CN115957335B - 基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物、制备方法及应用 - Google Patents
基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物、制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物、制备方法及应用，所述制备方法为，将嵌合抗原受体转染单核细胞，筛选获得CAR‑单核细胞系，再与靶向药物共孵育，经膜挤压、离心纯化后得到。所述单核细胞外囊泡类似物具有胶质母细胞瘤细胞趋化性与特异性识别能力，通过负载盐酸多柔比星靶向杀伤胶质母细胞瘤，绕过血脑屏障，可通过三叉神经与嗅神经鼻内分支实现更有效的颅内给药效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物、制备方法及应用。
背景技术
细胞源性微囊泡是细胞在激活、损伤或调信时经出芽方式释放的一类直径介于100～1000nm的膜性囊泡。细胞源性微囊泡携带母体细胞特征性生物信息分子(如脂质，蛋白质，DNA，mRNA，miRNA)，并可作为细胞间运输载体将这些生物分子传递给其他细胞。基于其生物信息分子传递功能，近来年越来越多的学者致力于将细胞源性微囊泡改造成药物释放纳米载体。与人工合成的纳米载体相比，细胞源性微囊泡具有多重优势：1)在药物到达肿瘤部位前，细胞源性微囊泡的双层磷脂结构可保护包裹于微囊泡内的药物，防止药物被降解或被代谢；2)细胞源性微囊泡到达肿瘤部位后，其双层磷脂结构可与肿瘤细胞膜直接融合，促进微囊泡内药物的释放；3)细胞源性微囊泡可透过生理屏障(如血脑屏障)，并将药物有效释放于脑组织治疗脑部疾患；4)研究表明，未经修饰的细胞源性微囊泡即具有一定的肿瘤靶向性；5)细胞源性微囊泡具有更强的循环稳定性，可有效延长药物在体内的半衰期；6)最重要的是，多项临床试验结果表明，自身来源的微囊泡几乎没有免疫原性和毒性，而人工合成的纳米载体在免疫原性和毒性方面仍然存在不可回避的安全隐患。
胶质母细胞瘤因其中枢神经系统的肿瘤定位，化疗受限于血脑屏障对于药物的屏障功能，盐酸多柔比星作为一种临床常用的化疗药物，本身不可透过血脑屏障，为靶向杀伤胶质母细胞瘤带来了瓶颈。
细胞外囊泡作为从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，本身具有跨过血脑屏障的能力。尽管如此，细胞天然分泌的细胞外囊泡存在产量低下，分离，纯化及载药流程繁琐的缺陷，限制了其作为药物载体的应用。
有鉴于此，有必要提供一种基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物的制备方法及其应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物、制备方法及其应用，解决化疗药物因血脑屏障的瓶颈难以靶向杀伤胶质母细胞瘤的问题。
一种基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物的制备方法，将嵌合抗原受体转染单核细胞，筛选获得CAR-单核细胞系，再与靶向药物共孵育，经膜挤压、离心纯化后得到。
进一步地，所述嵌合抗原受体为特异性识别EGFRvIII抗原的抗原嵌合受体，通过慢病毒载体形式转导到细胞系。
进一步地，所述单核细胞为人单核细胞白血病细胞系THP-1细胞。
进一步地，所述膜挤压依次通过10μm、5μm、1μm、200nm的滤膜。
进一步地，所述离心条件为，100000～120000g，2～3h。
本发明提供以上所述制备方法制得的基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物，所述单核细胞外囊泡类似物具有细胞外囊泡标志物及单核细胞肿瘤趋化因子受体。
进一步地，所述细胞外囊泡标志物包括CD9、CD63及TSG101。
进一步地，所述单核细胞肿瘤趋化因子受体包括CCR2、CXCR4及CSF1R。
本发明提供以上所述基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用，所述靶向药物包含治疗脑胶质瘤的药物。
进一步地，所述基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物制备过程中，单核细胞溶液中细胞个数为1×107个/ml，所述靶向药物为盐酸多柔比星，体积为10ml，浓度为400ug/ml。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明提供的制备方法利用来源于基于单核巨噬细胞胶质母细胞瘤细胞的趋化性与嵌合抗原受体对于肿瘤表明特异性抗原的特异性识别能力，转染CAR-单核细胞，并以其制备细胞外囊泡类似物(Extracellular vesicles Mimetics)，使所获得的类似物具有胶质母细胞瘤细胞趋化性与特异性识别能力，可载靶向药物杀伤胶质母细胞瘤。
2.本发明提供的制备方法获得的基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物相比天然细胞外囊泡而言产率显著提高，用于制备杀伤胶质母细胞瘤的靶向药物具有较好的应用前景。
3.本发明提供的基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物可绕过血脑屏障，通过三叉神经与嗅神经鼻内分支达到更有效的颅内给药效率。此外，应用于经鼻给药明显降低了裸鼠的盐酸多柔比星药物心脏富集，即具有降低盐酸多柔比星心脏毒性能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明CAR-EVM@DOX与EVM@DOX的NTA粒径分析对比结果。
图2为本发明CAR-EVM@DOX与EVM@DOX的透射电镜拍摄对比结果。
图3为本发明CAR-EVM@DOX蛋白质印迹检测结果。
图4为本发明CAR-EVM@DOX载药共定位分析及共聚焦及共聚焦半定量分析结果。
图5为本发明采用纳米流式检测CAR分子的材料表面修饰结果。
图6为本发明CAR-EVM@DOX与CAR-EVM材料产率对比结果。
图7为本发明实施例3实验组与对照组不同给药方式DiR用于标记示踪材料显色结果。
图8为本发明实施例3中CAR-EVM@DOX intranasal(经鼻给药组)进行脑切片的显色结果。
图9为本发明实施例4中实验组与对照组不同给药方式下对胶质母细胞瘤的疗效结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明基于单核巨噬细胞胶质母细胞瘤细胞的趋化性与嵌合抗原受体对于肿瘤表明特异性抗原的特异性识别能力，通过转染CAR-单核细胞，并以其制备细胞外囊泡类似物(Extracellular vesicles Mimetics)，使所获得的类似物具有胶质母细胞瘤细胞趋化性与特异性识别能力，并载盐酸多柔比星靶向杀伤胶质母细胞瘤。
本发明提出的基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物负载有盐酸多柔比星作为化疗药物，克服静脉给药存在较广泛的体内分布与代谢过程且难以跨过血脑屏障到达病灶的缺陷，采用鼻内给药方式，绕过血脑屏障，通过三叉神经与嗅神经鼻内分支达到更有效的颅内给药效率。
本发明实施例中的THP-1人单核细胞白血病细胞系为商品化细胞系，购自ATCC细胞库。
本发明所使用的其他常规试剂和设备，如无特殊说明，均可市售获得。
实施例1基于嵌合抗原受体修饰的细胞外囊泡类似物的制备及表征
1.1细胞转染：通过将CAR-EGFRvIII慢病毒转染THP-1人单核细胞白血病细胞系得到CAR-单核细胞。转染步骤：1×105细胞，1×108滴度CAR-EGFRvIII病毒20ul共孵育转染18h后换液培养，经流式分选后获得CAR-单核细胞系。
1.2CAR-EVM@DOX制备与纯化
1)共孵育：将转染得到的CAR-单核细胞溶液与盐酸多柔比星溶液混匀后37℃孵育10min，依次挤压通过10μm、5μm、1μm、200nm孔径的滤膜(选用聚碳酸酯膜)后，得到CAR-EVM@DOX粗制液；单核细胞溶液中细胞个数为1×107个/ml，盐酸多柔比星溶液体积为10ml，浓度为400ug/ml。
2)细胞外囊泡类似物的纯化：将步骤1)中得到的CAR-EVM@DOX粗制液进行超速离心，参数如下为100000～120000g，2～3h。沉淀用缓冲液洗涤后，得到纯化的CAR-EVM@DOX。
1.3细胞外囊泡类似物的表征
分别对未嵌合抗原受体修饰EVM@DOX、嵌合抗原受体修饰的细胞外囊泡类似物CAR-EVM@DOX对纳米颗粒跟踪分析(NTA)，如图1所示，证实制备的CAR-EVM@DOX(图1B)与对照组EVM@DOX(图1A)粒径大多数位于200nm以下。透射电镜拍摄结果如图2所示，图2A中EVM@DOX与图2B中CAR-EVM@DOX粒径大部分在200nm以下。
1.4细胞外囊泡类似物蛋白质印迹检测
对制备得到的细胞外囊泡类似物CAR-EVM@DOX进行蛋白质印迹检测如图3所示，WB证明CAR-EVM@DOX具有细胞外囊泡常见标志物(CD9 CD63TSG101)，具有单核细胞表面重要肿瘤趋化因子受体(CCR2 CXCR4 CSF1R)，即CAR-EVM@DOX具有被胶质母细胞瘤细胞驱化的能力。
1.5细胞外囊泡类似物载药共定位分析及共聚焦及共聚焦半定量分析
以PKH67对制备得到的细胞外囊泡类似物CAR-EVM@DOX进行染色，并进行载药共定位分析及共聚焦及共聚焦半定量分析，如图4所示，图4A代表共聚焦拍摄图，显示CAR-EVM与盐酸多柔比星(DOX)荧光信号重叠，证明DOX包载成功。图4B为共聚焦摄片的半定量分析，证明材料包被成功。
1.6纳米流式检测CAR分子的材料表面修饰
采用纳米流式检测CAR分子的材料表面修饰，结果如图5所示，其中：EVM@DOX为未转染CAR分子的单核细胞细胞外囊泡类似物包载DOX(阴性同型对照)，Mock为全阴空白对照，CAR-EVs(Extracellular vesicles)为CAR-单核细胞天然分泌的细胞外囊泡(粒径<200nm)，证实本发明所述制备方法合成的CAR-EVM@DOX，相比天然的CAR-EVs具有更高的CAR分子丰度。
1.7CAR-EVM@DOX材料产率分析
以同等数量的细胞，对照组采用转染获得的CAR-单核细胞系直接进行相同条件下的膜过滤、高速离心纯化，然后用缓冲液洗涤得到天然细胞外囊泡CAR-EVs。分析CAR-EVM@DOX数量与CAR-EVs数量，结果如图6所示，本方法所制备的细胞外囊泡类似物CAR-EVM@DOX数量是天然细胞外囊泡CAR-EVs的165.8倍。
实施例2体外血脑屏障模型的建立，并检测CAR-EVM@DOX的跨血脑屏障靶向下室胶质母细胞瘤细胞能力
通过于24孔Transwell板上室膜上预包被薄层基质胶后，于上室接种培养单层bEnd.3细胞1×105个，下室接种培养U87MG/原代胶质母细胞瘤细胞5×104个，以TEER值(转移上皮电阻)大于300Ωcm2作为体外血脑屏障模型构建成功的指标。
构建的体外血脑屏障模型，并通过细胞外囊泡染色及屏障模型各细胞染色，通过共聚焦检测制备的CAR-EVM@DOX的跨血脑屏障靶向下室胶质母细胞瘤细胞能力。
实施例3经鼻给药小鼠疗效实验
通过细胞外囊泡类似物染色DiR染料，各组裸鼠CAR-EVM@DOX中盐酸多柔比星动物给药剂量均控制为3mg/kg，鼻内滴鼻24h后，小鼠安乐死取脑组织与心脏组织，活体成像中行DiR显色，CAR-EVM@DOX通过DiR染色可在组织中显色，检测CAR-EVM@DOX在荷瘤小鼠经鼻给药后对于胶质母细胞瘤的趋化性能，并与尾静脉注射跨血脑屏障给药模式进行对比，以此检测两种给药模式下细胞外囊泡类似物的胶质母细胞瘤摄取量与分布情况。
DiR显色结果如图7所示，此处荧光均为DiR染料活体成像拍摄的激发荧光-所有组分裸鼠均接种表达EGFRvIII靶点与Luc标签(活体成像用)的U87 MG肿瘤细胞。其中：DiRIntranasal：鼻内给DiR染料(对照组)；EVM@DOX Intranasal(经鼻给EVM@DOX)；CAR-EVM@DOX Intranasal(经鼻给CAR-EVM@DOX，此组为实验组)；CAR-EVM@DOX intravenous(尾静脉给CAR-EVM@DOX，此组为静脉给药对照组)
图7左侧显示：相比其他组分，经鼻给药CAR-EVM@DOX显示出更高的脑内材料富集，证明所述材料具有很强的U87 EGFRvIII阳性细胞靶向性；图7右侧显示：相比静脉给药，经鼻给药显示出更少的药物心脏部位聚集，且CAR-EVM@DOX Intranasal组显示出更低的材料心脏富集，证实CAR-EVM@DOX经鼻给药明显降低了裸鼠的DOX药物心脏富集，即具有降低盐酸多柔比星心脏毒性能力。
对CAR-EVM@DOX intranasal组进行脑切片得到图8的结果，图中白色斑点为CAR-EVM@DOX(箭头所示)，灰色斑点为Nucleus，很明显地发现，肿瘤区域内CAR-EVM@DOX富集明显，而非肿瘤区几乎没有。相比非肿瘤区，肿瘤区体现了显著的CAR-EVM@DOX的富集，证实所述材料的肿瘤靶向能力。
实施例4对胶质母细胞瘤的疗效实验
首先构建表达EGFRvIII抗原的U87 MG细胞系和不表达EGFRvIII的U87MG细胞系(两种细胞系前期均以构建为荧光素酶阳性)，分别进行裸鼠成瘤后，给药方式两种：intranasal经鼻给药，intravenous经尾静脉给药，按下列组分进行给药：
Saline intranasasl：经鼻给生理盐水，即肿瘤对照；
DOX Intranasal：经鼻给盐酸多柔比星溶液，单纯药物对照组；
EVM@DOX intranasal：经鼻给材料，为对照组1；
CAR-EVM@DOX intranasal：经鼻给材料，实验组；
CAR-EVM@DOX intravenous：经尾静脉给药，为对照组2。
给药时间为肿瘤细胞植入(Day 0)后11-14-17-20-23天(5次给药，每次每只裸鼠剂量为盐酸多柔比星3mg/kg，CAR-EVM@DOX中盐酸多柔比星剂量与其一致)，在10-17-24天将裸鼠经异氟烷气体麻醉后，腹腔注射荧光素钠以标记荧光素酶基因阳性的脑胶质瘤U87MG细胞在活体成像中显色，以此来检测CAR-EVM@DOX在荷瘤小鼠经鼻给药后对于胶质母细胞瘤的治疗效果。显色情况如图9所示，此处荧光代表活体成像肿瘤，所有裸鼠均接种稳定表达EGFRvIII抗原与Luc标签(活体成像用)的U87 MG肿瘤细胞。图9中的显色结果不难看出，CAR-EVM@DOX intranasal实验组具备最好的治疗效果；EVM@DOX intranasal对照组1中，由于肿瘤细胞不表达EGFRvIII抗原，不被CAR分子识别，故相比实验组治疗效果弱；CAR-EVM@DOX intravenous对照组2相比实验组肿瘤缓解较弱，但因其CAR分子可识别EGFRvIII，相比CAR-EVM@DOX intranasal有更好的肿瘤缓解能力。
以上实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用，其特征在于，所述药物为鼻内给药药物；所述单核细胞外囊泡类似物的制备方法为：将嵌合抗原受体转染单核细胞，筛选获得CAR-单核细胞系，再与靶向药物共孵育，经膜挤压、离心纯化后得到；所述嵌合抗原受体为特异性识别EGFRvIII抗原的抗原嵌合受体；
所述膜挤压依次通过10μm、5μm、1μm、200nm的滤膜；所述离心条件为，100000～120000g，2～3h。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合抗原受体通过慢病毒载体形式转导到细胞系。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单核细胞为人单核细胞白血病细胞系THP-1细胞。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基于嵌合抗原受体修饰的单核细胞外囊泡类似物制备过程中，单核细胞溶液中细胞个数为1×107个/ml，所述靶向药物为盐酸多柔比星，体积为10ml，浓度为400ug/ml。
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