 인간이 아닌 동물에 투여하는 단계,
    (c) 기준 수지상 세포와 비교하였을 때, 상기 면역 억제성 종양 미세환경에 대한 침윤 개선, 생존율 개선 및 면역 세포 활성화 유도 기능 강화로부터 선택되는 수지상 세포 활성화를 위한 마커를 검출하는 단계, 및
    (d) 수지상 세포를 활성화할 수 있는 CAR로서 상기 후보 CAR을 선별하는 단계.
  67. 제66항에 있어서, 상기 면역 억제성 종양 미세환경이 임상적으로 적절한 것인, 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 인간이 아닌 동물이 인간 태아 흉선 및 자가유래성 인간 조혈 줄기 세포 (예를 들어, 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포)를 포함하는 것인, 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 면역 억제성 종양 미세환경이 종양 및/또는 면역 억제성 분자를 발현하는 종양 침윤성 면역 세포를 포함하는 것인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 면역 억제성 분자가 PD-1, TIM-3, TIGIT, LAG-3, A2AR, BTLA (CD272), CTLA-4 (CD152), IDO1, IDO2, TDO, NOX2, VISTA, SIGLEC7 (CD328), PVR (CD155) 및 SIGLEC9 (CD329), PD-L1, PD-L2, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), PVR (CD155), HLA 클래스 I, 시알로당단백질, CD112, CD113, 갈렉틴9, CD24 및 CD47로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 면역 억제성 분자가 CTLA-4 및/또는 PD-L1인 것인, 방법.
  72. 제69항에 있어서, 상기 종양이 CTLA4-Ig 및/또는 PD-L1을 발현하는 세포를 포함하는 것인, 방법.
  73. 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호산구 또는 호중구인 것인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 면역 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 세포독성 T 세포, 말단 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 미감작 T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마-델타 T 세포, 사이토카인 유도형 살해 (CIK) T 세포 및 종양 침윤성 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 T 세포인 것인, 방법.
  75. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 자가유래성 또는 동종이계성인 것인, 방법.
  76. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포가 변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-T 세포) 또는 천연 면역 세포인 것인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-T 세포)가 후보 CAR을 발현하는 수지상 세포와 함께 투여되는 것인, 방법.
  78. 제66항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간이 아닌 동물이 랫트와 마우스와 같은 설치류인 것인, 방법.
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