KR20210082186A - 폐 염증 요법을 위한 나노담체 - Google Patents

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KR20210082186A
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나탈리아 히구이타-카스트로
다니엘 갈레고-페레즈
사미르 가디알리
조슈아 엥글러트
찬단 센
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오하이오 스테이트 이노베이션 파운데이션
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Abstract

항-염증성 적하물이 로딩된 폐 표적화된 세포외 소포체 (EV), 뿐만 아니라 조성물, 시스템 및 이를 제조하는 방법이 개시된다. 개시된 EV는 폐 표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질과 같은 폐 표적화된 리간드를 포함할 수 있다. 또한, 개시된 융합 단백질을 포함하는 EV를 포함하는 조성물도 개시된다. 일정 구현예에서, EV는 항-염증성 적하물이 로딩된다. 또한, 개시된 EV를 생산하도록 제작된 EV 생산하는 세포가 개시된다. 또한, EV를 생산하는데 적합한 조건 하에 개시된 EV 생산하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 개시된 EV를 제조하는 방법이 개시된다.

Description

폐 염증 요법을 위한 나노담체
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2018년 10월 19일자로 제출된 미국 가출원 US 62/747,987의 우선권을 주장하고 있으며, 이의 전문이 본원에서 참고문헌으로 통합된다.
서열목록
본 출원은 2019년 10월 18일자로 작성된 "321501-2340_Sequence_ Listing_ST25"이라는 제목의 ASCⅡ.txt 파일로서 전자 형태로 제출된 서열 목록을 포함한다. 서열 목록의 내용은 이의 전문이 본원에 통합된다.
급성 호흡기 곤란 증후군 (ARDS)은 중증 저산소혈증, 확산성 양측 폐 침윤물 및 폐 순응도의 감소를 특징으로 한다. 현재까지 ARDS에 대해 승인받은 치료는 전혀 없다.
본원에서는 ARDS 동안 폐 염증을 조정하도록 항-염증성 적하물이 로딩된, 폐 세포를 효과적으로 표적하는 나노담체 시스템이 개시된다. 이들 나노담체는 다양한 형질감염 기법 (예로, 대용량 전기천공, 나노전기천공, 조직 나노형질감염, 바이러스성 형질감염법)을 사용하는 시험관내 세포 또는 생체내 조직의 형질감염 이후에 획득될 수 있다. 개시된 나노담체는 마이크로RNA 146a와 같은 항-염증성 적하물이 로딩된 맞춤 제작된 세포외 소포 (EV)이고, 폐 미세환경에서 특이적인 수용체에 대한 리간드로의 장식 (decoration)에 의해 표적화된 전달을 위해 기능화된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, EV에 항-염증성 적하물을 로딩하는 것 및/또는 세포 표적화 리간드로의 장식은, 예를 들면 특이적인 적하물 또는 리간드를 인코딩하는 플라스미드 DNA를 형질감염시킴으로써 달성될 수 있다. 적하물은 조절이 필요한 염증 경로에 따라 달라질 수 있고, 표면 장식은 표적 세포 유형에 따라 달라질 수 있다.
예를 들면, 제 Ⅱ형 폐포세포 및 폐 대식구는 각각 표면활성제 단백질 A (SPA) 및 막 당단백질 CD200을 인코딩할 수 있는 플라스미드 유전자를 사용하여 표적화될 수 있다. SPA로 기능화된 EV는 제 Ⅱ형 세포 상의 수용체 P63/CKAP4와 상호작용하는 반면, CD200으로 기능화된 EV는 폐포 대식구에서 우선적으로 CD200 수용체와 상호작용한다.
EV는 폐 혈관구조에서 수용체 CXCR7와 상호작용할 SDF1으로 기능화될 수 있다. 이것은 예를 들면 EV가 혈관내 방법에 의해 전달될 때 중요할 수 있다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 표면 장식된 EV는 또한 농도 구배를 통해 EV 내로 확산될 수 있는 막-투과가능한 약학적 화합물 (예로, Y-27632 Rho-저해제, 캘바이오켐사)인 항-염증성 적하물이 로딩될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 첨부된 도면 및 하기 상세한 설명에 설명된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 상세한 설명 및 도면 그리고 청구범위로부터 자명해질 것이다.
도 1은 세포 또는 조직의 형질감염 이후에 항-염증성 적하물이 로딩되고/거나 세포 표적화 리간드로 장식되는 맞춤 제작된 나노담체의 생산의 모식도이다.
도 2는 다른 항-염증성 적하물, 예를 들면 막-투과가능한 약학적 화합물이 로딩된 표면 장식된 EV의 모식도이다.
도 3a 내지 도 3e는 시험관내 유래한 디자이너 EV 특성화를 나타낸다. 도 3a 및 도 3b는 일차 마우스 배아 섬유모세포 (PMEF)의 나노형질감염 이후 24시간째 단리된 miR-146a가 로딩되고, 200 nm 범위의 입자 크기 및 mL 당 수십억 개 범위의 입자 농도를 갖는 디자이너 EV를 나타낸다. 도 3c는 miR-146a를 인코딩하는 플라스미드 및 모의/대조군 플라스미드로 나노형질감염 이후 48시간째 마우스 수지상 세포로부터 획득된 miR-146a 로딩된 디자이너 EV의 qRT-PCR 특성화를 나타낸다 (*p-값 = 0.041). 도 3d는 이들 miR-146a 또는 모의 디자이너 EV로 처리된 A549 폐 상피세포 및 분화된 THP-1 단핵세포에서 상대적 miR-146a 발현을 나타낸다 (*p-값 < 0.001). 도 3e는 PMEF로부터 유래한 형광으로 표지된 miR-146a 디자이너 EV로 처리 이후 48시간째 C57BL/6 마우스 일차 폐포 상피세포를 나타내고, 여기서 흰색 화살표는 EV 흡수를 강조한다.
도 4a 내지 도 4f는 생체내 유래한 디자이너 EV 특성화를 나타낸다. 도 4a는 생체내 피부의 조직 나노형질감염 (TNT) 및 디자이너 EV의 후속적 단리의 모식도이다. 도 4b는 피부 cm2 당 10조 개 단위의 EV 입자 농도를 나타낸다. 도 4c는 109 내지 135 nm 범위의 평균 입자 크기를 나타낸다. 도 4d는 모의 및 miR-146a 디자이너 EV 둘 다가 막 EV 마커 테트라스파닌 CD9의 양성 발현을 제시함을 나타낸다. 도 4e는 이들 생체내 유래한 miR-146A 디자이너 EV의 qRT-PCR 특성화를 보여주고, 분자적 적하물의 성공적인 로딩을 나타낸다. 도 4f 및 도 4g는 표지된 디자이너 EV의 생체내 생산을 나타내고, 여기서 CD63-GFP (EV 추적자)를 인코딩하는 플라스미드로 피부의 TNT 이후 24시간째, 형질감염되지 않은 동물로부터의 대조군 조직과 비교하여 (도 4g) GFP 표지된 디자이너 EV가 형질감염된 피부 세포에 의해 명백하게 생산된다 (희색 화살표).
도 5a 내지 도 5f는 생체내 유래한 디자이너 EV가 폐에서 염증을 조절함을 나타낸다. 인공 호흡 동안 4시간 처리 이후 miR-146a 디자이너 EV는 생리학적 매개변수의 개선 (도 5a 내지 도 5d), BAL 단백질 함량의 유의한 감소 (도 5e) 및 염증성 사이토카인 분비의 감소된 경향성 (도 5f, *p-값 = 0.022)의 효과를 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 염증을 일으킨 폐를 표적하도록 기능화된 디자이너 EV를 나타낸다. 디자이너 EV는 기능화되어 폐포 공간에서 상이한 세포 구획을 표적할 수 있다. 도 6a는 폐포 대식구를 표적하도록 CD200으로 기능화된 디자이너 EV로 24시간 동안 처리된 동물로부터 수집된 장기의 생체내 영상화를 나타낸다. 도 6b는 형광으로 표지된 기능화된 디자이너 EV로의 처리 이후 24시간째 폐 조직의 IF 영상을 나타내고, 폐 세포에 의한 성공적인 흡수를 보여준다 (화살표).
항-염증성 적하물이 로딩된 폐 표적화된 세포외 소포체 (EV), 뿐만 아니라 조성물, 시스템 및 이를 제조하는 방법이 개시된다. 개시된 EV는 폐 표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질과 같은 폐 표적화된 리간드를 포함할 수 있다. 또한, 개시된 융합 단백질을 포함하는 EV를 포함하는 조성물도 개시된다. 일정 구현예에서, EV는 항-염증성 적하물이 로딩된다. 또한, 개시된 EV를 생산하도록 제작된 EV 생산하는 세포가 개시된다. 또한, 개시된 EV 생산하는 세포를 EV를 생산하는데 적합한 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 개시된 EV를 제조하는 방법도 개시된다.
본 발명을 더 자세하게 설명하기 이전에, 본 발명이 기술된 특정한 구현예에 한정되지 않고, 이와 같이 물론 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어학이 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 목적이고, 본 발명의 범주가 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에 제한하려고 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
값의 범위가 제공되는 곳에서, 각각의 개입된 값은 달리 명백하게 진술되지 않는 한 하부 한계의 십분의 일 단위로 해당 범위의 상부 및 하부 한계 사이에 있고, 해당 진술된 범위에서 임의의 다른 진술되거나 개입된 값은 본 발명 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들의 더 작은 범위의 상부 및 하부 한계는 독립적으로 더 작은 범위에 포함되고, 진술된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계가 되어 본 발명 내에 또한 포괄된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어 모두는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 공통적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 방법 및 재료와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 관행 또는 테스트에도 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 이제 설명될 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참고문헌으로 통합하도록 표시된 것처럼 본원에 참고문헌으로 통합되고, 간행물이 인용된 것과 연결하여 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하도록 본원에 참고문헌으로 통합된다. 임의의 간행물의 인용은 출원일 이전에 본 발명을 위한 것이고, 본 발명이 선행 발명 덕분에 이러한 간행물을 앞설 권리가 없음을 인정하는 것으로서 고려되어서는 안된다. 또한, 제공된 공개일은 독립적으로 검증되는 것이 필요할 수 있는 실제 공개일과 상이할 수 있다.
본 발명을 해석할 때 당업자에게 자명할 바와 같이, 본원에 설명되고 예시된 각각의 개별 구현예는 본 발명의 범주 또는 정신을 벗어나지 않고도 구별된 구성요소 및 임의의 다른 여러 구현예의 특징과 쉽게 분리되거나 이들과 조합될 수 있는 특징을 갖는다. 임의의 재인용된 방법은 재인용된 과정의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 발명의 구현예는 달리 표시되지 않는 한, 당해 기술분야의 기술에 속하는 화학, 생물학 등의 기법을 채용할 것이다.
다음의 실시예는 당업자에게 본원에 개시되고 청구된 방법을 수행하고, 프로브를 사용하는 방식을 완벽하게 개시하고, 설명하도록 제시된다. 숫자 (에로, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하도록 노력을 하였지만, 일정 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부분은 중량으로 부분이고, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 또는 이의 근처이다. 표준 온도 및 압력은 20℃ 및 1 대기압으로서 정의된다.
본 발명의 구현예가 자세하게 기술되기 이전에, 달리 표시되지 않는 한, 본 발명이 이와 같이 달라질 수 있는 구체적인 물질, 시약, 반응 물질 또는 제조 공정 등에 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어학이 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 목적이고, 제한하려고 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본 발명에서는 가능한 곳에서 단계가 상이한 순서로 시행될 수 있음이 가능하다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 문맥상 명백하게 진술되지 않는 한, 복수 대상을 포함함이 언급되어야 한다.
일정 구현예에서, 개시된 EV는 세포에 의해 생산될 수 있는 임의의 EV일 수 있다. 세포는 세포사멸체 (1 내지 5 μm), 미세소포 (100 내지 100 nm 크기) 및 엑소좀으로서 알려진 엔도좀 기원의 소포 (50 내지 150 nm)를 포함하여, 넓은 범위의 직경 및 기능을 갖는 세포외 소포 (EV)를 분비한다.
개시된 세포외 소포는 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 개시된 세포외 소포는 진핵 세포에서 세포 표적화 리간드를 인코딩하는 mRNA를 발현함으로써 제조될 수 있다. 일정 구현예에서, 세포는 항-염증성 적하물을 인코딩하는 mRNA도 발현한다. 세포 표적화 리간드 및 항-염증성 적하물에 대한 mRNA는 개시된 EV를 생산하는데 적합한 생산 세포 내에 형질감염된 벡터로부터 발현될 수 있다. 세포 표적화 리간드 및 항-염증성 적하물에 대한 mRNA는 동일한 벡터 (예로, 벡터가 별도의 프로모터로부터 세포 표적화 리간드 및 항-염증성 적하물에 대한 mRNA를 발현함)로부터 발현될 수 있거나, 세포 표적화 리간드 및 항-염증성 적하물에 대한 mRNA는 별도의 벡터로부터 발현될 수 있다. 세포 표적화 리간드 및 항-염증성 적하물에 대한 mRNA를 발현하는 벡터 또는 벡터들은 개시된 세포외 소포를 제조하기 위해 설계된 키트에 포장될 수 있다.
또한, 개시된 표적화 리간드를 포함하는 EV를 포함하는 조성물이 개시된다. 일정 구현예에서, EV는 개시된 항-염증성 적하물과 함께 로딩된다. 또한, 개시된 EV를 분비하도록 제작된 EV 생산하는 세포가 개시된다.
엑소좀과 같은 EV는 B 림프구, T 림프구, 수지상 세포 (DC) 및 대부분의 세포와 같은 면역 세포를 포함하는 많은 상이한 유형의 세포에 의해 생산된다. 또한, EV는 예를 들면 교아종 세포, 혈소판, 망상적혈구, 뉴런, 장내 상피세포 및 종양 세포에 의해 생산된다. 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 EV는 상기에 확인된 세포를 포함하여 임의의 적합한 세포로부터 유래할 수 있다. 대량 생산에 적합한 EV 생산하는 세포의 비-제한적인 예는 수지상 세포s (예로, 미성숙한 수지상 세포), 인간 배아 신장 293 (HEK) 세포, 293T 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 인간 ESC 유래한 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 또한, EV는 자가유래 환자 유래한, 이종유래 반수체형 매칭된 또는 이종유래 줄기 세포로부터 획득되어 엑소좀이 전달되는 환자에서 면역 반응의 생성을 감소시키거나 회피할 수 있다. 임의의 EV 생산하는 세포가 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 항-염증성 적하물이 로딩된 개시된 EV를 제조하는 방법으로서, 개시된 EV를 분비하도록 제작되는 개시된 EV 생산하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다. 상기 방법은 세포로부터 EV를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
세포로부터 생산된 EV는 임의의 적합한 방법에 의해 배양 배지로부터 수집될 수 있다. 전형적으로, EV의 제조는 세포 배양물 또는 배양 상청액으로부터 원심분리, 여과 또는 이들 방법의 조합에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, EV는 차별적인 원심분리, 즉 더 큰 입자를 펠렛화하는 저속 (< 20000 g) 원심분리, 이어지는 EV를 펠렛화하는 고속 (> 100000 g) 원심분리, 적절한 필터로의 크기 여과, 구배 초원심분리 (예를 들면, 슈크로스 구배를 사용함) 또는 이들 방법의 조합에 의해 제조될 수 있다.
개시된 EV는 폐 세포의 표면 상에 발현된 세포 표면 모이어티에 결합하는 표적화 모이어티를 EV의 표면 상에 발현함으로써 폐로 표적화될 수 있다. 적합한 표적화 모이어티의 예는 표적화 모이어티가 엑소좀의 표면 상에서 발현될 수 있는 한, 짧은 펩티드, scFv 및 완전한 단백질이다. 펩티드 표적화 모이어티는 전형적으로 100개 미만의 아미노산 길이, 예를 들면 50개 미만의 아미노산 길이, 30개 미만의 아미노산 길이, 내지 10개, 5개 또는 3개 미만의 아미노산의 최소 길이일 수 있다.
일정 구현예에서, 제 Ⅱ형 폐포세포는 표면활성제 단백질 A (SPA)를 사용하여 표적화된다. SPA로 기능화된 EV는 제 Ⅱ형 세포 상의 수용체 P63/CKAP4와 상호작용한다. 일정 구현예에서, 표적화 모이어티는 하기 아미노산 서열을 갖는 SPA1: MWLCPLALNLILMAASGAVCEVKDVCVGTPGIPGECGEKGEPGERGPPGLPAHLDEELQATLHDFRHQILQTRGALSLQGSIMTVGEKVFSSNGQSITFDAIQEACARAGGRIAVPRNPEENEAIASFVKKYNTYAYVGLTEGPSPGDFRYSDGTPVNYTNWYRGEPAGRGKEQCVEMYTDGQWNDRNCLYSRLTICEF (서열번호 1), 또는 제 Ⅱ형 세포 상의 수용체 P63/CKAP4와 상호작용할 수 있는 서열번호 1과 적어도 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 이의 변이체 및/또는 단편이다.
일정 구현예에서, 표적화 리간드는 서열번호 1의 적어도 100, 110, 120, 130, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 156, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 또는 199개의 연속적 아미노산을 포함하는 SPA1의 단편 또는 이의 변이체이다.
일정 구현예에서, 표적화 모이어티는 하기 아미노산 서열을 갖는 SPA2: MWLCPLALTLILMAASGAACEVKDVCVGSPGIPGTPGSHGLPGRDGRDGVKGDPGPPGPMGPPGETPCPPGNNGLPGAPGVPGERGEKGEAGERGPPGLPAHLDEELQATLHDFRHQILQTRGALSLQGSIMTVGEKVFSSNGQSITFDAIQEACARAGGRIAVPRNPEENEAIASFVKKYNTYAYVGLTEGPSPGDFRYSDGTPVNYTNWYRGEPAGRGKEQCVEMYTDGQWNDRNCLYSRLTICEF (서열번호 2), 또는 제 Ⅱ형 세포 상의 수용체 P63/CKAP4와 상호작용할 수 있는 서열번호 2와 적어도 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 이의 변이체 및/또는 단편이다.
일정 구현예에서, 표적화 리간드는 서열번호 2의 적어도 100, 110, 120, 130, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 156, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247 또는 248개의 연속적 아미노산을 포함하는 SPA2의 단편 또는 이의 변이체이다.
일정 구현예에서, 폐 대식구는 막 당단백질 CD200을 사용하여 표적화될 수 있다. CD200로 기능화된 EV는 폐포 대식구에서 우선적으로 CD200R 수용체와 상호작용한다. 일정 구현예에서, 표적화 모이어티는 하기 아미노산 서열을 갖는 CD200: MERLVIRMPFCHLSTYSLVWVMAAVVLCTAQVQVVTQDEREQLYTPASLKCSLQNAQEALIVTWQKKKAVSPENMVTFSENHGVVIQPAYKDKINITQLGLQNSTITFWNITLEDEGCYMCLFNTFGFGKISGTACLTVYVQPIVSLHYKFSEDHLNITCSATARPAPMVFWKVPRSGIENSTVTLSHPNGTTSVTSILHIKDPKNQVGKEVICQVLHLGTVTDFKQTVNKGYWFSVPLLLSIVSLVILLVLISILLYWKRHRNQDREP (서열번호 3), 또는 폐 대식구와 상호작용할 수 있는 서열번호 3과 적어도 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 이의 변이체 및/또는 단편이다.
일정 구현예에서, 표적화 리간드는 서열번호 3의 적어도 100, 110, 120, 130, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 156, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268 또는 269개의 연속적 아미노산을 포함하는 CD200의 단편 또는 이의 변이체이다.
세포 표적화 리간드는 일정 경우에 엑소좀성 또는 리소좀성 막통과 단백질과의 융합 단백질로서 이를 발현함으로써 EV의 표면 상에 발현될 수 있다. 많은 단백질은 엑소좀과 관련된 것으로 알려져 있고, 즉 이들은 엑소좀이 형성되면서 이에 혼입된다. 예로는 Lamp-1, Lamp-2, CD13, CD86, 플로틸린, 신탁신-3, CD2, CD36, CD40, CD40L, CD41a, CD44, CD45, ICAM-1, 인테그린 알파4, LiCAM, LFA-1, Mac-1 알파 및 베타, Vti-IA 및 B, CD3 엡실론 및 제타, CD9, CD18, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82, CXCR4, FcR, GluR2/3, HLA-DM (MHC Ⅱ), 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-Ⅱ 구성성분, TCR 베타 및 테트라스파닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
개시된 세포외 소포는 항-염증제가 추가로 로딩될 수 있고, 세포외 소포가 제제를 표적 세포에 전달한다. 적합한 항-염증제는 치료제 약물 (예로, 소분자 약물), 치료제 단백질 및 치료제 핵산 (예로, 치료제 RNA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일정 구현예에서, 개시된 세포외 소포는 치료제 RNA (본원에서 "적하물 RNA"로도 지칭됨)를 포함한다. 예를 들면, 일정 구현예에서 세포 표적화 모티브를 포함하는 융합 단백질은 또한 세포외 소포가 세포로부터 분비되기 이전에, 적하물 RNA를 세포외 소포 내에 포장하기 위하여 적하물 RNA에 존재하는 하나 이상의 RNA 모티브에 결합하는 RNA 도메인을 (예로, 융합 단백질의 세포질 C-말단에서) 포함한다. 이와 같이, 융합 단백질은 "세포 표적화 단백질" 및 "포장화 단백질" 둘 다로서 기능할 수 있다. 일정 구현예에서, 포장화 단백질은 세포외 소포 로딩 단백질 또는 "EV 로딩 단백질"로도 지칭될 수 있다.
일정 구현예에서, 적하물 RNA는 miRNA, shRNA, mRNA, ncRNA, sgRNA 또는 임의의 이들의 조합이다. 예를 들면, 일정 구현예에서, 항-염증제는 마이크로-RNA 146a이다.
사용될 수 있는 추가적인 항-염증성 마이크로-RNA는 miR-155, miR-9, miR-210, miR-146b 및 miR-181이다. 항-염증성 miRs-155, miR-9, miR-210 및 miR-146b은 높은 일회 호흡량 통기의 마우스 모델 및 급성 폐 손상 (ALI), 인공 호흡기 유도성 폐 손상 (VILI) 및 골 관절염과 같은 다른 병리학적 병태를 사용하여 ALI/ARDS 동안 상향조절되는 것으로 관찰되어 왔다. 한편, miR-181은 IL-1α, MiR-9, miR-511, miR-146a, miR-23b 및 miR-181a을 통해 대식구에서 염증성 반응을 조정하고, 구체적으로 패혈증 및 ARDS 동안 폐에서 상향조절되는 항-염증성 miRNA로서 이전부터 보고되어 왔다.
또한 디자이너 EV는 핵심 성장인자, 조절 단백질 및 항-염증성 사이토카인을 효율적으로 전달하는데 사용되어 폐 염증 및 손상을 감소시키고, ARDS/VILI 동안 조직 복구를 증진할 수 있다. 이것은 예를 들면 함-염증성 사이토카인 인터류킨-10, 인터류킨-4, 조절 단백질 분비된 백혈구 프로테아제 저해제 (SLP1) 및 각질형성세포 성장인자 (KGF)가 로딩될 수 있고, 이는 사망율을 감소시키고, ARDS 동안 염증을 조정하는 것으로 확인되었다.
개시된 세포외 소포의 적하물 RNA는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들면, 일정 구현예에서 적하물 RNA는 적어도 약 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1000개, 2000개 또는 5000개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖을 수 있다. 다른 구현예에서, 적하물 RNA는 약 5000개, 2000개, 1000개, 500개, 200개, 100개, 50개, 40개, 30개, 20개 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖을 수 있다. 추가의 구현예에서, 적하물 RNA는 이들 고려된 뉴클레오티드 길이의 범위, 예를 들면 약 10개 내지 5000개 범위 또는 기타 범위 이내의 뉴클레오티드 범위를 갖을 수 있다. 개시된 세포외 소포의 적하물 RNA는 비교적 길 수 있고, 예를 들면 적하물 RNA가 mRNA 또는 또 다른 비교적 긴 RNA를 포함한다.
일정 구현예에서, 항-염증성 적하물은 세포에 의해 분비된 이후에 EV 내에 로딩되는 막 투과가능한 약학적 화합물이다. 예를 들면, 일정 구현예에서, 항-염증성 적하물은 Y-27632 Rho 저해제 (캘바이오켐사)를 포함하고, 이는 농도 구배를 통해 EV 내로 확산될 수 있다 (도 2 참조).
개시된 방법은 EV에 임상적으로 적절한 친유성 화합물 및 다른 항-염증성 막 투과가능한 화합물을 로딩하는데 적용될 수 있다. 이러한 유형의 화합물의 예는 스타틴이고, 보다 구체적으로 임상 설정에서 혈액의 콜레스테롤 수준을 감소시키는데 사용되는 심바스타틴이다. 심바스타틴은 디자이너 EV를 통해 국소적으로 염증을 일으킨 폐에 효과적으로 전달되고, 염증에 관여하여 예를 들면 ALI/ARDS 또는 VILI에 걸린 환자의 더 신속한 회복을 도울 수 있다.
일정 구현예에서, 항-염증성 적하물은 농도 구배를 통한 확산에 의해 EV에 로딩된다.
또한 본원에서는 개시된 EV를 사용하는 방법이 고려된다. 예를 들면, 개시된 세포외 소포는 개시된 항-염증성 적하물을 표적 폐 세포에 전달하는데 사용될 수 있고, 여기서 방법은 표적 세포를 개시된 EV와 접촉시키는 단계를 포함한다. 따라서, 본원에서는 또한 폐 질환을 대상체에서 치료하는 방법으로서, 본원에 개시된 적하물이 로딩된 폐 표적화된 EV를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법이 개시된다. 일정 구현예에서, 대상체는 ARDS에 걸려 있다.
개시된 디자이너 EV는 기본적으로 EV를 장식하는데 사용된 리간드를 재단함으로써 폐뿐만 아니라 상이한 장기 시스템에서 매우 다양한 염증성 병태를 조정하는데 사용될 수 있다. 추가적인 호흡기 적용은 인공호흡기 유도성 폐 손상 (VILI), 호흡기 섬유증 및 패혈증, 독감 및 폐렴과 같은 감염성 질환을 포함할 수 있다.
개시된 EV는 폐 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제학적 조성물의 부분으로서 제형화될 수 있고, 상기 약제학적 조성물은 폐 질환 또는 장애를 치료하기 위하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여되어 적하물을 표적 폐 세포에 전달할 수 있다.
개시된 EV는 임의의 적합한 수단에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 인간 또는 동물 대상체에게 투여는 비경구, 근육내, 뇌내, 혈관내, 피하 또는 경피 투여로부터 선택될 수 있다. 전형적으로 전달 방법은 주사에 의한다. 바람직하게, 주사는 근육내 또는 혈관내 (예로, 정맥내) 주사이다. 의사가 각각의 특정한 환자에 대해 필요한 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다.
EV는 바람직하게 조성물로서 전달된다. 조성물은 비경구, 근육내, 뇌내, 혈관내 (정맥내를 포함함), 피하 또는 경피 투여를 위해 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 완충액, 희석제 및 기타 적합한 첨가물도 역시 포함할 수 있는 멸균 수용성 용액을 포함할 수 있다. EV는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있고, 이는 EV에 추가하여 약제학적으로 허용가능한 담체, 증점제, 희석제, 완충액, 보존제 및 기타 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내와 같은 주사를 특징으로 한다. 비경구 투여를 위한 조제물은 즉석 주사를 위한 멸균 용액, 사용 직전에 용매와 즉석 조합될 동결건조된 분말과 같은 멸균 건조 가용성 산물, 사용 직전에 운반체와 즉석 조합될 멸균 건조 불용성 산물 및 멸균 에멀전을 포함한다. 용액은 수용성 또는 비-수용성일 수 있다.
정맥내로 투여되는 경우, 적합한 담체는 생리학적 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS), 포도당, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 증점제 및 용해화제를 포함하는 용액 및 이들의 혼합물을 포함한다. 비경구 조제물에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체는 수용성 운반체, 비-수용성 운반체, 항미생물제, 등장제, 완충액, 항산화제, 국소 마취제, 현탁제 및 분산제, 에멀전화제, 격리제 또는 킬레이팅제 및 기타 약제학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수용성 운반체의 예는 염화나트륨 주사, 링커 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 덱스트로스 및 락테이트화된 링거 주사를 포함한다. 비-수용성 비경구 운반체는 식물 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 및 땅콩유를 포함한다. 세균 성장억제 또는 진균 성장억제 농도의 항미생물제가 다회 용량 용기에 포장되는 비경구 조제물에 첨가되어야 하고, 이는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티머로살, 벤즈알코늄 염화물 및 벤즈토늄 염화물을 포함한다. 등장제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 완충액은 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 현탁제 및 분산제는 소듐 카르복실메틸셀룰로스, 히드록시메틸 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다.
에멀전화제는 폴리솔베이트 80 (트윈®80)을 포함한다. 금속 이온의 격리제 또는 킬레이팅제는 EDTA를 포함한다. 또한, 약제학적 담체는 물 혼화가능한 운반체를 위한 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜; 및 pH 조절을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다. 약제학적 활성 화합물의 농도가 조절되어 주사가 원하는 약학적 효과를 생산하는 유효량을 제공한다. 정확한 용량은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 연령, 체중 및 환자 또는 동물의 병태에 의존한다.
단위 용량 비경구 조제물은 앰풀, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 포장될 수 있다. 비경구 투여를 위한 모든 제조물은 당해 기술분야에 공지되어 실행되는 바와 같이 멸균되어야 한다.
조성물의 약제학적 유효량이 투여된다. 용량은 다양한 매개변수에 따라, 특히 병태의 중증도; 치료될 환자의 연령 및 체중; 투여 경로; 및 요구되는 섭생에 따라 결정될 수 있다. 의사가 임의의 특정한 환자에 대해 필요한 투여 경로 및 용량을 결정할 수 있을 것이다. 최적의 용량은 개별 구조물의 상대 효능에 의존하여 달라질 수 있고, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 관찰된 EC50을 기초로 하여 추정될 수 있다. 전형적인 매일 용량은 특이적 구조물의 효능, 치료될 환자의 연령, 체중 및 병태, 질환의 중증도 및 투여의 빈도와 경로에 따라 체중 kg 당 약 0.1 내지 50 mg, 바람직하게 kg 당 약 0.1 내지 10 mg이다. 투여가 근육내 주사 또는 전신 (정맥내 또는 피하) 주사에 의하는지 여부에 의존하여 상이한 용량의 구조물이 투여될 수 있다.
바람직하게, 단회 근육내 주사의 용량은 약 5 내지 20 μg의 범위이다. 바람직하게, 단회 또는 다회 전신 주사의 용량은 약 10 내지 100 mg/kg 체중의 범위이다.
구조물 청소 (및 임의의 표적화된 분자의 분해)로 인해, 환자는 반복적으로, 예를 들면 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상 처리되어야 할 수 있다. 당업자라면 체액 또는 조직에서 측정된 체류 시간 및 구조물의 농도를 기초로 하여 투약의 반복율을 용이하게 추정할 수 있다. 성공적인 치료에 이어서, 환자에게 유지 요법을 진행하는 것이 바람직할 수 있고, 여기서 구조물은 체중 kg 당 0.01 mg 내지 100 mg 범위를 갖는 유지 용량으로 매일 1회 이상 내지 20년마다 1회 투여된다.
본 발명의 많은 구현예가 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 성립될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 기타 구현예는 다음의 청구항의 범주에 속한다.
실시예
실시예 1
도 3은 생체내 유래한 디자이너 EV의 특성화 및 전달을 나타낸다. 도 3a는 qRT-PCR에 의한 miR-146a 및 SH 로딩된 EV 특성화를 나타내는 막대 그래프이다. SH-CT 또는 miR 로딩된 EV가 삽관 매개된 기관내 전달을 통한 호흡 이전에 전달되었다. 도 3b는 SH-CT 또는 miR-146A 로딩된 EV로 처리된 동물로부터 생리학 측정을 나타내는 막대 그래프이다 (MV 프로토콜: 12 cc/kg의 1회 호흡량, 150회 호흡/분의 호흡율, 0 cm H2O 양성 말단-호기 압력에서 4시간). 도 3c는 4시간의 MV 이후에 SH 및 miR-146a 처리된 동물의 경우 BAL 단백질 함량의 변화를 나타내는 막대 그래프를 포함한다. 도 3d는 모의 플라스미드 (모의 대조군 -SH) 또는 항-염증성 miR-146a가 로딩된 EV의 평균 크기 분포를 나타내는 막대 그래프이다.
항-염증성 miR-146a가 로딩된 생체내 유래한 디자이너 EV는 miR-146a를 인코딩하는 플라스미드 (오리진사)로 C57BL6 mice (8 내지 10주령)의 등쪽 피부를 나노형질감염시킴으로써 획득하였다. 피부 형질감염 이후 24시간째, 로딩된 EV를 피부 생검으로부터 수집하였고, ExoQuick 키트 (시스템바이오사)를 사용하여 단리하였다. 단리 이후에, EV를 펠렛 형태로 유지한 다음 후속 사용을 위해 0.9% 염화나트륨 용액에 현탁하였다. EV 로딩 효율을 miR-146a 사본수를 qRT-PCR에 의해 정량화함으로써 측정하였다.
디자이너 EV는 생체내에서 평가하였다. 간략하게, 인공 호흡 (MV)을 상당한 폐 손상을 유도할 이전에 보고된 호흡 프로토콜인 12 cc/kg의 1회 호흡량, 150회 호흡/분의 호흡율, 0 cm H2O 양성 말단-호기 압력에서 4시간으로 시행하였다. 이들 실험을 위해, MV 이전에 디자이너 EV를 기관내 주사 (2 μL/g 마우스 체중)을 통해 이들 마우스의 폐 내로 전달하였다. 폐 생리학 및 산소 포화 데이타를 호흡 절차 동안 수집할 것이다. 4시간 후 동물을 안락사시키고, 기관지 폐포 세척물 (BAL) 및 조직을 수집하였다.
실시예 2: 디자이너 EV를 제조하려는 시험관내 접근법
나노채널 기반의 전기천공은 공여자 세포 내에 관심있는 적하물을 조절가능하게 과다발현시키고, EV의 내용물 및 표면 장식을 맞춤 제작하는데 사용하였다. 나노채널 기반의 전기천공은 형질감염 효율 및 세포 생존도를 ~ 100%로 수득할 수 있고, 캡시드 크기 한계에 의해 제한되지 않는다. 이러한 접근법은 항-염증성 miR-146A과 함께 로딩된 디자이너 EV를 마우스 수지상 세포 및 배아 섬유모세포, 뿐만 아니라 인간 세포주의 일차 배양물을 포함하는 다수의 세포 공급원으로부터 획득하는데 사용되었다 (도 3a 내지 도 3e). EV 내용물의 특성화는 모의 로딩된 EV와 비교하여 관심있는 분자적 적하물의 성공적인 혼입을 보여주었다 (도 3c). 다음으로 이러한 EV를 인간 폐 상피세포 및 인간 대식구의 배양에서 유전자 발현을 조정하는데 효과적으로 사용하였다 (도 3d). 또한, 전구-신경인자 ASCL1, BRN2 및 MYT1L (ABM)가 로딩된 디자이너 EV를 마우스 섬유모세포의 일차 배양물로부터 획득하였다. ABM 로딩된 디자이너 EV 방출 및 흡수의 동력학 연구는 공여자 세포로부터의 EV 방출이 10억 개 입자/mL 단위의 농도로 형질감염 이후 24시간째 피크에 도달하는 것을 드러내었다. EV 내부에 충전된 유전자 사본의 수가 "공여자" 세포에 전달된 사본의 원래 수를 대략 3배의 크기로 초과하였으며, EV 방출 이전에 치료제 적하물의 세포내 증폭을 시시하고 있다.
실시예 3: 디자이너 EV를 제조하려는 생체내 접근법
생체내 조직으로부터 디자이너 EV의 유도를 위한 나노채널 기반의 조직 형질감염은 생산적인 EV 생체반응기로서 환자 자신의 조직의 사용을 가능하게 할 수 있고, 이는 주요한 임상 및 번역 관련성을 갖을 것이다. 이러한 방법은 대략 1 cm2의 마우스 피부로부터 항-염증성 miR-146a가 로딩된 약 10조 개의 EV의 수율을 갖는다 (도 4). 다음으로 이러한 EV를 인공 호흡에 의해 유발된 염증을 막는데 사용하였다.
실시예 3:
ARDS는 건강 관리 시스템에 상당한 부담이 되고, 중환자 치료의 필요성, 연장된 입원 기간 및 느린 회복을 고려해야 한다. 미국 폐 협회 (2013)에 따르면, 미국에서 매년 대략 190,000개의 사례가 생긴다. ARDS에 걸린 환자의 사망율은 38 내지 45% 범위로 높다. ARDS는 정상적으로 페에 대한 둔감한 외상 또는 패혈증과 같은 내재하는 병태에 의해 유발된다. 폐 손상의 맥락에서, 패혈증은 감염에 의해 야기된 중증 전신성 염증 반응을 특징으로 하는 생명을 위협하는 병태이고, ICU 환자의 경우 주요 사망 원인이다. ARDS의 표식은 중증 저산소증, 페포 모세혈관 장벽 기능부전, 호흡기 표면활성제의 생산 감소로 인한 작은 기도의 출혈 과다 및 전-염증 경로의 활성화를 포함한다. 인공 호흡이 산소 요법을 지원하는데 사용되는 반면, 인공 호흡기 스트레스가 초기 손상을 악화시키고, 인공호흡기 유도성 폐 손상 (VILI)를 유발할 수 있으며, 이는 훨씬 더 높은 사망율을 갖는다. 이들 요인 모두가 내재하는 폐 손상을 추가로 악화시키고, 따라서 염증을 선호하고, 다중시스템 장기 부전 및 사망을 유도할 수 있는 양성 피드백 고리를 자극시킨다. 현재까지 ARDS에 대한 치유법은 없지만, 폐를 표적하는 항-염증 접근법의 사용은 상당한 유망성을 보여주었다. 예를 들면, 세포 기반의 요법 (예로, 내피 전구체, 중간엽 줄기 세포)이 영양성 및 항-염증/감염 기작을 통해 염증을 감소시키고 폐 복구를 증진하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 여전히 종양생성 및 높은 면역원성 반응에 대한 잠재력을 포함하여, 부분적으로 과다한 생체외 프로세싱으로부터 발생하는 전구체 기반의 세포 요법의 안정성에 대한 상당한 걱정이 남아있다. 특이적 치료제가 확인되었던 반면, 염증을 일으킨 폐에 대한 효율적인 치료제의 전달이 아직 중환자에서 주요 문제점으로 남아있다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 핵심 항-염증성 및 항-세균성 분자적 적하물을 기능화된 디자이너 EV를 사용하여 효율적으로 및 선택적으로 전달하여 폐 염증 민 손상을 감소시키고, 패혈증 유도성 ARDS 동안 조직 복구를 증진시킨다. 표 1에 설명된 분자적 적하물이 로딩된 디자이너 EV가 제작된다.
Figure pct00001
프로토콜을 살아있는 조직으로부터 유래한 디자이너 EV를 획득하도록 최적화하였다. 이러한 중점 영역을 위해, 표 1에 설명된 항-염증성 또는 항-세균성 적하물이 로딩된 생체내 유래한 디자이너 EV를 8 내지 10주령 C57BL6 마우스의 피부에 각각의 인자를 인코딩하는 플라스미드로 생체내에서 나노형질감염시킴으로써 획득한다. 조직 나노형질감염 플랫폼을 이전에 보고된 바와 같이 투사 및 접촉 사진평판술의 조합 및 깊은 반응성 이온 에칭을 사용하여 청정 공간에서 제조한다. EV를 형질감염 이후 상이한 시점에 피부 생검으로부터 수집할 것이다. EV 단리를 위해, 피부 시료를 분해하고, 젠틀MACS 해리기를 사용하여 균질화한다. EV를 총 엑소좀 단리 키트를 사용하여 선택적으로 침전시키고, 후속 사용을 위해 -80℃에 보관한다.
디자이너 EV는 폐 상피세포 및 대식구에 표적화된 전달을 위해 기능화되고, 이들 세포성 구획은 ARDS 동안 염증의 유의한 출처이다. 기능화된 디자이너 EV를표면면활성제 단백질 A (SPA) 및 막 당단백질 CD200을 위한 플라스미드로의 나노형질감염을 통해 획득한다 (도 6). SPA-기능화된 EV는 폐포의 폐포세포 상의 수용체 P63/CKAP4와 상호작용하고, 이들 세포에서 톨-유사 수용체 2 (TLR2)에도 결합하는 잠재력을 갖으면서 NFκβ 염증 경로의 활성화 관여할 것으로 기대된다. CD200-기능화된 EV는 아마도 폐포의 폐포세포에서 CD200R 수용체와 우선적으로 상호작용하여 이들의 전-염증 상태를 조절할 것이다. 내피세포를 표적하는 추가적인 리간드는 SPA 및 CD200와 조합하여 전신 순환을 통해 전달된 디자이너 EV가 호흡기 미세혈관 구조와 상호작용을 선호하는데 사용될 것이다. SDF1 리간드로 공동-기능화된 EV는 폐의 혈관구조에서 CXCR7 수용체와 우선적으로 상호작용하고, 이는 손상 조건 하에 상향조절되어 아마도 디자이너 EV가 폐포 공간 내로의 후속적인 전위를 위한 폐 혈관구조에 고정화를 용이하게 할 것이다. 또한, 디자이너 EV의 최고의 투여 경로를 확인하는 것도 치료제 적용을 위해 디자이너 EV를 최적화하는 중요한 구성요소이다. 이와 같이, 3가지 비-침습적인 투여 경로 (표 2)를 비교하여 치료제 적용을 위한 최고이 전달 방법을 정의한다.
Figure pct00002
용량 민감성 분석을 각각의 전달 방법에 대해 기능화된 및 기능화되지 않은 항-염증성, 항-세균성 또는 모의 로딩된 디자이너 EV로 처리된 건강한 및 병든 동물 상에서 진행하였다 (표 3). 이러한 분석을 위해, 기관지폐포 세척물 (BAL), 혈액 및 폐를 수집하고, 전달된 분자적 적하물, 뿐만 아니라 핵심 전-염증성 및 항-염증성 인자 (표 4)를 인코딩하는 유전자의 상대 발현을 qRT-PCR에 의해 정량화한다. 이러한 분석은 생체내에서 폐 염증의 유의한 조정을 달성하도록 최적의 용량 농도를 정의한다. 이들 결과는 디자이너 EV의 최적의 농도를 획득하는데 필요한 형질감염된 피부의 영역과 상관된다. 표적을 벗어난 축적 및 청소는 정량적인 생체분포 연구를 통해 테스트된다 (도 6).
Figure pct00003
Figure pct00004
생체내 연구에 덧붙여, EV의 광범위한 시험관내 특성화를 이들의 특성을 더 잘 이해하기 위하여 시행한다. 이것은 나노사이트 및 제타 전위 분석기 시스템을 사용하는 적하물의 함수로서 크기 분포, 전하 및 입자 농도 그리고 표면 장식의 분석을 포함한다. EV 로딩 효율은 각각의 플라스미드 DNA에 대해 생성된 표준 곡선과 함께 절대적인 정량화 qRT-PCR 프로토콜을 사용하여 EV 당 충전된 각 유전자의 사본수를 정량화함으로써 정의된다. 이들 결과는 피부 내에 형질감염된 사본수와 상관된다. 총 RNA 서열을 항-염증성, 항-세균성 또는 모의 분자적 적하물이 로딩된 디자이너 EV의 내용물을 특성화하는데 사용하여 디자이너 EV 내부에 충전된 코딩 및 비-코딩 RNA 형태의 철저한 기록을 획득한다. 추가적으로, 기능화된 및 기능화되지 않은 디자이너 EV의 비교 프로테옴 분석을 (막 및 세포질 수준에서) 시행하여 항-염증성 및 항-세균성 분자적 적하물의 충전, 뿐만 아니라 막 리간드 발현의 효율을 추가로 정의한다.
디자이너 EV의 작용 메커니즘을 더 잘 이해하기 위하여, 폐 손상의 마우스 모델에서 생체내 성능 연구 (표 3)를 벤치마크하여 시험관내 손상 모델에서 잘 확립한다 (표 5). 시험관내 모델은 특이적 세포 집단에 미치는 디자이너 EV의 효과의 체계적인 연구를 가능하게 하는 반면, 생체내 모델은 다수의 장기 시스템 간의 상호작용이 활력이 되는 더욱 병리생리학적 조건 하에 반응의 더 양호한 이해를 제공할 것이다. 생체내에서 염증 및 세균성 감염을 감소시키는 디자이너 EV의 효능을 패혈증 유도성 ARDS 및 이중 히트 모델을 사용하여 평가한다. 이들 모델은 감염 하에 디자이너 EV의 특이적 농도로 관찰된 염증 약화 수준의 잠재적인 효과를 결정하도록 돕는다. 압력 외상 및 부피 외상의 시험관내 모델을 폐 조직 및 세균 배양물의 단리된 세포 구성성분 상에서 디자이너 EV를 찾는데 사용한다.
Figure pct00005
생체내 손상 모델의 경우, 디자이너 EV가 다양한 용량 (예로, 단일 대 반복) 및 시점 (예로, 손상-전 대 손상-후)에 투여된다. 패혈증 유도성 ARDS를 모델화하기 위하여, 8 내지 10주령 C57BL6 마우스에게 맹장 결찰 및 천자 (CLP) 또는 모의 개복술을 시행한다. CLP 이후에 호흡기 부종을 베보 2100 시스템을 사용한 초음파 촬영에 의해 평가한다. 동물을 희생시키고, BAL, 혈액 및 주요 장기 (즉, 폐, 심장, 비장, 간 및 신장)를 후속 분석을 위해 멸균 식염수로의 관류한 이후에 수집한다. 이중 히트 모델을 사용하는 것이 더욱 임상적으로 적절한 조건의 반복을 가능하게 하고, 여기서 환자는 내재하는 감염으로 인한 인공 호흡을 요구한다. 이러한 모델의 경우, 8 내지 10주령 C57BL6 마우스에게 CLP 또는 모의 개복술을 처음 시행하고, CLP 이후 24시간째 FlexiVent FX, SCIREQ를 사용하여 동물을 손상을 입히는 프로토콜 (12 cc/kg의 1회 호흡량, 120회 호흡/분 및 0 cm H2O 양성 말단-호기 압력)로 4시간 동안 인공 호흡을 시킨다. MV 절차 동안 폐 생리학 및 산소 포화 데이타를 수집하고, 동물을 MV의 종결 시 마취제의 과용량에 의해 희생시키고, BAL, 혈액 및 주요 장기를 후속 분석을 위해 멸균 식염수로의 관류한 이후에 수집한다. BAL 시료의 세포성 내용물을 염증성 세포 (즉, 폐포의 대식구, 림프구, 호산구, 호중구 및 비만 세포)의 계수에 의해 특성화한다. 또한, 단백질 함량의 상승이 폐포의 모세혈관 장벽 기능의 특성 상실과 상관되지 때문에, BAL 단백질 함량도 평가된다. 단백질 정량화 이후에, 모든 BAL 및 혈장 시료를 전-염증성 및 항-염증성 사이토카인 및 인자 (표 4)의 발현에 대해 맞춤 제작된 사이토카인 어레이를 사용하여 스크리닝한다. (표 1에 기술된 요법을 위해) 생체내 전달된 분자적 적하물의 상대 발현 및 핵심 항-염증성 및 전-염증성 분자 마커 (표 4에 설명됨)의 발현에 미치는 효과를 qRT-PCR에 의해 평가한다.
시험관내 손상 모델의 경우, 마우스로부터 유래한 일차 폐 상피세포 및 대식세포의 공동-배양물을 압력 외상 또는 부피 외상 손상에 노출시킨다. 압력 외상 손상은 이전에 공개된 순환 압력 모델을 사용하여 유도된다. 이 경우에, 세포를 웰통과 삽입물 상에 공동-배양하고, 첨단 구획에 24시간 동안 압력을 가하여 0.2 Hz 주파수에서 0 내지 20 cm H2O의 순환 진동 압력을 달성하고, 인공 호흡기 및 정상적인 호흡 빈도에서와 유사한 압력 크기를 모방한다. 부피 외상 손상을 플렉스셀 FX-5000 장력 시스템을 사용하여 모방할 것이다. 이러한 모델의 경우, 세포를 탄성제 바닥을 갖는 변형된 6-웰 플레이트 상에서 공동-배양하고, 세포 배양물 배양기에서 24시간 동안 1.25 Hz에서 10 내지 20% 연장하는 연속적인 순환 스트레칭에 노출시킬 것이다. 배지 내로 핵심 전-염증성 분자 (표 4)의 분비를 모니터링한다. ZO-1을 염색하여 IF로 촬영하고, 부피 외상 손상 이후에 상피-내피 장벽 기능의 지표로서 밀접 연접부 형성 및 유지를 평가한다. 이 평가에 사용된 실험군은 표 5에 설명된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어 모두는 개시된 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 공통적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 인용된 간행물 및 이들이 인용하는 물질은 상세하게 참고문헌으로 통합된다.
당업자라면 단지 일상적인 실험법만을 사용하여 본원에 기술된 발명의 상세한 구현예에 대한 많은 동등물을 인식하거나, 확증할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 다음의 청구범위에 의해 포괄되려고 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Ohio State Innovation Foundation <120> NANOCARRIERS FOR LUNG INFLAMMATION THERAPY <130> 321501-2340 <150> US 62/747,987 <151> 2018-10-19 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Met Trp Leu Cys Pro Leu Ala Leu Asn Leu Ile Leu Met Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Val Cys Glu Val Lys Asp Val Cys Val Gly Thr Pro Gly Ile 20 25 30 Pro Gly Glu Cys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro 35 40 45 Gly Leu Pro Ala His Leu Asp Glu Glu Leu Gln Ala Thr Leu His Asp 50 55 60 Phe Arg His Gln Ile Leu Gln Thr Arg Gly Ala Leu Ser Leu Gln Gly 65 70 75 80 Ser Ile Met Thr Val Gly Glu Lys Val Phe Ser Ser Asn Gly Gln Ser 85 90 95 Ile Thr Phe Asp Ala Ile Gln Glu Ala Cys Ala Arg Ala Gly Gly Arg 100 105 110 Ile Ala Val Pro Arg Asn Pro Glu Glu Asn Glu Ala Ile Ala Ser Phe 115 120 125 Val Lys Lys Tyr Asn Thr Tyr Ala Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Pro Gly Asp Phe Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Pro Val Asn Tyr Thr 145 150 155 160 Asn Trp Tyr Arg Gly Glu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Glu Gln Cys Val 165 170 175 Glu Met Tyr Thr Asp Gly Gln Trp Asn Asp Arg Asn Cys Leu Tyr Ser 180 185 190 Arg Leu Thr Ile Cys Glu Phe 195 <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Trp Leu Cys Pro Leu Ala Leu Thr Leu Ile Leu Met Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Ala Cys Glu Val Lys Asp Val Cys Val Gly Ser Pro Gly Ile 20 25 30 Pro Gly Thr Pro Gly Ser His Gly Leu Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp 35 40 45 Gly Val Lys Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly 50 55 60 Glu Thr Pro Cys Pro Pro Gly Asn Asn Gly Leu Pro Gly Ala Pro Gly 65 70 75 80 Val Pro Gly Glu Arg Gly Glu Lys Gly Glu Ala Gly Glu Arg Gly Pro 85 90 95 Pro Gly Leu Pro Ala His Leu Asp Glu Glu Leu Gln Ala Thr Leu His 100 105 110 Asp Phe Arg His Gln Ile Leu Gln Thr Arg Gly Ala Leu Ser Leu Gln 115 120 125 Gly Ser Ile Met Thr Val Gly Glu Lys Val Phe Ser Ser Asn Gly Gln 130 135 140 Ser Ile Thr Phe Asp Ala Ile Gln Glu Ala Cys Ala Arg Ala Gly Gly 145 150 155 160 Arg Ile Ala Val Pro Arg Asn Pro Glu Glu Asn Glu Ala Ile Ala Ser 165 170 175 Phe Val Lys Lys Tyr Asn Thr Tyr Ala Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gly 180 185 190 Pro Ser Pro Gly Asp Phe Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Pro Val Asn Tyr 195 200 205 Thr Asn Trp Tyr Arg Gly Glu Pro Ala Gly Arg Gly Lys Glu Gln Cys 210 215 220 Val Glu Met Tyr Thr Asp Gly Gln Trp Asn Asp Arg Asn Cys Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Arg Leu Thr Ile Cys Glu Phe 245 <210> 3 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Met Glu Arg Leu Val Ile Arg Met Pro Phe Cys His Leu Ser Thr Tyr 1 5 10 15 Ser Leu Val Trp Val Met Ala Ala Val Val Leu Cys Thr Ala Gln Val 20 25 30 Gln Val Val Thr Gln Asp Glu Arg Glu Gln Leu Tyr Thr Pro Ala Ser 35 40 45 Leu Lys Cys Ser Leu Gln Asn Ala Gln Glu Ala Leu Ile Val Thr Trp 50 55 60 Gln Lys Lys Lys Ala Val Ser Pro Glu Asn Met Val Thr Phe Ser Glu 65 70 75 80 Asn His Gly Val Val Ile Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Ile Asn Ile 85 90 95 Thr Gln Leu Gly Leu Gln Asn Ser Thr Ile Thr Phe Trp Asn Ile Thr 100 105 110 Leu Glu Asp Glu Gly Cys Tyr Met Cys Leu Phe Asn Thr Phe Gly Phe 115 120 125 Gly Lys Ile Ser Gly Thr Ala Cys Leu Thr Val Tyr Val Gln Pro Ile 130 135 140 Val Ser Leu His Tyr Lys Phe Ser Glu Asp His Leu Asn Ile Thr Cys 145 150 155 160 Ser Ala Thr Ala Arg Pro Ala Pro Met Val Phe Trp Lys Val Pro Arg 165 170 175 Ser Gly Ile Glu Asn Ser Thr Val Thr Leu Ser His Pro Asn Gly Thr 180 185 190 Thr Ser Val Thr Ser Ile Leu His Ile Lys Asp Pro Lys Asn Gln Val 195 200 205 Gly Lys Glu Val Ile Cys Gln Val Leu His Leu Gly Thr Val Thr Asp 210 215 220 Phe Lys Gln Thr Val Asn Lys Gly Tyr Trp Phe Ser Val Pro Leu Leu 225 230 235 240 Leu Ser Ile Val Ser Leu Val Ile Leu Leu Val Leu Ile Ser Ile Leu 245 250 255 Leu Tyr Trp Lys Arg His Arg Asn Gln Asp Arg Glu Pro 260 265

Claims (11)

  1. 표면활성제 단백질 A (SPA) 또는 CD200, 및 엑소좀성 똔는 리소좀성 막통과 단백질을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제 1항의 융합 단백질을 포함하는 세포외 소포 (vesicle).
  3. 제 2항에 있어서,
    치료제 적하물을 추가로 포함하는, 세포외 소포.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 치료제 적하물은 miR146a를 포함하는, 세포외 소포.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
    상기 치료제 적하물은 Y-27632를 포함하는, 세포외 소포.
  6. 제 1항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포.
  7. 제 6항에 있어서,
    치료제 RNA를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 세포.
  8. 세포외 소포를 제조하는 방법으로서, 제 6항 또는 제 7항의 세포를 소포 분비에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 및 상기 세포에 의해 분비된 세포외 소포를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 세포외 소포에 치료제 약물을 로딩하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 폐 장애를 대상체에서 치료하는 방법으로서, 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 세포외 소포의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 폐 장애는 급성 호흡기 곤란 증후군 (ARDS)을 포함하는, 방법.
KR1020217014376A 2018-10-19 2019-10-18 폐 염증 요법을 위한 나노담체 KR20210082186A (ko)

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