CN113271928A - 用于肺部炎症治疗的纳米载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了装载有抗炎货物的肺靶向细胞外囊泡(EV)，以及组合物、系统和其制备方法。所公开的EV可含有肺靶向配体，诸如含有肺靶向部分的融合蛋白。还公开了包含含有所公开的融合蛋白的EV的组合物。在一些实施例中，EV装载有抗炎货物。还公开了经工程改造用于产生所公开的EV的EV产生细胞。还公开了一种用于制造所公开的EV的方法，所述方法包括在适合产生EV的条件下培养所公开的EV产生细胞。

Description

用于肺部炎症治疗的纳米载体

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月19日提交的美国临时申请第62/747,987号的权益，该临时申请的全部内容通过引用整体并入本文。

序列表

本申请包含电子形式的、以在2019年10月18日创建的标题为“321501-2340Sequence Listing_ST25”的ASCII.txt文件形式提交的序列表。

背景技术

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的特征是严重的低氧血症、弥漫性双侧肺浸润和肺顺应性降低。目前尚无批准的ARDS治疗方法。

发明内容

本文公开了一种纳米载体(nanocarrier)系统，以有效靶向肺细胞并装载有抗炎货物，以在ARDS期间调节肺部炎症。这些纳米载体可以使用多种转染技术(例如，批量电穿孔、纳米电穿孔、组织纳米转染、病毒转染)在体外转染细胞或在体内转染组织后获得。所公开的纳米载体是装载有抗炎货物，诸如微小RNA 146a的定制的细胞外囊泡(EV)，并且通过用肺微环境中的特定受体的配体修饰进行功能化，以进行靶向传递。

如图1所示，可以通过转染例如编码特定货物或配体的质粒DNA来为EV装载抗炎货物和/或用细胞靶向的配体进行修饰。货物可能根据需要调节的炎症途径而所有不同，并且可以根据靶细胞类型来改变表面修饰。

例如，可以使用分别为表面活性剂蛋白A(SPA)和膜糖蛋白CD200编码的质粒基因来靶向II型肺细胞和肺巨噬细胞。用SPA功能化的细胞外囊泡与II型细胞上的受体P63/CKAP4相互作用，而用CD200功能化的细胞外囊泡则优先与肺泡巨噬细胞中的CD200R受体相互作用。

EV可以用SDF1功能化，其将与肺血管系统中的受体CXCR7相互作用。例如，当通过血管内方法递送EV时，这可能很有价值。

如图2所示，经表面修饰的EV还可以装载有抗炎货物，这些货物是可通过一定浓度梯度扩散到EV中的可透过膜的药理化合物(例如，Y-27632Rho抑制剂，Calbiochem)。

在下面的附图和描述中进一步说明了本发明的一个或多个实施例的细节。在说明书和附图以及权利要求书中，本发明的其他特征、主题和优点将是显而易见的。

附图说明

图1是在转染细胞或组织后装载有抗炎货物和/或用细胞靶向配体修饰的定制纳米载体的产生的示意图。

图2是装载有其他抗炎货物，例如可透过膜的药理化合物的经表面修饰的EV的示意图。

图3A至3E示出了体外衍生的策划EV(designer EV)的表征。图3A和3B示出了在纳米转染初级小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)24小时后分离出的装载有miR-146a的策划EV，其粒径范围为200nm，并且EV浓度为每毫升数十亿个颗粒。图3C示出了用编码miR-146A的质粒和假性/对照质粒(*p值＝0.041)进行纳米转染后48小时，从小鼠树突细胞获得的装载有miR-146A的策划EV的qRT-PCR表征。图3D示出了在用这些miR-146A或假性策划EV处理的A549肺上皮细胞和分化的THP-1单核细胞中相对的miR-146A表达(*p值<0.001)。图3E示出了用衍生自PMEF的荧光标记的miR-146a策划EV处理48小时后的C57BL/6小鼠初级肺泡上皮细胞，其中白色箭头突出显示了EV的吸收。

图4A至图4F示出了体内衍生的策划EV表征。图4A是体内皮肤的组织纳米转染(TNT)以及随后分离策划EV的示意图。图4B示出了每平方厘米皮肤约十万亿EV数量级的颗粒浓度。图4C示出了在109-135nm范围内的平均粒度。图4D示出了假性策划EV和miR-146a策划EV均呈现出膜EV标记物四跨膜蛋白CD9的阳性表达。图4E示出了这些体内衍生的miR-146A策划EV的qRT-PCR表征，其示出了分子货物的成功装载。图4F和4G示出了标记的策划EV的体内产生，其中在利用编码CD63-GFP的质粒(EV示踪剂)进行皮肤TNT后24小时，与未转染动物的对照组织(图4G)相比，转染的皮肤细胞明显产生了GFP标记的策划EV(白色箭头)。

图5A至图5F示出了体内衍生的策划EV调节肺中的炎症。miR-146a策划EV在通气条件下治疗4小时后的效果显示出生理参数改善(图5A至5D)，BAL蛋白含量显著下降(图5E)，以及炎性细胞因子分泌有下降趋势(图5F，*p值＝0.022)。

图6A和6B示出了靶向发炎肺部的功能化策划EV。可以将策划EV功能化，以针对肺泡空间的不同细胞区室。图6A示出了从动物收集的器官的体内成像，所述动物利用以CD200配体功能化以靶向肺泡巨噬细胞的策划EV处理24小时。图6B示出了用荧光标记的功能化策划EV处理24小时后的肺组织的IF图像，其示出了成功的肺细胞吸收(箭头)。

具体实施方式

公开了装载有抗炎货物的肺靶向细胞外囊泡(EV)，以及组合物、系统和其制造方法。所公开的EV可含有肺靶向配体，诸如含有肺靶向部分的融合蛋白。还公开了包含含有所公开的融合蛋白的EV的组合物。在一些实施例中，EV装载有抗炎货物。还公开了经工程改造用于产生所公开的EV的EV产生细胞。还公开了一种用于制造所公开的EV的方法，所述方法包括在适合产生EV的条件下培养所公开的EV产生细胞。所述方法可以进一步涉及从细胞中纯化EV。

在更详细地说明本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因此当然可以与此不同。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不用于限制本发明，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

在提供数值范围的情况下，应理解，所述范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另有明确规定，否则均应保留到下限值单位的十分位)以及任何其他所示的或在所述范围内的中间值都包括在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在这些较小范围内，并且也应涵盖在本公开内容之内，但要受到所述范围内的任何明确排除的限制。在所述范围包括这些极限值的一个或两个的情况下，排除这些所包括的极限值中的一个或两个的范围也包括在本公开中。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文描述的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。

本说明书中引用的所有公开和专利均通过引用并入本文，每个单独的公开或专利均被具体地和单独地指出通过引用并入本文，并通过引用并入本文用以公开和描述本发明的方法和/或材料，这些公开也因此被引用。任何公开的引用均是为了其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认由于公开在先而使得本公开内容无法早于该公开。此外，提供的发布日期可能与可能需要独立确认的实际发布日期不同。

对于本领域技术人员而言，在阅读本公开后将显而易见的是，本文所描述和图示的每个单独的实施例均具有离散的组成和特征，其可以容易地与其他数个实施例中的任何一个的特征分离或组合，而不会脱离本公开的范围或精神。任何所述的方法都可以以所述的步骤顺序或逻辑上可能的任何其他顺序执行。

除非另外指出，否则本公开的实施例将采用其在本领域技术范围内的化学、生物学技术等。

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何实施方法以及如何使用本文所公开和要求保护的探针的完整公开和描述。已经尽力确保数字(例如，数量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则比例为重量份，温度为℃，压力为大气压或接近大气压。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

在详细描述本公开的实施例之前，应理解，除非另外指出，否则本公开不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造工艺等，因为这些都可以不同。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而无意于进行限制。在本公开中还可能的是，在逻辑上可行的情况下，可以以不同的顺序执行步骤。

必须注意，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括相应复数，除非上下文另有明确规定。

在一些实施例中，所公开的EV可以是可以由细胞产生的任何EV。细胞分泌直径和功能范围广泛的细胞外囊泡(EV)，包括凋亡小体(1-5μm)、微囊泡(大小为100-1000nm)和内体起源的囊泡，称为外泌体(50-150nm)。

所公开的细胞外囊泡可以通过本领域已知的方法制备。例如，可以通过在真核细胞中表达编码细胞靶向配体的mRNA来制备所公开的细胞外囊泡。在一些实施例中，细胞还表达编码抗炎货物的mRNA。用于细胞靶向配体和抗炎货物的mRNA可以从载体(vector)表达，所述载体被转染到合适的生产细胞中以产生所公开的EV。可以从同一载体表达用于细胞靶向配体和抗炎货物的mRNA(例如，其中载体从不同的启动子表达用于细胞靶向配体和抗炎货物的mRNA)，或可从单独的载体表达用于细胞靶向配体和抗炎货物的mRNA。可以将用于表达细胞靶向配体和抗炎货物的mRNA包装在设计用于制备所公开的细胞外囊泡的试剂盒中。

还公开了包含含有所公开的靶向配体的EV的组合物。在一些实施例中，EV装载有所公开的抗炎货物。还公开了经工程改造以分泌所公开的EV的EV产生细胞。

EV诸如外泌体是由许多不同类型的细胞产生的，包括免疫细胞诸如B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突状细胞(DC)和大多数细胞。EV例如也由神经胶质瘤细胞、血小板、网状细胞、神经元、肠上皮细胞和肿瘤细胞产生。用于所公开的组合物和方法的EV可以衍生自任何合适的细胞，包括上文提出的细胞。用于大规模生产的合适的EV产生细胞的非限制性示例包括树突状细胞(例如，未成熟的树突状细胞)、人胚肾293(HEK)细胞、293T细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人ESC衍生的间充质干细胞。EV也可以从自体患者衍生的、异源单倍型匹配的或异源干细胞获得，以减少或避免在递送有外泌体的患者中产生免疫应答。任何EV产生细胞均可用于此目的。

还公开了一种用于制造所公开的装载有抗炎货物的EV的方法，所述方法涉及培养经工程改造以分泌所公开的EV的EV产生细胞。所述方法可以进一步涉及从细胞中纯化EV。

可以通过任何合适的方法从培养基中收集由细胞产生的EV。通常，可以通过离心、过滤或这些方法的组合，从细胞培养物或组织上清液中制备EV。例如，EV可以通过以下来制备，差速离心，即低速(＜20000g)离心以沉淀较大的颗粒，然后高速(＞100000g)离心以沉淀EV；使用合适过滤器进行尺寸过滤；梯度超速离心(例如，使用蔗糖梯度)或这些方法的组合。

通过在EV的表面上表达与肺细胞表面上表达的细胞表面部分结合的靶向部分，可以使所公开的EV靶向肺。合适的靶向部分的示例是短肽、scFv和完整蛋白质，只要靶向部分可以在外泌体表面上表达即可。肽靶向部分的长度通常可以小于100个氨基酸，例如小于50个氨基酸、小于30个氨基酸，最小长度为10、5或3个氨基酸。

在一些实施例中，可以使用表面活性剂蛋白A(SPA)靶向II型肺细胞。用SPA功能化的EV与II型细胞上的受体P63/CKAP4相互作用。在一些实施例中，靶向部分是具有下列氨基酸序列的SPA1：MWLCPLALNLILMAASGAVCEVKDVCVGTPGIPGECGEKGEPGERGPPGLPAHLDEELQATLHDFRHQILQTRGALSLQGSIMTVGEKVFSSNGQSITFDAIQEACARAGGRIAVPRNPEENEAIASFVKKYNTYAYVGLTEGPSPGDFRYSDGTPVNYTNWYRGEPAGRGKEQCVEMYTDGQWNDRNCLYSRLTICEF(序列识别号：1)，或与序列识别号：1具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似度的、可以与II型细胞上的受体P63/CKAP4相互作用的变体和/或片段。

在一些实施例中，靶向配体是SPA1的片段，其包含至少100、110、120、130、140、141、142、143、144、145、156、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、或199个序列识别号：1的连续氨基酸或其变体。

在一些实施例中，靶向部分是具有下列氨基酸序列的SPA2：

MWLCPLALTLILMAASGAACEVKDVCVGSPGIPGTPGSHGLPGRDGRDGVKGDPGPPGPMGPPGETPCPPGNNGLPGAPGVPGERGEKGEAGERGPPGLPAHLDEELQATLHDFRHQILQTRGALSLQGSIMTVGEKVFSSNGQSITFDAIQEACARAGGRIAVPRNPEENEAIASFVKKYNTYAYVGLTEGPSPGDFRYSDGTPVNYTNWYRGEPAGRGKEQCVEMYTDGQWNDRNCLYSRLTICEF(序列识别号：2)，或与序列识别号：2具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似度的、可以与II型细胞上的受体P63/CKAP4相互作用的变体和/或片段。

在一些实施例中，靶向配体是SPA2的片段，其包含至少100、110、120、130、140、141、142、143、144、145、156、147、148、149、150、151，152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247或248个序列识别号：2的连续氨基酸或其变体。

在一些实施例中，可以使用膜糖蛋白CD200靶向肺巨噬细胞。用CD200功能化的EV优先与肺泡巨噬细胞中的CD200R受体相互作用。在一些实施例中，靶向部分是具有下列氨基酸序列的CD200：MERLVIRMPFCHLSTYSLVWVMAAVVLCTAQVQVVTQDEREQLYTPASLKCSLQNAQEALIVTWQKKKAVSPENMVTFSENHGVVIQPAYKDKINITQLGLQNSTITFWNITLEDEGCYMCLFNTFGFGKISGTACLTVYVQPIVSLHYKFSEDHLNITCSATARPAPMVFWKVPRSGIENSTVTLSHPNGTTSVTSILHIKDPKNQVGKEVICQVLHLGTVTDFKQTVNKGYWFSVPLLLSIVSLVILLVLISILLYWKRHRNQDREP(序列识别号：3)，或与序列识别号：3具有至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似度的、可以与肺巨噬细胞相互作用的的变体和/或片段。

在一些实施例中，靶向配体是CD200的片段，其包含至少100、110、120、130、140、141、142、143、144、145、156、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268或269个序列识别号：3的连续氨基酸或其变体。

在一些情况下，通过将细胞靶向配体表达为与外泌体或溶酶体跨膜蛋白的融合蛋白来将其表达在EV的表面上。已知许多蛋白质与外泌体有关。也就是说，其在外泌体形成时就被整合到了外泌体中。示例包括但不限于Lamp-1、Lamp-2、CD13、CD86、Flotillin、Syntaxin-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、ICAM-1、整联蛋白α4、LiCAM、LFA-1、Mac-1α和β、Vti-IA和B、CD3ε和ζ、CD9、CD18、CD37、CD53、CD63、CD81、CD82、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、TCRβ和四跨膜蛋白。

所公开的细胞外囊泡可进一步装载抗炎剂，其中细胞外囊泡将药剂递送至靶细胞。合适的抗炎剂包括但不限于治疗药物(例如，小分子药物)、治疗性蛋白质和治疗性核酸(例如，治疗性RNA)。在一些实施例中，所公开的细胞外囊泡包含治疗性RNA(本文也称为“货物RNA”)。例如，在一些实施例中，含有细胞靶向基序的融合蛋白还包括RNA结构域(例如，在融合蛋白的胞质C末端)，其与货物RNA中存在的一种或多种RNA基序结合，以将货物RNA包装到细胞外囊泡中，然后将细胞外囊泡从细胞中分泌出来。这样，融合蛋白可以同时充当“细胞靶向蛋白”和“包装蛋白”。在一些实施例中，包装蛋白可以被称为细胞外囊泡装载蛋白或“EV装载蛋白”。

在一些实施例中，货物RNA是miRNA、shRNA、mRNA、ncRNA、sgRNA或其任何组合。例如，在一些实施例中，抗炎剂是微小RNA 146a。

可以使用的其他抗炎微小RNA包括miR-155、miR-9、miR-210、miR-146b和miR-181。使用高潮气量通气和其他病理条件诸如急性肺损伤(ALI)、呼吸机诱发的肺损伤(VILI)和骨关节炎的小鼠模型的ALI/ARDS期间显示出抗炎miRs-155、miR-9、miR-210和miR-146b上调。另一方面，MiR-181通过IL-1α调节巨噬细胞的炎症反应。先前已经报道了MiR-9、miR-511、miR-146a、miR-23b和miR-181a是在脓毒症和ARDS期间在肺中被上调的抗炎miRNA。

策划EV也可用于有效递送关键生长因子、调节蛋白和抗炎细胞因子，以减少肺部炎症和损伤，并增强ARDS/VILI期间的组织修复。可以例如装载有抗炎细胞因子白介素10和白介素4、调节蛋白分泌型白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)和角质形成细胞生长因子(KGF)，已显示出其降低了ARDS期间的死亡率并调节了炎症。

所公开的细胞外囊泡的货物RNA可以具有任何合适的长度。例如，在一些实施例中，货物RNA可具有至少约10nt、20nt、30nt、40nt、50nt、100nt、200nt、500nt、1000nt、2000nt、5000nt或更长的核苷酸长度。在其他实施例中，货物RNA可以具有不超过约5000nt、2000nt、1000nt、500nt、200nt、100nt、50nt、40nt、30nt、20nt或10nt的核苷酸长度。在甚至进一步的实施例中，货物RNA可具有在这些预期的核苷酸长度的范围内的核苷酸长度，例如，在约10nt-5000nt的范围内，或其他范围的核苷酸长度。所公开的细胞外囊泡的货物RNA可以相对较长，例如，其中货物RNA包含mRNA或另一相对较长的RNA。

在一些实施例中，抗炎货物是可透过膜的药理化合物，其在被细胞分泌后装载到EV中。例如，在一些实施例中，抗炎货物包含Y-27632Rho抑制剂(Calbiochem)，其可以通过浓度梯度扩散到EV中(参见图2)。

所公开的方法可以应用于为EV装载临床相关的亲脂性化合物和其他抗炎性可透过膜的化合物。这种化合物的一个示例是他汀类化合物，更具体地说是辛伐他汀，其在临床环境中用于降低血液中的胆固醇水平。辛伐他汀可以通过策划EV有效地局部递送至发炎的肺部，以减轻炎症并帮助例如ALI/ARDS或VILI的患者更快康复。

在一些实施例中，通过浓度梯度扩散将抗炎货物装载到EV中。

本文还设想了使用所公开的EV的方法。例如，所公开的细胞外囊泡可用于将所公开的抗炎货物递送至靶肺细胞，其中所述方法包括使靶细胞与所公开的EV接触。因此，本发明还公开了一种治疗受试对象的肺部疾病的方法，所述方法包括向受试对象施用治疗有效量的含有本发明公开的货物装载的肺靶向EV的组合物。在一些实施例中，受试对象患有ARDS。

所公开的策划EV基本上可以通过定制用于修饰EV的配体，不仅在肺中而且在不同的器官系统中用于调节种类广泛的炎症状况。其他肺部应用可包括呼吸机诱发的肺部损伤(VILI)、肺纤维化和感染性疾病，诸如败血症、流感和肺炎。

所公开的EV可以被配制成用于治疗肺部疾病或病症的药物组合物的一部分，并且可以将所述药物组合物施用于有需要的患者以将所述货物递送至靶肺细胞，从而治疗所述肺部疾病或病症。

所公开的EV可以通过任何合适的方式施用于受试对象。对人或动物受试对象的施用可以选自肠胃外、肌内、脑内、血管内、皮下或透皮施用。通常，递送方法是注射。优选地，注射是肌内或血管内的(例如，静脉内的)。医生能够确定每个特定患者所需的施用途径。

优选地，将EV作为组合物递送。所述组合物可以配制用于肠胃外、肌内、脑内、血管内(包括静脉内)、皮下或透皮施用。肠胃外施用的组合物可以含有无菌水溶液，其也可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。EV可以配制成这样的药物组合物，即除了EV之外，其可以包括药学上可接受的载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂和其他药学上可接受的载体或辅料等。

肠胃外施用通常以注射为特征，诸如皮下、肌内或静脉内注射。用于肠胃外施用的制剂包括注射用无菌溶液；使用前与溶剂混合的无菌干燥可溶性产品，诸如冻干粉剂，包括皮下注射片剂；注射用无菌悬浮液，在使用前与赋形剂结合的无菌干燥不溶性产品和无菌乳液。溶液可以是水性或非水性的。

如果静脉内施用，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂诸如葡萄糖、聚乙二醇和聚丙二醇及其混合物的溶液。肠胃外制剂中使用的药学上可接受的载体包括水性赋形剂、非水性赋形剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂或络合剂以及其他药学上可接受的物质。水性赋形剂的示例包括氯化钠注射剂、林格注射剂、等渗葡萄糖注射剂、无菌水注射剂、葡萄糖和乳酸林格注射剂。非水性肠胃外赋形剂包括植物来源的不挥发性油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。必须将抗菌剂以抗菌或抑菌浓度添加到包装在多剂量容器中的肠胃外制剂中，这些抗菌剂包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和丙基酯、硫柳撒、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和葡萄糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉剂包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。

乳化剂包括聚山梨酯80

金属离子的螯合剂或络合剂包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性赋形剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸来调节pH。调节药物活性化合物的浓度，以使注射剂提供有效量，以产生所需的药理作用。如本领域中已知的，确切的剂量取决于患者或动物的年龄、体重和状况。

单位剂量的肠胃外制剂可以包装在安瓿瓶、小瓶或带针注射器中。如本领域已知的和惯常的做法，用于肠胃外施用的所有制剂应为无菌的。

施用治疗有效量的组合物。剂量可以根据各种参数来确定，特别是根据要治疗的患者的状况的危重程度、年龄和体重；施用途径；以及要求的方案。医生能够确定任何特定患者所需的施用途径和剂量。最佳剂量可以根据各个构建体的相对有效剂量而有所不同，并且通常可以根据被发现在体外和体内动物模型中有效的EC50进行估算。通常，剂量为0.01mg/kg体重至100mg/kg体重。典型的日剂量为约0.1至50mg/kg体重，优选约0.1mg/kg体重至10mg/kg体重，这取决于具体构建体的效力，所要治疗的受试对象的年龄、体重和状况；疾病的严重程度；以及施用的频率和途径。取决于施用是通过肌内注射还是全身性(静脉内或皮下)注射，可以施用不同剂量的构建体。

优选地，单次肌内注射的剂量在约5至20μg的范围内。单次或多次全身注射的剂量优选在10至100mg/kg体重的范围内。

由于构建体清除(和任何靶向分子的分解)，可能需要对患者反复进行治疗，例如每天、每周、每月或每年一次或多次。本领域普通技术人员可以基于测得的体液或组织中构建体的停留时间和浓度，容易地估计给药的重复率。治疗成功后，可能需要让患者接受维持治疗，其中以0.01mg/kg体重至100mg/kg体重的维持剂量，每天一次或多次，至每20年一次施用构建体。

已经说明了本发明的多个实施例。然而，将理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他的实施例也在所附权利要求的范围内。

实例

实例1：

图3示出了体内衍生的策划EV的表征和递送。图3A是显示通过qRT-PCR表征的miR-146a和SH装载的EV的条形图。在通气前，通过插管介导的气管内递送方式递送SH-CT或miR装载的EV。图3B是示出了接受SH-CT或miR-146A装载的EV处理的动物的生理测量值的条形图(MV方案：潮气量为12cc/kg，呼吸频率为150次呼吸/分钟，在0cm H2O呼气末正压下通气4个小时)。图3C中的条形图示出了4小时的MV后，SH和mir-146a处理的动物的BAL蛋白含量的变化。图3D是示出了装载有模拟质粒(假性对照–SH)或抗炎miR-146a的EV的平均尺寸分布的条形图。

通过用编码miR-146a的质粒(OriGene)对C57BL6小鼠(8-10周大)的背部皮肤进行纳米转染，获得了装载有抗炎miR-146a的体内衍生策划EV。在皮肤转染24小时后，从皮肤活检样本中收集装载的EV，并使用ExoQuick试剂盒(SystemBio)进行分离。分离后，将EV以小药丸形式保存，然后将其悬浮在0.9％的氯化钠溶液中以备后续使用。EV装载效率通过经由qRT-PCR定量miR-146a拷贝数来测量。

策划EV在体内进行评估。简而言之，按照先前说明的通气方案进行机械通气(MV)4小时，其将导致严重的肺损伤，其中潮气量为12cc/kg，呼吸频率为120呼吸/分钟，在0cmH₂O呼气末正压下。对于这些实验，在进行MV之前，通过气管内注射(使用2μL/g小鼠体重)将策划EV运送到这些小鼠的肺中。在通气过程中收集肺部生理和氧饱和度数据。4小时后，对动物实施安乐死并收集支气管肺泡灌洗液(BAL)和组织。

实例2：制造策划EV的体外方法

使用基于纳米通道的电穿孔在供体细胞内可控地过度表达目标货物，并定制EV的内容和表面修饰。基于纳米通道的电穿孔可以产生约100％的转染效率和细胞活力，并且不受衣壳大小限制。这一方法用于从多种细胞来源获得装载有抗炎miR-146A的策划EV，包括小鼠树突状细胞和胚胎成纤维细胞的原代培养以及人类细胞系(图3A-3E)。与假性装载的EV相比，EV内含物的表征显示出成功并入了目标分子货物(图3C)。然后，这种EV可有效地用于调节人肺上皮细胞和人巨噬细胞培养物中的基因表达(图3D)。还从小鼠成纤维细胞的原代培养物中获得了装载有前神经因子基因ASCL1、BRN2和MYT1L(ABM)的策划EV。对ABM装载的策划EV的释放和吸收动力学的研究表明，转染后24小时，供体细胞的EV释放达到峰值，浓度约为数十亿数量级颗粒/ml。EV内所包装的基因拷贝数比递送给“供体”细胞的原始拷贝数大了约3个数量级，表明在EV释放前治疗性货物的细胞内扩增。

实例3：采用体内方法制造策划EV

能够想到的是，用于从体内组织衍生出策划EV的基于纳米通道的组织转染可以将患者自己的组织用作多产的EV生物反应器，这可能具有临床和转化意义。这一方法的产率为大约1cm²的小鼠皮肤中获得约10万亿个装载有抗炎miR-146A的EV(图4)。这些EV随后被有效地用于阻止由机械通气引起的炎症(图5)。

实例3：

考虑到需要重症监护，住院时间延长和康复缓慢，ARDS对医疗保健系统构成了沉重负担。根据美国肺脏协会(2013)的数据，美国每年大约有190,000例ARDS病例。ARDS患者的死亡率很高，介于38-45％之间。ARDS通常是由诸如肺部钝伤或败血症等潜在疾病引起的。在肺损伤的背景下，败血症是一种危及生命的病况，其特征在于感染引起的严重的全身性炎症反应，并且是ICU患者死亡的主要原因。ARDS的特点包括严重缺氧、肺泡毛细血管屏障功能障碍、小气道充血伴随肺表面活性物质产生减少以及促炎途径的激活。虽然使用机械通气支持氧疗，但机械应力会加剧初始损伤，并可能导致呼吸机诱发的肺损伤(VILI)，其死亡率甚至更高。所有这些因素进一步加剧了潜在的肺损伤，从而加剧了有利于炎症的正反馈回路，并可能导致多系统器官衰竭，甚至死亡。尽管目前尚无治愈ARDS的方法，但针对肺部的抗炎方法的使用已显示出巨大的进展。例如，基于细胞的疗法(例如，内皮祖细胞、间充质干细胞)已显示出通过营养和抗炎/抗感染机制减少炎症并增强肺修复。然而，基于祖细胞的细胞疗法的安全性仍然存在重大隐患，包括部分可能由于过度的离体加工而引起的肿瘤发生和高免疫原性应答的潜在风险。虽然已经确定了特定的治疗药剂，但是将治疗药剂有效地递送至发炎的肺仍然是危重患者中的主要挑战。为了克服这些限制，关键的抗炎和抗菌分子货物可以使用功能化的策划EV有效地、选择性地递送，以减少肺部炎症和损伤，并在败血症诱发的ARDS期间增强组织修复能力。表1中所述的装载有分子货物的策划EV是经工程改造的。

已对方案进行了优化，以获取衍生自活组织的策划EV。对于这一重点领域，通过在体内对8-10周龄C57BL6小鼠的皮肤用为每种因子进行编码的质粒进行纳米转染，可以得到装载有表1中所述的抗炎或抗微生物货物的体内衍生的策划EV。如前所述，组织纳米转染平台是在无尘室中使用投影和接触光刻技术以及深反应离子刻蚀技术组合制成的。在转染后的不同时间点从皮肤活检样本中收集EV。对于EV的分离，使用温和的MACS解离器将皮肤样品解离并均质化。使用总的外泌体分离试剂盒选择性沉淀EV，并在-80℃下保存以备后续使用。

将策划EV功能化以靶向递送至肺上皮和巨噬细胞，因为这些细胞区室是ARDS期间炎症的重要来源。通过用表面活性剂蛋白A(SPA)和膜糖蛋白CD200的质粒进行纳米转染，可以获得功能化的策划EV(图6)。期望使SPA功能化的EV与肺泡肺细胞上的受体P63/CKAP4相互作用，并有与这些细胞中的Toll样受体2(TLR2)结合的潜力，从而抑制NF_kβ炎性途径的激活。CD200功能化的EV可能会优先与肺泡巨噬细胞中的CD200R受体相互作用，以调节其促炎状态。靶向内皮的其他配体将与SPA和CD200结合用于通过全身循环递送的策划EV，以促进与肺微血管的相互作用。与SDF1配体共功能化的EV将优先与肺血管中的CXCR7受体相互作用，其在受伤条件下会上调，这可能有助于将策划EV锚定在肺血管上，以便随后转移到肺泡腔内。为策划EV确定最佳的施用途径也是优化用于治疗应用的策划EV的重要组成部分。因此，比较了三种非侵入性施用途径(表2)，以定义用于治疗的最佳递送方法。

对健康和患病的动物(表3)进行剂量敏感性分析，并针对每种给药方法分别使用功能化和非功能化的抗炎、抗菌或假性装载的EV进行处理。为了进行这一分析，收集了支气管肺泡灌洗液(BAL)、血液和肺，并通过qRT-PCR定量了编码所递送的分子货物的基因以及关键的促炎和抗炎因子(表4)的相对表达。这一分析定义了实现体内肺部炎症显著调节的最佳剂量浓度。这些结果与获得最佳策划EV浓度所需的转染皮肤面积相关。脱靶积累和清除率通过定量生物分布研究进行测试(图6)。

除了体内研究，还对EV进行了广泛的体外表征，以更好地了解其性质。这包括使用Nanosight和Zeta电位分析仪系统分析作为货物和表面修饰的函数的尺寸分布、电荷和颗粒浓度。EV装载效率通过使用绝对定量qRT-PCR方案定量每个EV中包装的每个基因的拷贝数来定义，并为每个质粒DNA生成标准曲线。这些结果与转染到皮肤中的拷贝数相关。总RNA-seq用于表征装载有抗炎、抗微生物或假性分子货物的层策划EV的含量，以获取包装在策划EV内的编码和非编码RNA形式的深入记录。此外，对功能化和非功能化策划EV进行了比较蛋白质组学分析(在膜和胞质水平)，以进一步确定抗炎和抗菌分子货物包装的效率以及膜配体的表达。

为了更好地了解策划EV的作用机理，将肺损伤小鼠模型中的体内性能研究(表3)与成熟的体外损伤模型(表5)进行基准比较。体外模型能够对策划EV对特定细胞群体的作用进行系统研究，而体内模型则可以更好地理解在更多病理生理条件下的反应，其中多个器官系统之间的相互作用至关重要。在体内，使用败血症诱发的ARDS小鼠模型和二次打击模型评估策划EV减少炎症和细菌感染的功效。这些模型有助于确定感染时在特定浓度的策划EV下所观察到的炎症减弱水平的潜在影响。气压创伤和容积创伤的体外模型用于探测肺组织和细菌培养物中分离出的细胞组分上的策划EV。

对于体内损伤模型，以不同剂量(例如，单次对重复)和时间点(例如，损伤前对损伤后)给予策划EV(表2)。为了模拟败血症诱发的ARDS，对8-10周大的C57BL6小鼠进行盲肠结扎和穿刺(CLP)或假性剖腹术。CLP后，使用Vevo 2100系统通过超声成像评估肺水肿。处死动物并用无菌盐水灌注后收集BAL、血液和主要器官(即肺、心脏、脾脏、肝脏和肾脏)以进行下游分析。使用二次打击模型可以复制更多与临床相关的疾病，其中患者可能由于潜在的感染而需要进行机械通气。对于此模型，最初对8-10周大的C57BL6小鼠进行CLP或假性剖腹手术，并且在CLP后24小时，使用FlexiVent FX，SCIREQ对动物进行创伤方案的机械通气(潮气量为12cc/kg，120次呼吸/分钟，0cm H₂O呼气末正压)4小时。在MV操作过程中收集肺部生理学和氧饱和度数据，在MV结束时通过麻醉过量处死动物，并在用无菌盐水灌注后收集BAL、血液和主要器官用于下游分析。BAL样品的细胞含量通过炎性细胞计数(即肺泡巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞)来表征。还评估了BAL蛋白质含量，因为蛋白质含量升高与肺泡-毛细血管屏障功能完整性的丧失相关。蛋白质定量后，使用定制的细胞因子阵列筛选所有BAL和血浆样品来确定是否有促炎和抗炎细胞因子和参数的表达(表4)。通过qRT-PCR评估体内递送(针对表1中说明的疗法)的分子货物的相对表达及其对关键抗炎和促炎分子标志物的表达的影响(在表4中说明)。

对于体外损伤模型，原代肺上皮细胞和源自小鼠的巨噬细胞的共培养物暴露于气压创伤或容积创伤。使用先前公开的循环压力模型可诱发气压创伤。为此，将细胞在transwell小室上共培养，并将顶端隔室加压24小时，以在0.2Hz的下频率达到0至20cmH₂O之间的循环振荡压力，从而模拟类似于机械通气的压力等级和正常呼吸频率。使用Flexcell FX-5000张力系统模拟容积创伤。对于这一模型，将细胞在带有弹性体底部的改良6孔板上共培养，并在细胞培养培养箱中在1.25Hz下暴露于伸长率为10-20％的连续循环拉伸24小时。监测关键促炎分子(表4)在培养基中的分泌。将ZO-1染色并通过IF成像，以评估紧密连接的形成和维持，作为创伤性创伤后上皮-内皮屏障功能的指标。表5中说明了用于这一评估的实验组。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本公开所引用的公开及其被引用的材料通过引用具体结合到本公开中。

本领域技术人员将仅使用常规实验就将认识到或能够确定所说明的本发明的具体实施例的许多等同方案。这样的等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。

序列表

<110> 俄亥俄州国家创新基金会

<120> 用于肺部炎症治疗的纳米载体

<130> 321501-2340

<150> US 62/747,987

<151> 2018-10-19

<160> 3

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

Met Trp Leu Cys Pro Leu Ala Leu Asn Leu Ile Leu Met Ala Ala Ser

1 5 10 15

Gly Ala Val Cys Glu Val Lys Asp Val Cys Val Gly Thr Pro Gly Ile

20 25 30

Pro Gly Glu Cys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro

35 40 45

Gly Leu Pro Ala His Leu Asp Glu Glu Leu Gln Ala Thr Leu His Asp

50 55 60

Phe Arg His Gln Ile Leu Gln Thr Arg Gly Ala Leu Ser Leu Gln Gly

65 70 75 80

Ser Ile Met Thr Val Gly Glu Lys Val Phe Ser Ser Asn Gly Gln Ser

85 90 95

Ile Thr Phe Asp Ala Ile Gln Glu Ala Cys Ala Arg Ala Gly Gly Arg

100 105 110

Ile Ala Val Pro Arg Asn Pro Glu Glu Asn Glu Ala Ile Ala Ser Phe

115 120 125

Val Lys Lys Tyr Asn Thr Tyr Ala Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Pro Gly Asp Phe Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Pro Val Asn Tyr Thr

145 150 155 160

Asn Trp Tyr Arg Gly Glu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Glu Gln Cys Val

165 170 175

Glu Met Tyr Thr Asp Gly Gln Trp Asn Asp Arg Asn Cys Leu Tyr Ser

180 185 190

Arg Leu Thr Ile Cys Glu Phe

195

<210> 2

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 2

Met Trp Leu Cys Pro Leu Ala Leu Thr Leu Ile Leu Met Ala Ala Ser

1 5 10 15

Gly Ala Ala Cys Glu Val Lys Asp Val Cys Val Gly Ser Pro Gly Ile

20 25 30

Pro Gly Thr Pro Gly Ser His Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp

35 40 45

Gly Val Lys Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly

50 55 60

Glu Thr Pro Cys Pro Pro Gly Asn Asn Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly

65 70 75 80

Val Pro Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Ala Gly Glu Arg Gly Pro

85 90 95

Pro Gly Leu Pro Ala His Leu Asp Glu Glu Leu Gln Ala Thr Leu His

100 105 110

Asp Phe Arg His Gln Ile Leu Gln Thr Arg Gly Ala Leu Ser Leu Gln

115 120 125

Gly Ser Ile Met Thr Val Gly Glu Lys Val Phe Ser Ser Asn Gly Gln

130 135 140

Ser Ile Thr Phe Asp Ala Ile Gln Glu Ala Cys Ala Arg Ala Gly Gly

145 150 155 160

Arg Ile Ala Val Pro Arg Asn Pro Glu Glu Asn Glu Ala Ile Ala Ser

165 170 175

Phe Val Lys Lys Tyr Asn Thr Tyr Ala Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gly

180 185 190

Pro Ser Pro Gly Asp Phe Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Pro Val Asn Tyr

195 200 205

Thr Asn Trp Tyr Arg Gly Glu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Glu Gln Cys

210 215 220

Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Gln Trp Asn Asp Arg Asn Cys Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Arg Leu Thr Ile Cys Glu Phe

245

<210> 3

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 3

Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Cys His Leu Ser Thr Tyr

1 5 10 15

Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val

20 25 30

Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser

35 40 45

Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp

50 55 60

Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu

65 70 75 80

Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile

85 90 95

Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr

100 105 110

Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe

115 120 125

Gly Lys Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile

130 135 140

Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys

145 150 155 160

Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg

165 170 175

Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr

180 185 190

Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val

195 200 205

Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp

210 215 220

Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Tyr Trp Phe Ser Val Pro Leu Leu

225 230 235 240

Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Ile Leu Leu Val Leu Ile Ser Ile Leu

245 250 255

Leu Tyr Trp Lys Arg His Arg Asn Gln Asp Arg Glu Pro

260 265

Claims (11)

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含表面活性剂蛋白A(SPA)或CD200，以及外泌体或溶酶体跨膜蛋白。

2.一种细胞外囊泡，所述细胞外囊泡包含根据权利要求1所述的融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡进一步包含治疗性货物。

4.根据权利要求3所述的细胞外囊泡，其中所述治疗性货物包含miR146a。

5.根据权利要求3或4所述的细胞外囊泡，其中所述治疗性货物包含Y-27632。

6.一种细胞，所述细胞包含编码根据权利要求1所述的融合蛋白的核酸。

7.根据权利要求6所述的细胞，所述细胞进一步包含编码治疗性RNA的核酸。

8.一种产生细胞外囊泡的方法，所述方法包括在适合于囊泡分泌的条件下培养根据权利要求6或7所述的细胞，并分离所述细胞分泌的细胞外囊泡。

9.根据权利要求8所述的方法，所述方法进一步包括将治疗性药物装载在所述细胞外囊泡中。

10.一种治疗受试对象的肺部病症的方法，所述方法包括向所述受试对象施用治疗有效量的根据权利要求3至5中任一项所述的细胞外囊泡。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述肺部病症包括急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

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