ES2909752T3 - MSC en el tratamiento de enfermedades pulmonares inflamatorias - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende una población de MSC inmunomoduladoras que tienen el siguiente perfil antigénico: CD73+, CD90+, CD105+, CD34-, CD45-, CD14- y CD3-, y una población de vesículas que comprende vesículas extracelulares de dicha población de MSC, en la que las vesículas extracelulares son exosomas y en la que la población de vesículas muestra el siguiente orden de abundancia polipeptídica: serotransferrina < anexina A2, para uso en el tratamiento del síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), en el que el paciente que sufre de ARDS es elegible para y/o se está sometiendo a tratamiento de oxigenación membranosa extracorpórea (ECMO), y en el que la composición se administra mediante inyección intravenosa periférica, inyección venosa central en la aurícula derecha, inyección en el ventrículo derecho del corazón y/o inyección en el tronco/arteria pulmonar.

Description

DESCRIPCIÓN

MSC en el tratamiento de enfermedades pulmonares inflamatorias

Campo técnico

La presente invención se refiere, entre otras cosas, a métodos para cultivar células madre mesenquimales (MSC) (sin el uso de componentes séricos no humanos), MSC obtenidas a partir de tales métodos de cultivo, MSC y/o vesículas extracelulares derivadas de dichas MSC que tienen perfiles proteómicos que aseguran la capacidad inmunomoduladora, composiciones farmacéuticas que comprenden tales MSC, y tratamiento médico y métodos profilácticos y usos médicos de MSC y/o vesículas extracelulares en una variedad de enfermedades.

Antecedentes en el estado de la técnica

Las células madre mesenquimales (MSC) se pueden encontrar, entre otros, en la médula ósea, la sangre, la dermis, el periostio y varios otros tejidos y las MSC se pueden diferenciar en una variedad de tipos de células, que incluyen adiposas, areolares, óseas, cartilaginosas, elásticas, del estroma de la médula, músculo, tejido conectivo fibroso y tejido cardíaco, dependiendo del medio externo y los estimulantes. Debido a su origen celular y su fenotipo, las MSC normalmente no estimulan respuestas inmunitarias adversas, lo que permite utilizar donantes humanos no emparentados en entornos clínicos.

Las MSC normalmente se aíslan del tejido, se purifican y luego se expanden en un medio de cultivo apropiado. El medio de cultivo adecuado para las MSC puede comprender varios componentes para promover la expansión de las MSC, por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas y suero. Después de las etapas de aislamiento, purificación y expansión del cultivo, las MSC se lavan y centrifugan, y luego se congelan en un medio de crioconservación adecuado. En el momento del tratamiento, las MSC se descongelan justo antes de la administración a un paciente. La técnica anterior normalmente describe procesos de expansión que involucran el cultivo de células en presencia de componentes no humanos (comúnmente suero fetal bovino (FBS)).

Las proteínas xenogénicas derivadas del suero no humano pueden provocar respuestas inmunitarias mediadas por células o humorales (por ejemplo, la generación de anticuerpos anti-proteína sérica bovina), lo que puede resultar en un injerto menos eficiente de las MSC, particularmente si tales proteínas xenogénicas se asocian con las membranas de la superficie celular de las MSC. Se han sugerido medios que comprenden suero humano autólogo, pero este enfoque se ha considerado inviable cuando las cantidades de células requeridas en el producto final de MSC superan las que se pueden cultivar en una cantidad fija de suero autólogo. Además, el uso de suero humano autólogo presupone que el paciente tendrá suficiente tiempo y será suficientemente saludable para donar suero antes del inicio de la terapia de MSC. El actual proceso de cultivo convencional de MSC típicamente requiere de 2 a 10 semanas para aislar, expandir, recolectar y purificar una cantidad adecuada de células para constituir un tratamiento farmacéutico. En algunos casos un tratamiento farmacéutico consta de 1 dosis. En otros casos un tratamiento farmacéutico consta de 2 o más dosis. Desafortunadamente, en algunos casos, la terapia de MSC se necesita en menos de 2 semanas desde el diagnóstico o la presentación de los síntomas clínicos, o en menos de 1 semana desde el diagnóstico o la presentación de los síntomas clínicos, o en menos de 48 horas desde el diagnóstico o la presentación de los síntomas clínicos. Cuando se necesita terapia de MSC dentro de un período de tiempo corto desde el diagnóstico o la presentación de síntomas clínicos, las MSC que ya han sido fabricadas, purificadas y crioconservadas exhiben el beneficio significativo de estar disponibles en el momento del diagnóstico o la presentación de una enfermedad aguda. Sin embargo, determinar la potencia terapéutica clínica de las MSC sigue siendo un desafío.

Los hallazgos in vitro indican que las MSC son inmunosupresoras, y las MSC de roedores, babuinos o humanos suprimen la proliferación de linfocitos en cultivos mixtos de linfocitos, así como la inhibición de la formación de células T citotóxicas y células NK. Las propiedades inmunorreguladoras y regenerativas únicas de las MSC las convierten en una herramienta atractiva para el tratamiento celular de la autoinmunidad y la inflamación, y las MSC se han aplicado en una variedad de contextos clínicos, por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad grave de injerto contra huésped (Le Blanc, 2004, Lancet), sino también para el tratamiento de la esclerosis múltiple y la enfermedad de Crohn. Sin embargo, existen muchas otras indicaciones graves para las que actualmente existe una falta de tratamientos médicos eficaces y, por lo tanto, la presente invención tiene como objetivo expandir el uso de MSC, obtenidas de cultivos celulares desprovistos de productos animales no humanos, para indicaciones adicionales en las que existe una necesidad médica insatisfecha. Es más, aunque las MSC se están investigando en varios ensayos clínicos en curso, se sabe muy poco sobre qué hace que las MSC sean clínicamente eficaces, es decir, qué características son necesarias para que las MSC sean capaces de ejercer los efectos terapéuticos deseados en una enfermedad determinada.

Gotts et al. (2011, Critical Care Clinics, W.B. Saunders, EE. UU.; Volumen 27, páginas 719-733) es un artículo de revisión que describe el efecto terapéutico de las MSC en el tratamiento de enfermedades pulmonares agudas.

El documento WO 2012/125471 se refiere a composiciones que comprenden exosomas derivados de MSC y su uso para el tratamiento de enfermedades pulmonares inflamatorias.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se divulgan métodos para cultivar células madre mesenquimales (MSC) (sin el uso de componentes de suero no humano), métodos para seleccionar MSC clínicamente potentes y/o componentes extracelulares (principalmente vesículas extracelulares tales como exosomas) para el tratamiento de la inflamación respiratoria y condiciones asociadas, y las MSC y/o vesículas extracelulares con perfiles proteómicos clínicamente eficaces y capacidad inmunomoduladora obtenidas a partir de dichos métodos de cultivo y/o selección. La invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas MSC y/o vesículas, y tratamiento médico y métodos profilácticos y usos médicos de ^m S^c en una variedad de enfermedades, en particular, el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) y afecciones asociadas, como se define en las reivindicaciones.

En el presente documento se divulga un método para cultivar células madre mesenquimales (MSC), que comprende cultivar MSC (de un origen adecuado) en un medio de cultivo que comprenda trombocitos humanos lisados, así como, en aspectos adicionales, métodos de selección y criterios de inmunomodulación, y composiciones de cultivo celular para cultivar MSC y MSC obtenibles por los métodos. Además, en otros aspectos más, la presente invención se refiere a MSC y vesículas extracelulares de las mismas como tales, composiciones farmacéuticas, métodos para preparar dichas composiciones farmacéuticas y usos médicos que involucran MSC y vesículas extracelulares, así como métodos de tratamiento que involucran MSC. En este documento se divulgan métodos para seleccionar MSC inmunomoduladoras clínicamente efectivas y factores paracrinos relacionados (por ejemplo, vesículas extracelulares tales como exosomas), utilizando perfiles proteómicos y evaluando las características funcionales de las MSC. Más específicamente, las MSC muestran ciertas características en términos de expresión de polipéptidos, así como en términos de expresión de polipéptidos en fracciones extracelulares (que pueden comprender vesículas extracelulares tales como exosomas y, además, polipéptidos extracelulares).

También se divulgan en el presente documento MSC y/o vesículas extracelulares que se pueden obtener mediante los métodos divulgaos en el presente documento.

También se divulga en el presente documento una composición de cultivo celular para cultivar MSC, en la que la composición comprende un medio de cultivo celular (por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)) y trombocitos humanos lisados.

También se divulga en el presente documento un método para preparar una composición farmacéutica que comprende MSC, que comprende las etapas de cultivo de MSC (preferiblemente originadas en la cresta iliaca y/o originadas en el esternón) en una composición de cultivo celular que comprende trombocitos humanos lisados, pasando las MSC en el cultivo no más de 5 veces, y, resuspendiendo las MSC en solución salina hasta una concentración final de entre aproximadamente 5x105 y 4x106 MSC por ml.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención para uso en medicina, específicamente, en un séptimo aspecto, para uso en el tratamiento y/o profilaxis del síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), síndrome de dificultad respiratoria infantil (IRDS), hipertensión pulmonar (PH) y/o insuficiencia orgánica aguda (por ejemplo, insuficiencia renal, hepática y/o cardíaca) en relación con ARDS o IRDS.

También se divulga en el presente documento una célula madre mesenquimatosa (MSC), en la que las MSC muestran una morfología en forma de huso y expresan CD73, CD90 y CD105, y en la que las MSC carecen de CD34, CD45, CD14 y CD3. Las MSC pueden ser positivas o negativas para HLA-ABC (MHC clase I) y/o HLA-DR (MHC clase II), por ejemplo, dependiendo del grado de cebado/activación de las MSC. Además, las MSC pueden ser negativas para CD11b, CD19 y/o CD31.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para tratar y/o prevenir enfermedades y/o trastornos seleccionados del grupo que comprende el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), síndrome de dificultad respiratoria infantil (IRDS), hipertensión pulmonar (PH) e insuficiencia orgánica aguda (por ejemplo, riñón, hígado y/o corazón) (opcionalmente en relación con ARDS o IRDS), que comprende las etapas de proporcionar una dosis terapéutica de MSC y administrar la dosis terapéutica a un paciente que sufre de cualquiera de las enfermedades antes mencionadas.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una modalidad terapéutica novedosa, basada en MSC que muestra un perfil proteómico específico, potencia en ensayos inmunomoduladores in vitro, cultivadas a través de métodos sorprendentemente ventajosos, para el tratamiento de diversas enfermedades en las que actualmente existe una significativa necesidad médica insatisfecha, en particular ARDS, IRDS, PH y trastornos y enfermedades relacionados. El perfil de polipéptidos y la actividad inmunomoduladora comprobada dan como resultado MSC que son clínicamente eficaces, en marcado contraste con muchas preparaciones de MSC descritas en la técnica. Además, la ausencia de componentes no humanos durante los procesos de cultivo y los componentes ventajosos comprendidos en las composiciones de cultivo celular y en las composiciones farmacéuticas permiten un tratamiento clínico muy eficaz de estas enfermedades graves.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La CRP disminuyó fuertemente después de la administración de las MSC.

Figura 2. En el lavado broncoalveolar (BAL) disminuyó la interleucina 6 (IL-6) postratamiento, evidenciando disminución de la inflamación pulmonar.

Figura 3. La presión de oxígeno parcial (pO2) aumentó significativamente desde antes de la inyección hasta el día 3 después de la inyección y la presión de dióxido de carbono parcial (pCO2) mostró una disminución concomitante. Figura 4. El volumen corriente de expiración aumentó en respuesta a la administración de MSC.

Figura 5. La distensibilidad pulmonar aumentó significativamente después del tratamiento con MSC.

Figura 6. Los niveles séricos de RANTES se elevaron claramente aproximadamente cuatro semanas después del tratamiento, lo que indica la movilización de células madre en respuesta a la inyección de MSC.

Figura 7. Los niveles de creatinina sérica disminuyeron considerablemente tras la inyección de MSC en un paciente con insuficiencia renal aguda inducida por ARDS

Figuras 8 y 9. Radiografías de pulmón que evidencian recuperación pulmonar significativa.

Figura 10. Los niveles de surfactante B en plasma aumentaron sustancialmente después del tratamiento, mostrando recuperación de neumocitos tipo 2.

Figura 11. (A) De acuerdo con la declaración de consenso de la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT), las MSC derivadas de médula ósea infundidas expresaron CD73, CD90 y CD105 y carecieron de expresión de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR de acuerdo con lo evaluado por citometría de flujo (FACS) y se muestran como histogramas. Además, las MSC fueron negativas para el marcador endotelial CD31.

Figura 12. Las citoquinas inflamatorias pueden activar ("cebar") las MSC, lo que se considera una etapa clave (también conocida como "licencia") para que las MSC controlen la inflamación de manera eficiente. El aumento característico de ICAM-1 (CD54), VCAM-1 (CD106), HLA-ABC y HLA-DR tras 48 horas de exposición celular a IFN-^y y TNF-a proinflamatorios fue confirmada por FACS en las MSC.

Figura 13. Las MSC promueven la generación in vitro de células T reguladoras. Las MSC son capaces de promover la inducción y expansión de células T reguladoras inmunosupresoras (TReg). El cultivo conjunto de MSC en diferentes proporciones con células T de control sanas purificadas condujo a un aumento de la fracción de TReg CD25+CD127dim entre las células T CD4+. Las células T de control se estimularon utilizando microesferas activadoras anti-CD3 y anti-CD28. El panel izquierdo muestra un análisis de diagrama de puntos representativo de citometría de flujo (FACS) y el panel derecho los valores medios (columnas) de dos experimentos independientes realizados por duplicado.

Figura 14. En experimentos seleccionados, las MSC se expusieron a IFN-^y y TNF-a durante 48 horas (MSC cebadas, pMSC). Después del cebado, la expresión de IDO aumentó según lo evaluado por PCR cuantitativa (A). MSC y pMSC no estimuladas afectaron la viabilidad del control o PMN estimulados con LPS, como se demuestra en el panel B. (C) Se demostró que la expresión de CD16 (F^cyR-III) se usó como marcador de viabilidad de PMN y se comparó con el porcentaje de PMN viables en todas las condiciones de cultivo. De manera similar, las expresiones de CD11b y CD54 se asociaron con el estado de activación de PMN. El porcentaje de PMN positivos para CD11b fue mayor en presencia de MSC y mejoró aún más con el tratamiento con LPS (D), mientras que la intensidad de fluorescencia media relativa (rMFI) de CD54 aumentó con el tratamiento con LPS y este efecto se mejoró con el cocultivo con MSC (E). A continuación, se probó la capacidad de MSC para promover la generación de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) dentro de nuestro modelo de cocultivo con PMN. El cocultivo con MSC condujo a un marcado aumento de PMN maduros CD11brillante/CD16brillante/CD62Ldim (tipo N2) que se asemejan a MDSC granulocíticas (F). (G) Los cocultivos de MSC y PMN se tiñeron con colorante May Grunwald-Giemsa para observar la morfología celular después de la interacción recíproca durante 24 horas. De acuerdo con el marcado aumento de PMN maduros CD11brillante/CD16brillante/CD62Ldim (tipo N2) que se muestra en este momento mediante citometría de flujo, los PMN mostraron una morfología nuclear hipersegmentada después del cocultivo con ambos en reposo (MSC PMN 24 h) y MSC cebadas (pMSC PMN 24 h). De manera similar, el cocultivo de MSC con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de control saludable en diferentes proporciones promovió los monocitos CD14+HLA-DRbajo que se asemejan a las MDSC monocíticas (H). Las MSC también fueron capaces de promover la inducción y expansión de células T reguladoras (TReg) CD4+CD25alt°CD127baj° inmunosupresoras, cuando se cultivaron conjuntamente en diferentes proporciones con células T de control sanas purificadas (I). (J) También se observaron niveles aumentados de TReg CD4+CD25altoCD127bajo circulantes hasta 20 días después de la administración de MSC. (K) Esto podría deberse en parte al aumento de la producción tímica, como lo indica el aumento de la proporción de emigrantes tímicos recientes (RTE) CD31+ entre las TReg CD45RA+ no modificadas en pacientes. Las barras indican la media del error estándar. Abreviaturas: *valor-p < 0,05, **valor-p < 0,01, ***valorp<0,01.

Figura 15. El panel A demuestra la progresión de la enfermedad y las radiografías de tórax (CXR) concomitantes desde el inicio de la influenza A H1N1 hasta el alta hospitalaria. Como se demostró, hubo una progresión de las opacificaciones bilaterales de los pulmones después del inicio de la infección por influenza, y el paciente requirió ventilación mecánica y soporte ECMO. A las 24 horas de la infusión de MSC, hubo una disminución de los infiltrados pulmonares en la CXR, seguida de una mejoría progresiva hasta el momento de la desconexión de ECMO y la extubación 4 semanas después de la administración de MSC. Paralelamente a la mejora en las radiografías de tórax, tanto la distensibilidad pulmonar (B) como los volúmenes corrientes (C) mejoraron de nuevo a niveles normales en los primeros 2 días. Sin embargo, 5 días después de la administración de MSC, el paciente desarrolló una neumonía nosocomial con aumento del recuento de glóbulos blancos (WBC) (D) y nuevos infiltrados en la CXR (A), que se resolvieron en 3 días. La función hepática también mejoró durante la primera semana con la normalización de los niveles séricos de ALT, AST y bilirrubina (E).

Figura 16. El panel A demuestra la progresión del ARDS tanto en las CXR como en tomografía computarizada en serie. Como se demostró, hubo una disminución progresiva de los infiltrados pulmonares a partir del primer día después de la infusión de MSC. Para el día 7, la CXR volvió a la normalidad y el paciente fue desconectado de la ECMO al día siguiente y extubado el día 12. (B) La distensibilidad pulmonar y (C) los volúmenes corrientes volvieron a los niveles normales durante la primera semana. Después de la infusión de MSC, la función de la médula ósea continuó reconstituyéndose con resolución de (D) leucopenia y (E) trombocitopenia.

Figura 17. La respuesta de citocinas en el BAL (A) Los niveles de citoqueratina (ccK)-18 escindida por caspasa, indicativa de apoptosis epitelial, y de citoqueratina (K)-18 no escindida, indicativa de muerte epitelial total en el líquido de BAL, disminuyeron en ambos pacientes en unas pocas horas después de la administración de MSC. (B) Paralelamente, la proteína B del surfactante (SP-B) aumentó durante los primeros 3 días después de la infusión de MSC, lo que sugiere una recuperación de la función epitelial alveolar (C). Varios miARN relacionados con la inflamación demostraron una disminución significativa dentro de las primeras 24 horas después de la administración de MSC. Se observó un aumento transitorio en estos niveles de miARN el día 7 en el paciente uno debido a neumonía y volvió a la normalidad el día 28. En comparación con los donantes sanos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se divulga en las reivindicaciones adjuntas. También se divulgan métodos para cultivar células madre mesenquimales (MSC) (sin el uso de componentes de suero no humanos), métodos para seleccionar MSC inmunomoduladoras clínicamente potentes y/o componentes extracelulares (principalmente vesículas extracelulares tales como exosomas) para el tratamiento de inflamación respiratoria y afecciones asociadas, MSC y/o vesículas extracelulares que tienen perfiles proteómicos clínicamente eficaces obtenidos a partir de dichos métodos de cultivo y/o selección. La invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas MSC y/o vesículas, y tratamientos médicos y métodos profilácticos y usos médicos de las MSC en una variedad de enfermedades, en particular el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) y afecciones asociadas.

Cuando las características, realizaciones o aspectos de la presente invención se describen en términos de grupos Markush, un experto en la materia reconocerá que la invención también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush. El experto en la materia reconocerá además que la invención también se describe en términos de cualquier combinación de miembros individuales o subgrupos de miembros de grupos Markush. Además, cabe señalar que las realizaciones y características descritas en relación con uno de los aspectos y/o realizaciones de la presente invención también se aplican haciendo los cambios necesarios a todos los demás aspectos, alternativas y/o realizaciones de la invención. Por ejemplo, los aspectos, alternativas y/o realizaciones descritas en relación con los métodos para obtener MSC inmunomoduladoras clínicamente efectivas (por ejemplo, los criterios de inmunomodulación) también pueden ser aplicables, relevantes y/o combinarse con enseñanzas relacionadas con, por ejemplo, realizaciones relacionadas con las MSC y/o vesículas extracelulares que se pueden obtener mediante dichos métodos. A modo de otro ejemplo no limitativo, los aspectos, alternativas y/o realizaciones descritas en relación con el método para cultivar m Sc en ausencia de componentes de suero no humano también pueden ser aplicables a otros aspectos y/o realizaciones de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, los criterios de selección de inmunomodulación, lo que significa que la presente invención, aunque no se menciona explícitamente en este documento, también abarca combinar las enseñanzas relacionadas, por ejemplo, con los métodos de cultivo con las enseñanzas de los métodos de selección de inmunomodulación. De manera similar, los aspectos, alternativas y/o realizaciones descritas en relación con las MSC y/o las vesículas extracelulares también pueden ser naturalmente aplicables, relevantes y/o combinarse con enseñanzas relacionadas con las composiciones farmacéuticas en sí mismas, que comprenden dichas MSC y/o vesículas extracelulares.

Generalmente, todos los polipéptidos y/o nucleótidos divulgados en la presente solicitud abarcan naturalmente secuencias de polipéptidos y/o nucleótidos que tienen al menos un 50% de identidad de secuencia con el polipéptido y/o nucleótido en cuestión, preferiblemente un 70% de identidad de secuencia con el polipéptido y/o nucleótido en cuestión, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 80%, e incluso más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 90% con el polipéptido y/o nucleótido en cuestión.

Por conveniencia y claridad, ciertos términos empleados en este documento se recopilan a continuación. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Los términos "positivo para" y "negativo para" en el contexto de la presente invención (por ejemplo, una MSC que es "positiva para" un polipéptido y/o polinucleótido en cuestión) se entenderán de acuerdo con el significado que normalmente se le da al término dentro de las ciencias biológicas y médicas, en esencia una célula que es positiva para un determinado polipéptido y/o polinucleótido expresa dicho polipéptido y/o polinucleótido. El polipéptido y/o polinucleótido en cuestión puede identificarse a través de diversos medios, por ejemplo, usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y/o técnicas inmunohistoquímicas y/o técnicas proteómicas tales como LC-MS y/o 2D-PAGE. En ciertos casos, puede entenderse que el término "positivo para" comprende poblaciones de células en las que al menos el 50% de las células expresan el polipéptido (o polinucleótido o cualquier otro marcador) en cuestión, pero preferiblemente al menos el 70% o incluso más preferiblemente al menos el 90% de la población expresa el polipéptido en cuestión. El término "negativo para" puede entenderse naturalmente, en el mismo sentido, como lo contrario del término "positivo para", es decir, al menos el 50% pero preferiblemente al menos el 70% o aún más preferiblemente al menos el 90% de las células de la población no expresarán el polipéptido (u otro marcador adecuado) en cuestión.

El término "población", que puede estar relacionado con las MSC o con vesículas extracelulares como los exosomas, debe entenderse que abarca una pluralidad de entidades que constituyen una población determinada, por ejemplo, las MSC individuales que, cuando están presentes en una pluralidad, constituyen una población de MSC. Por lo tanto, naturalmente, la presente invención se refiere también a las células y vesículas individuales de, por ejemplo, una población de MSC o una población de vesículas extracelulares, respectivamente.

Los términos "sujeto" y/o "individuo" y/o "paciente" pueden usarse indistintamente en este documento y debe entenderse que se refieren ampliamente a un animal, por ejemplo un ser humano, del cual se pueden obtener células y/o a quien se proporciona tratamiento, incluida la profilaxis o el tratamiento preventivo (por ejemplo, utilizando las células de acuerdo con la presente invención). Ventajosamente, el sujeto de los tratamientos como se describe en el contexto de la presente invención es un mamífero, preferiblemente un humano, u otros mamíferos, preferiblemente mamíferos domésticos o de producción.

Se debe entender que el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que da como resultado una mejora, alivio o remedio de la enfermedad, trastorno o síntomas de la enfermedad o afección.

Los términos "administrar", "introducir" y "trasplantar" se usan indistintamente para los fines de la presente invención, por ejemplo, en el contexto de la administración de las MSC a un paciente que padece cualquiera de las enfermedades y/o trastornos mencionados en el contexto de la presente invención. Un método o ruta adecuada es aquella que conduce a la localización al menos parcial de las MSC en un sitio deseado. Las células pueden administrarse (suministrarse) por cualquier ruta apropiada que dé como resultado el suministro de las células y/o factores paracrinos excretados de las células a una ubicación/tejido/sitio deseado en el sujeto. Los modos de administración adecuados para los fines de la presente invención comprenden, por ejemplo (sin limitación), inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbitaria, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e intraesternal.

La frase "excipiente farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, debe entenderse que se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un relleno sólido o líquido, un diluyente, un excipiente, un vehículo, un solvente o un material de encapsulación, implicado en la suspensión, el mantenimiento de la actividad o el porte o el transporte de los agentes en cuestión desde un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo.

En el presente documento se divulgan métodos para obtener MSC inmunomoduladoras. Garantizar que las MSC tengan una capacidad inmunomoduladora clínicamente eficaz es un aspecto crucial pero que en el estado de la técnica se pasa por alto con frecuencia. Se divulgan métodos para validar las propiedades inmunomoduladoras de las MSC mediante métodos que comprenden las etapas de (i) cultivo de Ms C (ii) establecimiento de que la población de MSC cumple al menos uno de los siguientes criterios de inmunomodulación:

(a) la población de MSC es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: vimentina (SEQ ID No 1), caldesmon (SEQ ID No 2), anexina A1 (SEQ ID No 3), proteína 14-3-3 épsilon (S^eQ ID No 4), factor 1 de ribosilación de ADP (SEQ ID No 5), calnexina (SeQ ID No 6), factor 5 de ribosilación de ADP (SEQ ID No 7), proteína transformante RhoA (SeQ ID No 8), CD44 (SEQ ID No 9), proteína similar a la coactosina (SEQ ID No 10), proteína quinasa 3 activada por mitógeno (SEQ ID No 11), proteína de unión al factor 7 de crecimiento similar a la insulina (SEQ ID No 12), N-acetil-glucosamina-6-sulfatasa (SEQ ID No 13), proteína 2 de unión al ácido retinoico celular (SEQ ID No 14), polipéptido 1 del factor B de alargamiento de la transcripción (SEQ ID No 15), NEDD8 (SEQ ID No 16), proteína de unión a ácidos grasos, corazón (SEQ ID No 17);

(b) una población de vesículas extracelulares derivadas de la población de MSC es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: serotransferrina (SEQ ID No 18), proteína central de versicano (s Eq ID No 19), anexina A2 (SEQ ID No 20), serina proteasa HTRA1 (SEQ ID No 21), proteína 3 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (SEQ ID No 22), factor de crecimiento del tejido conectivo (SEQ ID No 23), vinculina (SEQ ID No 24), proteína asociada a la diferenciación de neuroblastos AHNAK (SEQ ID No 25), proteína 1B asociada a microtúbulos (SEQ ID No 26), ácido graso-sintasa (SEQ ID No 27), triosafosfato isomerasa (SEQ ID No 28), ATP-citrato sintasa (SEQ ID No 29), calreticulina (SEQ ID No 30), vigilina (SEQ ID No 31), subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN (SEQ ID No 32), inhibidor beta de la disociación Rab GDP (SEQ ID No 33), subunidad beta de ATP sintasa, mitocondrial ( SEQ ID No 34);

(c) la población de MSC en (a) muestra el siguiente orden de abundancia de polipéptidos: vimentina > anexina A1. Preferiblemente, la población de MSC presenta el siguiente orden de abundancia de polipéptidos: vimentina > anexina A1 > CD44 > proteína 7 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina > proteína 3 de unión a ácidos grasos;

(d) la población de vesículas extracelulares en (b) muestra el siguiente orden de abundancia de polipéptidos: serotransferrina > anexina A2. Preferiblemente, la población de vesículas extracelulares presenta la siguiente abundancia de polipéptidos: serotransferrina > anexina A2 > factor de crecimiento del tejido conectivo;

(e) el aumento de la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la población de MSC es <10 cuando las MSC se ceban con 15 ng/ml de TNF-alfa;

(f) el aumento de la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la población de MSC es >100 cuando las MSC se ceban con 10 ng/ml de IFN-gamma;

(g) la viabilidad de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) aumenta en al menos un 20% (preferiblemente al menos un 30% o incluso más preferiblemente al menos un 50%) cuando se cocultivan con MSC de la población de MSC cebadas con IFN-gamma o TNF -alfa de acuerdo con (e) o (f);

(h) el número de monocitos CD14+HLA-DRbajo aumenta al menos 1.5 veces (más preferiblemente al menos 2 veces, o incluso más preferiblemente al menos 3 veces) cuando las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de controles sanos se cocultivan con la población de MSC cebada con IFN-gamma o TNF-alfa de acuerdo con (e) o (f);

(i) el número de células T reguladoras (TReg) CD4+CD25alt°CD127baj° aumenta al menos 1.5 veces (más preferiblemente al menos 2 veces, o incluso más preferiblemente al menos 3 veces) cuando las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de controles sanos se cocultivan con la población de MSC cebadas con IFN-gamma o TNF-alfa de acuerdo con (e) o (f).

Además, la población de vesículas extracelulares que se puede obtener de la población de MSC puede ser preferiblemente negativa para (es decir, carecer de) al menos uno de los siguientes polipéptidos: proteína 7 del dominio LIM solamente (SEQ ID No 35), dominio LIM y proteína 1 de unión a actina (SEQ ID No 36), complejo proteico del coatómero, subunidad beta 2 (Beta prime), isoforma CRA_b (SEQ ID No 37), inhibidor de ribonucleasa (SEQ ID No 38), PDZ y proteína 5 del dominio LIM (s Eq ID No 39), reticulocalbina 1 (SEQ ID No 40), antígeno 1 de endosoma temprano (SEQ ID No 41), septina 2 (SEQ ID No 42), subunidad 2 del complejo de proteína 2/3 relacionada con actina (SEQ ID No 43), septina 11 (SEQ ID No 44).

Naturalmente, el cultivo de MSC (es decir, la población de MSC, la población de vesículas extracelulares derivadas de las MSC, y tanto la población de MSC como la población de vesículas extracelulares derivadas de las MSC) puede cumplir solo uno (1) de los criterios anteriores, pero preferiblemente se cumplen varios criterios. Por ejemplo, el cultivo puede cumplir los criterios (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c), (a) y (d), (a) y (e), (b) y (d), (a) y (e), (a), (b), y (c), (a), (b), y (d), (b), (c) y (d), (c), (d) y (e), (d) y (e), (a), (f) y (g), (e), (f) y (g), (a), (b) y (g), (a), (c) y (f), etc., etc. Por lo tanto, el cultivo de MSC puede cumplir con todas las combinaciones y permutaciones posibles de los criterios anteriores (a) -(i) sin apartarse del alcance de la presente invención.

En esencia, con base en el cribado de un gran número de cultivos de MSC, los inventores se han dado cuenta de que ciertos perfiles de polipéptidos tanto de células como de componentes extracelulares contribuyen fuertemente a la eficacia inmunomoduladora terapéutica. Algunas de las características clave de expresión de polipéptidos se resumen en las tablas a continuación, pero otros patrones de expresión de polipéptidos además de los mencionados explícitamente también se han relacionado con propiedades inmunomoduladoras.

Las fuentes de las MSC de acuerdo con la presente invención se pueden seleccionar del grupo que comprende médula ósea, sangre del cordón umbilical, tejido amniótico, gelatina de Wharton, brote dental, tejido adiposo, material embrionario o fetal, pero varias otras fuentes de MSC podrían también ser aplicables. Las MSC de origen en la médula ósea son normalmente de originan en la cresta ilíaca y/o en el esternón.

De manera importante, para retener el potencial inmunomodulador de las MSC (por ejemplo, el orden de abundancia entre vimentina y anexina A1, o cualquiera de los otros patrones de abundancia de las MSC y/o las vesículas extracelulares mencionadas anteriormente), las MSC preferiblemente no se pasarán más de 5 veces antes del uso clínico.

También se divulga en el presente documento una población de MSC inmunomoduladoras que se pueden obtener mediante los métodos de la presente invención.

También se divulga en el presente documento una población de MSC inmunomoduladoras que tienen el siguiente perfil antigénico: CD73+, CD90+, CD105+, CD34-, CD45-, CD14- y CD3-. En una realización adicional, la población de MSC puede ser positiva para vimentina y/o anexina A1, y además positiva para la proteína 7 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina y/o la proteína 3 de unión a ácidos grasos y/o la anexina A1.

Las MSC normalmente se definen como funcionales y biológicamente activas a través de una prueba de formación de unidades de colonias (CFU) y diferenciación en adipocitos (células grasas), osteoblastos (células óseas) y condrocitos (células cartilaginosas). Madeira y sus coautores (PLOS One, 2012) compararon MSC biológicamente activas e inactivas y descubrieron que en las células inactivas, la expresión de la anexina A1 aumentó 1,5 veces. La anexina A1 es una proteína conocida relacionada con la apoptosis, que afecta la inmunidad innata y adaptativa. Por el contrario, la expresión de vimentina, que es un componente del citoesqueleto celular, está subregulada 2,5 veces en las MSC biológicamente inactivas en comparación con las activas. Esto probablemente refleja una subregulación en la capacidad de proliferación de las MCS inactivas. Sin embargo, lo que inesperadamente han encontrado los inventores de la presente invención es que es claramente preferencial con una mayor abundancia de vimentina (y polipéptidos relacionados) que de anexina A1 (y polipéptidos relacionados). De manera similar, se ha demostrado que otros patrones de abundancia de acuerdo con la presente invención dan como resultado una potencia inmunomoduladora mejorada, por ejemplo, en el contexto de los lisados de células completas: vimentina < caldesmon, vimentina < CD44 y vimentina < anexina A1 < CD44. Y, en el contexto del lisado de la fracción que contiene vesículas extracelulares: serotransferrina < proteína central de Versicano, serotransferrina < anexina a 2 < factor de crecimiento del tejido conectivo, y serotransferrina < anexina A2 < vinculina. Es importante destacar que los diferentes perfiles polipeptídicos de las MSC y las vesículas extracelulares pueden coexistir, por ejemplo, en que el lisado celular completo (es decir, el patrón de polipéptidos de MSC) puede mostrar una mayor abundancia de vimentina que de anexina A1, mientras que la fracción de vesícula extracelular derivada de la población de MSC presenta una mayor abundancia de serotransferrina que de anexina A2.

Naturalmente, los perfiles antes mencionados pueden detectarse/evaluarse en el momento de obtener el material de un donante, en varios momentos durante la expansión/cultivo de las MSC antes de la aplicación clínica, en varios momentos después de que las células hayan sido cultivadas in vitro, y/o en el punto en que es el momento de administrar las MSC y/o vesículas extracelulares a un paciente a tratar.

En una realización adicional, la población de MSC puede ser positiva para el antígeno CD44, y CD44 puede estar presente ventajosamente en menor abundancia que la anexina A1.

Como se mencionó anteriormente, la población de MSC de acuerdo con la presente invención cumple al menos uno de los siguientes criterios de inmunomodulación:

a) la población de MSC es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: vimentina (SEQ ID No 1), caldesmon (SEQ ID No 2), anexina a 1 (SEQ ID No 3), proteína 14-3-3 épsilon (SeQ ID No 4), factor 1 de ribosilación de ADP (SEQ ID No 5), calnexina (S^eQ ID No 6), factor 5 de ribosilación de ADP (SEQ ID No 7), proteína transformante RhoA (SeQ ID No 8), CD44 (SEQ ID No 9), proteína similar a la coactosina (SEQ ID No 10), proteína quinasa 3 activada por mitógeno (SEQ ID No 11), proteína de unión al factor 7 de crecimiento similar a la insulina (SEQ ID No 12), N-acetil-glucosamina-6-sulfatasa (SEQ ID No 13), proteína 2 de unión al ácido retinoico celular (SEQ ID No 14), polipéptido 1 del factor B de alargamiento de la transcripción (SEQ ID No 15), NEDD8 (SEQ ID No 16), proteína de unión a ácidos grasos, corazón (SEQ ID No 17);

(b) una población de vesículas extracelulares derivadas de la población de MSC es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: serotransferrina (SEQ ID No 18), proteína central de versicano (s Eq ID No 19), anexina A2 (SEQ ID No 20), serina proteasa HTRA1 (SEQ ID No 21), proteína 3 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (SEQ ID No 22), factor de crecimiento del tejido conectivo (SEQ ID No 23), vinculina (SEQ ID No 24), proteína asociada a la diferenciación de neuroblastos AHNAK (SEQ ID No 25), proteína 1B asociada a microtúbulos (SEQ ID No 26), ácido graso-sintasa (SEQ ID No 27), triosafosfato isomerasa (SEQ ID No 28), ATP-citrato sintasa (SEQ ID No 29), calreticulina (SEQ ID No 30), vigilina (SEQ ID No 31), subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN (SEQ ID No 32), inhibidor beta de la disociación Rab GDP (SEQ ID No 33), subunidad beta de ATP sintasa, mitocondrial (SEQ ID No 34);

(c) la población de MSC en (a) muestra el siguiente orden de abundancia de polipéptidos: vimentina > anexina A1; (d) la población de vesículas extracelulares en (b) muestra el siguiente orden de abundancia de polipéptidos: serotransferrina > anexina A2;

(e) el aumento de la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la población de MSC es <10 cuando las MSC se ceban con 15 ng/ml de TNF-alfa;

(f) el aumento de la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la población de MSC es >100 cuando las MSC se ceban con 10 ng/ml de IFN-gamma;

(g) la viabilidad de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) aumenta en al menos un 20% (preferiblemente al menos un 30%) cuando se cocultivan con MSC de la población de MSC cebadas con IFN-gamma o TNF -alfa de acuerdo con (e) o (f);

(h) el número de monocitos CD14+HLA-DRbajo aumenta al menos 1,5 veces (más preferiblemente al menos 2 veces, o incluso más preferiblemente al menos 3 veces) cuando las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de controles sanos se cocultivan con la población de MSC cebada con IFN-gamma o TNF-alfa de acuerdo con (e) o (f);

(i) el número de células T reguladoras (TReg) CD4+CD25alt°CD127baj° aumenta al menos 1,5 veces (más preferiblemente al menos 2 veces, o incluso más preferiblemente al menos 3 veces) cuando las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de controles sanos se cocultivan con la población de MSC cebadas con IFN-gamma o TNF-alfa de acuerdo con (e) o (f).

De manera similar, como se menciona en relación con los criterios de inmunomodulación anteriores y también como se ejemplifica, por ejemplo mediante las tablas anteriores, la población de vesículas extracelulares que se pueden obtener de las MSC de acuerdo con la presente invención es preferiblemente negativa para (es decir, desprovista de) los siguientes polipéptidos: proteína7 del dominio LIM únicamente (SEQ ID No 35), dominio LIM y proteína 1 de unión a actina (SEQ ID No 36), complejo proteico del coatómero, subunidad beta 2 (Beta prime), isoforma CRA_b (SEQ ID No 37), inhibidor de ribonucleasa (SEQ ID No 38), PDZ y proteína 5 del dominio LIM (SEQ ID No 39), reticulocalbina 1 (SEQ ID No 40), antígeno 1 de endosoma temprano (SEQ ID No 41), septina 2 (SEQ ID No 42), subunidad 2 del complejo de proteína 2/3 relacionada con actina (SEQ ID No 43), septina 11 (SEQ ID No 44).

También se divulga una población de vesículas de vesículas extracelulares derivadas de la población de MSC de acuerdo con la presente invención. La población de vesículas comprende preferiblemente vesículas extracelulares en forma de exosomas.

Como se mencionó anteriormente, las MSC de acuerdo con la presente invención (es decir, la población de MSC, la población de vesículas extracelulares derivadas de las MSC, y tanto la población de MSC como la población de vesículas extracelulares derivadas de las MSC) pueden cumplir solo uno (1) de los criterios anteriores, pero preferiblemente se cumplen varios criterios. Por ejemplo, el cultivo puede cumplir los criterios (a) y (b), (a) y (c), (b) y (c), (a) y (d), (a) y (e), (b) y (d), (a) y (e), (a), (b), y (c), (a), (b), y (d), (b), (c) y (d), (c), (d) y (e), (d) y (e), (a), (f) y (g), (e), (f) y (g), (a), (b) y (g), (a), (c) y (f), etc., etc. Por lo tanto, el cultivo de MSC puede cumplir con todas las combinaciones y permutaciones posibles de los criterios anteriores (a) -(i) sin apartarse del alcance de la presente invención.

Naturalmente, todas las características y patrones de expresión mencionados en relación con los criterios de inmunomodulación anteriores también se aplican a las MSC y/o a las vesículas extracelulares como tales.

Las vesículas extracelulares y otros factores paracrinos son de gran importancia para la eficacia terapéutica de las MSC y, por lo tanto, la población de vesículas cumple los criterios de inmunomodulación mencionados anteriormente, a saber, que la población de vesículas puede ser positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos: serotransferrina (^s E^q ID No 18), proteína central de versicano (SEQ ID No 19), anexina A2 (SEQ ID No 20), serina proteasa HTRA1 (SEQ ID No 21), proteína 3 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (SEQ ID No 22), factor de crecimiento de tejido conectivo (SEQ ID No 23), vinculina (SEQ ID No 24), proteína asociada a la diferenciación de neuroblastos AHNAK (SEQ ID No 25), proteína 1B asociada a microtúbulos (SEQ ID No 26), ácido graso sintasa (SEQ ID No 27), triosafosfato isomerasa (SEQ ID No 28), ATP citrato sintasa (SEQ ID No 29), calreticulina (SEQ ID No 30), vigilina (SEQ ID No 31), subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN (SEQ ID No 32), inhibidor beta de la disociación Rab GDP (SEQ ID No 33), subunidad beta de ATP sintasa, mitocondrial (SEQ ID No 34). Y, como se mencionó anteriormente, la población de vesículas extracelulares es preferiblemente negativa para (es decir, desprovista de) los siguientes polipéptidos: proteína 7 de dominio LIM únicamente (SEQ ID No 35), dominio LIM y proteína 1 de unión a actina (SEQ ID No 36), complejo proteico de coatómero, subunidad beta 2 (Beta prime), isoforma CRA_b (SEQ ID No 37), inhibidor de ribonucleasa (SEQ ID No 38), PDZ y proteína 5 del dominio LⁱM (SEQ ID No 39), reticulocalbina-1 (SEQ ID No 40), antígeno 1 endosómico temprano (SEQ ID No 41), septina-2 (SEQ ID No 42), subunidad 2 del complejo de proteína 2/3 relacionado con actina (SEQ ID No 43), septina 11 (SEQ ID No 44).

Los inventores se han dado cuenta inesperadamente de que para optimizar la capacidad inmunomoduladora, la población de vesículas puede tener preferiblemente una mayor abundancia de anexina A2 que de serotransferrina, y preferiblemente una mayor abundancia de anexina A2 que de factor de crecimiento de tejido conectivo. Los patrones de abundancia adicionales que son importantes para las MSC y la capacidad inmunomoduladora de las vesículas extracelulares también se mencionaron anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la población de MSC y/o la población de vesículas extracelulares como se define en las reivindicaciones. En una realización adicional, la composición farmacéutica puede comprender además plasma de tipo sanguíneo AB, preferiblemente a una concentración de al menos alrededor del 1%, preferiblemente alrededor del 10%. Además, las MSC están presentes preferiblemente a una concentración final de entre aproximadamente 5x105 y 4x106 MSC por ml de la composición farmacéutica.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a la población de MSC y/o la población de vesículas y/o la composición farmacéutica para uso en medicina.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a la población de MSC y/o la población de vesículas y/o la composición farmacéutica para uso en el tratamiento del síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), síndrome de dificultad respiratoria infantil (IRDS), hipertensión pulmonar (PH) o insuficiencia orgánica aguda (por ejemplo insuficiencia renal, hepática y/o cardíaca) en relación con ARDS o IRDS.

En una realización, la población de MSC y/o la población de vesículas y/o la composición farmacéutica se pueden usar en el tratamiento del ARDS y/o insuficiencia orgánica aguda en relación con el ARDS mediante la administración a través de una inyección intravenosa periférica, inyección venosa central en la aurícula derecha, inyección en el ventrículo derecho del corazón y/o inyección en el tronco/arteria pulmonar.

Los pacientes que padecen las enfermedades/trastornos anteriores y que son elegibles para y/o se están sometiendo a un tratamiento de oxigenación membranosa extracorporal (ECMO) son particularmente adecuados para el tratamiento usando las MSC y/o las vesículas extracelulares y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Además, un subgrupo de pacientes en los que la eficacia terapéutica es óptima es el grupo de pacientes que tienen niveles elevados de citoqueratina 18 escindida con caspasa (ccK18), como indicador de apoptosis epitelial. Además, otra subpoblación de pacientes es el grupo de pacientes que tiene niveles elevados de al menos uno de los siguientes microARN (miR): miR-409-3P, miR-886-5P, miR-324-3P, miR-222, miR-125A-5P, miR-339-3P y/o miR-155 (Figura 17). En estos pacientes el tratamiento ha demostrado ser especialmente eficaz y los resultados clínicos han sido excelentes.

También se divulga un método para cultivar células madre mesenquimales (MSC). El método de cultivo no utiliza ningún componente no humano y, por lo tanto, reduce en gran medida el riesgo de provocar respuestas inmunitarias, lo que posiblemente mejore el injerto y los resultados terapéuticos. En una primera etapa, las células madre mesenquimales se obtienen de una fuente adecuada, seguida por el cultivo de las células en un medio de cultivo que comprende trombocitos humanos lisados (plaquetas), preferiblemente al menos 107 (o incluso números más altos, tales como 108 o 109) trombocitos humanos lisados por ml de medio de cultivo.

Las MSC se pueden obtener de diversos tejidos, por ejemplo, médula ósea, sangre, dermis y/o periostio, utilizando fuentes alogénicas o autólogas. Cuando se utiliza una fuente alogénica de MSC, es de suma importancia obtener células de un donante joven y saludable, que tenga preferiblemente 35 años de edad, preferiblemente menos de 30 años, aún más preferiblemente menos de 25 años, y lo más preferiblemente menor de 20 años de edad

En una realización adicional, cuando las MSC se van a utilizar para el tratamiento médico de un paciente que padece cualquiera de las enfermedades y trastornos que pueden prevenirse, tratarse, curarse o aliviarse con las MSC, las células y/o las vesículas extracelulares se pueden recolectar (y posteriormente utilizar para el tratamiento terapéutico) cuando la población de MSC haya alcanzado preferiblemente como máximo 750 x 106 células, preferiblemente como máximo 500 x 106 células, a partir de 60 ml como máximo (cm3) de aspirado de médula ósea. Por lo tanto, todo el procedimiento desde la obtención de las células hasta la preparación de una composición farmacéutica puede implicar aspirar no más de 60 ml (preferiblemente no más de 40 ml y aún más preferiblemente no más de 30 ml) de la médula ósea de un donante sano (preferiblemente de la cresta iliaca y/o esternón), expandir las MSC obtenidas del aspirado a preferiblemente no más de 750 x 106 células y, finalmente, recolectar las células para preparar una composición farmacéutica para administrar a un paciente. Las MSC y/o las vesículas extracelulares derivadas de las MSC obtenidas mediante los métodos divulgaos en el presente documento muestran un nivel muy sorprendente de potencia terapéutica y, por lo tanto, se puede administrar a un paciente un número significativamente menor de células sin reducir la eficacia terapéutica, lo que simplifica y acelera realizar todo el procedimiento. La clave detrás de la potencia terapéutica es el hecho de que las MSC y/o las vesículas extracelulares pueden seleccionarse con base en los criterios inmunomoduladores de la presente invención, lo que significa que las MSC y/o los componentes extracelulares tienen un perfil proteómico específico y ventajoso y capacidad inmunomoduladora. Otro aspecto clave detrás de la potencia terapéutica mejorada radica en el menor número de divisiones celulares que han sufrido las MSC de acuerdo con la presente invención, lo que significa que se conservan sus características inmunomoduladoras beneficiosas. Cuando las MSC se obtienen del donante, se pueden congelar de inmediato, seguido de descongelación e inicio del cultivo celular cuando sea necesaria una intervención terapéutica (alternativamente, las células se pueden obtener (y cultivar directamente) de un donante cuando surja una necesidad clínica de MSC). Sorprendentemente, es crucial no cultivar las MSC durante un período de tiempo más largo, preferiblemente menos de 5 pases (después de obtener las células del donante o después de descongelarlas), e incluso más preferiblemente no más de 3 o 2 pases, para conservar la potencia de las MSC. La expansión limitada del aspirado de médula ósea a no más de 750 x 106 células a partir de no más de 60 ml (preferiblemente no más de 50 ml, preferiblemente no más de 40 ml o aún más preferiblemente no más de 40 ml), y el número limitado de pasajes, representan un enfoque completamente novedoso en comparación con el arte existente, con efectos terapéuticos claramente beneficiosos.

También se divulga una composición de cultivo celular para cultivar MSC. La composición de cultivo celular comprende un medio de cultivo celular (por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), que tiene una concentración de glucosa de entre 0,5 y 2 g/l (preferiblemente 1 g/l) (por ejemplo, Gibco, InVitrogen Corp, # 31885-023)), y trombocitos humanos lisados (plaquetas), preferiblemente al menos 107 plaquetas lisadas por ml de composición de cultivo celular. La inclusión de trombocitos humanos lisados es muy ventajosa, ya que reduce el riesgo de respuestas inmunitarias a antígenos extraños introducidos cuando se utiliza suero no humano convencional (por ejemplo, suero fetal de ternera). El medio de cultivo/composición que contiene plaquetas puede obtenerse usando el siguiente método: (1) aislamiento de plaquetas de sangre humana (usando técnicas de aislamiento convencionales), (2) lisado de plaquetas (preferiblemente usando radiación, por ejemplo, radiación ionizante a alrededor de 24 Gy), (3) mezcla del lisado de plaquetas y la heparina, (4) mezcla de la mezcla de plaquetas y heparina con DMEM o cualquier otro medio de cultivo celular adecuado (el medio preferiblemente contiene aditivos adecuados, tales como antibióticos y/o antimicóticos), y (5) centrifugación para eliminar eventuales agregados (normalmente a unos 900 g durante unos 10 minutos).

La composición de cultivo celular puede comprender componentes adicionales, tales como fármacos antibióticos y antimicóticos convencionales (por ejemplo, antibióticos/antimicóticos, 100x Gibco, #15240-062), nutrientes u otros aditivos. El DMEM normalmente comprende los ingredientes estándar del DMEM bajo en glucosa, a saber, aminoácidos, sales (normalmente cloruro de calcio, cloruro de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio y fosfato monosódico), glucosa, hierro y vitaminas (típicamente ácido fólico, nicotinamida, riboflavina y vitamina B12). En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para uso que comprende entre 5 x 105 (500.000) y 3 x 106 (3.000.000) de MSC por ml en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las MSC en la composición farmacéutica se pueden obtener ventajosamente mediante los métodos divulgaos en el presente documento, pero las MSC se pueden obtener alternativamente mediante otros métodos adecuados.

En una realización, la composición farmacéutica puede comprender además plasma de sangre tipo AB. Sorprendentemente, el plasma de sangre tipo AB se puede utilizar ventajosamente independientemente del tipo de sangre del paciente al que se va a administrar la composición farmacéutica. Sin pretender limitarse a ninguna teoría, se supone que la ausencia de anticuerpos contra los antígenos A o B es ventajosa cuando se administra la composición farmacéutica a un paciente.

El plasma (preferiblemente de sangre tipo AB) puede estar presente en cualquier concentración por encima del 1%, preferiblemente alrededor del 10%. El plasma puede obtenerse preferiblemente fresco, normalmente criorreducido, y posteriormente almacenarse a -20°C hasta su uso. En una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser una solución acuosa que comprende al menos 5% p/v de cloruro de sodio, pero también se pueden emplear otros vehículos farmacéutica y fisiológicamente aceptables. La concentración de cloruro de sodio en la solución acuosa es preferiblemente de alrededor del 9% p/v.

En realizaciones adicionales, las MSC y/o los componentes extracelulares de la composición farmacéutica pueden ser de una fuente celular alogénica y/o autóloga. Si las células de la composición farmacéutica se obtienen de un donante alogénico, es crucial que el donante sea un individuo joven, sano, menor de 30 años, preferiblemente menor de 25 años, y aún más preferiblemente menor de 20 años.

También se divulga un método para preparar una composición farmacéutica que comprende MSC, que comprende las siguientes etapas de cultivo de Ms C de origen en la cresta iliaca y/o esternón en una composición de cultivo celular que comprende trombocitos humanos lisados, pasando dichas MSC no más de 5 veces, y, resuspender las MSC así obtenidas en solución salina hasta una concentración final de entre aproximadamente 5 x 105 y 4 x 106 MSC por ml.

La composición farmacéutica se puede obtener aspirando entre 20 y 60 ml (por ejemplo, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 ml) de médula ósea del esternón o de cresta iliaca usando una aguja de aspiración que se inserta a través de la piel usando presión manual hasta que la aguja toca el hueso. Cuando la aguja toca el hueso, con un movimiento giratorio de la mano, la aguja avanza a través de la corteza ósea y hacia la cavidad de la médula. Una vez que la aguja está en la cavidad de la médula, se conecta una jeringa y se usa para aspirar la médula ósea líquida. Preferiblemente, se puede realizar un movimiento giratorio durante la aspiración para evitar un contenido excesivo de sangre en la muestra, lo que podría ser el caso si se toma una muestra demasiado grande de un solo punto.

Después de la aspiración, las células se lavan normalmente en un líquido adecuado, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS), y las células lavadas se pueden resuspender en medio de Eagle modificado de Dulbecco con bajo contenido de glucosa complementado con lisado de trombocitos (plaquetas) y se siembran en placa a una densidad de, por ejemplo, 160.000 células por cm2 Los cultivos se mantienen a 37°C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2, preferiblemente en matraces de 175 cm2. Cuando los cultivos están cerca de la confluencia (>80%), las células pueden separarse mediante tratamiento con tripsina y EDTA y volverse a sembrar a una densidad de 4000 células por cm2. Cuando se obtienen aproximadamente 2 x 106 células o más, las células se recogen y se crioconservan en dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 % o se lavan repetidamente con PBS y se vuelven a suspender hasta una concentración final de entre aproximadamente 5 x 105 y 4 x 106 células por ml en solución salina. La solución salina en la que se resuspenden las MSC puede comprender preferiblemente plasma sanguíneo, preferiblemente plasma de sangre tipo AB.

Después de la aspiración de las MSC de la médula ósea de un donante, es crucial no cultivar las MSC durante un período de tiempo más largo, preferiblemente menos de 5 pases (después de obtener las células del donante o después de descongelarlas), y aún más preferiblemente, no más de 3 o 2 pases, para conservar la potencia de las MSC. Se deben cumplir varios criterios para la liberación de MSC para uso clínico, incluida la ausencia de grumos visibles y la ausencia de contaminación por patógenos (como se documenta por cultivos aerobios y anaerobios antes de su liberación), las MSC deberán mostrar preferiblemente una morfología fusiforme, tener una viabilidad preferiblemente superior al 95% y el fenotipado inmunitario deberá mostrar preferiblemente la expresión de moléculas de superficie CD73, CD90 y CD105 (> 90%) y ausencia de CD34, CD45, CD14 y CD3.

En otras realizaciones adicionales, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede comprender además vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas) que se pueden obtener de las MSC. Los exosomas se pueden agregar a la composición farmacéutica a partir de un cultivo separado de MSC o se pueden derivar de las MSC que se van a incluir en la composición farmacéutica.

Para optimizar las propiedades de la composición farmacéutica y evitar la coagulación tras la inyección, la composición farmacéutica puede comprender heparina o cualquier otro factor anticoagulante.

La presente invención, en otro aspecto, se refiere así al uso de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención para su uso en medicina, y específicamente en el tratamiento de enfermedades y trastornos tales como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), síndrome de dificultad respiratoria infantil (IRDS), hipertensión pulmonar (PH), cardiopatías congénitas e insuficiencia orgánica aguda (opcionalmente en relación con ARDS y/o IRDS), por ejemplo, insuficiencia cardíaca, insuficiencia renal y/o insuficiencia hepática.

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) es una causa importante de insuficiencia respiratoria aguda y a menudo se asocia con insuficiencia orgánica múltiple. Varios trastornos clínicos pueden precipitar ARDS, por ejemplo, neumonía viral y/o bacteriana, aspiración de contenido gástrico, sepsis, cirugía y traumatismo mayor. Los criterios clínicos para ARDS son normalmente los siguientes:

- Comienzo agudo: 20-50% de los pacientes con lesión pulmonar aguda desarrollarán ARDS dentro de los 7 días. - Presión de cuña capilar (PCWP) <18 mm de Hg o sin evidencia de insuficiencia cardíaca. La radiografía de tórax muestra infiltrados bilaterales.

- Hipoxemia refractaria: ARDS está presente cuando PaO2:FiO2 <200.

- Desde el punto de vista fisiológico, el ARDS se caracteriza por un aumento de la permeabilidad del edema pulmonar, hipoxemia arterial grave y alteración de la excreción de dióxido de carbono, y es el resultado de una respuesta inflamatoria continua.

- Clínicamente, el aumento de las citocinas inflamatorias persiste con frecuencia en los pacientes.

El síndrome de dificultad respiratoria infantil (IRDS) del recién nacido es la causa más común de dificultad respiratoria en bebés prematuros, en correlación con la inmadurez pulmonar estructural y funcional. La fisiopatología se caracteriza por una respuesta inflamatoria continua que genera células alveolares de tipo II inmaduras que producen menos surfactante, lo que provoca un aumento de la tensión superficial alveolar y una disminución de la distensibilidad. La atelectasia resultante causa constricción vascular pulmonar, hipoperfusión e isquemia del tejido pulmonar. Las membranas hialinas se forman a través de la combinación de epitelio desprendido, proteínas y edema. El síndrome de dificultad respiratoria persistente conduce a displasia broncopulmonar, caracterizada por hallazgos típicos en la radiografía de tórax y dependencia crónica de oxígeno.

La hipertensión pulmonar (PH) es un aumento de la presión sanguínea en la arteria pulmonar, la vena pulmonar y/o los capilares pulmonares y puede ser una enfermedad grave con una marcada disminución de la tolerancia al ejercicio e insuficiencia cardiaca. Se está acumulando evidencia que sugiere que la inflamación juega un papel importante en la patogénesis de la PH. Las células endoteliales juegan un papel importante en la inflamación y las reacciones inmunes, y las citoquinas inflamatorias causan disfunción endotelial. La disfunción endotelial es un sello distintivo de la PH, que consiste en una menor disponibilidad de vasodilatadores y factores antiproliferativos y una mayor producción de vasoconstrictores y factores de proliferación vascular. Se ha detectado aumento de las citocinas inflamatorias y la infiltración de células inflamatorias perivasculares en los pulmones de pacientes con PH. La PH persistente del recién nacido ocurre cuando la resistencia vascular pulmonar no disminuye pronto después del nacimiento, como ocurre con la transición normal. La etiología puede ser idiopática o secundaria al síndrome de aspiración de meconio, neumonía o sepsis, síndrome de dificultad respiratoria o taquipnea transitoria del recién nacido. El aumento de la hipertensión pulmonar da lugar a una respuesta inflamatoria continua en el pulmón.

Los trastornos cardíacos congénitos que dan lugar a una enfermedad cardíaca cianótica incluyen la transposición de las grandes arterias y la tetralogía de Fallot (TOF). Lesiones cardíacas no cianóticas que causan un estado de desbordamiento pulmonar que conduce a insuficiencia cardíaca congestiva. Estas lesiones incluyen defectos septales grandes, conducto arterioso permeable y coartación de la aorta. El aumento de la hipertensión, así como la cianosis, da lugar a una respuesta inflamatoria en el pulmón.

Por lo tanto, el denominador común entre las diversas enfermedades y trastornos de acuerdo con la presente invención es el aspecto inflamatorio, ya sea en (1) el sistema pulmonar como tal, (2) que emana del sistema pulmonar y que involucra otras partes del cuerpo, tales como el riñón (por ejemplo, insuficiencia renal o hepática), o (3) que emana de alguna otra parte del cuerpo y afecta al sistema pulmonar (por ejemplo, como en los trastornos cardíacos congénitos).

Los presentes inventores han descubierto inesperadamente que la vía de administración de las MSC es importante para lograr la eficacia terapéutica. Por ejemplo, en el tratamiento del síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), una composición farmacéutica que comprende MSC y/o vesículas extracelulares derivadas de dichas MSC se puede administrar preferiblemente mediante inyección intravenosa periférica, inyección venosa central en la aurícula derecha, inyección en ventrículo derecho del corazón y/o inyección en el tronco/arteria pulmonar. Específicamente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención muestran una eficacia terapéutica considerable en el grupo de pacientes que (1) padecen ARDS, IRDS, PH o cualquier otra enfermedad o trastorno pulmonar dentro del alcance de la presente invención, y (2) son elegibles y/o están recibiendo tratamiento de oxigenación membranosa extracorpórea (ECMO). Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden así administrarse tanto a pacientes que ya han recibido apoyo de ECMO como a pacientes que son elegibles pero que aún no han comenzado el tratamiento de ECMO. Además, como se mencionó anteriormente, los sujetos que tienen ciertos perfiles de miARN son particularmente elegibles para el tratamiento. Más específicamente, los pacientes que tienen niveles aumentados de al menos uno de los siguientes microARN (miR) responden al tratamiento de una manera sorprendentemente rápida y estable: miR-409-3P, miR-886-5P, miR-324-3P, miR-222, miR-125A-5P, miR-339-3P y/o miR-155 (Figura 17). Además, otro subgrupo de pacientes en el que la eficacia terapéutica es óptima es cuando el sujeto presenta niveles elevados de citoqueratina 18 escindida por caspasa (ccK18), como indicador de apoptosis epitelial.

En una realización, en pacientes que se colocan en soporte de ECMO, el modo y vía de administración de las composiciones farmacéuticas pueden optimizarse reduciendo el flujo directo de ECM^o a cero, ya sea apagando la máquina y/o sujetando una parte adecuada de la máquina para detener el flujo. Reduciendo el caudal a cero durante un tiempo suficiente para permitir la administración de la composición farmacéutica que comprende las MSC y/o las vesículas extracelulares que se pueden obtener a partir de las MSC, se puede mejorar el injerto y la eficacia terapéutica.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para prevenir, tratar y/o aliviar enfermedades y/o trastornos seleccionados del grupo que comprende ARDS, IRDS, falla orgánica aguda, (por ejemplo, renal, cardíaca y/o hepática) (opcionalmente en relación con IRDS y/o ARDS), y cardiopatías congénitas (con afectación pulmonar). Los métodos de tratamiento pueden comprender las etapas de proporcionar una dosis terapéutica de MSC y/o vesículas extracelulares que se pueden obtener de dichas MSC, y administrar dicha dosis terapéutica a un paciente que la necesite. En una realización, la dosis terapéutica de MSC y/o exosomas que se puede obtener de dichas MSC comprende al menos 500.000 MSC por kg de peso corporal, preferiblemente al menos 1.000.000 MSC por kg de peso corporal, o incluso más preferiblemente al menos 1.500.000 MSC por kg de peso corporal.

Experimentos y ensayos

Materiales y métodos

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizadas en estudios in vitro se recuperaron de pacientes y de donantes sanos, se aislaron mediante centrifugación basada en gradiente de densidad y se almacenaron en DMSO al 10% en nitrógeno líquido hasta su posterior análisis. Para una mayor purificación de las células T, se utilizó una selección basada en perlas paramagnéticas (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Las MSC derivadas de médula ósea (BM-MSC) se cocultivaron con células T alogénicas (proporción de MSC:células T 1:5, 1:10) durante 5 días. Las células T se estimularon con anticuerpos anti-CD2/CD3/CD28 activadores (Miltenyi Biotec) en una proporción de 0,5 perlas por célula. Las PBMC se cultivaron durante cinco días en presencia de MSC (proporción de MSC:PBMC 1:5 y 1:10) y posteriormente se analizó el compartimento monocítico.

Se ultrapurificaron leucocitos polimorfonucleares (PMN) de capas leucocitarias de donantes sanos en condiciones libres de endotoxinas, como se describió previamente. Se cocultivaron PMN (pureza > 95%) y MSC durante un máximo de 40 h en presencia o ausencia de 100 ng/ml de LPS. En todos los casos, las MSC se sembraron en placas 72 horas antes del comienzo de los cocultivos. En experimentos seleccionados, las MSC se pretrataron con IFN-y humano recombinante (10 ng/ml) y TNF-a (15 ng/ml) durante 48 h (Figura 12), se lavaron suavemente dos veces con medio fresco para eliminar las citocinas residuales y finalmente se cocultivaron con PMN recién aislados. Los cocultivos de MSC y PMN se tiñeron con colorante May Grunwald-Giemsa para observar la morfología celular después de la interacción recíproca.

Análisis de fluidos y suero de BAL

Se evaluaron los niveles de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias en muestras seriadas de suero y líquido de BAL utilizando un ensayo de citocinas multiplex (Millipore, MA, EE. UU.) en una máquina Luminex (Luminex, Millipore). En líquido de BAL, la concentración de proteína B tensioactiva se determinó mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Uscn Life Science Inc, Houston, EE. UU.). La K18 escindida con caspasa (ccK18) y la K18 total se midieron utilizando ELISA M30-Apoptosense® (Peviva AB, Bromma, Suecia) y ELISA M65 EpiDeath® (Peviva AB), respectivamente.

Análisis de miARN

La purificación de EV y el aislamiento de miARN fueron realizados por Exosome Diagnostic Inc. (NY, EE. UU.). En resumen, se purificaron 1,5-2 ml de muestra de sangre de cada punto de tiempo usando EXO50 (Exosome Diagnostics, Martinsried, Alemania). El ARN eluido se procesó para el análisis de microARN utilizando el protocolo con bajo volumen de muestra para el panel de microARN humano TaqMan® OpenArray® (Life Technologies, EE. UU.). Se usaron cebadores MegaplexMC RT, Human Pool A y Human Pool B para la transcripción inversa seguida de una etapa de preamplificación de acuerdo con el protocolo del fabricante. El material preamplificado se diluyó 1:20 en TE (pH 8,0) y se analizó en el panel de microARN humano TaqMan OpenArray para la detección final mediante qPCR. En total, se analizaron 758 miARN y de 200 a 300 miARN produjeron un valor de CT detectable para cada punto de tiempo.

Se usó U6 para normalizar la variación de subarreglo a subarreglo y las diferencias entre dos grupos Megaplex, porque este ARN estaba presente en cada muestra y generó valores de Ct en un intervalo confiable entre 12 y 22. Los valores de Delta Ct se calcularon para cada miARN restando el valor Ct de U6 ubicado en el mismo subarreglo. A continuación, se corrigió la variación de la cantidad total de ARN. Por lo tanto, se restó cada Ct por el valor medio de Ct de 128 miARN presentes en todas las muestras en el primer paciente y por el valor medio de Ct de 79 miARN presentes en todas las muestras en el segundo paciente. Este procedimiento se realizó para todas las muestras. Los valores faltantes se ingresaron con el valor de Ct normalizado más alto observado por paciente. Finalmente, se calculó el cambio en el número de veces para cada miARN en relación con la muestra de control sana normal. Expansión de células madre mesenquimales

Se aspiraron veintiocho ml de médula ósea de un tercer voluntario sano de 49 años de edad con HLA no coincidente. Las MSC de grado clínico se generaron en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP) de acuerdo con un protocolo común elaborado por el Comité de Desarrollo de la EBMT, acreditado por la Junta Nacional Sueca de Salud y Bienestar. Se sembraron células mononucleares de médula ósea (146 x 105) en matraces de 175 cm2 (Falcon, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) en medio de Eagle modificado de Dulbecco bajo en glucosa (DMEM-LG, Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE. UU.) complementado con plaquetas humanas lisadas (concentraciones finales que oscilan entre 107 y 109, normalmente 108/ml). Cuando los cultivos estaban cerca de la confluencia (> 80%), las células se separaron mediante tratamiento con tripsina y EDTA (Invitrogen, Grand Island, NY, EE. UU.) y se volvieron a sembrar una vez a una densidad de 4.000 células/cm2. Las MSC se recogieron y se crioconservaron en dimetilsulfóxido al 10% (WAK-Chemie Medical GmbH, Alemania). Después de descongelar, las células se lavaron tres veces en PBS y se resuspendieron en solución salina al 0,9% con la adición de plasma AB al 10%, hasta una concentración final de 2 x 106 células/ml. Los criterios de liberación de MSC para uso clínico incluyeron: ausencia de grumos visibles, morfología en forma de huso, ausencia de contaminación por patógenos (bacterias y micoplasmas) y viabilidad > 95%. Las MSC expresaron CD73, CD90, CD105, HLA-AbC y fueron negativas para CD14, CD31, CD34, CD45 y HLA-DR (Figura 11).

Evaluación de la capacidad inmunomoduladora

• Las MSC expandidas ex vivo se pretrataron (MSC cebadas, pMSC) o no (MSC) con 10 ng/ml de IFN-y y 15 ng/ml de TNF-a durante 48 horas antes de usarse en cocultivos con PMN con o sin activación por endotoxina (100 ng/ml de lipopolisacáridos (LPS)). Después del cebado inflamatorio, las MSC aumentaron la expresión en la superficie celular de CD54 (ICAM-1), CD106 (VCAM-1) y HLA-ABC y -DR (Fig. 2), así como la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO), un potente mediador de muchas funciones inmunorreguladoras de MSC (Figuras 12, 13 y 14).

• El aumento de veces de la expresión de IDO después de la estimulación con TNFa de células donantes MSC debe ser <10 y el aumento de veces de la expresión de IDO después de la estimulación de INFy debe ser superior a >100 (p 0,05). Las MSC se cultivaron en presencia de TNF-a (15 ng/ml) o IFN-^y (10 ng/ml).

• La viabilidad de PMN debería mejorarse significativamente (p 0,05), preferiblemente mejorarse en al menos un 10 %, o más preferiblemente en al menos un 20%, después de agregarse ya sea en MSC y LPS o pMSC con o sin LPS como un cocultivo. La viabilidad y los niveles de expresión de los marcadores de superficie por control o PMN estimulados con LPS se investigaron después de 40 horas de cocultivo directo ya sea en reposo o con pMSC. Se usó la expresión de CD16 (FcyR-III) como marcador sustituto de la viabilidad de PMN. En ausencia de LPS, la supervivencia de PMN mejoró solo en presencia de pMSC. Cuando se añadió LPS al cocultivo, tanto en reposo como las pMSC protegieron a los PMN de la apoptosis. En consecuencia, el porcentaje de PMN positivos para CD16 coincidió con el porcentaje de PMN viables en todas las condiciones de cultivo. Paralelamente, la expresión de CD11b y CD54 se asocia típicamente con el estado de activación de PMN. Como se esperaba, el porcentaje de PMN positivos para CD11b fue mayor en presencia de MSC y mejoró aún más con el tratamiento con LPS, mientras que la intensidad de fluorescencia media relativa (rMFI) de CD11b no cambió significativamente, lo que sugiere que más PMN se activan después de la exposición a MSC o pMSC. Lo que significa que CD11b debería mejorar significativamente (p 0,05) en presencia de MSC, pMSC con o sin LPS. Por el contrario, la rMFI de CD54 debería estar significativamente (p 0,05) aumentado por el tratamiento con LPS y este efecto se mejoró con el cocultivo con MSC. En general, la mayor supervivencia y activación de PMN provocada por las MSC sugiere que las MSC pueden influir en la respuesta innata dependiente de PMN a través de modificaciones funcionales en lugar de efectos proapoptóticos (Figura 14).

• Las MSC donantes deberían aumentar preferiblemente el número de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) en un factor de 1,5, o más preferiblemente en un factor de 2. El cocultivo de PMN con MSC condujo a un marcado aumento en células CD11bbrillante/CD16brillante/CD62Ldim maduras (tipo N2) con núcleos hipersegmentados consistentes con MDSC granulocíticas (Figura 14). De manera similar, el cocultivo de MSC con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana de control sano en diferentes proporciones promovió un aumento significativo (p 0,05) de monocitos CD14+HLA-DRbaj° que se asemejan a las MDSC monocíticas (Figura 14).

• Las MSC donantes deberían aumentar significativamente (p 0,05), preferiblemente 1,5 veces o incluso más preferiblemente 2 veces, el número de células T reguladoras, como lo ejemplifican las células T reguladoras (TReg) CD4+CD25altoCD127baj° una población de células reguladoras inmunitarias clave, también se expandió en experimentos de cocultivo con PBMC (Figuras 13 y 14). Esto se correspondió con mayores niveles de TReg CD4+CD25altoCD127bajo circulantes que se observaron en la sangre periférica de los pacientes tratados en observación hasta 20 días después de la administración de MSC (TReg entre las células T CD4+ en controles sanos (n=11) 3,84+/-1,60%, intervalo de TReg en pacientes 3,34-17,8%) (Figura 14). Este hallazgo podría haber resultado de una producción tímica elevada, como lo indica el aumento de la proporción de emigrantes tímicos recientes CD31+ entre las TReg CD45RA+ no modificadas en pacientes y/o la conversión estimulada por MSC de células T convencionales en la periferia (Figura 14).

Paciente masculino con ARDS inducido por virus

Paciente 1: un hombre de 58 años con antecedentes de hipertensión fue hospitalizado ocho días después de la aparición de fiebre alta, tos y disnea. La radiografía de tórax (CXR) demostró infiltrados bilaterales difusos y la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) del líquido de lavado broncoalveolar (BAL) fue positiva para influenza A H1N1. Se inició oseltamivir (Tamiflu, Roche, Suiza), pero el paciente se deterioró durante los siguientes dos días con aumento de las opacidades bilaterales en la CXR e insuficiencia respiratoria progresiva que requirió ventilación mecánica, seguida de ECMO veno-venosa (vv) inicial y veno-arterial (va) posterior (CardioHelp, Maquet, Alemania) para la hipoxemia refractaria. Se desarrolló insuficiencia renal aguda que requirió terapia de reemplazo renal continua (CRRT).

Durante los cuatro días siguientes, el estado del paciente empeoró con hipoxemia persistente, infiltrados bilaterales progresivos e insuficiencia hepática. En este momento, luego de extensas discusiones con la familia, la administración del hospital y la junta de ética, se le infundieron sistemáticamente MSC derivadas de médula ósea alogénica no coincidente h La obtenidas de un voluntario sano a través de un catéter venoso central colocado en la aurícula derecha del corazón. La dosis total (aproximadamente 2 * 106 células/kg de peso del receptor) se dividió en alícuotas de 5 ml de suspensión de células administradas en seis puntos de tiempo durante 20 minutos. Para evitar la infusión de MSC en el circuito de ECMO, la cánula de salida de ECMO se sujetó durante cada infusión, lo que resultó en una infusión en la aurícula derecha del corazón. En el momento de la infusión, el paciente no tenía partículas de influenza A H1N1 detectables, según lo evaluado por RT-PCR y no tenía otra infección activa detectable.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende una población de MSC inmunomoduladoras que tienen el siguiente perfil antigénico: CD73+, CD90+, CD105+, CD34-, CD45-, CD14- y CD3-, y una población de vesículas que comprende vesículas extracelulares de dicha población de MSC, en la que las vesículas extracelulares son exosomas y en la que la población de vesículas muestra el siguiente orden de abundancia polipeptídica: serotransferrina < anexina A2, para uso en el tratamiento del síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDs ), en el que el paciente que sufre de ARDS es elegible para y/o se está sometiendo a tratamiento de oxigenación membranosa extracorpórea (ECMO), y en el que la composición se administra mediante inyección intravenosa periférica, inyección venosa central en la aurícula derecha, inyección en el ventrículo derecho del corazón y/o inyección en el tronco/arteria pulmonar.

2. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la población de MSC es positiva para vimentina y/o anexina A1.

3. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la población de MSC expresa una mayor abundancia de vimentina que de CD44.

4. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la población de MSC cumple al menos uno de los siguientes criterios de inmunomodulación:

(a) la población de MSC es positiva para al menos uno de los siguientes polipéptidos:

vimentina (SEQ ID No 1), caldesmon (SEQ ID No 2), anexina A1 (SEQ ID No 3), proteína 14-3-3 épsilon (SEQ ID No 4), factor 1 de ribosilación de ADP (s Eq ID No 5), calnexina (SeQ ID No 6), factor 5 de ribosilación de a Dp (SEQ ID No 7), proteína RhoA transformante (SEQ ID No 8), CD44 (SEQ ID No 9), proteína similar a coactosina (SEQ ID No 10), proteína quinasa 3 activada por mitógeno (SEQ ID No 11), proteína 7 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina (SEQ ID No 12), N-acetil-glucosamina-6-sulfatasa (SEQ ID No 13), proteína 2 de unión al ácido retinoico celular (SEQ ID No 14), polipéptido 1 del factor B de alargamiento de la transcripción (SEQ ID No 15), NEDD8 (SEQ ID No 16), proteína de unión a ácidos grasos, corazón (SEQ ID No 17);

(b) la población de MSC en (a) muestra el siguiente orden de abundancia de polipéptidos:

vimentina > anexina A1;

(c) las veces que aumenta la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la población de MSC es <10 cuando las MSC se ceban con 15 ng/ml de TNF-alfa;

(d) las veces que aumenta la expresión de indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) en la población de MSC es >100 cuando las MSC se ceban con 10 ng/ml de IFN-gamma;

(e) la viabilidad de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) aumenta en al menos un 20% cuando se cocultivan con MSC de la población de MSC cebada con IFN gamma o TNF-alfa de acuerdo con (c) o (d);

(f) el número de monocitos CD14+HLA-DRBAJO aumenta al menos 1,5 veces cuando las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de control sanas se cocultivan con la población de MSC cebada con IFN-gamma o TNF-alfa de acuerdo con (c) o (d);

(g) el número de células T reguladoras (TReg) CD4+CD25altoCD127BAJO aumenta al menos 1,5 veces cuando las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de control sanas se cocultivan con la población de MSC cebada con IFN-gamma o TNF-alfa de acuerdo con (c) o (d).

5. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además plasma de sangre tipo AB a una concentración de al menos 1%, preferiblemente 10%.

6. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de ARDS, en el que el paciente a tratar tiene niveles elevados de citoqueratina 18 escindida por caspasa (ccK18) como indicador de apoptosis epitelial.

7. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento del ARDS, en el que el paciente a tratar tiene niveles elevados de al menos uno de los siguientes microARN (miR): miR-409-3P, miR-886-5P, miR-324-3P, miR-222, miR-125A-5P, miR-339-3P y/o miR-155.