WO2023176709A1 - 造血幹細胞移植における移植前処理を受けた患者を処置する方法および当該方法に用いるための組成物 - Google Patents

造血幹細胞移植における移植前処理を受けた患者を処置する方法および当該方法に用いるための組成物 Download PDF

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WO2023176709A1
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cells
cmp
hematopoietic stem
excmp
mice
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聡 山崎
次郎 ベッカーハンス
孝夫 余語
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国立大学法人 筑波大学
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for treating a patient who has undergone transplant pretreatment in hematopoietic stem cell transplantation, and a composition for use in the method.
  • Non-patent Document 1 Patent Documents 1 and 2.
  • hematopoietic stem cell transplantation a method has been proposed in which hematopoietic stem cells, which may be allogeneic, are transplanted to compensate for the limitation (ie, small number) of transplanted cells (Patent Document 3).
  • the present disclosure provides methods of treating patients undergoing pre-transplant treatment in hematopoietic stem cell transplantation and compositions for use in the methods.
  • the present disclosure further provides methods of making such compositions.
  • a composition comprising a cell population, the cell population comprising common myeloid progenitor cells (CMP), Common myeloid progenitor cells (CMPs) are one or more cells selected from the group consisting of CXCR4, ITGA4, DPP4, MPO, CEBPA, and GATA1, compared to CMPs contained in the hematopoietic stem cell fraction of bone marrow in living bodies. or a composition in which the expression of all marker genes (preferably DDP4) is downregulated.
  • CMP common myeloid progenitor cells
  • CMPs Common myeloid progenitor cells
  • compositions comprising a cell population, the cell population comprising common myeloid progenitor cells (CMP); A composition wherein the common myeloid progenitor cells (CMPs) are grown in vitro, preferably in a serum albumin-free medium.
  • CMPs common myeloid progenitor cells
  • the medium contains polyvinyl alcohol or modified polyalkylene glycol.
  • a composition comprising a cell population, the cell population comprising common myeloid progenitor cells (CMP), which is administered to a recipient undergoing pre-transplant treatment for hematopoietic stem cell transplantation.
  • CMP common myeloid progenitor cells
  • the composition according to (7) above comprising the cell population defined in any one of (1) to (6) above.
  • composition according to (8) or (9) above which is used to assist in accelerating post-transplant hematopoiesis in hematopoietic stem cell transplantation in a recipient.
  • (11) The composition according to (9) above, for use in supporting the survival of a recipient.
  • (12) The composition according to (10) or (11) above, which is administered to a recipient multiple times.
  • (13) The composition according to any one of (8) to (12) above, for use in inducing hematopoiesis in the spleen.
  • a method of culturing a cell population containing common myeloid progenitor cells comprising: A method comprising culturing a cell population comprising common myeloid progenitor cells (CMP) in a serum albumin-free medium, thereby expanding common myeloid progenitor cells (CMP).
  • the medium contains polyvinyl alcohol or modified polyalkylene glycol.
  • a composition comprising a cell population containing common myeloid progenitor cells (CMP) obtained by the method described in (16) above.
  • CMPs Common myeloid progenitor cells
  • CXCR4, ITGA4, DPP4, MPO, CEBPA, and GATA1 compared to CMPs contained in hematopoietic stem cell fractions in vivo.
  • the hematopoietic system can be activated earlier than CMP obtained from bone marrow before culture (fresh CMP).
  • Compositions as described.
  • the CMP is more responsive to granulocyte colony stimulating factor (GCSF) than CMP before culture obtained from bone marrow (freshCMP).
  • GCSF granulocyte colony stimulating factor
  • the responsiveness to GCSF is, for example, responsiveness to an action that promotes differentiation and proliferation of granulocytes, particularly an action that increases neutrophils.
  • proliferation of CMP is performed in the presence of hematopoietic stem cells.
  • composition according to any of the above, wherein proliferation of CMP is performed in the presence of a PI3K activator.
  • proliferation of CMP is performed in the presence of a TPO receptor agonist.
  • proliferation of CMP is performed in the presence of a PI3K activator and a TPO receptor agonist.
  • proliferation of CMP is performed under cytokine-free conditions.
  • Proliferation is 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40x or more, 50x or more, 60x or more, 70x or more, 80x or more, 90x or more, 100x or more, 200x or more, 300x or more, 400x or more, 500x or more, 600x or more, 700x 800 times or more, 900 times or more, 1000 times or more, 2000 times or more, 3000 times or more, 4000 times or more, 5000 times or more, 6000 times or more, 7000 times or more, 8000 times or more, 9000 times or more, or 10000 times or more
  • the composition according to any of the above, wherein the composition is a proliferation of.
  • FIG. 1A shows a series of schemes to test the contribution of Akaluc-expressing hematopoietic stem cells in irradiated mice transplanted with them cultured in albumin-free polyvinyl alcohol-containing medium.
  • FIG. 1B is an IVIS image showing the contribution of hematopoietic stem cells in irradiated mice transplanted with mNG-positive Akaluc-expressing hematopoietic stem cells after culture.
  • FIG. 1C is an IVIS image showing the contribution of hematopoietic stem cells in irradiated mice transplanted with cultured mNG-positive Akaluc-expressing hematopoietic stem cells.
  • FIG. 1A shows a series of schemes to test the contribution of Akaluc-expressing hematopoietic stem cells in irradiated mice transplanted with them cultured in albumin-free polyvinyl alcohol-containing medium.
  • FIG. 1B is an IVIS image showing the contribution of hematopoietic stem cells
  • FIG. 2A is an IVIS image showing the contribution of hematopoietic stem cells in irradiated mice transplanted with cultured CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells.
  • FIG. 2B is a flow cytometry result showing the isolation of CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells from the culture after culturing.
  • FIG. 2C shows that the CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells contained in the culture after 16 weeks of culture have the ability to differentiate into bone marrow, B cells, and T cells.
  • FIG. 3A shows that only the administered mNG+ cells (donor cells) produce Akaluc-derived luminescence.
  • FIG. 3B shows changes in the number of cells in the spleen and bone marrow of various cells derived from the administered mNG+ cells (donor cells). The solid line indicates the number of cells in the spleen (SP), and the dash-dotted line indicates the number of cells in the bone marrow (BM).
  • Figure 3C shows the time course of the proportion of cell types in the spleen (SP) and bone marrow (BM), respectively.
  • Figure 4A shows the results of clustering based on marker expression of mNG+Lin- cell populations in the bone marrow and spleen of irradiated mice after hematopoietic stem cell transplantation.
  • FIG. 4B shows the time course of clustering results based on marker expression of cells present in the spleen (SP) and bone marrow (BM) of irradiated mice after hematopoietic stem cell transplantation.
  • FIG. 4C shows changes over time in the proportions of CMP, MEP, and GMP in cells present in the spleen (SP) and bone marrow (BM) of irradiated mice after hematopoietic stem cell transplantation.
  • FIG. 4D shows changes over time in the abundance of each cell fraction in the spleen (SP) of irradiated mice after hematopoietic stem cell transplantation.
  • FIG. 5A shows changes over time in IVIS images after transplantation of irradiated splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) transplanted with cultured CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells.
  • WT irradiated splenectomized mice
  • SPex irradiated splenectomized mice
  • FIG. 5B shows the number of mNG+ cells in the bone marrow of irradiated splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) transplanted with CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells after culture.
  • FIG. 5C shows the percentage of CMP in the bone marrow of irradiated splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) transplanted with CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells after culture.
  • FIG. 5C shows the percentage of CMP in the bone marrow of irradiated splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) transplanted with CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells after culture.
  • FIG. 6 shows the changes in Hb values and the number of Gr1/Mac1-positive cells in irradiated splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) transplanted with CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells after culture.
  • Figure 7A shows the scheme of the experiment of Figure 7B.
  • FIG. 7B shows changes over time in the percentage of peripheral blood cells derived from irradiated splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) transplanted with CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells.
  • FIG. 8A shows a scheme in which CMP, MEP, or GMP obtained from the hematopoietic stem cell fraction 12 weeks after transplantation of irradiated mice transplanted with cultured CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells is further transplanted into irradiated B6 mice.
  • FIG. 8B shows the analysis results of bone marrow cells 12 weeks after transplantation of irradiated mice transplanted with cultured CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells.
  • Figure 8C shows post-implantation IVIS images of irradiated B6 mice implanted with CMP, MEP, or GMP.
  • FIG. 8C show the time course of signal intensity in IVIS images after implantation of irradiated B6 mice implanted with CMP, MEP, or GMP.
  • FIG. 8E shows the results of analysis of marker expression of cells in the post-transplant spleen of irradiated B6 mice transplanted with CMP, MEP, or GMP.
  • Figure 8F shows the percentage of transplanted cells in the peripheral blood of irradiated B6 mice transplanted with CMP, MEP, or GMP 4 weeks after transplantation.
  • Figure 9A shows a scheme in which whole blood is administered to irradiated mice and subsequently analyzed.
  • Figure 9B shows the percentage of CMP in the spleen (SP) and bone marrow (BM).
  • FIG. 10A shows the analysis results of cultured Akaluc-positive hematopoietic stem cells.
  • FIG. 10B shows an IVIS image after CMP (hereinafter referred to as "exCMP") and GMP (hereinafter referred to as "exGMP") exGMP obtained by culture were transplanted into irradiated mice.
  • FIG. 10C shows the time course of signal intensity in IVIS images of mice transplanted with exCMP or exGMP.
  • FIG. 10D shows the results of analyzing marker expression in spleen cells after transplantation of mice transplanted with exCMP or exGMP.
  • FIG. 10E shows the number of Gr1/Mac1 positive cells or Ter119+ cells in the spleen of irradiated mice transplanted with each cell fraction.
  • FIG. 10F shows the percentage of exCMP-derived cells in the peripheral blood of irradiated mice implanted with exCMP.
  • FIG. 11A shows an IVIS image of an irradiated mouse implanted with Akaluc-positive exCMP.
  • FIG. 11B shows signal intensities in the spleen, bone marrow, and periphery 24 hours after transplantation of irradiated mice transplanted with Akaluc-positive exCMP.
  • FIG. 11C shows the percentage of transplanted cells in the spleen and bone marrow 24 hours after transplantation of irradiated mice transplanted with Akaluc-positive exCMP.
  • FIG. 11D shows the percentage of transplanted cells in the spleen (SP), bone marrow (BM), and peripheral blood (PB) 24 hours after transplantation of irradiated mice transplanted with Akaluc-positive exCMP.
  • FIG. 12A shows the analysis results of CMP in a culture obtained by culturing cKit-positive cells using the cKit bulk culture system.
  • FIG. 12B shows changes over time in the number of CMPs in a culture obtained by culturing cKit-positive cells using the cKit bulk culture system.
  • FIG. 13A shows the difference in gene expression between freshCMP (fCMP) and exCMP.
  • FIG. 13B shows the results of flow cytometry analyzing DPP4 expression during freshCMP (fCMP) and exCMP.
  • FIG. 13C shows the measurement results of DPP4 activity of freshCMP (fCMP) and exCMP.
  • FIG. 14A shows an IVIS image of an irradiated mouse transplanted with a mixture of CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells, ecCMP, and bone marrow cells.
  • FIG. 14B shows the time course of signal intensity from IVIS images of irradiated mice transplanted with a mixture of CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells, ecCMP, and bone marrow cells.
  • FIG. 14C shows an IVIS image 3 days after transplantation of an irradiated mouse transplanted with a mixture of CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells, ecCMP, and bone marrow cells.
  • FIG. 14D shows the time-course changes in Hb, the number of Gr1/Mac1 positive cells, and the amount of platelets (PLT) in the peripheral blood of irradiated mice after transplantation of a mixture of CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells and ecCMP. show.
  • FIG. 14E shows the number of Hb, Gr1/Mac1 positive cells, and platelet (PLT) in irradiated non-splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) transplanted with a mixture of CD150+CD201+ Akaluc-expressing hematopoietic stem cells and ecCMP. Shows changes over time.
  • FIG. 14E shows the number of Hb, Gr1/Mac1 positive cells, and platelet (PLT) in irradiated non-splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) transplanted
  • FIG. 15A shows an experimental scheme in which exCMP is periodically administered weekly to lethally irradiated mice.
  • FIG. 15B shows survival curves of irradiated non-splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) that were regularly administered exCMP every week, as well as irradiated non-splenectomized mice that were not administered.
  • FIG. 15C shows survival curves of irradiated non-splenectomized mice (WT) and irradiated splenectomized mice (SPex) that were regularly administered exCMP every week.
  • FIG. 16A shows the results of a knockout experiment of cell surface expression of MHC class I by CRISPR/Cas9.
  • FIG. 16B shows an IVIS image of an allogeneic irradiated mouse transplanted with exCMP (UN exCMP) in which cell surface expression of MHC class I was knocked out on day 5 of transplantation.
  • Figure 16C shows the signal intensity of the spleen on day 7 of allogeneic irradiated mice transplanted with wild type (WT) or exCMP that knocked out cell surface expression of MHC class I (UN exCMP), and the spleen on day 7. The number of mNG+ cells in the figure is shown.
  • Figure 16D shows a dosing scheme in which wild type (WT) or exCMP with knockout of MHC class I cell surface expression (UN exCMP) and bone marrow cells are administered to irradiated mice and survival curves of mice treated with this scheme. and shows the results of chimerism analysis in peripheral blood 4 weeks after transplantation.
  • FIG. 17A shows post-implantation IVIS images of irradiated mice administered CMP or exCMP.
  • FIG. 17B and FIG. 17A show time-course changes in signal intensity in IVIS images after implantation of irradiated mice administered with CMP or exCMP.
  • FIG. 17C shows the number of mNG+ cells in the spleen of irradiated mice administered CMP or exCMP 7 days after transplantation.
  • FIG. 17D shows the percentage of CMP and exCMP in the spleens after 7 days of irradiated mice that received equal doses of CMP and exCMP and were further equalized with GCSF.
  • FIG. 18 shows the number of Ter119+ cells and the number of Gr1/Mac1+ cells in the spleen 7 days after transplantation of irradiated mice administered mNG+ CMP, MEP, GMP, cCMP (exCMP), or cGMP (exGMP).
  • FIG. 19 shows the numbers of human CMP and hematopoietic stem cells (HSC) in the spleens of irradiated mice transplanted with human CMP or exCMP on day 7 of transplantation.
  • FIG. 20A shows changes in cell number during in vitro culture of human CMP.
  • Figure 20B shows the presence of human CMP in culture.
  • FIG. 20C shows the expression of ITGA4 and DPP4 in human CMPs in culture.
  • FIG. 20D shows proliferation of blood cells in NOG mice implanted with cultured human CMP.
  • subject refers to mammals, e.g., primates such as humans; rodents such as mice, rats, and hamsters; carnivores such as dogs and cats; can be artiodactyls such as cows, pigs, llamas, alpacas, goats and sheep.
  • cells refer to mammals, e.g. primates such as humans; rodents such as mice, rats, and hamsters; carnivores such as dogs and cats; perissodactyls such as horses, donkeys and mules; , pigs, llamas, alpacas, goats and sheep, preferably human cells or mouse cells.
  • recipient refers to a subject receiving hematopoietic stem cell transplantation.
  • donor refers to a subject who provides cells for hematopoietic stem cell transplantation.
  • hematopoietic stem cell transplantation is performed allogeneically.
  • techniques have been developed to facilitate allogeneic transplantation by deleting the major histocompatibility complex (MHC, HLA in humans). Cells obtained in this way are called universal cells.
  • hematopoietic stem cells are stem cells that can differentiate into blood cell lineage cells. Hematopoietic stem cells can be harvested from bone marrow, umbilical cord, placenta, and peripheral blood. Human hematopoietic stem cells are CD34 positive cells. In humans, it is known that hematopoietic stem cells are abundantly contained in the CD34-positive, CD38-negative cell fraction (also referred to as “hematopoietic stem cell fraction"). Therefore, human hematopoietic stem cells can be CD34 positive and CD38 negative. Hematopoietic stem cells may be cells obtained by ex vivo differentiation of pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells. In mice, hematopoietic stem cells can be KSL cells. KSL cells are characterized as c-kit+Sca1+Lineage-.
  • blood cell lineage cells refer to hematopoietic stem cells and cells produced by differentiation of hematopoietic stem cells.
  • Blood cells are broadly classified into hematopoietic stem cells, hematopoietic progenitor cells, and blood cells depending on the stage of differentiation.
  • Hematopoietic stem cells differentiate into blood cells via hematopoietic progenitor cells. More specifically, hematopoietic stem cells can differentiate into lymphocytes (eg, T cells, B cells, NK cells) via lymphoblasts.
  • lymphocytes eg, T cells, B cells, NK cells
  • Hematopoietic stem cells can also differentiate into monocytes via hematopoietic progenitor cells and monoblasts.
  • Hematopoietic stem cells can also be divided into hematopoietic progenitors, common myeloid progenitors (CMPs), granulocytic/monocytic progenitors (GMPs), and granulocytic leukocytes such as neutrophils, eosinophils, or basophils. or can differentiate into macrophages. Hematopoietic stem cells can also differentiate into red blood cells via hematopoietic progenitors, common myeloid progenitors (CMPs), erythroblast/megakaryocytic progenitors (MEPs).
  • CMPs common myeloid progenitors
  • GMPs granulocytic/monocytic progenitors
  • MEPs granulocytic leukocytes
  • Hematopoietic stem cells can also differentiate into platelets via hematopoietic progenitors, common myeloid progenitors (CMPs), megakaryocyte-erythroid progenitors (MEPs), megakaryocytes. All cells differentiated from these hematopoietic stem cells are blood cells.
  • CMPs common myeloid progenitors
  • MEPs megakaryocyte-erythroid progenitors
  • megakaryocytes All cells differentiated from these hematopoietic stem cells are blood cells.
  • CMPs common myeloid progenitor cells
  • CMPs are stem cells that have the ability to differentiate into granulocytic leukocytes, macrophages, red blood cells, and platelets.
  • CMP may be included in the hematopoietic stem cell fraction. Therefore, CMP can be obtained from the hematopoietic stem cell fraction based on marker expression of CMP.
  • human CMPs are characterized as CD34+CD38+CD123+CD45RA- cells among the hematopoietic stem cell fraction.
  • human GMP is characterized as CD34+CD38+CD123+CD45RA+ cells.
  • Human MEPs are also characterized as CD34+CD38+CD123-CD45RA- cells.
  • Human GMP and MEP, respectively can also be obtained from hematopoietic stem cell fractions based on markers expressed on these cells.
  • Mouse CMPs are characterized as Lin-cKit+Sca1-FcgR-CD34+ cells.
  • ex vivo means outside the body. In this specification, ex-vivo is used in comparison with in-vivo (in-vivo), and means a state in which cells existing in a living body are removed from the living body. Cultivation can be performed ex vivo.
  • positive means that the cell is found to express the molecule specified by the term immediately preceding it. Positive means expression with a significant difference compared to the negative control. In this specification, “positive” may be simply expressed as "+”.
  • negative means that the cell is not found to express the molecule specified by the immediately preceding term. Negative means that there is no significant difference in its expression or no expression compared to the negative control. In this specification, “negative” may be simply expressed as "-”.
  • polyvinyl alcohol refers to a polymer of vinyl alcohol.
  • Polyvinyl alcohol can be obtained by saponifying polyvinyl acetate obtained by polymerizing vinyl acetate monomers.
  • the weight average molecular weight (M W ) of the polyvinyl alcohol can be, for example, 1 kDa to 20 kDa, 3 kDa to 17 kDa, 5 kDa to 15 kDa, or 7 kDa to 13 kDa.
  • the saponification rate may be 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 99% or more.
  • albumin is a protein known as a plasma component. Albumin is said to account for 60% of plasma proteins, and is present in large amounts in blood, serum, and plasma. Albumin is thought to play a role in maintaining the osmotic pressure of blood in the living body, and to bind and transport biological substances such as fatty acids and hormones. The importance of serum albumin is also known in the maintenance culture of hematopoietic stem cells.
  • Human serum albumin (hereinafter sometimes referred to as "HSA”) is human serum albumin, for example, a protein having an amino acid sequence registered with GenBank registration number: AAN17825.1 or an amino acid sequence corresponding to this. It can be human serum albumin with.
  • agonist refers to a substance that activates proteins such as receptors and enzymes.
  • PI3K means phosphatidylinositol 3-kinase.
  • PI3K is an enzyme that phosphorylates inositol phospholipids, which are constituents of cells.
  • the resulting phosphorylated phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3) phosphorylates Akt (also known as protein kinase B) and transmits the signal downstream.
  • PIP3K activator refers to receptor tyrosine kinase agonists and substances that activate PI3K.
  • a PI3K activator may have selectivity for PI3K.
  • TPO means thrombopoietin.
  • TPO is a protein responsible for differentiation of hematopoietic stem cells into megakaryocytes. TPO is known to be involved in formally maintaining hematopoietic stem cells.
  • Human thrombopoietin can be, for example, a protein having the amino acid sequence registered with GenBank accession number: AAB33390.1 or thrombopoietin having the amino acid sequence corresponding thereto.
  • TPO receptor agonist refers to a substance other than TPO that activates the TPO receptor. TPO receptor agonists include variants of TPO other than TPO, peptides, and compounds that activate the TPO receptor.
  • the term "compound” is a concept that includes organic compounds. A TPO receptor agonist may have selectivity for the TPO receptor.
  • stem cell factor is a hematopoietic cell growth factor that acts in the early stages of hematopoietic function.
  • the human stem cell factor may be, for example, a protein having the amino acid sequence registered with GenBank accession number: AAA85450.1 or an SCF having the amino acid sequence corresponding thereto.
  • cultivating means incubating cells under conditions suitable for their growth or maintenance. Incubation may preferably be performed at 37° C. and 5% CO 2 atmosphere for human cells. When “culturing” involves proliferation, “culturing” is understood to be the production of proliferated cells. As used herein, “culturing” may be performed in a serum-free medium. As used herein, “culturing” may be carried out in a chemically defined culture medium (or in a fully defined medium). A chemically defined culture medium is a serum-free medium.
  • medium means a medium used for culturing cells.
  • a medium can be made by adding the necessary components to a basal medium.
  • Necessary ingredients include pH adjusters, sugar sources such as glucose, antibiotics (such as penicillin and streptomycin), and essential amino acids such as glutamine, as well as insulin, transferrin, and selenium (such as sodium selenite). and culture additives such as ethanolamine.
  • in the absence means an environment that does not substantially contain or does not contain the component specified by the immediately preceding term.
  • substantially may be used in the sense that it does not exclude contamination that is unavoidable during the manufacturing process or contamination that is below the detection limit.
  • not containing means not containing at a concentration above the detection limit or completely not containing.
  • a serum-free medium without the addition of serum or albumin is albumin-free and does not contain serum or albumin.
  • Albumin-free means that it does not substantially contain or does not contain albumin.
  • cytokine-free means that it does not substantially contain or does not contain cytokines.
  • the medium can be albumin free.
  • the medium can be cytokine free.
  • the medium can be albumin-free and cytokine-free.
  • the medium is preferably a serum-free medium, albumin-free and cytokine-free.
  • the medium is more preferably a chemically defined medium, albumin free and cytokine free.
  • cytotoxicity means a property that has the effect of reducing the number of cells or killing cells during culture.
  • non-cytotoxicity refers to a property that does not reduce the number of cells during culture.
  • increasing the concentration may cause cytotoxicity, but in this case, if the expected effect of the substance occurs even if the concentration is lowered to an extent that does not cause cytotoxicity, it is considered non-toxic.
  • the medium does not contain a cytotoxic agent or a cytotoxic agent means that it does not contain a cytotoxic agent or a cytotoxic agent in an amount sufficient to cause cytotoxicity. means. Therefore, even if a certain drug is cytotoxic at high concentrations, when used at a concentration that does not cause cytotoxicity, the drug is not a cytotoxic agent and is not a cytotoxic drug.
  • a "cell population” is a population of multiple cells.
  • Cell populations are usually dispersed in an aqueous solution.
  • a cell population can be an aqueous solution containing a plurality of cells, where the cells are dispersed within the aqueous solution.
  • the aqueous solution has a composition suitable for growing, maintaining or preserving cells.
  • the aqueous solution is a culture solution, physiological saline, or the like.
  • a cell population is not necessarily limited to a form containing only one type of cell, but includes a form containing two or more different types of cells.
  • the cell population may be a cell population obtained by culturing a specific cell population, or may be a specific cell population obtained from a living body before culture.
  • a cell population can be a fraction of cells separated from other cells based on the expression of one or more markers.
  • cell populations in which cells are dispersed in an aqueous solution there are also cell populations in the form of sediment obtained by sedimenting the cells of the cell population, and cell populations that have formed cell clusters. can be included in the definition.
  • the CMP-containing cell population can be, for example, a cell fraction separated from a hematopoietic stem cell fraction based on marker expression.
  • a cell population containing CMP can be obtained by culturing a hematopoietic stem cell fraction under conditions suitable for its culture (e.g., in the absence of albumin), preferably proliferating it, and then obtaining a cell population from the resulting culture based on marker expression. It can be a cell fraction that is separated.
  • a cell population containing CMP can be obtained, for example, from a hematopoietic stem cell fraction (for example, a hematopoietic stem cell fraction removed from a living body before culture) based on the fact that it is CD34+CD38+CD123+CD45RA-.
  • a cell population containing CMP after culture can be obtained from a cultured hematopoietic stem cell fraction (for example, a hematopoietic stem cell fraction cultured in the absence of albumin) based on the fact that it is CD34 + CD38 + CD123 + CD45RA-.
  • Other cell populations containing CMP can be obtained from cell populations using the expression of markers characteristic of CMP as an indicator.
  • the cell population includes common myeloid progenitor cells (CMPs).
  • CMPs common myeloid progenitor cells
  • the cell population may be a cell population obtained by enriching CMP from a hematopoietic stem cell fraction.
  • the cell population may also be a cell population obtained by enriching CMP from a culture obtained by culturing a hematopoietic stem cell fraction. Enrichment of CMP can be performed based on marker expression of CMP from a cell population. As mentioned above, enrichment of CMP can be performed by obtaining a cell population that is CD34+CD38+CD123+CD45RA- from a cell population. Other cell populations containing CMP can be concentrated from the cell population using the expression of markers characteristic of CMP as an indicator.
  • compositions comprising a cell population, wherein the composition comprises a CMP, and the CMP is one or more selected from the group consisting of CXCR4, ITGA4, DPP4, MPO, CEBPA, and GATA1.
  • the CMP is one or more selected from the group consisting of CXCR4, ITGA4, DPP4, MPO, CEBPA, and GATA1.
  • the CMP contains one or more or all marker genes selected from the group consisting of CXCR4, ITGA4, DPP4, MPO, CEBPA, and GATA1, compared to CMP contained in the hematopoietic stem cell fraction in the living body. expression is downregulated.
  • Downregulation is about 70% or less, about 60% or less, about 50% or less, about 40% or less, about 30% or less, about 20% or less of the expression level in CMP contained in the hematopoietic stem cell fraction in the living body, or The expression level may be downregulated by 10% or less.
  • the CMP can be DPP4 negative.
  • human CMPs (particularly human exCMPs) exhibit lower DPP4 expression compared to CMPs contained in hematopoietic stem cell fractions in vivo. Expression can be confirmed by flow cytometry using antibodies that bind to the marker.
  • the culture or composition comprising human CMP comprises DPP4 negative human CMP.
  • the present disclosure also provides a composition comprising a cell population, the composition comprising exCMP.
  • exCMP can be obtained by various methods.
  • the present disclosure also provides a composition comprising a population of cells, the composition comprising a CMP, the common myeloid progenitor (CMP) grown in a serum albumin-free medium. things are provided. Common myeloid progenitor cells (CMPs) or exCMPs are cultured or expanded under conditions suitable for their culture or expansion.
  • Proliferation is 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 30 times or more, 40 times or more , 50 times or more, 60 times or more, 70 times or more, 80 times or more, 90 times or more, 100 times or more, 200 times or more, 300 times or more, 400 times or more, 500 times or more, 600 times or more, 700 times or more, 800 times At least 900 times, 1000 times or more, 2000 times or more, 3000 times or more, 4000 times or more, 5000 times or more, 6000 times or more, 7000 times or more, 8000 times or more, 9000 times or more, or 10000 times or more be.
  • CMP grown in the absence of albumin may have various advantages compared to CMP as shown below.
  • CMP is one or more selected from the group consisting of CXCR4, ITGA4, DPP4, MPO, CEBPA, and GATA1, or Expression of all marker genes is downregulated, substantially not expressed, or not expressed.
  • the CMP may exhibit downregulated DPP4 expression compared to a biological control, or may preferably be DPP4 negative.
  • the CMP has substantially no or no DPP4 activity.
  • the term “substantial” in the context of expression and activity allows, for example, a difference that does not result in a significant difference. Therefore, "substantially no expression” means that even if it is expressed, the expression is, for example, at a background level or at a level that does not produce a significant difference from a negative control.
  • the CMP is more responsive to granulocyte colony stimulating factor (GCSF) compared to fresh CMP obtained from bone marrow.
  • GCSF granulocyte colony stimulating factor
  • Responsiveness to GCSF is, for example, responsiveness to an action that promotes differentiation and proliferation of granulocytes, particularly an action that increases neutrophils.
  • CMP is capable of launching the hematopoietic system earlier when transplanted into lethally irradiated mice compared to fresh CMP obtained from bone marrow. In some embodiments, the CMP produces or promotes the production of more hematopoietic cells in the spleen when transplanted into lethally irradiated mice compared to fresh CMP obtained from bone marrow. can do.
  • CMP or exCMP can be obtained from a culture obtained by culturing a cell population containing CMP, but preferably from a culture obtained by culturing a hematopoietic stem cell fraction. This is because CMP or exCMP is continuously supplied from hematopoietic stem cells, and therefore it is thought that a large amount can be obtained by culturing in the presence of hematopoietic stem cells. Techniques have been developed to culture mouse and human hematopoietic stem cells in vitro.
  • hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can be successfully cultured or grown in a medium containing polyvinyl alcohol or modified polyalkylene glycol.
  • Hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can be cultured or grown in a medium containing polyvinyl alcohol or modified polyalkylene glycol in the absence of albumin, for example.
  • the medium is between pH 7 and pH 7.5.
  • the medium has a pH of 7.3-7.5.
  • the medium has a pH of 7.1-7.3 (eg, about pH 7.2).
  • the modified polyalkylene glycol can be, for example, modified polyethylene glycol.
  • the modified polyalkylene glycol or modified polyethylene glycol may preferably be modified by a copolymer of polyvinylcaprolactam blocks and polyvinyl acetate blocks.
  • the modified polyalkylene glycol is a polyalkylene glycol (eg, polyethylene glycol) modified with a copolymer of polyvinyl caprolactam blocks and polyvinyl acetate blocks.
  • the modified polyalkylene glycol may have the following formula (I):
  • n is a natural number from 5 to 50
  • m is a natural number from 10 to 100
  • l is a natural number from 10 to 200.
  • n is a natural number of 5 to 20, or preferably 10 to 20
  • m is a natural number of 20 to 50, or preferably 30 to 40
  • l is 30. 100, or preferably 50 to 60.
  • n is about 13, m is about 30, and l is about 57.
  • Such compounds include Soluplus(TM).
  • the medium has a pH of 7.1-7.3 (eg, about pH 7.2). In this pH range, clouding of the solution due to the above compound can be reduced or eliminated.
  • Hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can be cultured or grown, for example, in a medium containing polyvinyl alcohol or a compound of formula (I) in the absence of albumin.
  • a medium for culturing or proliferating hematopoietic stem cells and CMP or exCMP a medium suitable for culturing hematopoietic stem cells can be used as appropriate.
  • S-clone SF-3 medium, F12 medium, StemSpan or StemSpan SFEM Stem Cell technologies
  • STEM ⁇ STEM ALPHA
  • StemPro-34 serum-free medium Gibco
  • StemPro MSC serum-free medium Invitrogen
  • HSC-CFU medium Miltenyl Biotech
  • S-Clone serum-free medium SF-02, SF-03, CM-B, SF-B) (Sanko Pure Chemical Industries), HPGM medium (Sanko Pure Chemical Industries), AIM V Medium (Invitrogen), Marrow MAX bone marrow medium (Invitrogen), KnockOut DMEM/F-12 medium (Invitrogen), Stemline hematopoietic stem cell growth medium (Sigma), SYN serum-free medium (SYN H, SYN B) ( AbCys SA), SPE IV medium (AbCys SA), MyeloCult medium (StemCell Technologies
  • the culture medium includes a basal medium.
  • the culture medium may contain, for example, one or more selected from insulin, transferrin (apo), sodium selenite, and ethanolamine, or all of them.
  • the culture medium may contain HEPES, sodium pyruvate, vitamins, amino acids, heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, and the like.
  • the culture medium may include antibiotics (eg, penicillin and streptomycin).
  • the culture medium may contain glutamine.
  • the culture medium may contain, for example, insulin, transferrin (Apo), sodium selenite, ethanolamine, and antibiotics, and may further contain HEPES.
  • the medium may contain one or more components selected from the group consisting of Soluplus, SR1, nicotinamide, and PVA, the content of which may preferably be in an effective amount.
  • the medium may contain one or more components selected from the group consisting of Soluplus, SR1, nicotinamide, and PVA, the content of which may preferably be in an effective amount, TPO, SCF, IL6, and Flt3L, and the content thereof may be preferably an effective amount.
  • the medium may include serum, preferably in an effective amount.
  • the medium may include albumin, preferably in an effective amount.
  • the medium can be a serum-free medium.
  • the medium can be an albumin-free medium.
  • the medium can be an albumin-free and cytokine-free medium. Albumin and/or cytokines may be partially or completely replaced by other components.
  • the medium may contain SCF (which may be recombinant SCF).
  • SCF can be, for example, a mammalian SCF, or a recombinant human SCF.
  • the SCF concentration is between 1 and 200 ng/mL, more preferably between 1 and 150 ng/mL, even more preferably between 1 and 100 ng/mL, such as between 1 and 50 ng/mL. and even more preferably 1 to 30 ng/mL, even more preferably 1 to 20 ng/mL, for example, 5 to 15 ng/mL.
  • the medium may contain TPO.
  • the TPO can be, for example, a recombinant mammalian TPO, or a recombinant human TPO.
  • the TPO concentration is 20-200 ng/mL, more preferably 30-150 ng/mL, even more preferably 40-150 ng/mL, for example 100 ng/mL. I can do it.
  • the medium may contain SCF and TPO.
  • the TPO concentration is between 20 and 200 ng/mL, more preferably between 30 and 150 ng/mL, even more preferably between 40 and 150 ng/mL, for example may be 100 ng/mL
  • the SCF concentration is 1 to 200 ng/mL, more preferably 1 to 150 ng/mL, even more preferably 1 to 100 ng/mL, for example 1 to 50 ng/mL, and even more preferably, It can be from 1 to 30 ng/mL, even more preferably from 1 to 20 ng/mL, for example from 5 to 15 ng/mL.
  • the medium used in the culture method of the present invention may contain 40-150 ng/mL recombinant TPO and 1-50 ng/mL recombinant SCF.
  • the medium used in the culture method of the present invention has a TPO concentration higher than the SCF concentration, for example, any concentration within the above concentration range, and is twice or more higher than the SCF concentration. , 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 6 times or more, 7 times or more, 8 times or more, 9 times or more, or 10 times or more.
  • Hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can preferably be cultured cytokine-free.
  • the medium is substantially free or completely free of cytokines.
  • substantially free means that the medium contains cytokines at a level that cannot be removed during cell isolation and culture steps. Further, “substantially free” means that the medium contains cytokines below the detection limit.
  • SCF and TPO are representative cytokines.
  • Hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can preferably be cultured albumin-free.
  • the medium is substantially free or completely free of albumin.
  • substantially free means that the medium contains albumin at a level that cannot be removed during the cell isolation and culture steps. Further, “substantially free” means that the medium contains albumin below the detection limit.
  • Hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can preferably be cultured albumin-free and cytokine-free.
  • the medium is substantially free or completely free of both albumin and cytokines.
  • hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can be cultured in a medium containing an effective amount of a non-cytotoxic PI3K activator.
  • human hematopoietic stem cells and human CMP or human exCMP are preferably cultured in a medium containing an effective amount of a non-cytotoxic PI3K activator.
  • PI3K activator various PI3K activators can be used as long as they are non-cytotoxic, and a preferred example is 740Y-P.
  • the medium comprises an effective amount of a PI3K activator and is substantially free or free of tissue factor (SCF).
  • the medium may include an effective amount of a thrombopoietin (TPO) receptor agonist.
  • TPO thrombopoietin
  • various TPO receptor agonists can be used as long as they are non-cytotoxic, and a preferred example is butizamide.
  • the medium comprises an effective amount of a TPO receptor agonist and is substantially free or free of TPO.
  • the medium comprises an effective amount of a PI3K activator and an effective amount of a TPO receptor agonist.
  • the medium comprises an effective amount of a PI3K activator and an effective amount of a TPO receptor agonist, and is substantially free or free of either or both SCF and TPO.
  • the medium can be a cytokine-free medium.
  • the medium is albumin-free and may be a cytokine-free medium.
  • the medium can be a serum-free medium or a chemically defined medium.
  • the medium is albumin-free and may be a cytokine-free serum-free medium or a chemically defined medium.
  • the medium contains 4-N-[2-benzyl-7-(2-methyltetrazol-5-yl)-9H-pyrimido[4,5-b]indol-4-yl]cyclohexane-1, It may further contain 4-diamine (hereinafter also referred to as "UM171").
  • UM171 4-diamine
  • differentiation into megakaryocyte lineage cells is suppressed, and proliferation of hematopoietic stem cells is improved.
  • hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can be cultured or expanded under conditions suitable for each culture (particularly conditions suitable for culturing hematopoietic stem cells).
  • the present disclosure provides an in vitro method of culturing hematopoietic stem cells and CMP or exCMP, comprising culturing the hematopoietic stem cells and CMP or exCMP in a medium suitable for their culture.
  • the medium in certain preferred embodiments, is substantially free or free of albumin.
  • the medium in certain preferred embodiments, includes polyvinyl alcohol or modified polyalkylene glycol.
  • the medium in certain preferred embodiments, further comprises a PI3K activator.
  • the medium in certain preferred embodiments, is substantially free or free of SCF.
  • the medium in certain preferred embodiments, includes a TPO receptor agonist.
  • the medium in certain preferred embodiments, is substantially free or free of TPO.
  • the medium in certain preferred embodiments, is substantially free or free of albumin, comprises polyvinyl alcohol or modified polyalkylene glycol, and further comprises a PI3K activator.
  • the medium is substantially free or free of albumin, comprises polyvinyl alcohol or modified polyalkylene glycol, further comprises a PI3K activator, and is substantially free or free of cytokines. Culturing may be performed in the presence of fibronectin.
  • the culture method of the present invention can be carried out under conditions that allow contact between hematopoietic stem cells and fibronectin.
  • the inside (eg, bottom surface) of the culture container is coated with fibronectin.
  • hematopoietic stem cells and CMP or exCMP include proliferating 10 times or more, 50 times or more, 100 times or more, 200 times or more, 300 times or more, 400 times or more, or 500 times or more from the time of culture initiation. obtain.
  • hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can be isolated from culture. Isolation of hematopoietic stem cells and CMP or exCMP can be performed using techniques well known to those skilled in the art, such as, for example, flow cytometry, based on their respective characteristic marker expression.
  • a problem with hematopoietic stem cell transplantation is that it takes time for the hematopoietic system to start up after transplantation of hematopoietic stem cells.
  • a subject undergoing hematopoietic stem cell transplantation (referred to as a recipient) undergoes chemical or irradiation treatment (pre-transplant treatment) to remove immune cells and hematopoietic systems from the recipient's body prior to hematopoietic stem cell transplantation. remove. It is hoped that this will lead to the establishment of a hematopoietic system in the recipient from the transplanted hematopoietic stem cells.
  • Hematopoiesis cannot occur in a recipient body that has undergone transplant pretreatment, and therefore it is extremely important to activate the hematopoietic system (particularly red blood cells, macrophages, platelets, or neutrophils, etc.) at an early stage. However, it takes time for the hematopoietic system to establish itself through hematopoietic stem cell transplantation.
  • CMP or exCMP supports the establishment of or establishes a hematopoietic system (eg, red blood cells, macrophages, platelets, or neutrophils) earlier than hematopoietic stem cells.
  • CMP or exCMP administered to a recipient may produce hematopoietic cells other than T cells and B cells within the recipient body, but may produce hematopoietic cells other than T cells and B cells within the recipient body.
  • Recipients receiving CMP or exCMP may be able to quickly launch hematopoietic systems (e.g., red blood cells, macrophages, platelets, or neutrophils) in the body, improving the safety of hematopoietic stem cell transplantation. can.
  • CMP or exCMP can be administered to a recipient before, simultaneously with, or after hematopoietic stem cell transplantation.
  • CMP or exCMP may preferably be administered to the recipient prior to or concurrently with the hematopoietic stem cell transplant.
  • exCMP has a higher ability to induce hematopoietic cells than fresh CMP (CMP before culture).
  • exCMP also has the ability to launch hematopoietic systems (eg, red blood cells, macrophages, platelets, or neutrophils, etc.) earlier compared to freshCMP. Therefore, exCMP can be preferably administered to recipients during hematopoietic stem cell transplantation.
  • CMP or exCMP administered to a recipient supports the establishment of early hematopoietic systems (e.g., red blood cells, macrophages, platelets, or neutrophils, etc.) or builds up the hematopoietic system while also Since it is removed, it will not survive in the recipient for a long period of time.
  • CMP or exCMP may be administered to a recipient to early and temporarily build up the hematopoietic system (eg, red blood cells, macrophages, platelets, or neutrophils, etc.) within the recipient body.
  • cells may be in an allogeneic relationship with the recipient, but are preferably allogeneic or syngeneic. Or more preferably, universalized allogeneic cells, as described below.
  • the recipient may be kept on life support by administering CMP or exCMP one or more times after pre-transplant treatment.
  • CMP or exCMP only temporarily supports hematopoiesis, by administering it multiple times, it can support the hematopoietic system in the recipient body over a long period of time and maintain the life of the recipient.
  • CMP or exCMP can be used to aid survival or sustain life in a transplant-conditioned recipient.
  • CMP or exCMP is preferably universalized. Universalization is a process that suppresses immune rejection and immune diseases such as graft-versus-host disease (GVHD) by removing part of MHC or HLA. Universalization can be achieved by loss of expression of a portion of MHC or HLA. Loss of expression of part of MHC or HLA can be achieved, for example, by knocking out ⁇ -2-microglobulin (B2M). According to the present disclosure, universalized CMP or exCMP may be provided. According to the present disclosure, CMP or exCMP in which ⁇ -2-microglobulin is knocked out and expression of a part of MHC or HLA is lost can be provided.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • CMP or exCMP generates hematopoietic cells in the spleen. Therefore, in the present disclosure, CMP or exCMP can induce hematopoiesis in the spleen.
  • CMP or exCMP has CXCR4 knocked out or knocked down. It is expected that CMP or exCMP in which CXCR4 has been knocked out or knocked down can improve the proliferative activity of CMP or exCMP in the spleen. According to the present disclosure, CMP or exCMP in which CXCR4 is knocked out or knocked down can be provided.
  • CMP or exCMP is universalized and CXCR4 is knocked out or knocked down.
  • a universalized CMP or exCMP in which CXCR4 is knocked out or knocked down can be provided.
  • CMP or exCMP in which ⁇ -2-microglobulin is knocked out, expression of a part of MHC or HLA is lost, and CXCR4 is knocked out or knocked down can be provided.
  • compositions containing these CMPs or exCMPs are provided.
  • This composition can be administered to a recipient undergoing transplant preparation.
  • This composition can be used to support the establishment of the hematopoietic system in the body of a recipient undergoing transplant pretreatment.
  • This composition can be used to support the life of a recipient undergoing transplant preparation.
  • the medium is Contains polyvinyl alcohol or modified polyalkylene glycol, and (1) comprising a PI3K activator and one or more selected from the group consisting of TPO and TPO receptor agonist; (2) comprising one or more selected from the group consisting of SCF and PI3K activator and a TPO receptor agonist; or (3) comprising a PI3K activator and a TPO receptor agonist; It can be a medium.
  • the medium is preferably substantially free or free of albumin.
  • the medium is preferably substantially free or free of cytokines.
  • the medium is preferably a serum-free medium or more preferably a chemically defined medium.
  • the medium is suitable, for example, for propagating or culturing human hematopoietic stem cells and CMP or exCMP.
  • the medium can also be, for example, a medium for the growth or culture of hematopoietic stem cells and CMP or exCMP.
  • a method for culturing hematopoietic stem cells and CMP or exCMP is provided.
  • the cells may be cultured in any of the media described above under conditions suitable for their culture.
  • Culture can increase hematopoietic stem cells and exCMP.
  • exCMP can be isolated from a culture containing hematopoietic stem cells and exCMP after culturing. Isolation of exCMP can be performed using, for example, flow cytometry based on marker expression characteristic of CMP.
  • a method for producing CMP or exCMP which comprises culturing cells included in a hematopoietic stem cell fraction in a medium suitable for the culture under conditions suitable for the culture. be done.
  • a medium any of the above-mentioned media can be preferably used.
  • cells included in the hematopoietic stem cell fraction can be proliferated by culturing.
  • the method may further include isolating exCMP from the obtained cells. Isolation of exCMP can be performed, for example, using flow cytometry, for example, based on the expression of markers characteristic of exCMP.
  • mice C57BL/6 (B6-Ly5.2) mice are SLC, C57BL/6 (B6-Ly5.1) mice, C57BL/6 (B6-Ly5.1/Ly5.2 F1) mice are Sankyo Labo Service, B6 Albino (B6N-Tyr c-Brd /BrdCrCrl) mice were purchased from Charles River Japan. All experiments were conducted in accordance with the Animal Experiment Practice Guidelines of the University of Tokyo and the University of Tsukuba.
  • Mouse bone marrow stem/progenitor cells were collected from the bone marrow of 8-12 week old mice by the following method. Bone marrow cells collected from mouse pelvis, femur, and tibia were stained with anti-APC-cKit antibody, and cKit-positive cells were separated using anti-APC MACS beads (Miltenyi Biotec) and LS columns (Miltenyi Biotec).
  • CD34-KSL and CD34-CD150+KSL cells were set as hematopoietic stem cell fractions, and sorting was performed using a FACS Aria III cell sorter (BD) and MoFlo XDP Cell Sorter (Beckman Coulter). For culturing cKit-positive cells, cells separated using an LS column were used.
  • CD34-KSL cells from B6-Ly5.1 mice were separated into 96-well plates (TPP) in 100 cells, or 24-well plates (TPP) in 1000-3000 cells, F-12 culture solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) was supplemented with SCF (10 ng/mL; Pepro Tech), TPO (100 ng/mL; Pepro Tech), ITSX (1%; Gibco TM ), HEPES (10 mM; Gibco TM ).
  • Bone marrow transplantation The competitive bone marrow reconstitution method was performed using the Ly5 congenic mouse system.
  • B6-Ly5 cells collected and cultured from B6-Ly5.1 mice were irradiated with 8 Gy of lethal radiation along with 5 ⁇ 10 5 bone marrow cells from B6-F1-Ly5.1/Ly5.2 mice. .2 mice were transplanted intravenously.
  • 1 ⁇ 10 6 bone marrow cells were collected from mice 16 weeks or more after transplantation, and intravenously transplanted into B6-Ly5.2 mice that had been irradiated with 8 Gy of lethal radiation. Peripheral blood was collected every 4 weeks and chimerism was analyzed after transplantation.
  • biotinylated lineage antigen antibodies anti-Gr1, Mac1, B220, CD4, CD8, IL7Ra, Ter119
  • anti-streptavidin-APCeFluor780 antibody anti-APC-cKit antibody
  • anti- Staining was performed with BV605-Sca1 antibody, anti-BV510-CD41 antibody, anti-PE-FcgR antibody, anti-PECy7-CD150 antibody, anti-BV786-CD105 antibody, and anti-PB-CD34 antibody.
  • biotinylated lineage antigen antibodies anti-Gr1, Mac1, B220, CD4, CD8, IL7Ra, Ter119
  • anti-streptavidin-APC-eFluor780 antibody anti-APC-cKit antibody
  • anti-BV605-Sca1 antibody Staining was performed with anti-PE-CD201 antibody, anti-PECy7-CD150 antibody, and anti-PB-CD34 antibody.
  • anti-APC-CD4 antibody, anti-APC-CD8 antibody, anti-APCCy7-B220 antibody, anti-PB-CD45.1 antibody, anti-PE-Gr1 antibody, anti-PE-Mac1 antibody, anti-PECy7-Ter119 antibody Staining was performed using Analysis of the stained cells was performed using a FACS Verse analyzer and a FACS AriaIII cell sorter. The number of each cell fraction was counted using Precision Count Beads TM .
  • RNA-Seq cDNA library creation 10,000 splenic pulp stromal cells and 10,000 vascular endothelial cells were collected from mice 10 days after irradiation with 4 Gy and suspended in Trizol-LS. Subsequent RNA extraction, RNA-Seq cDNA library creation, and mapping of the Sequence fragment onto the mouse genome were performed using the analysis services of the Genome Biology Department, Transborder Medical Research Center, University of Tsukuba. Gene expression analysis was performed using the DESeq2 package. Ontology analysis was performed using the mouse gene Gene Ontology annotation database. Raw transcriptomic analysis data is available at ***.
  • RNP ribonucleoprotein
  • the suspension was transferred to a 16-well cuvette (P3 Primary Cell 96-well-Nucleofector Kit), and electroporation was performed using a 4D nucleofector device (Lonza) (EO-100 program). Thereafter, Ca-free DMEM culture solution was immediately added to the cells and incubated for 10 minutes. Thereafter, the culture was restarted by returning to the PVA-based HSC amplification medium.
  • the obtained PCR products were separated by electrophoresis, visualized with blue light after staining with Midori Green Xtra (Nippon Genetics), and a fragment corresponding to the expected target product (approximately 700 bp) was excised and gel purified.
  • the obtained purified fragment was subjected to Sanger sequencing using Forward TIDE primer (sequencing was outsourced to FASMAC).
  • Forward TIDE primer sequencing was outsourced to FASMAC.
  • the sequence of hematopoietic stem cells without genome editing was used, and the knockout rate was calculated by the TIDE algorithm.
  • Hematopoiesis occurs in the spleen early after transplantation, and when hematopoietic stem cells, which change over time, are administered to mice after lethal radiation, they expand and differentiate over time, reconstituting blood cells of all lineages. I can do it.
  • the spatial dynamics and time course of how hematopoietic stem cells initiate hematopoiesis within the same individual after transplantation are not well understood.
  • the AkaLuc bioluminescence imaging (AkaBLI) system was applied.
  • AkaBLI is a recently established bioluminescence technology, in which Akalumine (AKA), a newly synthesized D-luciferin analogue, achieves 100-1000 times more luminescence than traditional bioluminescence and stimulates the pulmonary vasculature after intravenous injection. This made it possible to detect AkaLuc-expressing HeLa fibroblasts captured at the single-cell level. Therefore, we isolated 100 CD34-CD150+KSL cells, which are an HSC fraction, from mice, introduced the Akaluc gene using lentivirus (LV-Ubc-mNG2A-Akaluc), and then cultured hematopoietic stem cells using PVA, which has been established in recent years.
  • AKA Akalumine
  • bone marrow progenitor cells, neutrophils, and macrophages proliferate 9 to 10 days after transplantation, and then red blood cells account for the majority of hematopoiesis on the 12th day after transplantation, reaching the hematopoietic peak. was formed.
  • a hematopoietic peak in which multiple lineages including lymphocytes were observed was observed 18-20 days after transplantation.
  • Early hematopoiesis in the spleen is significantly different from hematopoiesis in the bone marrow; mature neutrophils and macrophages predominate in the bone marrow, whereas myeloid progenitor cells and erythropoiesis were prominent in the spleen (see Figure 3C).
  • the spleen and bone marrow differ greatly in the level of hematopoietic stem/progenitor cells, and the bone marrow 7-12 days after transplantation has FcgR+ positive populations such as GMP (Lin-cKit+Sca1-FcgR+CD34+ cells, the same applies hereinafter). It was noticeable that in the spleen, CMP (Lin-cKit+Sca1-FcgR-CD34+ cells, hereinafter the same) and MEP (Lin-cKit+Sca1-CD34-FcgR- cells, the same below) were characteristic. (See Figure 4B).
  • CMPs form hematopoiesis in the spleen early after transplantation.
  • bone marrow progenitor cell populations such as CMPs were confirmed early in the spleen after transplantation, indicating that this fraction plays an important role in early hematopoiesis after transplantation.
  • Aka+CD150+CD201+KSL 3000 cells were transplanted together with Sca1-F1 5.0 ⁇ 10 5 cells into lethally irradiated mice to create Aka+ mice in which all blood cells of the recipient mice were replaced with Aka+ cells.
  • the bone marrow of Aka+ mice was harvested more than 12 weeks after transplantation, and the CMP, GMP, and MEP fractions were collected, and 10,000 cells each were transplanted together with F1 5.0 ⁇ 10 5 cells into lethally irradiated mice. , IVIS imaging, and the spleen was collected and analyzed on day 7 after transplantation (see Figures 8A and B). As previously reported, CMP produced neutrophils/macrophages and red blood cells, GMP produced neutrophils/macrophages, and MEP produced red blood cells.
  • CMP transplantation hematopoiesis was mainly performed in the spleen, and hematopoietic peaks consisting of neutrophils, macrophages, and red blood cells were formed around the 9th and 12th day (see Figures 8C, D, and E). In either case, only short-term hematopoiesis occurred, and no detection was made in peripheral blood analysis 4 weeks later (see Fig. 8F).
  • Expanded CMP was found to contribute to early hematopoiesis in the spleen through extramedullary hematopoiesis in the spleen than fresh CMP.
  • CD34-KSL cells were collected from mouse bone marrow, Akaluc gene was introduced, and after culturing for 7 days under the conditions of (5) above, FcgR+ fraction (expanded GMP; exGMP) and FcgR were extracted from Lin-Sca1-cKit+CD34+ fraction.
  • - fraction (expanded CMP; exCMP), 10,000 cells were collected from each and transplanted into mice (see FIG. 10A).
  • exCMP is a fraction corresponding to CMP due to its differentiation ability.
  • fresh CMP CMP collected from the bone marrow of Aka+ mice
  • Hematopoietic cells containing CMP were difficult to grow in the absence of albumin.
  • a method for culturing hematopoietic stem cells in the absence of albumin was developed, which made it possible to culture hematopoietic cells including hematopoietic stem cells in the absence of albumin. Ta.
  • hematopoietic stem cells can be cultured even under cytokine-free conditions (particularly in a chemically defined medium) by replacing SCF or TPO with an alternative.
  • CMP could be grown in vitro by the above method, but CMP and exCMP could also be cultured using the recently established cKit bulk culture system (Nat. Commun., 2021, 12(1): 3568). .
  • cKit bulk culture system cKit-positive cells were separated by the method described in (4) above, and the obtained 10,000 cKit-positive cells were cultured in 1 mL of the medium containing PVA described in (5) above.
  • 20-50% of the cultured cells were exCMP, and when culture was started from 10,000 cKit+ cells, 4 ⁇ 10 5 cells of exCMP could be produced in 4 weeks (see FIGS. 12A and B).
  • CMP is a cell type that is continuously produced from hematopoietic stem cells, it is thought that it can be obtained in particularly large amounts under culture conditions in the absence of albumin, which allow hematopoietic stem cells to proliferate. Furthermore, in the absence of albumin, exCMP improves the expression of platelet-related genes compared to the condition in the presence of albumin. From this, it is considered that exCMP having properties of more immature CMP increases by culturing in the absence of albumin.
  • exCMP was able to produce many mature cells earlier than freshCMP
  • bulk RNAseq was performed to investigate the difference between exCMP and freshCMP in more detail.
  • exCMP and freshCMP have differences in cell cycle and expression levels of chemokine receptors, integrins, etc. (see FIGS. 13A, B, and C).
  • exCMP had more cells in the G2-M phase than freshCMP.
  • chemokine receptor it was found that the expression level of CXCR4 was lower in exCMP than in freshCMP.
  • CXCR4 knockout hematopoietic stem cells In transplantation of CXCR4 knockout hematopoietic stem cells, the number of proliferating cells in the spleen 7 days after transplantation significantly increases compared to the number of cells after transplantation of wild-type hematopoietic stem cells. Therefore, the decreased CXCR4 expression level in exCMP may be associated with the active cell proliferation in the spleen of exCMP.
  • integrin expression while Itga4 and L-selectin were highly expressed in freshCMP, their expression levels were low in exCMP, and Itgb1/b2/b3, Itga6, and P-selectin were highly expressed. .
  • Another characteristic was that the expression of DPP4, a serine protease, was significantly lower in exCMP.
  • exCMP is DDP4 negative by flow cytometry (see Figure 13B).
  • freshCMP has DPP4 activity, but exCMP does not have DPP4 activity (see Figure 13C). It is suggested that low DPP4 expression may improve responsiveness to cytokines (see Nat. Med., 18(12): 1786-1796, 2012).
  • gene expression related to bone marrow progenitor cells was compared to see if there was a difference in the differentiation stage between exCMP and freshCMP.
  • Myeloid and erythroid maturation markers such as MPO and Gata1 were more highly expressed in fresh CMP.
  • exCMP can rescue recipients after radiation irradiation through early hematopoiesis in the spleen Since exCMP generates hematopoiesis in the spleen early, it can be used as a bridge after radiation irradiation by starting hematopoiesis earlier than when transplanting only HSCs. I thought that I could play the role of Therefore, in order to investigate how the spatiotemporal dynamics of hematopoietic reconstitution changes when exCMP is mixed and transplanted, Aka + CD150 + CD201 + KSL fraction 3000 cells and Aka + exCMP 10000 cells were transferred to F1 mouse bone marrow cells 5x.
  • the cells were transplanted together with 10 5 cells into lethally irradiated mice, and time-lapse IVIS imaging was performed. As expected, an exCMP-derived hematopoietic peak could be confirmed earlier than when only the Aka+CD150+CD201+KSL fraction was transplanted (see FIGS. 14A and 14B). The signal itself was already visible on the third day after transplantation, and exCMP-derived hematopoiesis in the spleen could be detected (see FIG. 14C). In order to confirm that they were actually contributing to the rescue, Aka+ CD150+CD201+KSL fraction 3000 cells and Aka+ exCMP 10000 cells were transplanted into lethally irradiated mice, and their early rise was examined by peripheral blood analysis.
  • mice can be rescued by periodically transplanting only exCMP, and we inject 30,000 or 100,000 exCMP cells into lethally irradiated mice every week. were transplanted periodically (see Figure 15A). As a result, as expected, all mice were able to survive for a long period of time (see FIGS. 15B and 15C). When similar experiments were performed on splenectomized mice, rescue failed, confirming that these effects were spleen-dependent.
  • exCMP can contribute to hematopoietic reconstruction in mice after radiation irradiation through spleen-dependent early hematopoiesis, and by understanding the spatiotemporal dynamics after transplantation, exCMP can be administered in a planned manner after radiation irradiation. rescue was possible.
  • Universal Expanded CMP is an allogeneic transplant, and in the clinical setting of rescuing recipients after irradiation, autologous transplants, in which grafts derived from the patient's own body are prepared in advance, are extremely superior in that they do not cause immune rejection. , there are many challenges. First, it is expensive because it is individually adjusted for each patient, and it also takes a long time to collect cells from the patient, manipulate them, and apply them to treatment. Furthermore, since the cells are collected from the patient themselves, the quality of the cells depends on the patient's condition, which may impede subsequent application of the technology. Allogeneic transplantation can solve these problems, and if a common cell stock that can be administered to all patients can be created, it has great applicability.
  • exCMP can rescue mice after radiation irradiation through early hematopoiesis in the spleen, so we next investigated whether exCMP could be transplanted into other cells.
  • Aka+ exCMP 1 ⁇ 10 5 cells derived from cells collected from B6 mice were transplanted into irradiated B6 mice and BALB/c mice, and IVIS imaging was performed on the 5th day.
  • CD34-KSL cells were collected from the bone marrow of B6 mice and cultured for 5-7 days, and then the ⁇ 2 microglobulin (B2M) gene, which is important for the presence of MHC Class 1, was knocked out using the CRSPR-Cas9 system. After that, the culture was further carried out for 3 days, and the knockout efficiency was analyzed by confirming the presence or absence of MHC Class 1 expression using FACS.
  • B2M microglobulin
  • MHC Class1 (-) cells are known to be attacked by NK cells
  • NK cells in recipient BALB/c mice were depleted by administration of anti-ASGM1 antibody two days before transplantation, and then exposed to radiation. The cells were irradiated and 1 ⁇ 10 5 cells of MHC Class1 ( ⁇ ) exCMP (Universal exCMP; UNexCMP) were transplanted.
  • mice transplanted with non-knockout control cells no hematopoiesis was observed in the spleen on the 5th or 7th day after transplantation, and the appearance of hematopoiesis was not amplified, but MHC Class1 (- ) Hematopoiesis was confirmed in the spleen of mice transplanted with exCMP on the 5th day after transplantation, and the signal was further amplified on the 7th day (see FIGS. 16B and 16C).
  • NK-treated BALB/c mice after irradiation were treated with MHC Class1 (-) exCMP or control exCMP 1 ⁇ 10 5 Cells were transplanted in the first and second weeks, and 1 ⁇ 10 6 BALB/c bone marrow cells were transplanted in the third week.
  • mice transplanted with control exCMP could not survive for more than 2 weeks, whereas mice transplanted with MHC Class1 (-) exCMP were able to survive for a long time (Fig. 16D, left). (see panel).
  • ExCMP (Ly5.1) and fCMP (F1) were transplanted into irradiated mice, and then GCSF was administered on days 0, 1, 3, and 5, and the spleen was isolated on day 7. Recovered. exCMP-derived cells increased cell number in the spleen in response to GCSF. When compared to fCMP, exCMP showed higher responsiveness to GCSF, and the results showed that the number of exCMP-derived cells increased more than the number of fCMP-derived cells (see Figure 17D).
  • Ter119+ cells significantly increased in the exCMP transplantation group (see FIG. 10E).
  • Gr/Mac1+ cells also significantly increased in the exCMP transplantation group. This further demonstrated that exCMP fractionation is useful for starting up early hematopoiesis (see FIG. 18).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • SR1 stemregenin 1
  • human CMP CD34+CD38+CD123+CD45RA-
  • human hematopoietic stem cells HSC
  • CD34+CD38-CD45RA-CD90+ human hematopoietic stem cells
  • Human CMP was collected and cultured in the presence of human TPO, human SCF, human IL6, Flt3L at 50 ng/mL each, and various factors shown in the figure. As a result, as shown in FIG. 20A, human CMP was able to proliferate even in the absence of serum and albumin. In particular, CMP could be grown in the absence of albumin in the presence of either Soluplus, SR1, nicotinamide, and PVA. In this way, human CMP could be cultured and propagated under various conditions.
  • the obtained CMP (CD34+CD38+ fraction) was analyzed by flow cytometry. The results showed that the culture contained CD123+CD34RA- CMPs, as shown in Figure 20B. The percentage of CMP in all cells was approximately 33.3%.
  • human CMP (CD123+CD34RA-) in the resulting culture highly expressed ITGA4 and only lowly expressed DPP4. CMP in the obtained culture was transplanted into NOG mice. As a result, as shown in FIG. 20D, the obtained human CMP engrafted into mice and produced blood cells in vivo.

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Abstract

本開示は、造血幹細胞移植における移植前処理を受けた患者を処置する方法および当該方法に用いるための組成物を提供する。本開示の組成物は、骨髄系共通前駆細胞を含む。

Description

造血幹細胞移植における移植前処理を受けた患者を処置する方法および当該方法に用いるための組成物
　本開示は、造血幹細胞移植における移植前処理を受けた患者を処置する方法および当該方法に用いるための組成物に関する。
　造血幹細胞の培養において、化学的に定義された培地を用いた増殖について研究が進められており、マウスの造血幹細胞については、化学的に定義された培地を用いた培養が可能であることが明らかにされている（非特許文献１、特許文献１および２）。
　造血幹細胞移植において、移植細胞数の限界（すなわち少なさ）を補完するためにアロでもよい造血幹細胞を移植する手法が提案されている（特許文献３）。
ＷＯ２０２１／０４９６１７Ａ ＷＯ２０２１／１４９７９９Ａ ＪＰ２０１６－１０４７１１Ａ
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　５７１：１１７－１２１，　２０１９
本開示は、造血幹細胞移植における移植前処理を受けた患者を処置する方法および当該方法に用いるための組成物を提供する。本開示はさらに、そのような組成物の製造方法も提供する。
　本開示によれば、以下の発明が提供される。
（１）細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含み、
　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、生体中の骨髄の造血幹細胞分画に含まれるＣＭＰと比較して、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡ４、ＤＰＰ４、ＭＰＯ、ＣＥＢＰＡ、およびＧＡＴＡ１からなる群から選択される１以上または全てのマーカー遺伝子（好ましくはＤＤＰ４）の発現が下方制御されている、組成物。
（２）細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含み、
　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、インビトロで増殖したもの、好ましくは血清アルブミンフリーの培地中で増殖したものである、組成物。
（３）骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）が、ＤＰＰ４陰性である、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）前記培地は、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含む、上記（２）または（３）に記載の組成物。
（５）骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）において、ＣＸＣＲ４がノックダウンまたはノックアウトされている、上記（１）～（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）が、主要組織適合性遺伝子複合体を細胞膜表面に有しない、上記（１）～（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含み、造血幹細胞移植の移植前処置に供されたレシピエントに投与される、組成物。
（８）上記（１）～（６）のいずれかにおいて定義される細胞集団を含む、上記（７）に記載の組成物。
（９）造血幹細胞移植の前に、前記移植と同時に、または前記移植の後に投与される、上記（１）～（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）レシピエントにおいて造血幹細胞移植における移植後の造血の早期化を補助することに用いるための、上記（８）または（９）に記載の組成物。
（１１）レシピエントの生存を補助することに用いるための、上記（９）に記載の組成物。
（１２）レシピエントに複数回投与される、上記（１０）または（１１）に記載の組成物。
（１３）脾臓における造血を誘導することに用いるための、上記（８）～（１２）のいずれかに記載の組成物。
（１４）骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含む細胞集団を培養する方法であって、
　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含む細胞集団を血清アルブミンフリーの培地中で培養することを含み、これにより、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を増殖させることを含む、方法。
（１５）培地が、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含む、上記（１４）に記載の方法。
（１６）上記（１４）または（１５）に記載の方法であって、培養後の細胞集団から骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を回収することをさらに含む、方法。
（１７）上記（１６）に記載の方法により得られる骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含む細胞集団を含む組成物。
（１８）骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、生体中の造血幹細胞分画に含まれるＣＭＰと比較して、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡ４、ＤＰＰ４、ＭＰＯ、ＣＥＢＰＡ、およびＧＡＴＡ１からなる群から選択される１以上または全てのマーカー遺伝子の発現が下方制御されている、上記（１７）に記載の組成物。
（３１）ＣＭＰが、致死量放射線照射マウスに移植されると、骨髄から取得された培養前のＣＭＰ（ｆｒｅｓｈＣＭＰ）と比較して、より早期に造血系を立ち上げることができる、上記いずれかに記載の組成物。
（３２）ＣＭＰが、骨髄から取得された培養前のＣＭＰ（ｆｒｅｓｈＣＭＰ）と比較して、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）に対してより応答性である、上記いずれかに記載の組成物。
（３３）ＧＣＳＦへの応答性は、例えば、顆粒球の分化および増殖を促進する作用、特に好中球に対する増加作用への応答性である、上記（３２）に記載の組成物。
（３４）ＣＭＰの増殖は、造血幹細胞の存在下で行われる、上記いずれかに記載の組成物。
（３５）ＣＭＰの増殖は、ＰＩ３Ｋアクチベータの存在下で行われる、上記いずれかに記載の組成物。
（３６）ＣＭＰの増殖は、ＴＰＯ受容体アゴニストの存在下で行われる、上記いずれかに記載の組成物。
（３７）ＣＭＰの増殖は、ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストの存在下で行われる、上記いずれかに記載の組成物。
（３８）ＣＭＰの増殖は、サイトカインフリーの条件下で行われる、上記いずれかに記載の組成物。
（３９）増殖は、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、３００倍以上、４００倍以上、５００倍以上、６００倍以上、７００倍以上、８００倍以上、９００倍以上、１０００倍以上、２０００倍以上、３０００倍以上、４０００倍以上、５０００倍以上、６０００倍以上、７０００倍以上、８０００倍以上、９０００倍以上、または１００００倍以上の増殖である、上記いずれかに記載の組成物。
図１Ａは、アルブミン非含有ポリビニルアルコール含有培地で培養したＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射マウスにおける前記造血幹細胞の寄与を試験する一連のスキームを示す。 図１Ｂは、培養後のｍＮＧ陽性のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射マウスにおける前記造血幹細胞の寄与を示すＩＶＩＳ像である。 図１Ｃは、培養後のｍＮＧ陽性のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射マウスにおける前記造血幹細胞の寄与を示すＩＶＩＳ像である。 図２Ａは、培養後のＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射マウスにおける前記造血幹細胞の寄与を示すＩＶＩＳ像である。 図２Ｂは、培養後の培養物からのＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞の単離を示すフローサイトメトリの結果である。 図２Ｃは、培養１６週間後の培養物に含まれるＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞が、骨髄、Ｂ細胞、およびＴ細胞に分化する能力を有することを示す。 図２Ｄは、培養後のＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射マウスにおける脾臓でのＡｋａｌｕｃの平均輝度の経時変化およびＩＶＩＳ像の経時変化を示す。 図３Ａは、投与したｍＮＧ＋細胞（ドナー細胞）のみＡｋａｌｕｃの由来の発光を生じることを示す。 図３Ｂは、投与したｍＮＧ＋細胞（ドナー細胞）に由来する各種細胞の脾臓および骨髄での細胞数変化を示す。実線が脾臓（ＳＰ）における細胞数を示し、一点鎖線は骨髄（ＢＭ）における細胞数を示す。 図３Ｃは、脾臓（ＳＰ）および骨髄（ＢＭ）のそれぞれにおける細胞種の割合の経時変化を示す。 図４Ａは、造血幹細胞移植後の照射マウスの骨髄および脾臓のｍＮＧ＋Ｌｉｎ－細胞集団のマーカー発現に基づくクラスタリングの結果を示す。 図４Ｂは、造血幹細胞移植後の照射マウスの脾臓（ＳＰ）および骨髄（ＢＭ）に存在する細胞のマーカー発現に基づくクラスタリングの結果の経時変化を示す。 図４Ｃは、造血幹細胞移植後の照射マウスの脾臓（ＳＰ）および骨髄（ＢＭ）に存在する細胞に占めるＣＭＰ、ＭＥＰ、およびＧＭＰの割合の経時変化を示す。 図４Ｄは、造血幹細胞移植後の照射マウスの脾臓（ＳＰ）における各細胞分画の存在量の経時変化を示す。 図５Ａは、培養後のＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）の移植後のＩＶＩＳ像の経時変化を示す。 図５Ｂは、培養後のＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）における骨髄中のｍＮＧ＋細胞数を示す。 図５Ｃは、培養後のＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）における骨髄中のＣＭＰの割合を示す。 図６は、培養後のＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）におけるＨｂ値およびＧｒ１／Ｍａｃ１陽性細胞数の推移を示す。 図７Ａは、図７Ｂの実験のスキームを示す。 図７Ｂは、ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）にそれぞれ由来する末梢血細胞の割合の経時変化を示す。 図８Ａは、培養後のＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射マウスの移植１２週後の造血幹細胞分画から得られたＣＭＰ、ＭＥＰまたはＧＭＰを照射Ｂ６マウスにさらに移植するスキームを示す。 図８Ｂは、培養後のＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞を移植した照射マウスの移植１２週後の骨髄細胞の分析結果を示す。 図８Ｃは、ＣＭＰ、ＭＥＰ、またはＧＭＰを移植された照射Ｂ６マウスの移植後のＩＶＩＳ像を示す。 図８Ｄは、図８Ｃは、ＣＭＰ、ＭＥＰ、またはＧＭＰを移植された照射Ｂ６マウスの移植後のＩＶＩＳ像におけるシグナル強度の経時変化を示す。 図８Ｅは、ＣＭＰ、ＭＥＰ、またはＧＭＰを移植された照射Ｂ６マウスの移植後の脾臓の細胞のマーカー発現の分析結果を示す。 図８Ｆは、ＣＭＰ、ＭＥＰ、またはＧＭＰを移植された照射Ｂ６マウスの移植４週間後の末梢血における移植細胞の割合を示す。 図９Ａは、全血を照射マウスに投与してその後解析するスキームを示す。 図９Ｂは、脾臓（ＳＰ）および骨髄（ＢＭ）におけるＣＭＰの割合を示す。 図９Ｃは、末梢血（ＰＢ）、脾臓（ＳＰ）および骨髄（ＢＭ）におけるＣＭＰ、ＭＥＰ、およびＧＭＰの割合を示す。 図１０Ａは、培養したＡｋａｌｕｃ陽性造血幹細胞の分析結果を示す。 図１０Ｂは、培養により得られたＣＭＰ（以下「ｅｘＣＭＰ」という）とＧＭＰ（以下「ｅｘＧＭＰ」という）ｅｘＧＭＰを照射マウスに移植した後のＩＶＩＳ像を示す。 図１０Ｃは、ｅｘＣＭＰまたはｅｘＧＭＰを移植されたマウスのＩＶＩＳ像におけるシグナル強度の経時変化を示す。 図１０Ｄは、ｅｘＣＭＰまたはｅｘＧＭＰを移植されたマウスの移植後の脾臓の細胞のマーカー発現を分析した結果を示す。 図１０Ｅは、各細胞分画を移植した照射マウスの脾臓におけるＧｒ１／Ｍａｃ１陽性細胞数またはＴｅｒ１１９＋細胞数を示す。 図１０Ｆは、ｅｘＣＭＰを移植した照射マウスの末梢血におけるｅｘＣＭＰ由来の細胞の割合を示す。 図１１Ａは、Ａｋａｌｕｃ陽性ｅｘＣＭＰを移植した照射マウスのＩＶＩＳ像を示す。 図１１Ｂは、Ａｋａｌｕｃ陽性ｅｘＣＭＰを移植した照射マウスの移植２４時間後の脾臓、骨髄、および末梢のシグナル強度を示す。 図１１Ｃは、Ａｋａｌｕｃ陽性ｅｘＣＭＰを移植した照射マウスの移植２４時間後の脾臓および骨髄における移植細胞の割合を示す。 図１１Ｄは、Ａｋａｌｕｃ陽性ｅｘＣＭＰを移植した照射マウスの移植２４時間後の脾臓（ＳＰ）、骨髄（ＢＭ）、および末梢血（ＰＢ）における移植細胞の割合を示す。 図１２Ａは、ｃＫｉｔ陽性細胞をｃＫｉｔ　ｂｕｌｋ　ｃｕｌｔｕｒｅシステムにより培養して得られる培養物中のＣＭＰの分析結果を示す。 図１２Ｂは、ｃＫｉｔ陽性細胞をｃＫｉｔ　ｂｕｌｋ　ｃｕｌｔｕｒｅシステムにより培養して得られる培養物中のＣＭＰの数の経時変化を示す。 図１３Ａは、ｆｒｅｓｈＣＭＰ（ｆＣＭＰ）とｅｘＣＭＰにおける遺伝子発現の相違を示す。 図１３Ｂは、ｆｒｅｓｈＣＭＰ（ｆＣＭＰ）とｅｘＣＭＰ中のＤＰＰ４発現を分析したフローサイトメトリの結果を示す。 図１３Ｃは、ｆｒｅｓｈＣＭＰ（ｆＣＭＰ）とｅｘＣＭＰのＤＰＰ４活性の測定結果を示す。 図１４Ａは、ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞とｅｃＣＭＰと骨髄細胞との混合物を移植された照射マウスのＩＶＩＳ像を示す。 図１４Ｂは、ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞とｅｃＣＭＰと骨髄細胞との混合物を移植された照射マウスのＩＶＩＳ像からのシグナル強度の経時変化を示す。 図１４Ｃは、ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞とｅｃＣＭＰと骨髄細胞との混合物を移植された照射マウスの移植３日後のＩＶＩＳ像を示す。 図１４Ｄは、ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞とｅｃＣＭＰの混合物を移植された照射マウスの移植後の照射マウスの末梢血におけるＨｂ、Ｇｒ１／Ｍａｃ１陽性細胞数、および血小板（ＰＬＴ）の量の経時変化を示す。 図１４Ｅは、ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋のＡｋａｌｕｃ発現造血幹細胞とｅｃＣＭＰの混合物を移植された照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）におけるＨｂ、Ｇｒ１／Ｍａｃ１陽性細胞数、および血小板（ＰＬＴ）の経時変化を示す。 図１５Ａは、致死的放射線照射マウスに対してｅｘＣＭＰを１週間毎に定期投与する実験のスキームを示す。 図１５Ｂは、ｅｘＣＭＰを１週間毎に定期投与された照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）、並びに投与無しの照射脾臓非摘出マウスの生存曲線を示す。 図１５Ｃは、ｅｘＣＭＰを１週間毎に定期投与された照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）の生存曲線を示す。 図１５Ｄは、ｅｘＣＭＰを１週間毎に定期投与された照射脾臓非摘出マウス（ＷＴ）と照射脾臓摘出マウス（ＳＰｅｘ）の１０日目のＧｒ１／Ｍａｃ１陽性細胞数、Ｈｂ、および血小板（ＰＬＴ）数を示す。 図１６Ａは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＭＨＣクラスＩの細胞表面発現のノックアウト実験の結果を示す。 図１６Ｂは、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現をノックアウトしたｅｘＣＭＰ（ＵＮ　ｅｘＣＭＰ）を移植された同種異系照射マウスの移植５日目のＩＶＩＳ像を示す。 図１６Ｃは、野生型（ＷＴ）またはＭＨＣクラスＩの細胞表面発現をノックアウトしたｅｘＣＭＰ（ＵＮ　ｅｘＣＭＰ）を移植された同種異系照射マウスの７日目の脾臓のシグナル強度、および７日目の脾臓中のｍＮＧ＋細胞数を示す。 図１６Ｄは、照射マウスに対して野生型（ＷＴ）またはＭＨＣクラスＩの細胞表面発現をノックアウトしたｅｘＣＭＰ（ＵＮ　ｅｘＣＭＰ）、および骨髄細胞を投与する投与スキームとこのスキームで処置されたマウスの生存曲線と、移植４週後の末梢血におけるキメリズム解析の結果を示す。 図１７Ａは、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを投与された照射マウスの移植後のＩＶＩＳ像を示す。 図１７Ｂは、図１７Ａは、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを投与された照射マウスの移植後のＩＶＩＳ像におけるシグナル強度の経時変化を示す。 図１７Ｃは、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを投与された照射マウスの移植７日後の脾臓におけるｍＮＧ＋細胞数を示す。 図１７Ｄは、ＣＭＰおよびｅｘＣＭＰを同数投与され、ＧＣＳＦをさらに等された照射マウスの７日後の脾臓におけるＣＭＰおよびｅｘＣＭＰの割合を示す。 図１８は、ｍＮＧ＋のＣＭＰ、ＭＥＰ、ＧＭＰ、ｃＣＭＰ（ｅｘＣＭＰ）、またはｃＧＭＰ（ｅｘＧＭＰ）を投与された照射マウスの移植７日後の脾臓におけるＴｅｒ１１９＋細胞数およびＧｒ１／Ｍａｃ１＋細胞の数を示す。 図１９は、ヒトＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを移植された照射マウスの移植７日目の脾臓におけるヒトＣＭＰ数および造血幹細胞（ＨＳＣ）数を示す。 図２０Ａは、ヒトＣＭＰのインビトロでの培養における細胞数変化を示す。 図２０Ｂは、培養物中のヒトＣＭＰの存在を示す。 図２０Ｃは、培養物中のヒトＣＭＰにおけるＩＴＧＡ４の発現、およびＤＰＰ４の発現を示す。 図２０Ｄは、培養したヒトＣＭＰを移植したＮＯＧマウスにおける血液細胞の増殖を示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「対象」とは、哺乳類、例えば、ヒトなどの霊長類；マウス、ラット、およびハムスターなどの齧歯類；イヌおよびネコなどの食肉類；ウマ、ロバおよびラバなどの奇蹄類；ウシ、ブタ、ラマ、アルパカ、ヤギおよびヒツジなどの偶蹄類であり得る。本明細書では、細胞は、哺乳類、例えば、ヒトなどの霊長類；マウス、ラット、およびハムスターなどの齧歯類；イヌおよびネコなどの食肉類；ウマ、ロバおよびラバなどの奇蹄類；ウシ、ブタ、ラマ、アルパカ、ヤギおよびヒツジなどの偶蹄類の細胞であり得、好ましくは、ヒト細胞またはマウス細胞であり得る。
　本明細書では、「レシピエント」とは、造血幹細胞移植を受ける対象をいう。本明細書では、「ドナー」とは、造血幹細胞移植用の細胞を提供する対象をいう。通常、造血幹細胞移植は、同種異系間で行われる。近年では、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ、ヒトの場合はＨＬＡ）を欠損させることによって、同種異系間の移植を容易にする技術が開発されている。このようにして得られる細胞をユニバーサル細胞という。
　本明細書では、「造血幹細胞」とは、血球系細胞に分化することができる幹細胞である。造血幹細胞は、骨髄、さい帯、胎盤、および末梢血から採取することができる。ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性の細胞である。ヒトにおいて、造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性の細胞分画（「造血幹細胞分画」ともいう）に多く含まれていることが知られている。従って、ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性であり得る。造血幹細胞は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞をエクスビボで分化させて得られる細胞であってもよい。マウスでは、造血幹細胞はＫＳＬ細胞であり得る。ＫＳＬ細胞は、ｃ－ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎｅａｇｅ－として特徴付けられる。
　本明細書では、「血球系細胞」とは、造血幹細胞および造血幹細胞が分化して生じる細胞である。血球系細胞は、分化段階に応じて、造血幹細胞、造血前駆細胞、および血液細胞に大別される。造血幹細胞は、造血前駆細胞を経て血液細胞に分化する。より具体的には、造血幹細胞は、リンパ芽球を経てリンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）に分化し得る。造血幹細胞はまた、造血前駆細胞および単芽球を経て単球に分化し得る。造血幹細胞はまた、造血前駆細胞、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）、顆粒球／単球系前駆細胞（ＧＭＰ）を経て好中球、好酸球もしくは好塩基球などの顆粒球系白血球、またはマクロファージに分化し得る。造血幹細胞はまた、造血前駆細胞、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）、赤芽球／巨核球系前駆細胞（ＭＥＰ）を経て赤血球に分化し得る。造血幹細胞はまた、造血前駆細胞、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）、巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、巨核球を経て血小板に分化し得る。これらの造血幹細胞から分化して生じる細胞はすべて血球系細胞である。
　本明細書では、「骨髄球性共通前駆細胞」（ＣＭＰ）とは、顆粒球系白血球、マクロファージ、赤血球、および血小板への分化能を有する幹細胞である。ＣＭＰは、造血幹細胞分画に含まれうる。したがって、ＣＭＰは、造血幹細胞分画からＣＭＰのマーカー発現に基づいて取得することができる。例えば、ヒトＣＭＰは、造血幹細胞分画のうち、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ＲＡ－細胞として特徴付けられる。なお、ヒトＧＭＰは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞として特徴付けられる。また、ヒトＭＥＰは、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３－ＣＤ４５ＲＡ－細胞として特徴付けられる。ヒトＧＭＰおよびＭＥＰもそれぞれ、これら細胞に発現するマーカーに基づいて造血幹細胞分画から取得できる。マウスＣＭＰは、Ｌｉｎ－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１－ＦｃｇＲ－ＣＤ３４＋細胞として特徴付けられる。
　本明細書では、「エクスビボ」とは、生体外を意味する。本明細書では、エクスビボはインビボ（生体内）との対比で用いられ、生体内に存在する細胞を生体内から生体外に取り出した状態を意味する。培養は、エクスビボで行われ得るものである。
　本明細書では、「陽性」は、その直前に存在する用語で特定される分子を細胞が発現していると認められることを意味する。陽性とは、陰性対照と比較して有意差をもって発現していることを意味する。本明細書では、「陽性」を単に「＋」と表記することがある。本明細書では、「陰性」は、その直前に存在する用語で特定される分子を細胞が発現していないと認められることを意味する。陰性とは、陰性対照と比較してその発現に有意差がないか、発現していないことを意味する。本明細書では、「陰性」を単に「－」と表記することがある。
　本明細書では、「ポリビニルアルコール」（ＰＶＡ）とは、ビニルアルコールの重合体を意味する。ポリビニルアルコールは、酢酸ビニルモノマーを重合させて得られるポリ酢酸ビニルをケン化して得ることができる。ポリビニルアルコールの重量平均分子量（ＭW）は、例えば、１ｋＤａ～２０ｋＤａ、３ｋＤａ～１７ｋＤａ、５ｋＤａ～１５ｋＤａ、または７ｋＤａ～１３ｋＤａとすることができる。上記の方法でポリ酢酸ビニルをケン化してＰＶＡを得る場合には、ケン化率は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９９％以上であり得る。
　本明細書では、「アルブミン」とは、血漿成分として知られるタンパク質である。アルブミンは、血漿タンパク質の６割を占めると言われ、血液、血清および血漿中に大量に存在する。アルブミンは、生体内において血液の浸透圧の維持を担ったり、脂肪酸およびホルモンなどの生体物質と結合してこれらを運搬する働きを担っていると考えられている。造血幹細胞の維持培養においても、血清アルブミンの重要性が知られている。ヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ということがある）は、ヒトの血清アルブミンであり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＡＮ１７８２５．１で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはこれに対応するアミノ酸配列を有するヒト血清アルブミンであり得る。
　本明細書では、「アゴニスト」とは、受容体や酵素等のタンパク質を活性化させる物質をいう。
　本明細書では、「ＰＩ３Ｋ」とは、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼを意味する。ＰＩ３Ｋは、細胞の構成成分であるイノシトールリン脂質をリン酸化する酵素である。リン酸化されて生じるホスファチジルイノシトール３，４，５－三リン酸（ＰＩＰ３）は、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢとしても知られる）をリン酸化し、そのシグナルを下流に伝える。本明細書では、「ＰＩ３Ｋアクチベータ」とは、受容体チロシンキナーゼのアゴニスト、およびＰＩ３Ｋを活性化する物質を意味する。ＰＩ３Ｋアクチベータは、ＰＩ３Ｋに対する選択性を有し得る。
　本明細書では、「ＴＰＯ」とは、トロンボポイエチンを意味する。ＴＰＯは、造血幹細胞から巨核球への分化を担うタンパク質である。ＴＰＯは、造血幹細胞を正式に維持することに関与していることが知られている。ヒトトロンボポイエチンは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＡＢ３３３９０．１で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはこれに対応するアミノ酸配列を有するトロンボポイエチンであり得る。
　本明細書では、「ＴＰＯ受容体アゴニスト」とは、ＴＰＯ以外の物質であって、ＴＰＯ受容体を活性化する物質を意味する。ＴＰＯ受容体アゴニストとしては、ＴＰＯ以外のＴＰＯの変種、ペプチド、およびＴＰＯ受容体を活性化する化合物が挙げられる。本明細書で「化合物」は、有機化合物を包含する概念である。ＴＰＯ受容体アゴニストは、ＴＰＯ受容体に対する選択性を有し得る。
　本明細書では、幹細胞因子（ＳＣＦ）とは、造血機能の初期段階で働く造血細胞成長因子である。ヒト幹細胞因子は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＡＡ８５４５０．１で登録されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはこれに対応するアミノ酸配列を有するＳＣＦであり得る。
　本明細書では、「培養する」とは、細胞をその増殖または維持に適した条件下でインキュベートすることを意味する。インキュベートは、ヒト細胞の場合は、好ましくは、３７℃および５％ＣＯ2雰囲気下において行われ得る。「培養」が増殖を伴う場合は、「培養」は増殖した細胞の生産であると理解される。本明細書では、「培養」は、無血清培地中で行われ得る。本明細書では、「培養」は、化学的に定義された培養培地中（または完全合成培地中）で行われ得る。化学的に定義された培養培地は、無血清培地である。
　本明細書では、「培地」とは、細胞の培養のために用いられる培地を意味する。培地は、基本培地に必要な成分を追加することによって作製され得る。必要な成分とは、ｐＨ調整剤、グルコースなどの糖源、抗生物質（例えば、ペニシリン、およびストレプトマイシンなど）、およびグルタミンなどの必須アミノ酸、並びに、インシュリン、トランスフェリン、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム）およびエタノールアミンなどの培養添加物であり得る。
　本明細書では、「非存在下」とは、直前の用語で特定される成分を実質的に含まないか、含まない環境下を意味する。ここで「実質的」とは、製造工程において避けられない混入、または検出限界以下の混入を除外しない意味で用いられ得る。本明細書では、「含まない」とは、検出限界以上の濃度で含まない、または完全に含まないことを意味する。例えば、血清またはアルブミンの無添加の無血清培地は、アルブミンフリーであり、血清またはアルブミンを含まない。「アルブミンフリー」とは、アルブミンを実質的に含有しないか、含有しないことをいう。また、「サイトカインフリー」とは、サイトカインを実質的に含有しないか、含有しないことをいう。培地は、アルブミンフリーであり得る。培地は、サイトカインフリーであり得る。培地は、アルブミンフリーかつサイトカインフリーであり得る。培地は、好ましくは、無血清培地であり、アルブミンフリーかつサイトカインフリーである。培地は、より好ましくは、化学的に定義された培地であり、アルブミンフリーかつサイトカインフリーである。
　本明細書では、「細胞傷害性」は、培養中に細胞数を減少させる作用または細胞を死滅させる作用を有する性質を意味する。本明細書では、「非細胞傷害性」は、培養により細胞数を減少させない性質をいう。物質によっては、濃度を高めることによって細胞傷害性が生じ得るが、この場合は、細胞傷害性を生じない程度に濃度を低下させても当該物質に期待される作用が発生する場合には、非細胞傷害性であると定義することができる。本明細書では、培地は細胞傷害剤を含まない、または細胞傷害性を有する薬剤を含まないは、細胞傷害剤または細胞傷害性を有する薬剤を細胞傷害性を生じさせるに十分な量含まないことを意味する。したがって、ある薬剤が高濃度では細胞傷害性を有する場合であっても、細胞傷害性を生じさせない濃度で用いられるときには、当該薬剤は細胞傷害剤ではないし、細胞傷害性を有する薬剤ではない。
　本明細書では、「細胞集団」とは、複数の細胞の集団である。細胞集団は、通常は水溶液中に分散している。したがって、細胞集団は、複数の細胞を含む水溶液であって、細胞は水溶液中で分散している水溶液であり得る。水溶液は、細胞の増殖、維持または保存に適した組成を有する。例えば、水溶液は、培養液、生理食塩水等である。細胞集団は、必ずしも１種類の細胞のみを含む形態に限られず、２種類以上の異なる細胞を含む形態を含む。細胞集団は、特定の細胞集団を培養して得られる細胞集団であってもよく、または、生体から得られる培養前の特定の細胞集団であってもよい。細胞集団は、１以上のマーカーの発現に基づいて他の細胞から分離された細胞分画であり得る。上記のような細胞が水溶液中に分散している細胞集団に加えて、当該細胞集団の細胞を沈降させた得られる沈降物の形態の細胞集団や、細胞塊を形成した細胞集団も細胞集団の定義に含まれうる。ＣＭＰを含む細胞集団は、例えば、造血幹細胞分画からマーカー発現に基づいて分離される細胞分画であり得る。また、ＣＭＰを含む細胞集団は、造血幹細胞分画をその培養に適した条件下（例えば、アルブミン非存在下）で培養し、好ましくは増殖させ、その後に得られる培養物からマーカー発現に基づいて分離される細胞分画であり得る。
　ＣＭＰを含む細胞集団は、例えば、造血幹細胞分画（例えば、生体から取り出した培養前の造血幹細胞分画）からＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ＲＡ－であることに基づいて取得することができる。また、培養後のＣＭＰを含む細胞集団は、培養した造血幹細胞分画（例えば、アルブミン非存在下で培養された造血幹細胞分画）からＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ＲＡ－であることに基づいて取得することができる。その他ＣＭＰを含む細胞集団は、ＣＭＰに特徴的なマーカー発現を指標として細胞集団から取得することができる。
　本開示によれば、細胞集団を含む組成物が提供される。本開示によれば、細胞集団は、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含む。本開示によれば、細胞集団は、造血幹細胞分画からＣＭＰを濃縮して得られる細胞集団であり得る。本開示によればまた、細胞集団は、造血幹細胞分画を培養して得られる培養物からＣＭＰを濃縮して得られる細胞集団であり得る。ＣＭＰの濃縮は、細胞集団からＣＭＰのマーカー発現に基づいて行うことができる。上述のように、ＣＭＰの濃縮は、細胞集団からＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ＲＡ－である細胞集団を取得することにより行うことができる。その他ＣＭＰを含む細胞集団は、ＣＭＰに特徴的なマーカー発現を指標として細胞集団から濃縮することができる。
　本開示によればまた、細胞集団を含む組成物であって、前記組成物はＣＭＰを含み、前記ＣＭＰは、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡ４、ＤＰＰ４、ＭＰＯ、ＣＥＢＰＡ、およびＧＡＴＡ１からなる群から選択される１以上または全てのマーカー遺伝子の発現が下方制御されている、組成物が提供される。前記ＣＭＰは、ある態様では、生体中の造血幹細胞分画に含まれるＣＭＰと比較して、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡ４、ＤＰＰ４、ＭＰＯ、ＣＥＢＰＡ、およびＧＡＴＡ１からなる群から選択される１以上または全てのマーカー遺伝子の発現が下方制御されている。下方制御は、生体中の造血幹細胞分画に含まれるＣＭＰにおける発現量の約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、または１０％以下の発現量への下方制御であり得る。また、ある態様では、ＣＭＰは、ＤＰＰ４陰性であり得る。ある態様では、ヒトＣＭＰ（特にヒトｅｘＣＭＰ）は、生体中の造血幹細胞分画に含まれるＣＭＰと比較して低いＤＰＰ４発現を示す。発現は、マーカーに結合する抗体を用いたフローサイトメトリにより確認することができる。ある態様では、ヒトＣＭＰ（特にヒトｅｘＣＭＰ）を含む培養物または組成物は、ＤＰＰ４陰性のヒトＣＭＰを含む。
　本開示によればまた、細胞集団を含む組成物であって、前記組成物はｅｘＣＭＰを含む。ｅｘＣＭＰは、種々の方法により取得することができる。本開示によればまた、細胞集団を含む組成物であって、前記組成物はＣＭＰを含み、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、血清アルブミンフリーの培地中で増殖したものである、組成物が提供される。骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）またはｅｘＣＭＰは、その培養または増殖に適した条件下で培養または増殖される。増殖は、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、３００倍以上、４００倍以上、５００倍以上、６００倍以上、７００倍以上、８００倍以上、９００倍以上、１０００倍以上、２０００倍以上、３０００倍以上、４０００倍以上、５０００倍以上、６０００倍以上、７０００倍以上、８０００倍以上、９０００倍以上、または１００００倍以上の増殖である。アルブミン非存在下で増殖したＣＭＰは、ＣＭＰと比較して下記に示されるような様々な利点を有し得る。
　ある態様では、ＣＭＰは、生体中の造血幹細胞分画に含まれるＣＭＰ（生体の対照）と比較して、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡ４、ＤＰＰ４、ＭＰＯ、ＣＥＢＰＡ、およびＧＡＴＡ１からなる群から選択される１以上または全てのマーカー遺伝子の発現が下方制御されているか、実質的に発現していない、または発現していない。また、ある態様では、ＣＭＰは、生体の対照と比較して下方制御されたＤＰＰ４発現を示すか、好ましくはＤＰＰ４陰性であり得る。ある態様では、ＣＭＰは、ＤＰＰ４活性を実質的に有しないか、有しない。ここで、発現および活性の文脈における用語「実質的」は、例えば、有意差が生じない程度の差を許容する。したがって、実質的に発現しないは、発現をしていたとしても、その発現は、例えばバックグラウンドレベルであるとか、陰性対照と有意差を生じないレベルでの発現である。
　ある態様では、ＣＭＰは、骨髄から取得された培養前のＣＭＰ（ｆｒｅｓｈＣＭＰ）と比較して、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）に対してより応答性である。ＧＣＳＦは、顆粒球の分化および増殖を促進する作用を有し、特に好中球に対する増加作用などの様々な作用を示す。ＧＣＳＦへの応答性は、例えば、顆粒球の分化および増殖を促進する作用、特に好中球に対する増加作用への応答性である。
　ある態様では、ＣＭＰは、骨髄から取得された培養前のＣＭＰ（ｆｒｅｓｈＣＭＰ）と比較して、致死量放射線照射マウスに移植されると、より早期に造血系を立ち上げることができる。ある態様では、ＣＭＰは、骨髄から取得された培養前のＣＭＰ（ｆｒｅｓｈＣＭＰ）と比較して、致死量放射線照射マウスに移植されると、より脾臓で多くの造血細胞を産生するまたは当該産生を促進することができる。
　ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、ＣＭＰを含む細胞集団を培養して得られる培養物から取得することもできるが、好ましくは、造血幹細胞分画を培養して得られる培養物から取得することができる。ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、持続的に造血幹細胞から供給されるために、造血幹細胞存在下で培養した方が大量に取得できると考えられるためである。マウスおよびヒト造血幹細胞をインビトロで培養する手法が開発されている。例えば、ＷＯ２０２１／０４９６１７ＡおよびＷＯ２０２１／１４９７９９Ａでは、造血幹細胞をアルブミン非存在下で培養する手法が開発され、これによってマウスおよびヒトの造血幹細胞をインビトロで大量に調製することが可能となっている。ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰ自体もアルブミン非存在下で、造血幹細胞の培養と同じ条件下で培養することができ、かつ増殖させることもできる。好ましい態様では、造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含む培地中で良好に培養または増殖することができる。造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、例えば、アルブミン非存在下でポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含む培地中で培養または増殖することができる。ある態様では、培地は、ｐＨ７～ｐＨ７．５である。ある態様では、培地は、ｐＨ７．３～７．５である。ある態様では、培地は、ｐＨ７．１～７．３（例えば、約ｐＨ７．２）である。
　ある態様では、修飾ポリアルキレングリコールは、例えば、修飾ポリエチレングリコールであり得る。修飾ポリアルキレングリコールまたは修飾ポリエチレングリコールは、好ましくは、ポリビニルカプロラクタムブロックおよびポリビニルアセタートブロックの共重合体により修飾されていることができる。ある態様では、修飾ポリアルキレングリコールは、ポリビニルカプロラクタムブロックおよびポリビニルアセタートブロックの共重合体により修飾されたポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）である。ある好ましい態様では、修飾ポリアルキレングリコールは、以下式（Ｉ）を有し得る：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 ｛式中、ｎは、５～５０のいずれかの自然数であり、ｍは、１０～１００のいずれかの自然数であり、ｌは、１０～２００のいずれかの自然数である。｝
　ある態様では、ｎは、５～２０、または好ましくは１０～２０のいずれかの自然数であり、ｍは、２０～５０、または好ましくは３０～４０のいずれかの自然数であり、ｌは、３０～１００、または好ましくは５０～６０のいずれかの自然数であり得る。ある好ましい態様では、ｎは約１３であり、ｍは約３０であり、ｌは約５７である。このような化合物としては、Ｓｏｌｕｐｌｕｓ（商標）が挙げられる。ある態様では、培地は、ｐＨ７．１～７．３（例えば、約ｐＨ７．２）である。このｐＨ範囲では、上記化合物による溶液の白濁を低減または消失させ得る。
　造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、例えば、アルブミン非存在下でポリビニルアルコールまたは式（Ｉ）の化合物を含む培地中で培養または増殖することができる。造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを培養または増殖するための培地は、造血幹細胞の培養に適したものを適宜用いることができる。基礎培地としては、Ｓ－ｃｌｏｎｅ　ＳＦ－３培地、Ｆ１２培地、ＳｔｅｍＳｐａｎまたはＳｔｅｍＳｐａｎ　ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＴＥＭα（ＳＴＥＭ　ＡＬＰＨＡ）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４無血清培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｔｅｍＰｒｏ　ＭＳＣ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、ＨＳＣ－ＣＦＵ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｓ－Ｃｌｏｎｅ無血清培地（ＳＦ－０２、ＳＦ－０３、ＣＭ－Ｂ、ＳＦ－Ｂ）（三光純薬）、ＨＰＧＭ培地（三光純薬）、ＡＩＭ　Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、Ｍａｒｒｏｗ　ＭＡＸ骨髄培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ造血幹細胞増殖培地（Ｓｉｇｍａ）、ＳＹＮ無血清培地（ＳＹＮ　Ｈ、ＳＹＮ　Ｂ）（ＡｂＣｙｓ　ＳＡ）、ＳＰＥ　ＩＶ培地（ＡｂＣｙｓ　ＳＡ）、ＭｙｅｌｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＨＰＧ無血清培地（Ｌｏｎｚａ）、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ培地（Ｌｏｎｚａ）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＭＥＭα（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、ＰＲＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ他）、Ｈａｍ　Ｆ－１２培地（Ｇｉｂｃｏ他）、ＲＤ培地等を用いることができる。培養培地は、基礎培地を含む。培養培地は、例えば、インスリン、トランフフェリン（アポ）、亜セレン酸ナトリウム、およびエタノールアミンから選択される１以上、または全てを含んでいてもよい。培養培地は、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、ビタミン類、アミノ酸類、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸等を含んでいてもよい。培養培地は、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）を含んでいてもよい。培養培地は、グルタミンを含んでいてもよい。培養培地は、例えば、インスリン、トランフフェリン（アポ）、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、および抗生物質を含んでいてもよく、さらにＨＥＰＥＳを含んでいてもよい。また、ある態様では、培地は、Ｓｏｌｕｐｌｕｓ、ＳＲ１、ニコチンアミド、およびＰＶＡからなる群から選択される１以上の成分を含み得、その含有量は、好ましくは有効量であり得る。ある態様では、培地は、Ｓｏｌｕｐｌｕｓ、ＳＲ１、ニコチンアミド、およびＰＶＡからなる群から選択される１以上の成分を含み得、その含有量は、好ましくは有効量であり得、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ６、およびＦｌｔ３Ｌからなる群から選択される１以上または全ての成分をさらに含み得、その含有量は、好ましくは有効量であり得る。ある態様では、培地は、血清を含み得、その含有量は、好ましくは有効量であり得る。ある態様では、培地はアルブミンを含み得、その含有量は、好ましくは有効量であり得る。ある態様では、培地は、無血清培地であり得る。ある態様では、培地は、アルブミンフリーの培地であり得る。ある態様では、培地は、アルブミンフリーかつサイトカインフリーの培地であり得る。アルブミンおよび／またはサイトカインは、他の成分により部分的にまたは完全に置き換えられ得る。
　培地は、ＳＣＦ（組換えＳＣＦであってもよい）を含んでいてもよい。ＳＣＦは、例えば、哺乳動物のＳＣＦであり得、組換えヒトＳＣＦであり得る。本発明のある態様では、ＳＣＦ濃度は、１～２００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１～１５０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、１～１００ｎｇ／ｍＬであり、例えば、１～５０ｎｇ／ｍＬであり、さらにより好ましくは、１～３０ｎｇ／ｍＬであり、さらにより好ましくは、１～２０ｎｇ／ｍＬであり、例えば、５～１５ｎｇ／ｍＬであり得る。
　培地は、ＴＰＯを含んでいてもよい。ＴＰＯは、例えば、哺乳動物の組換えＴＰＯであり得、組換えヒトＴＰＯであり得る。本発明のある態様では、ＴＰＯ濃度は、２０～２００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは３０～１５０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、４０～１５０ｎｇ／ｍＬであり、例えば、１００ｎｇ／ｍＬとすることができる。
　培地は、ＳＣＦとＴＰＯを含んでいてもよい。この態様では、ＴＰＯ濃度は、２０～２００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは３０～１５０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、４０～１５０ｎｇ／ｍＬであり、例えば、１００ｎｇ／ｍＬであり得、かつ、ＳＣＦ濃度は、１～２００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１～１５０ｎｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは、１～１００ｎｇ／ｍＬであり、例えば、１～５０ｎｇ／ｍＬであり、さらにより好ましくは、１～３０ｎｇ／ｍＬであり、さらにより好ましくは、１～２０ｎｇ／ｍＬであり、例えば、５～１５ｎｇ／ｍＬであり得る。ある好ましい態様では、本発明の培養方法で用いられる培地は、４０～１５０ｎｇ／ｍＬの組換えＴＰＯと１～５０ｎｇ／ｍＬの組換えＳＣＦを含んでいてもよい。ある好ましい態様では、本発明の培養方法で用いられる培地は、ＴＰＯ濃度がＳＣＦ濃度よりも高く、例えば、例えば、上記の濃度範囲に含まれる何れかの濃度であってよく、かつ、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、または１０倍以上高くてもよい。
　造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、好ましくはサイトカインフリーで培養されうる。この場合、培地は、サイトカインを実質的に含まないか、全く含まない。ここで実質的に含まないとは、細胞の単離工程および培養工程において除去することができないレベルのサイトカインを培地が含むことを許容する。また、実質的に含まないとは、検出限界以下のサイトカインを培地が含むことを許容する。ＳＣＦおよびＴＰＯは、代表的なサイトカインである。
　造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、好ましくはアルブミンフリーで培養されうる。この場合、培地は、アルブミンを実質的に含まないか、全く含まない。ここで実質的に含まないとは、細胞の単離工程および培養工程において除去することができないレベルのアルブミンを培地が含むことを許容する。また、実質的に含まないとは、検出限界以下のアルブミンを培地が含むことを許容する。
　造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、好ましくはアルブミンフリー、かつサイトカインフリーで培養されうる。この場合、培地は、アルブミンおよびサイトカインのいずれも実質的に含まないか、全く含まない。
　好ましいある態様では、造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、非細胞傷害性のＰＩ３Ｋアクチベータの有効量を含む培地で培養されうる。特に、ヒト造血幹細胞およびヒトＣＭＰまたはヒトｅｘＣＭＰは、非細胞傷害性のＰＩ３Ｋアクチベータの有効量を含む培地で培養されることが好ましい。これにより、ヒト造血幹細胞およびヒトＣＭＰまたはヒトｅｘＣＭＰは、アルブミンが低減された条件下またはアルブミン非存在下においても、良好な増殖を示すことができる。ＰＩ３Ｋアクチベータとしては、非細胞傷害性である限り、種々のＰＩ３Ｋアクチベータを用いることができるが、好ましい一例として例えば、７４０Ｙ－Ｐが挙げられる。ある好ましい態様では、培地は、ＰＩ３Ｋアクチベータの有効量を含み、組織因子（ＳＣＦ）を実質的に含まないか、または含まない。ある好ましい態様では、培地は、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）受容体アゴニストの有効量を含み得る。ある好ましい態様では、ＴＰＯ受容体アゴニストとしては、非細胞傷害性である限り、種々のＴＰＯ受容体アゴニストを用いることができるが、好ましい一例としては例えば、ブチザミドであり得る。ある好ましい態様では、培地は、ＴＰＯ受容体アゴニストの有効量を含み、ＴＰＯを実質的に含まないか、または含まない。ある好ましい態様では、培地は、ＰＩ３Ｋアクチベータの有効量と、ＴＰＯ受容体アゴニストの有効量を含む。ある好ましい態様では、培地は、ＰＩ３Ｋアクチベータの有効量と、ＴＰＯ受容体アゴニストの有効量を含み、ＳＣＦおよびＴＰＯのいずれかまたは両方を実質的に含まないか、含まない。ある好ましい態様では、培地は、サイトカインフリーの培地であり得る。ある好ましい態様では、培地は、アルブミンフリーであり、かつ、サイトカインフリーの培地であり得る。ある好ましい態様では、培地は、無血清培地であり、または化学的に定義された培地であり得る。ある好ましい態様では、培地は、アルブミンフリーであり、かつ、サイトカインフリーの無血清培地または化学的に定義された培地であり得る。
　ある好ましい態様では、培地は、４－Ｎ－［２－ベンジル－７－（２－メチルテトラゾール－５－イル）－９Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－４－イル］シクロヘキサン－１，４－ジアミン（以下、「ＵＭ１７１」ともいう）をさらに含んでいてもよい。ＵＭ１７１をさらに含む培地中では、巨核球系列の細胞への分化が抑制され、造血幹細胞の増殖が向上する。
　本開示では、造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、それぞれの培養に適した条件（特に造血幹細胞の培養に適した条件）下で培養または増殖されうる。本開示では、造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを培養するインビトロの方法であって、造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰをその培養に適した培地において培養することを含む、方法が提供される。培地は、ある好ましい態様では、アルブミンを実質的に含まないか、含まない。培地は、ある好ましい態様では、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含む。培地は、ある好ましい態様では、ＰＩ３Ｋアクチベータをさらに含む。培地はある好ましい態様では、ＳＣＦを実質的に含まないか、含まない。培地は、ある好ましい態様では、ＴＰＯ受容体アゴニストを含む。培地は、ある好ましい態様では、ＴＰＯを実質的に含まないか、含まない。ある好ましい態様では、培地は、アルブミンを実質的に含まないか、含まず、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含み、ＰＩ３Ｋアクチベータをさらに含む。ある好ましい態様では、培地は、アルブミンを実質的に含まないか、含まず、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含み、ＰＩ３Ｋアクチベータをさらに含み、サイトカインを実質的に含まないか、含まない。培養は、フィブロネクチン存在下で行われ得る。本発明の培養方法では、造血幹細胞とフィブロネクチンとが接触可能な条件下で行われ得る。培養は、本発明の培養方法では、好ましくは、例えば、培養容器の内側（例えば、底面）がフィブロネクチンでコーティングされている。本開示では、造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、培養開始時から１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、３００倍以上、４００倍以上、または５００倍以上に増殖させることを含み得る。本開示では、培養物から造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを単離することができる。造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰの単離は、それぞれに特徴的なマーカー発現に基づいて、例えば、フローサイトメトリなどの当業者に周知の技術を用いて単離することができる。
　造血幹細胞移植では、造血幹細胞の移植から造血系の立ち上がりに時間がかかることが問題とされている。すなわち、造血幹細胞移植を受ける対象（レシピエントという）は、造血幹細胞移植前に自己の造血系を化学的にまたは照射線照射による処置（移植前処置）を受けレシピエント体内から免疫細胞や造血系を除去する。これにより、レシピエントにおいて移植した造血幹細胞から造血系が構築されることを期待しているのである。移植前処置を受けたレシピエント体内では、造血ができず、したがって、早期に造血系（特に、赤血球、マクロファージ、血小板、または好中球等）を立ち上げることが極めて重要である。しかしながら、造血幹細胞移植による造血系の立ち上がりには時間を要する。これに対して、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、造血幹細胞よりも早期に造血系（例えば、赤血球、マクロファージ、血小板、または好中球等）の立ち上がりを支持する、または造血系を構築する。レシピエントに投与されたＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、レシピエント体内で、Ｔ細胞およびＢ細胞以外の造血細胞を産生しうるが、レシピエント体内で、Ｔ細胞およびＢ細胞以外の造血細胞を産生しうる。ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを投与されたレシピエントは、早期に造血系（例えば、赤血球、マクロファージ、血小板、または好中球等）を体内で立ち上げることができ、造血幹細胞移植の安全性を向上させることができる。したがって、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、造血幹細胞移植の前、それと同時に、またはその後にレシピエントに投与することができる。ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、好ましくは、造血幹細胞移植の前に、または造血幹細胞移植と同時にレシピエントに投与され得る。ｅｘＣＭＰは、ｆｒｅｓｈＣＭＰ（培養前ＣＭＰ）と比較して造血細胞誘導能が高い。ｅｘＣＭＰはまた、ｆｒｅｓｈＣＭＰと比較して造血系（例えば、赤血球、マクロファージ、血小板、または好中球等）を早期に立ち上げる能力を有する。したがって、ｅｘＣＭＰは、造血幹細胞移植の際にレシピエントに好ましく投与されうる。レシピエントに投与されたＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、早期の造血系（例えば、赤血球、マクロファージ、血小板、または好中球等）の立ち上がりを支持する、または造血系を構築する一方で、レシピエントの体内から除去されるため、長期にレシピエントに生着することがない。そのため、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、早期かつ一時的にレシピエント体内で造血系（例えば、赤血球、マクロファージ、血小板、または好中球等）を構築するためにレシピエントに投与され得る。ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、レシピエント体内で一時的に造血系を構築すれば十分であり、したがって、レシピエントと同種異系の関係の細胞であってもよいが、好ましくは、同種同系であるか、またはより好ましくは、後述するように、ユニバーサル化された同種異系の細胞である。
　本開示では、レシピエントは、移植前処置後に、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを１回または複数回投与することにより、生命維持がなされ得る。ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、一時的な造血を支持するに過ぎないが、複数回投与することにより、長期にわたってレシピエント体内の造血系を支持し、レシピエントの生命を維持することができる。このように、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、移植前処置を受けたレシピエントの生存を補助するまたは生命を維持するために用いられ得る。
　本開示では、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、好ましくは、ユニバーサル化されている。ユニバーサル化とは、ＭＨＣまたはＨＬＡの一部を除去すること等により、免疫拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの免疫疾患の発生を抑える加工である。ユニバーサル化は、ＭＨＣまたはＨＬＡの一部の発現を喪失させることによりなされ得る。ＭＨＣまたはＨＬＡの一部の発現の喪失は、例えば、β－2－マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のノックアウトにより達成され得る。本開示によれば、ユニバーサル化されたＣＭＰまたはｅｘＣＭＰが提供され得る。本開示によれば、β－2－マイクログロブリンがノックアウトされ、ＭＨＣまたはＨＬＡの一部の発現が喪失したＣＭＰまたはｅｘＣＭＰが提供され得る。
　本開示によれば、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、脾臓において造血細胞を生じさせる。したがって、本開示では、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、脾臓における造血を誘導することができる。本開示では、好ましくは、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、ＣＸＣＲ４をノックアウトまたはノックダウンされている。ＣＸＣＲ４をノックアウトまたはノックダウンされているＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、脾臓におけるＣＭＰまたはｅｘＣＭＰの増殖の活性を向上させることができると期待される。本開示によれば、ＣＸＣＲ４をノックアウトまたはノックダウンされたＣＭＰまたはｅｘＣＭＰが提供され得る。
　ある好ましい態様では、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰは、ユニバーサル化され、かつ、ＣＸＣＲ４をノックアウトまたはノックダウンされている。本開示によれば、ユニバーサル化され、ＣＸＣＲ４をノックアウトまたはノックダウンされたＣＭＰまたはｅｘＣＭＰが提供され得る。本開示によれば、β－2－マイクログロブリンがノックアウトされ、ＭＨＣまたはＨＬＡの一部の発現が喪失し、かつ、ＣＸＣＲ４をノックアウトまたはノックダウンされたＣＭＰまたはｅｘＣＭＰが提供され得る。
　本開示によれば、これらのＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを含む組成物が提供される。この組成物は、移植前処置を受けたレシピエントに投与され得る。この組成物は、移植前処置を受けたレシピエントの体内における造血系の立ち上がりを支持することに用いられ得る。この組成物は、移植前処置を受けたレシピエントの生命の維持に用いられ得る。
　ある態様では、培地は、
　ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含み、かつ、
　（１）ＰＩ３Ｋアクチベータと、ＴＰＯおよびＴＰＯ受容体アゴニストからなる群から選択される１以上とを含む；
　（２）ＳＣＦおよびＰＩ３Ｋアクチベータからなる群から選択される１以上と、ＴＰＯ受容体アゴニストとを含む；または
　（３）ＰＩ３ＫアクチベータとＴＰＯ受容体アゴニストとを含む、
培地であり得る。培地は好ましくは、アルブミンを実質的に含まないか、含まない。培地は好ましくは、サイトカインを実質的に含まないか、含まない。培地は好ましくは、無血清培地またはより好ましくは化学的に定義された培地である。培地は、例えば、ヒトの造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰの増殖または培養に適している。培地はまた、例えば、造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰの増殖または培養用の培地であり得る。
　本開示によれば、造血幹細胞およびＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを培養する方法が提供される。上記細胞は、上記いずれかに記載の培地中でその培養に適した条件下で培養され得る。培養により、造血幹細胞およびｅｘＣＭＰが増加し得る。培養後の造血幹細胞およびｅｘＣＭＰを含む培養物から、例えば、ｅｘＣＭＰを単離することができる。ｅｘＣＭＰの単離は、ＣＭＰに特徴的なマーカー発現に基づいて例えばフローサイトメトリを用いて行うことができる。
　本開示によれば、ＣＭＰまたはｅｘＣＭＰを製造する方法であって、造血幹細胞分画に含まれる細胞をその培養に適した条件下でその培養に適した培地中で培養することを含む方法が提供される。培地は、上記のいずれかの培地を好ましく用いることができる。本方法では、培養により、造血幹細胞分画に含まれる細胞を増殖させることができる。本方法は、得られた細胞から、ｅｘＣＭＰを単離することをさらに含み得る。ｅｘＣＭＰの単離は、例えば、ｅｘＣＭＰに特徴的なマーカー発現に基づいて例えばフローサイトメトリを用いて行うことができる。
材料と方法
（１）マウス
　Ｃ５７ＢＬ／６　（Ｂ６－Ｌｙ５．２）マウスはＳＬＣ、Ｃ５７ＢＬ／６　（Ｂ６－Ｌｙ５．１）マウス、Ｃ５７ＢＬ／６　（Ｂ６－Ｌｙ５．１／Ｌｙ５．２　Ｆ１）マウスは三協ラボサービス、Ｂ６　Ａｌｂｉｎｏ　（Ｂ６Ｎ－Ｔｙｒc-Brd／ＢｒｄＣｒＣｒｌ）マウスは日本チャールス・リバーより購入した。すべての実験は東京大学および筑波大学の動物実験実施規定に基づいて行われた。
（２）脾臓摘出
　マウスの脾臓摘出は各実験の１４日前までに行った。３酒混合麻酔薬（塩酸メデトミジン（ドミトール、日本全薬工業株式会社）、ミダゾラム（ドルミカム注射液、丸石製薬）、酒石酸ブトルファノール（ベトルファール、Ｍｅｉｊｉ　Ｓｅｉｋａ　ファルマ株式会社））による麻酔後、マウス左側腹部に５ｍｍ大の切開をおき脾臓を切離し、縫合打針器によるクリップで速やかに閉腹した。
（３）全血球計算
　マウスの眼底静脈叢よりヘパリン管で末梢血を採取し、全自動血球計測機ＭＥＫ－６４５０（日本光電工業）を用いて全血球計算を行った。
（４）マウス造血幹・前駆細胞の純化
　８－１２週齢のマウスの骨髄より以下の方法でマウス骨髄幹・前駆細胞を採取した。マウスの骨盤、大腿骨、脛骨から採取した骨髄細胞を抗ＡＰＣ－ｃＫｉｔ抗体で染色した後、抗ＡＰＣ　ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）とＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてｃＫｉｔ陽性細胞を分離した。これらの細胞をビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗原抗体（抗Ｇｒ１，　Ｍａｃ１，　Ｂ２２０，　ＣＤ４，　ＣＤ８，　ＩＬ７Ｒａ，　Ｔｅｒ１１９）で反応後に抗ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０抗体、抗ＡＰＣ－ｃＫｉｔ抗体、抗ＦＩＴＣ－ＣＤ３４抗体、抗ＰＥ－Ｓｃａ１抗体、抗ＰＥＣｙ７－ＣＤ１５０抗体で染色した。造血幹細胞分画として、ＣＤ３４－ＫＳＬおよびＣＤ３４－ＣＤ１５０＋ＫＳＬ細胞を設定し、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩＩ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　（ＢＤ）およびＭｏＦｌｏ　ＸＤＰ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてソーティングを行った。ｃＫｉｔ陽性細胞の培養では、ＬＳカラムで分離後の細胞を用いた。
（５）マウス造血幹・前駆細胞の培養
　Ｂ６－Ｌｙ５．１マウスからＣＤ３４－ＫＳＬ細胞を１００個ずつ９６ｗｅｌｌプレート（ＴＰＰ）に分離、あるいは、１０００－３０００細胞ずつ２４ｗｅｌｌプレート（ＴＰＰ）に分離し、Ｆ－１２培養液（富士フイルム和光純薬）に、ＳＣＦ　（１０ｎｇ／ｍＬ；　Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）、ＴＰＯ　（１００ｎｇ／ｍＬ；　Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ）、ＩＴＳＸ　（１％；　ＧｉｂｃｏTM）、ＨＥＰＥＳ　（１０ｍＭ；　ＧｉｂｃｏTM）、ペニシリン－ストレプトマイシン－Ｌ－グルタミン溶液　（１％；　富士フイルム和光純薬）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）　（０．１％；　１０％　ｗ／ｖ　ｓｔｏｃｋ，　Ｗａｋｏ）を加えて、５％　ＣＯ2、３７℃のインキュベーターで培養した。ｃＫｉｔ陽性細胞の培養ではｃＫｉｔ陽性細胞１００００個ずつ２４ｗｅｌｌプレートに分離し、同様の培地・条件で培養した。培養開始後、２－３日毎に全量培地交換を行った。
（６）造血幹細胞培養後の表面マーカー解析およびソーティング
　造血幹細胞の培養で得た細胞分画の評価およびソーティングは以下のように行った。造血幹細胞分画の評価は、培養した細胞を回収し、ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗原抗体（抗Ｇｒ１，　Ｍａｃ１，　Ｂ２２０，　ＣＤ４，　ＣＤ８，　ＩＬ７Ｒａ，　Ｔｅｒ１１９）で反応後に抗ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＢＶ　４２１抗体、抗ＰＥ－ＣＤ２０１抗体、抗ＰＥＣｙ７－ＣＤ１５０抗体、抗ＡＰＣ－ｃＫｉｔ抗体、抗ＡＰＣＣｙ７－Ｓｃａ１抗体で染色し、Ｌｉｎ－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１＋ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋細胞を解析・ソーティングすることで行った。骨髄前駆細胞分画の評価は、ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗原抗体（抗Ｇｒ１，　Ｍａｃ１，　Ｂ２２０，　ＣＤ４，　ＣＤ８，　ＩＬ７Ｒａ，　Ｔｅｒ１１９）で反応後に抗ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＡＰＣＣｙ７抗体、抗ＰＥ－Ｓｃａ１抗体、抗ＰＥＣｙ７－ＦｃｇＲ抗体、抗ＡＰＣ－ｃＫｉｔ抗体で染色し、Ｌｉｎ－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１－ＦｃｇＲ－細胞を解析・ソーティングすることで行った。ＭＨＣ　ＣｌａｓｓＩ　ノックアウト細胞の回収では、ノックアウト後の細胞を抗ＰＢ－Ｇｒ１抗体、抗ＰＢ－Ｍａｃ１抗体、抗ＡＰＣ－ｃＫｉｔ抗体、抗ＡＰＣＣｙ７－Ｓｃａ１抗体、抗ＰＥＣｙ７－ＦｃｇＲ抗体、抗ＰＥ－ＭＨＣ　ＣｌａｓｓＩ抗体で染色後に、Ｇｒ１－Ｍａｃ１－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１－ＦｃｇＲ－ＭＨＣ　ＣｌａｓｓＩ－細胞をソーティングした。
（７）骨髄移植
　競合的骨髄再構築法はＬｙ５コンジェニックマウス系で行った。Ｂ６－Ｌｙ５．１マウスから採取し培養して得た細胞を、Ｂ６－Ｆ１－Ｌｙ５．１／Ｌｙ５．２マウス５×１０5個の骨髄細胞とともに、８Ｇｙの致死的放射線を照射したＢ６－Ｌｙ５．２マウスへ経静脈的に移植した。２次移植では、移植後１６週以上経過したマウスより１×１０6個の骨髄細胞を採取し、８Ｇｙの致死的放射線を照射したＢ６－Ｌｙ５．２マウスへ経静脈的に移植した。４週毎に末梢血を採取し移植後キメリズムを解析した。
（８）末梢血、骨髄の血球分化細胞解析
　ヘパリン化採血管で採取された末梢血は、ＮＨ4Ｃｌ溶液（１５０ｍＭ）で溶血処理後、抗ＡＰＣ－ＣＤ４抗体、抗ＡＰＣ－ＣＤ８抗体、抗ＡＰＣ／Ｃｙ７－Ｂ２２０抗体、抗ＰＥ－Ｇｒ１抗体、抗ＰＥ－Ｍａｃ１抗体、抗ＰＥ／Ｃｙ７－ＣＤ４５．１抗体、抗ＰＢ－ＣＤ４５．２抗体で染色し、ＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ　ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ）で解析を行った。各細胞分画の数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｃｏｕｎｔ　ＢｅａｄｓTM　を用いて計測した。キメリズムは　（％　Ｌｙ５．１　ｃｅｌｌｓ）　×　１００　／　（％　Ｌｙ５．１　ｃｅｌｌｓ　＋　％　Ｆ１　ｃｅｌｌｓ）　で算出した。移植後骨髄および脾臓の造血前駆細胞の解析では、ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗原抗体（抗Ｇｒ１，　Ｍａｃ１，　Ｂ２２０，　ＣＤ４，　ＣＤ８，　ＩＬ７Ｒａ，　Ｔｅｒ１１９）で反応後に抗ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＡＰＣｅＦｌｕｏｒ７８０抗体、抗ＡＰＣ－ｃＫｉｔ抗体、抗ＢＶ６０５－Ｓｃａ１抗体、抗ＢＶ５１０－ＣＤ４１抗体、抗ＰＥ－ＦｃｇＲ抗体、抗ＰＥＣｙ７－ＣＤ１５０抗体、抗ＢＶ７８６－ＣＤ１０５抗体、抗ＰＢ－ＣＤ３４抗体で染色を行った。造血幹細胞の解析では、ビオチン化ｌｉｎｅａｇｅ抗原抗体（抗Ｇｒ１，　Ｍａｃ１，　Ｂ２２０，　ＣＤ４，　ＣＤ８，　ＩＬ７Ｒａ，　Ｔｅｒ１１９）で反応後に抗ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０抗体、抗ＡＰＣ－ｃＫｉｔ抗体、抗ＢＶ６０５－Ｓｃａ１抗体、抗ＰＥ－ＣＤ２０１抗体、抗ＰＥＣｙ７－ＣＤ１５０抗体、抗ＰＢ－ＣＤ３４抗体で染色を行った。成熟細胞の解析には、抗ＡＰＣ－ＣＤ４抗体、抗ＡＰＣ－ＣＤ８抗体、抗ＡＰＣＣｙ７－Ｂ２２０抗体、抗ＰＢ－ＣＤ４５．１抗体、抗ＰＥ－Ｇｒ１抗体、抗ＰＥ－Ｍａｃ１抗体、抗ＰＥＣｙ７－Ｔｅｒ１１９抗体を用いて染色を行った。染色細胞の解析はＦＡＣＳ　Ｖｅｒｓｅ　ａｎａｌｙｚｅｒおよびＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒで行った。各細胞分画の数はＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｃｏｕｎｔ　ＢｅａｄｓTM　を用いて計測した。移植後造血幹前駆細胞分画の脾臓と骨髄の比較解析では、ｍＮＧ＋Ｌｉｎ－細胞集団の統合データに対してＦｌｏｗｊｏ　ｐｌｕｇｉｎのＵＭＡＰおよびＸ－ｓｈｉｆｔアルゴリズムを用いた。脾臓と骨髄での各細胞分画の存在割合比は、ｌｏｇ2（脾臓Ｌｉｎ－中の各分画割合／骨髄Ｌｉｎ－中の各分画割合）として定義しヒートマップを作成した。
（９）レンチウイルスベクター作成
　ＬＶ－Ｕｂｃ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ－２Ａ－ＡｋａｌｕｃベクターはＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　アッセンブリーシステムを用いて作成した。Ａｋａｌｕｃ　ｆｒａｇｍｅｎｔは国立大学法人理化学研究所　脳神経科学研究センター　宮脇敦史博士、岩野智博士のご厚意で提供いただいた。
（１０）レンチウイルス作成
　２９３Ｔ細胞に対してＰＥＩ法によるトランスフェクションを行い、目的のレンチウイルスを作成した。具体的にはＨＢＳＳ中にプラスミド混合液（目的プラスミドベクター：パッケージングプラスミド（ｐｓＰＡＸ２）：エンベローププラスミド（ｐＤＭ２Ｇ）＝４　：　２　：　１）を用意し、ＰＥＩ（１μｇ／μＬ）を加え１０－１５分静置後、ＤＭＥＭ培養液中（富士フイルム和光純薬）に準備しておいた２９３Ｔ細胞（５．０×１０6／ｍＬ）に添加した。翌日にＦｏｒｓｋｏｌｉｎ　（１０ｕＭ）を含むＤＭＥＭ培地に培地交換し、さらに４８時間培養した後、上清を回収した。超遠心により濃縮を行い、２９３Ｔ細胞を用いて機能的感染力価を評価した。
（１１）レンチウイルスによる造血幹前駆細胞への遺伝子導入
　濃縮したレンチウイルスストックを、培養中の造血幹細胞に対して機能的感染力価として約３００－６００ＭＯＩの量で培養液中に投与し、２４時間後に半量培地交換、さらに４８時間後に半量培地交換を行い、その後通常通り培養を継続した。ＬＶ－Ｕｂｃ－ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ－２Ａ－Ａｋａｌｕｃ導入後の細胞はｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ陽性細胞としてＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩＩ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　およびＭｏＦｌｏ　ＸＤＰ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ　を用いてソーティングを行った。
（１２）Ａｋａｌｕｃ　Ｉｎ　ｖｉｖｏ発光イメージング
　移植後マウスの３Ｄ発光イメージングはＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ＣＴを用いて行った。２Ｄ発光イメージングはＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　Ｓｅｒｉｅｓ　ＩＩＩおよびＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いて行った。マウスはイソフルランで麻酔後、Ａｋａｌｕｍｉｎｅ（１５ｍＭ，　５０μＬ）を投与し、５分後に発光イメージングを行った。発光強度に併せて、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｔｉｍｅを１－３００秒の間で調節した。発光シグナル強度はＬｉｖｉｎｇ　Ｉｍａｇｅ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。
（１３）脾臓間質細胞採取
　通常マウスおより放射線照射後のマウスから脾臓を摘出し、スライドガラスを用いて細胞を分散させ、コラゲナーゼ溶液（ＲＰＭＩ１６４０培養液（富士フイルム和光純薬），　２％　ＦＢＳ，　２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ｐ　０．２ｍｇ／ｍＬ　（Ｒｏｃｈｅ））中で３７℃３０分間コラゲナーゼ処理を行った。細胞懸濁液をフィルター処理し、抗ＡＰＣ－Ｔｅｒ１１９抗体、抗ＡＰＣ－ＣＤ４５抗体、抗ＡＰＣ－Ｂ２２０抗体で染色した後、抗ＡＰＣ　ＭＡＣＳビーズとＬＳカラムを用いてｃＫｉｔ陰性細胞を分離した。次に、抗ＡＰＣ－Ｔｅｒ１１９抗体、抗ＡＰＣ－ＣＤ４５抗体、抗ＡＰＣ－Ｂ２２０抗体、抗ＡＰＣＣｙ７－Ｓｃａ１抗体、抗ＦＩＴＣ－ＣＤ７１抗体、抗ＰＥ－ＩＣＡＭ１抗体、抗ＰＥＣｙ７－ＣＤ３１抗体、抗ＰＢ－ＣＤ１０５抗体を用いて染色し、ＣＤ４５－Ｔｅｒ１１９－Ｂ２２０－ＣＤ３１＋Ｓｃａ１＋／ＩＣＡＭ１＋分画を脾臓血管内皮細胞として、ＣＤ４５－Ｔｅｒ１１９－Ｂ２２０－ＣＤ３１－ＣＤ７１－ＣＤ１０５＋ＩＣＡＭ１＋分画を赤脾髄間質細胞としてＭｏＦｌｏ　ＸＤＰ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒにより回収した。
（１４）Ｂｕｌｋ　ＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
　ＣＭＰの解析では、８週齢のＢ６マウスからＬｉｎ－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１－ＣＤ３４＋ＦｃｇＲ－細胞を３００００個、ＣＤ３４－ＫＳＬ細胞を１週間培養後に採取したＬｉｎ－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１－ＦｃｇＲ－細胞を３００００個それぞれ採取し、Ｔｒｉｚｏｌ－ＬＳ中に懸濁した。脾臓間質細胞の解析では、８週齢のＢ６マウスからＣＤ４５－Ｔｅｒ１１９－ＣＤ３１－ＣＤ７１－ＣＤ１０５＋ＩＣＡＭ１＋細胞（赤脾髄間質細胞）を１００００個、ＣＤ４５－Ｔｅｒ１１９－ＣＤ３１＋ＩＣＡＭ１＋　ｏｒ　Ｓｃａ１＋細胞（血管内皮細胞）を１００００個、また４Ｇｙ照射後１０日目のマウスから赤脾髄間質細胞を３０００個、血管内皮細胞を１００００個ずつ採取して、Ｔｒｉｚｏｌ－ＬＳ中に懸濁した。その後のＲＮＡ抽出、ＲＮＡ－Ｓｅｑ　ｃＤＮＡライブラリー作成、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ断片のマウスゲノム上へのマッピングは筑波大学トランスボーダー医学研究センター・ゲノム生物学分野の解析サービスを利用した。遺伝子発現解析はＤＥＳｅｑ２パッケージを用いて行った。Ｏｎｔｏｌｏｇｙ　解析はマウス遺伝子の　Ｇｅｎｅ　Ｏｎｔｏｌｏｇｙ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ　ｄａｔａｂａｓｅで行った。生のｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ　解析データは＊＊＊で利用可能である。
（１５）ゲノム編集
　９μｇのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｓ．　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　Ｃａｓ９　（Ａｌｔ－Ｒ　Ｓ．ｐ．　Ｃａｓ９　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｖ３，　ＩＤＴ）　と設計したｓｉｎｇｌｅ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　（Ａｌｔ－Ｒ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９　ｓｇＲＮＡ，　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｔ　ＩＤＴ）　をモル比１：２．５で混合し、２５℃で１０分反応させることでｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ　（ＲＮＰ）　ｄｕｐｌｅｘ　を作成した。ＨＳＣはＰＢＳにて２回洗浄後、２０　μｌのｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｐ３　（Ｌｏｎｚａ）に懸濁し、ＲＮＰと混合した。懸濁液を１６ｗｅｌｌキュベット　（Ｐ３　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｃｅｌｌ　９６－ｗｅｌｌ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ）　に移し、４Ｄ　ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ｄｅｖｉｃｅ　（Ｌｏｎｚａ）　にてｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを行った（ＥＯ－１００　プログラム）。その後速やかにＣａ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ培養液を細胞に加え、１０分間インキュベーションを行った。その後ＰＶＡベースのＨＳＣ増幅培地に戻して培養を再開した。
（１６）ＴＩＤＥによる目的遺伝子ノックアウト効率の解析
　ＴＩＤＥ（ｈｔｔｐ：／／ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｄａｔａｃｕｒａｔｏｒｓ．ｎｌ／ｔｉｄｅ／）プロトコルで推奨されているようにＣａｓ９切断部位周囲約７００ｂｐの領域を、末端から約２００ｂｐ部分に切断部位を含むように適切なプライマーを設計した。培養細胞からｉｎｄｅｌを定量するために、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｓｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｏｌｕｍｎｓ　（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて培養細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度はＮａｎｏｄｒｏｐ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）で測定した。得られたゲノムＤＮＡに対し、設計したプライマーとＱ５　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動により分離し、Ｍｉｄｏｒｉ　Ｇｒｅｅｎ　Ｘｔｒａ　（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）による染色後ブルーライトで可視化し、予想される標的産物（約７００ｂｐ）に対応する断片を切り出してゲル精製を行った。得られた精製断片をＦｏｒｗａｒｄ　ＴＩＤＥプライマーを用いてサンガーシークエンスを行った（シークエンスはＦＡＳＭＡＣに外注した）。ネガティブコントロールとして、ゲノム編集を行っていない造血幹細胞の配列を使用し、ＴＩＤＥアルゴリズムによってノックアウト率を計算した。
（１７）統計学的解析
データは平均値　（±標準偏差）　で示し、統計学的有意差は　ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ　検定、ｏｎｅ－ｗａｙ－ＡＮＯＶＡ解析およびｔｗｏ－ｗａｙ－ＡＮＯＶＡ解析により、Ｐｒｉｓｍ　（ｖｅｒｓｉｏｎ　＞８．０，　Ｇｒａｐｈｐａｄ）　を用いて計算した。統計学的有意差は＊Ｐ＜０．０５，　＊＊Ｐ＜０．０１，　＊＊＊Ｐ＜０．００１　で示した。
結果
１．移植後早期に脾臓で造血が行われており、時間経過とともに変化する
　造血幹細胞を致死的放射線照射後のマウスに投与すると、時間経過とともに増幅・分化し、全系統の血液細胞を再構築することができる。しかし、移植後の造血幹細胞が同一個体内でどのように造血を立ち上げるのかについての空間的ダイナミクスやタイムコースはよく分かっていない。造血幹細胞移植後におけるマウス体内での早期造血の時空間的動態を、同一個体内で連続的に観察するために、ＡｋａＬｕｃ生物発光イメージング（ＡｋａＢＬＩ：Ａｋａｌｕｃ　ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍａｇｉｎｇ）システムを応用した。ＡｋａＢＬＩは最近確立された生物発光技術であり、新規に合成されたＤ－ルシフェリンアナログであるＡｋａｌｕｍｉｎｅ（ＡＫＡ）は、従来の生物発光の１００－１０００倍の発光を実現し、静脈注射後に肺血管系に捕捉されたＡｋａＬｕｃ発現ＨｅＬａ線維芽細胞の検出を１細胞レベルで可能とした。そこで、マウスからＨＳＣ分画であるＣＤ３４－ＣＤ１５０＋ＫＳＬ細胞を１００個ずつ分離し、レンチウイルス（ＬＶ－Ｕｂｃ－ｍＮＧ２Ａ－Ａｋａｌｕｃ）を用いてＡｋａｌｕｃ遺伝子を導入後、近年確立したＰＶＡを用いた造血幹細胞培養技術により増幅培養してｍＮＧ陽性細胞１００００個をＦ１マウス骨髄細胞１×１０6個と共に致死的放射線照射マウスに移植し、経時的にＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ＣＴによるリアルタイム３Ｄイメージングを行った（図１Ａ参照）。シグナルは移植後５日目以降から十分確認でき、マイクロＣＴとの合成による全身イメージングの結果から、造血幹細胞移植後早期に脾臓が骨髄以上に主な造血の場となっていることが判明した（図１Ｂ，　Ｃ参照）。脾臓と骨髄以外の臓器では、脾臓や骨髄ほどの顕著な造血は観察されなかった。移植後の造血幹細胞が時空間的にどのように全身の血液を再構築するのかについて、より連続的に詳しく調べるために、培養後の造血幹細胞分画であるＡｋａｌｕｃ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋ＫＳＬ細胞を３０００個と、Ｆ１マウス骨髄細胞５×１０5個を致死的放射線照射マウスに移植し、経時的なＩＶＩＳによるイメージングと長期的骨髄再構築能の評価を行った（図２Ａ参照）。Ａｋａｌｕｃ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋ＫＳＬ細胞は、移植後の長期的な末梢血中ドナー細胞キメリズムの評価から、１６週間に渡って骨髄系、Ｂリンパ系、Ｔリンパ系の３系統の細胞の生着を認め、二次移植後も１６週間に渡り造血を維持したことから、造血幹細胞を含む分画であることが確認できた（図２Ｂ，　Ｃ参照）。移植後５日目～２５日目にかけてＩＶＩＳイメージングによる観察を行ったところ、３Ｄイメージングで観測されたように、早期から脾臓で顕著な造血が行われた。さらに、経時的な観察により、脾臓での造血は骨髄と比較してダイナミックに変化し、複数の造血ピーク（図２Ｄ中のピークＩ～ＩＩＩ）を形成していることがわかった（図２Ｄ参照）。脾臓での造血の構成細胞とその経時的変化や、骨髄での造血との比較を行うために、移植後に脾臓・骨髄を採取し、移植細胞由来の細胞分画を解析した。ＡｋａｌｕｃタンパクとｍＮＧは２Ａを挟んで同一プロモーター下流に設計したため同時に発現することが期待され、実際に移植後９日目の脾臓から回収したｍＮＧ＋細胞はＡｋａｌｕｍｉｎｅ投与で発光したが、ｍＮＧ－細胞はＡｋａｌｕｍｉｎｅ投与によって発光しなかった（図３Ａ参照）。そこで、ドナー由来の細胞としてｍＮＧ＋細胞の細胞分画を詳細に調べたところ、脾臓に存在する血液細胞の分画は時間と共に大きく変化し、骨髄とも大きく異なっていた（図３Ｂ参照）。具体的には、脾臓では移植後９－１０日目に骨髄前駆細胞分画や好中球・マクロファージが増殖し、続いて移植後１２日目には赤血球が造血の大部分を占め、造血ピークを形成した。移植後１８－２０日目にはリンパ球を含む複数系統を認める造血ピークが確認できた。脾臓での早期造血は骨髄での造血と大きく異なり、骨髄では成熟した好中球やマクロファージが多くを占めるのに対して、脾臓では骨髄前駆細胞や赤血球造血が目立った（図３Ｃ参照）。骨髄造血幹・前駆細胞レベルでの骨髄との造血の差を明らかにするために、ＦＡＣＳデータを元に、定常状態および移植後７，　９，　１０，　１１，　１２，　１６，　１９，　２２，　２８日目、１６週後の骨髄・脾臓のｍＮＧ＋Ｌｉｎ－細胞集団を統合し、ｃＫｉｔ，　Ｓｃａ１，　ＦｃｇＲ，　ＣＤ３４，　ＣＤ４１，　ＣＤ１５０，　ＣＤ１０５の発現レベルによるＣｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　（ＵＭＡＰ）およびＸ－ｓｈｉｆｔによる自動クラスタリングを行った（図４Ａ参照）。その結果、脾臓と骨髄では造血幹・前駆細胞レベルで大きく異なっており、移植後７－１２日目の骨髄ではＧＭＰ（Ｌｉｎ－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１－ＦｃｇＲ＋ＣＤ３４＋細胞であり、以下同様。）などのＦｃｇＲ＋陽性集団が目立ったが、脾臓ではＣＭＰ（Ｌｉｎ－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１－ＦｃｇＲ－ＣＤ３４＋細胞であり、以下同様。）およびＭＥＰ（Ｌｉｎ－ｃＫｉｔ＋Ｓｃａ１－ＣＤ３４－ＦｃｇＲ－細胞であり、以下同様。）の集団が特徴的であった（図４Ｂ参照）。骨髄前駆細胞分画に大きな差が認められたので、移植後骨髄・脾臓のＬｉｎ－細胞中の骨髄前駆細胞分画割合を調べたところ、７－１２日目にかけて脾臓でＣＭＰやＭＥＰが骨髄と比較して高い割合で存在していることがわかった。脾臓におけるＣＭＰの増加は一時的で、移植後１９日目には骨髄と差がなくなり、移植後２８日目の脾臓ではＧＭＰとＭＥＰの集団が大部分を占め、ＣＭＰは骨髄で有意に多く確認され、定常状態と同様のバランスに戻った（図４Ｃ参照）。移植後早期に脾臓特異的に集中している細胞分画をより明らかにするために、造血幹・前駆細胞の各分画の割合を網羅的に脾臓と骨髄で比較した。その結果移植後７日目の時点で、脾臓ではＣＭＰ分画、Ｐｒｅ－ＧＭ分画、Ｐｒｅ　Ｍｋ／Ｅ分画が特に集中していることが確認できた（図４Ｄ参照）。
　次に、造血幹細胞移植後に脾臓で造血が行われていたことから、脾臓がない場合に造血動態がどのように変化するのかを、脾臓摘出マウスを使用して観察した。予め脾臓を摘出したマウスに対して、Ａｋａｌｕｃ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋ＫＳＬ細胞を３０００個と、Ｆ１マウス骨髄細胞５×１０5細胞を致死的放射線照射後に移植し、経時的なＩＶＩＳによるイメージングを行った。脾臓摘出マウスでも同様に早期からの造血が確認できたが、骨髄での造血量が一時的にやや増加したのみで、肝臓等のその他の臓器での顕著な造血は確認できなかった（図５Ａ参照）。実際に骨髄中のｍＮＧ＋細胞数を比較すると、９日目、１２日目の骨髄では脾臓摘出マウスの方がｍＮＧ＋細胞数が多く、１９日目には差がなくなった（図５Ｂ参照）。そこで移植後早期に脾臓で特徴的に観察されたＣＭＰの分画が、脾臓摘出マウスの骨髄で代償できているのかを確認したが、脾臓摘出マウスと正常マウスとで有意な差は認められなかった（図５Ｃ参照）。つまり脾臓ＣＭＰによる造血は、脾臓摘出マウスの骨髄では十分量代償できていないことが分かった。
　次に、脾臓での早期造血が末梢血に与える影響を調べるために、脾臓摘出マウスと通常マウスで移植後早期の末梢血を比較した。脾臓摘出マウスと通常マウスに対して、ＨＳＣの培養で得られたＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋ＫＳＬ細胞を３０００個、致死的放射線照射に移植し、移植後２日目以降から３日毎に末梢血を採取し解析した。その結果、脾臓摘出マウスでは末梢血中のＨｂ値やＧｒ１／Ｍａｃ１陽性細胞の回復が遅延することが分かった。この結果から脾臓が早期の造血回復に重要であることが確認できた（図６参照）。
　最後に、脾臓摘出による放射線照射後の回復遅延が、骨髄中の造血幹細胞に影響を及ぼすかを検討した。通常のＬｙ５．１　Ｂ６マウスと、脾臓摘出を行ったＬｙ５．２　Ｂ６マウスを準備し、それぞれに４Ｇｙの放射線照射を行い、５週あるいは１２週経過後に骨髄を採取し、それぞれのマウス由来の骨髄細胞５×１０5個を混合してＦ１マウスに移植して４週間毎に末梢血キメリズムを解析した（図７Ａ参照）。その結果、５週および１２週経過後の骨髄を移植したマウスいずれにおいても、末梢血中のＬｙ５．１由来細胞とＬｙ５．２由来細胞の割合は同程度であり、両者の骨髄中の造血幹細胞割合に差がなかった（図７Ｂ参照）。つまり造血障害後の早期造血回復に脾臓は重要であるが、脾臓が無くても骨髄中のＨＳＣは造血ストレスから保護されることが分かった。
２．ＣＭＰは脾臓で移植後早期に造血する
　ＩＶＩＳイメージングの結果から、移植後の脾臓でＣＭＰ等の骨髄前駆細胞集団が早期に確認できたことから、同分画が移植後早期造血に重要な役割を担っていると考え、各骨髄前駆細胞分画を移植した際の、移植後早期造血の時空間的動態を観察した。まず、Ａｋａ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋ＫＳＬ　３０００細胞を、Ｓｃａ１－　Ｆ１　５．０×１０5細胞と共に致死的放射線照射マウスに移植し、レシピエントマウスの全血液細胞をＡｋａ＋細胞に置き換えたＡｋａ＋マウスを作成した。移植後１２週以上が経過したＡｋａ＋マウスの骨髄を採取し、ＣＭＰ，　ＧＭＰ，　ＭＥＰ分画を回収し、それぞれ１００００細胞ずつ、Ｆ１　５．０×１０5細胞と共に致死的放射線照射マウスへ移植して、ＩＶＩＳによるイメージングおよび移植後７日目の脾臓を採取して解析を行った（図８Ａ，　Ｂ参照）。過去の報告通り、ＣＭＰは好中球・マクロファージおよび赤血球を産生し、ＧＭＰは好中球・マクロファージ、ＭＥＰは赤血球を産生した。ＩＶＩＳによる観察から、ＧＭＰは移植後主に骨髄で造血が行われたが、ＭＥＰは脾臓で造血が行われ１つの造血ピークを形成した。ＣＭＰも移植後は脾臓での造血が中心的に行われ、９日目と１２日目付近に好中球・マクロファージ・赤血球からなる造血ピークを形成した（図８Ｃ，　Ｄ，　Ｅ参照）。いずれも短期的な造血のみで、４週間後の末梢血解析では検出されなかった（図８Ｆ参照）。ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰを同細胞数移植した後の造血再構築をＩＶＩＳによるシグナル強度により比較すると、ＣＭＰを移植したときに遥かに多くの造血が行われていることが確認できた（図８Ｄ参照）。このようにＣＭＰは移植後に脾臓を中心として造血を行い、早期造血に貢献できる可能性が示唆された。これはＡｋａ＋造血幹細胞を移植した際に、移植後７日目～１２日目の脾臓で、骨髄と比較してＣＭＰ分画が多く存在していたことと確かに一致した。
　ＣＭＰが移植後に脾臓で造血する様子が確認できたことから、ＣＭＰが移植直後の段階で脾臓にホーミングしている可能性が示唆された。このことを確認するために、Ｌｙ５．１マウス由来の全骨髄細胞２×１０7個を放射線照射後のＬｙ５．２マウスに移植し、２４時間後に骨髄と脾臓および末梢血を回収してドナー由来の細胞分画を解析した（図９Ａ参照）。その結果、確かに骨髄や末梢血と比較して、脾臓においてＣＭＰの存在割合が高いことが確認できた（図９Ｂ，　Ｃ参照）。以上から、ＣＭＰはホーミングの段階から骨髄よりも脾臓へ移動しやすいことが分かった。
３．Ｅｘｐａｎｄｅｄ　ＣＭＰ　（ｅｘＣＭＰ）はｆｒｅｓｈ　ＣＭＰよりも早期に脾臓で造血する
　ＣＭＰが脾臓での髄外造血を経て、移植後の早期造血に貢献していることが分かったので、次に造血幹細胞の培養によって同様の分画が入手可能かを検討した。マウス骨髄よりＣＤ３４－ＫＳＬ細胞を採取しＡｋａｌｕｃ遺伝子を導入して上記（5）の条件で7日間培養した後、Ｌｉｎ－Ｓｃａ１－ｃＫｉｔ＋ＣＤ３４＋分画の中でＦｃｇＲ＋分画（ｅｘｐａｎｄｅｄ　ＧＭＰ；　ｅｘＧＭＰ）とＦｃｇＲ－分画（ｅｘｐａｎｄｅｄ　ＣＭＰ；　ｅｘＣＭＰ）をそれぞれ１００００細胞回収してマウスに移植した（図１０Ａ参照）。ＩＶＩＳによるイメージングの結果、ｅｘＧＭＰは観察されるシグナル強度が全体的に弱かったが、ｅｘＣＭＰ分画では脾臓での増幅造血が確認できた（図１０Ｂ，　Ｃ参照）。移植後７日目の脾臓を回収して解析すると、ｅｘＧＭＰ分画を移植した場合は好中球・マクロファージがほとんどを占めたが、ｅｘＣＭＰ分画を移植した場合は好中球・マクロファージ、赤血球への分化を確認できた（図１０Ｄ参照）。回収した脾臓を解析すると、ｅｘＣＭＰ分画はｅｘＧＭＰ分画と比較して大量の好中球・マクロファージを産生可能であった（図１０Ｅ参照）。以上からｅｘＣＭＰは、その分化能からＣＭＰに該当する分画であることが示唆された。次に、ｅｘＣＭＰと骨髄中のＣＭＰの造血能の違いを調べるために、Ａｋａ＋マウス骨髄から採取したＣＭＰ（骨髄から採取したばかりの培養前のＣＭＰであり「ｆｒｅｓｈ　ＣＭＰ」とよぶ）および培養で得られたｅｘＣＭＰをそれぞれ１００００細胞ずつ移植して行ったイメージング結果を比較したところ、いずれも脾臓での造血が中心ではあるが、培養後のｅｘＣＭＰ分画を移植した方が脾臓での造血がより早期に起こることが分かった（図１０Ｃ参照）。移植後７日目の脾臓の細胞数を解析すると、確かに培養後のｅｘＣＭＰ分画を移植した際の方が、好中球・マクロファージ、赤血球ともに多かった（図１０Ｅ参照）。移植後のマウスの末梢血を分析すると、ｅｘＣＭＰは移植後早期に大量の造血を行うが、それは一時的なものであり長期に生着することはなかった（図１０Ｆ参照）。以上のことから、培養で得られるｅｘＣＭＰはＣＭＰと同様の分化能を有するものの、ＣＭＰよりも早期に脾臓で造血可能であることが分かった。
　ｅｘＣＭＰも移植後のホーミングの段階で、脾臓に移動していることを確認するために、Ａｋａ＋　ｅｘＣＭＰ　５×１０5細胞を放射線照射したＡｌｂｉｎｏ　Ｂ６マウスに移植して、２４時間後にＩＶＩＳイメージングおよび脾臓、骨髄の解析を行った。その結果、予想通りに脾臓にシグナルが集中しており（図１１Ａ，　Ｂ参照）、ＦＡＣＳによる解析でも骨髄や末梢血と比較して脾臓に移植細胞が集中していることが分かった（図１１Ｃ，　Ｄ参照）。以上より、ｅｘＣＭＰはホーミングの段階で脾臓へ集積していることが判明した。
　ＣＭＰを含む造血細胞はアルブミン非存在下で増殖させることが困難であった。これに対して、ＷＯ２０２１／０４９６１７ＡおよびＷＯ２０２１／１４９７９９Ａでは、造血幹細胞をアルブミン非存在下で培養する手法が開発され、これにより造血幹細胞を含む造血細胞をアルブミン非存在下で培養することが可能となった。また、上記方法では、ＳＣＦやＴＰＯを代替物に置き換えることによって、サイトカインフリー条件（特に、化学的に定義された培地中）でも造血幹細胞を培養することができる。ＣＭＰは、上記方法によってインビトロで増殖させることができたが、ＣＭＰおよびｅｘＣＭＰは近年確立した、ｃＫｉｔ　ｂｕｌｋ　ｃｕｌｔｕｒｅシステム（Ｎａｔ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２０２１，　１２（１）：　３５６８）でも培養が可能であった。ｃＫｉｔ　ｂｕｌｋ　ｃｕｌｔｕｒｅシステムでは、上記（４）の方法によりｃＫｉｔ陽性細胞を分離し、得られた１００００個のｃＫｉｔ陽性細胞を上記（５）に記載のＰＶＡを含む１ｍＬの培地で培養した。ｃＫｉｔ　ｂｕｌｋ　ｃｕｌｔｕｒｅでは培養細胞中の２０－５０％がｅｘＣＭＰであり、ｃＫｉｔ＋細胞１００００個から培養を開始して、４週間で４×１０5細胞のｅｘＣＭＰを生成できた（図１２Ａ，Ｂ参照）。ＣＭＰは、造血幹細胞から持続的に産生される細胞種であるため、造血幹細胞が増殖できるアルブミン非存在下の培養条件において特に大量に得られると考えられる。また、アルブミン非存在下では、アルブミン存在下の条件よりも、ｅｘＣＭＰが血小板関連遺伝子の発現が向上する。このことから、アルブミン非存在下で培養することによって、より未熟なＣＭＰの性質を有するｅｘＣＭＰが増えると考えられる。
　ｅｘＣＭＰはｆｒｅｓｈＣＭＰと比較して早期に多くの成熟細胞を産生できたことから、ｅｘＣＭＰとｆｒｅｓｈＣＭＰの違いをより詳しく調べるためにＢｕｌｋ　ＲＮＡｓｅｑを行った。その結果、ｅｘＣＭＰとｆｒｅｓｈＣＭＰは、細胞周期や、ケモカイン受容体、インテグリンなどの発現レベルに差があることが分かった（図１３Ａ，　Ｂ，　Ｃ参照）。具体的には、ｅｘＣＭＰはｆｒｅｓｈＣＭＰと比較してＧ２－Ｍ期にいる細胞が多かった。ケモカイン受容体としては、ｅｘＣＭＰの方がｆｒｅｓｈＣＭＰよりもＣＸＣＲ４発現レベルが低下していることが分かった。ＣＸＣＲ４のノックアウト造血幹細胞の移植では、移植７日後の脾臓における増殖細胞数が、野生型造血幹細胞移植後の細胞数よりも有意に増加する。したがって、ｅｘＣＭＰにおいてＣＸＣＲ４発現レベルが低下していることは、ｅｘＣＭＰの脾臓での細胞増殖の活発さと関連している可能性がある。また、インテグリンの発現については、ｆｒｅｓｈＣＭＰではＩｔｇａ４やＬ－ｓｅｌｅｃｔｉｎが高発現している一方で、ｅｘＣＭＰではそれらの発現レベルは低く、Ｉｔｇｂ１／ｂ２／ｂ３，　Ｉｔｇａ６，　Ｐ－ｓｅｌｅｃｔｉｎが高発現していた。また、セリンプロテアーゼであるＤＰＰ４の発現がｅｘＣＭＰで有意に低い点も特徴的であった。フローサイトメトリーによればｅｘＣＭＰはＤＤＰ４陰性である（図１３Ｂ参照）。ＤＰＰＩＶ－ＧｌｏTM　ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ａｓｓａｙによれば、ｆｒｅｓｈＣＭＰはＤＰＰ４活性を有するが、ｅｘＣＭＰはＤＰＰ４活性を有さない（図１３Ｃ参照）。ＤＰＰ４発現が低いことによりサイトカインへの応答性が向上している可能性が示唆される（Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．，　１８（１２）：　１７８６－１７９６，　２０１２参照）。続いて、ｅｘＣＭＰとｆｒｅｓｈＣＭＰで分化段階に差があるかどうか、骨髄前駆細胞に関連する遺伝子発現を比較した。ＭＰＯやＧａｔａ１などの骨髄球および赤血球系の成熟マーカーはｆｒｅｓｈＣＭＰでより高発現していた。一方、Ｐｆ４やＩｔｇａ２ｂ（Ｃｄ４１）、Ｎｆｅ２など血小板関連の遺伝子はｅｘＣＭＰで高発現していた。その他、過去の論文にて報告されている遺伝子セットを比較しても骨髄系細胞への分化寄与度は遺伝子発現レベルで互いに異なっており、ｅｘＣＭＰとｆｒｅｓｈＣＭＰはどちらもＣＭＰとしての特徴を有しながらも、似て非なる細胞であることが分かった。結果を表１にまとめた。
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４．ｅｘＣＭＰは脾臓での早期造血により放射線照射後のレシピエントをレスキューできる
　ｅｘＣＭＰは早期に脾臓で造血することから、ＨＳＣのみを移植する際よりも早く造血を立ち上げることで、放射線照射後の橋渡しとしての役割を担えると考えた。そこで、ｅｘＣＭＰを混合して移植した際に、造血再構築の時空間的動態がどのように変化するかを調べるために、Ａｋａ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋ＫＳＬ分画３０００細胞と、Ａｋａ＋　ｅｘＣＭＰ　１００００細胞をＦ１マウス骨髄細胞５×１０5細胞と共に致死的放射線照射マウスに移植し、経時的なＩＶＩＳによるイメージングを行った。すると予想通りに、Ａｋａ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋ＫＳＬ分画のみを移植した際と比較して、より早期にｅｘＣＭＰ由来の造血ピークを確認することができた（図１４Ａ，　Ｂ参照）。シグナル自体は移植後３日目の時点ですでに確認でき、ｅｘＣＭＰ由来の脾臓での造血を検出できた（図１４Ｃ参照）。実際にレスキューとして貢献できていることを確認するために、Ａｋａ＋　ＣＤ１５０＋ＣＤ２０１＋ＫＳＬ分画３０００細胞と、Ａｋａ＋　ｅｘＣＭＰ　１００００細胞を致死的放射線照射マウスに移植し、末梢血の解析により早期の立ち上がりを調べた。その結果予想通りに、末梢血のＨｂ値および好中球・マクロファージ数、血小板数すべて、ｅｘＣＭＰを混合して移植した方が早期に回復することが確認できた（図１４Ｄ参照）。これらのレスキューが脾臓依存的であることを確認するために、同様の実験を脾臓摘出マウスに行ったところ、正常マウスと比較してＨｂ値および好中球・マクロファージ数の回復が遅延した（図１４Ｅ参照）。以上から、ｅｘＣＭＰ　は脾臓での造血を通して早期の造血を立ち上げることができることが分かった。
　この技術を応用し、定期的にｅｘＣＭＰのみを移植することで致死的放射線照射マウスをレスキューできると考え、致死的放射線照射を行ったマウスに対し、１週間毎にｅｘＣＭＰを３００００細胞、あるいは１０００００細胞を定期的に移植した（図１５Ａ参照）。その結果、予想通りにいずれも長期的にマウスを生存させることができた（図１５Ｂ，　Ｃ参照）。同様の実験を脾臓摘出マウスで行うとレスキューに失敗したことから、これらの効果は脾臓依存的であることが確認できた。１０００００細胞を移植した１０日目の末梢血解析を行ったところ、１０日目時点ではいずれのマウス群も全て生存していたが、脾臓摘出マウスではＨｂ値、好中球・マクロファージ数、血小板数全てが低下していることが分かった（図１５Ｄ参照）。以上から、ｅｘＣＭＰ　は脾臓依存的な早期造血を通じて、放射線照射後のマウスの造血再構築に貢献することができ、移植後の時空間的動態を把握することで、計画的な投与により放射線照射後のレスキューが可能となった。
５．Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｅｘｐａｎｄｅｄ　ＣＭＰは他家移植にて、放射線照射後のレシピエントをレスキューする
　臨床において、患者自身由来のグラフトを予め準備しておく自家移植は免疫拒絶をおこさないという点で非常に優れているが、課題も多い。まず、患者毎に個別に調整するためコストが高く、また患者自身から細胞を採取して操作し治療に応用するまでに長い時間を要する。また、患者自身から細胞を採取するため、細胞のクオリティが患者の状態に依存してしまい、その後の技術応用に支障をきたす可能性がある。これらの問題点を解決できるのは他家移植であり、あらゆる患者に投与可能な共通細胞ストックが作成できれば、応用性は非常に高い。これまでの実験から、ｅｘＣＭＰが脾臓での早期造血により放射線照射後のマウスをレスキュー可能であることが分かったので、次にｅｘＣＭＰが他家移植可能かどうか検討した。Ｂ６マウスから採取した細胞由来のＡｋａ＋　ｅｘＣＭＰ　１×１０5細胞を放射線照射したＢ６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し、５日目にＩＶＩＳイメージングを行った。その結果、Ｂ６マウスに移植した場合はこれまで通り脾臓での早期造血を確認できたが、ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した場合は脾臓での早期造血は確認できず、むしろ脾臓以外の骨髄で造血シグナルが確認された。これは脾臓が髄外造血としての臓器ではなく、他家移植においては免疫組織として機能することで免疫拒絶が起こっているためと考えた。実際、過去に実施された臨床研究では、脾臓を何らかの理由で摘出している患者に対して他家移植を行った際は、通常時と比較してむしろ造血回復が早くなるという結果が報告されている、これは、脾臓が免疫組織として機能するため他家移植においてはむしろ造血回復の妨げとなっているためだと考えられる。そこで、他家移植でも脾臓を髄外造血の場として有効活用するために、ｅｘＣＭＰのユニバーサル化を計画した。Ｂ６マウス骨髄からＣＤ３４－ＫＳＬ細胞を採取して５－７日間培養した後、ＣＲＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて、ＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１の存在に重要なβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子のノックアウトを行った。その後さらに３日間培養を行い、ノックアウト効率をＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１の発現の有無をＦＡＣＳで確認することで解析したところ、用意したｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　１　（配列番号１：ＣＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＡＣ）　とｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　２　（配列番号２：ＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＧ）それぞれにおいて、ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　１では約９０％、ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　２では約７０％の細胞でＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１のノックアウトが確認できた（図１６Ａ参照）。以降の実験ではノックアウト効率の良かったｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　１を選択した。その後、レンチウイルスを用いてＡｋａｌｕｃ遺伝子を導入し、１－２週間増幅培養した後にＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１　（－）のｅｘＣＭＰをソーティングにより回収した。ＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１　（－）の細胞はＮＫ細胞からの攻撃を受けることが知られているため、移植２日前にａｎｔｉ－ＡＳＧＭ１抗体の投与によってレシピエントＢＡＬＢ／ｃマウスのＮＫ　細胞を枯渇させた上で放射線照射し、１×１０5細胞のＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１　（－）　ｅｘＣＭＰ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｅｘＣＭＰ；　ＵＮｅｘＣＭＰ）を移植した。その結果、ノックアウトを行っていないコントロールの細胞を移植したマウスでは移植後５日目も７日目も脾臓での造血を確認されず、また造血の様子も増幅しなかったが、ＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１　（－）　ｅｘＣＭＰを移植したマウスの脾臓では移植後５日目の時点で造血が確認でき、７日目になるとシグナルはさらに増幅した（図１６Ｂ，　Ｃ参照）。実際に７日目のマウスの脾臓を採取して解析するとｍＮＧ＋細胞数はＵＮｅｘＣＭＰを移植したマウスで有意に多く、ＵＮｅｘＣＭＰが脾臓で造血しており（図１６Ｃ参照）、ＭＨＣ　ＣｌａｓｓＩ（－）の赤血球、好中球・マクロファージへの分化を確認できた。以上から、ＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１　（－）　ｅｘＣＭＰはＮＫ細胞処理後の他家移植において、脾臓を造血の場として利用して早期造血できることが分かった。次に、実際に放射線照射後のＢＡＬＢ／ｃマウスをレスキューできるかどうか確かめるために、ＮＫ処理した放射線照射後のＢＡＬＢ／ｃマウスに対して、ＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１　（－）　ｅｘＣＭＰあるいはコントロールｅｘＣＭＰ　１×１０5細胞を１週目と２週目に移植し、３週目にＢＡＬＢ／ｃの骨髄細胞１×１０6個を移植した。その結果、予想通りに、コントロールのｅｘＣＭＰを移植したマウスは２週間以上生き延びることができなかったが、ＭＨＣ　Ｃｌａｓｓ１　（－）　ｅｘＣＭＰを移植したマウスは長期に生存することができた（図１６Ｄの左パネル参照）。骨髄細胞を移植後４週目に末梢血を解析したところ、ＵＮｅｘＣＭＰ由来の細胞はほとんど確認できず、ＵＮｅｘＣＭＰが短期的な造血により個体をレスキューしたことが確認できた（図１６Ｄの右パネル参照）。このように、今回移植後の時空間的動態を明らかにしたｅｘＣＭＰと細胞のユニバーサル化を組み合わせることで、放射線照射後のアロレシピエントに対して計画的にＵＮｅｘＣＭＰを投与することでレスキューが可能となった。
　さらにＣＭＰとｅｘＣＭＰ（またはｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＣＭＰ）の造血細胞誘導能を比較した。ｅｘＣＭＰを照射したマウスに移植すると、６日目から脾臓での造血開始が認められ、細胞量の第一のピークが７日目に訪れ、第二のピークが１０日目に訪れた（図１７Ａ，　図１０Ｃ参照）。すなわち、培養前のＣＭＰの移植実験の結果と比較すると、細胞数の増加、およびピークの到来時期が早期化されていた（図１０Ｃ参照）。移植７日後の脾臓におけるｍＮＧ＋細胞数を測定すると、ＣＭＰよりもｅｘＣＭＰ由来の細胞数が有意に多かった（図１７Ｃ参照）。照射マウスにｅｘＣＭＰ（Ｌｙ５．１）とｆＣＭＰ（Ｆ１）を同細胞移植し、その後、ＧＣＳＦを０日目、１日目、３日目、および５日目に投与して７日目に脾臓を回収した。ｅｘＣＭＰ由来細胞は、ＧＣＳＦに反応して脾臓において細胞数を増加させた。ｆＣＭＰと比較するとｅｘＣＭＰの方がＧＣＳＦに対して高い応答性を示し、その結果、ｅｘＣＭＰ由来の細胞数がｆＣＭＰ由来の細胞数よりも増加することが示された（図１７Ｄ参照）。
　ｍＮＧ＋のＣＭＰ、ＭＥＰ、およびＧＭＰ、並びに上記（５）の培養条件で培養して得られたｅｘＣＭＰおよびｅｘＧＭＰを照射マウスに投与して７日目に脾臓を回収した。フローサイトメトリーにより蛍光を発する移植細胞由来の細胞数を計数した。その結果、Ｔｅｒ１１９＋細胞は、ｅｘＣＭＰ移植群において有意に増加した（図１０Ｅ参照）。また、Ｇｒ／Ｍａｃ１＋細胞もｅｘＣＭＰ移植群において有意に増加した。このことから早期造血の立ち上げにｅｘＣＭＰ分画が有用であることがさらに示された（図１８参照）。
　ヒトＣＤ３４＋末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を回収し、ヒトＴＰＯ、ヒトＳＣＦ、ヒトＩＬ６、Ｆｌｔ３Ｌをそれぞれ５０ｎｇ／ｍＬ、およびｓｔｅｍｒｅｇｅｎｉｎ　１（ＳＲ１）を１μＭ含む無血清培地中で、回収した細胞を１週間培養した。無血清培地としては、ＳｔｅｍｐａｎＴＭ　ＳＦＥＭを用いた。ＣＭＰ分画または得られた培養物中のｅｘＣＭＰ分画または造血幹細胞分画を照射マウスに移植し、移植７日後に脾臓を回収して、ｅｘＣＭＰ由来の細胞数を評価した。その結果、ヒトＣＤ３４＋ＰＢＭＣからヒトＣＭＰ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ１２３＋ＣＤ４５ＲＡ－）およびヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）（ＣＤ３４＋ＣＤ３８－ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ９０＋）を増殖させることができ、かつ得られた細胞に由来する細胞数を脾臓において増加させることができた（図１９参照）。
　ヒトＣＭＰを回収し、ヒトＴＰＯ、ヒトＳＣＦ、ヒトＩＬ６、Ｆｌｔ３Ｌをそれぞれ５０ｎｇ／ｍＬ、および図に記載の各種因子の存在下で培養した。その結果、図２０Ａに示されるように、ヒトＣＭＰは、血清非存在下、かつアルブミン非存在下でも増殖させることができた。特に、Ｓｏｌｕｐｌｕｓ、ＳＲ１、ニコチンアミド、およびＰＶＡのいずれかの存在下で、ＣＭＰを、アルブミン非存在下で増殖させることができた。このようにヒトＣＭＰは、様々な条件下で培養でき、かつ増殖させることができた。
　得られたＣＭＰ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋画分）をフローサイトメトリにより分析した。その結果は、図２０Ｂに示されるように、培養物がＣＤ１２３＋ＣＤ３４ＲＡ-のＣＭＰを含むことを示した。全細胞中のＣＭＰの割合は、約３３．３％であった。図２０Ｃに示されるように、得られた培養物中のヒトＣＭＰ（ＣＤ１２３＋ＣＤ３４ＲＡ-）は、ＩＴＧＡ４を高発現し、ＤＰＰ４を低くしか発現しなかった。得られた培養物中のＣＭＰをＮＯＧマウスに移植した。その結果、図２０Ｄに示されるように、得られたヒトＣＭＰは、マウスに生着し、生体内で血液細胞を産生した。

 

Claims (18)

  1. 　細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含み、
    　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、生体中の骨髄の造血幹細胞分画に含まれるＣＭＰと比較して、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡ４、ＤＰＰ４、ＭＰＯ、ＣＥＢＰＡ、およびＧＡＴＡ１からなる群から選択される１以上または全てのマーカー遺伝子の発現が下方制御されている、組成物。
  2. 　細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含み、
    　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、血清アルブミンフリーの培地中で増殖したものである、組成物。
  3. 　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）が、ＤＰＰ４陰性である、請求項１または2に記載の組成物。
  4. 　前記培地は、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含む、請求項２または３に記載の組成物。
  5. 　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）において、ＣＸＣＲ４がノックダウンまたはノックアウトされている、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）が、主要組織適合性遺伝子複合体を細胞膜表面に有しない、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 　細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団は骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含み、造血幹細胞移植の移植前処置に供されたレシピエントに投与される、組成物。
  8. 　請求項１～６のいずれか一項において定義される細胞集団を含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 　造血幹細胞移植の前に、前記移植と同時に、または前記移植の後に投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 　レシピエントにおいて造血幹細胞移植における移植後の造血の早期化を補助することに用いるための、請求項８または９に記載の組成物。
  11. 　レシピエントの生存を補助することに用いるための、請求項９に記載の組成物。
  12. 　レシピエントに複数回投与される、請求項１０または１１に記載の組成物。
  13. 　脾臓における造血を誘導することに用いるための、請求項８～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含む細胞集団を培養する方法であって、
    　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含む細胞集団を血清アルブミンフリーの培地中で培養することを含み、これにより、骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を増殖させることを含む、方法。
  15. 　培地が、ポリビニルアルコールまたは修飾ポリアルキレングリコールを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 　請求項１４または１５に記載の方法であって、培養後の細胞集団から骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を回収することをさらに含む、方法。
  17. 　請求項１６に記載の方法により得られる骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）を含む細胞集団を含む組成物。
  18. 　骨髄球性共通前駆細胞（ＣＭＰ）は、生体中の造血幹細胞分画に含まれるＣＭＰと比較して、ＣＸＣＲ４、ＩＴＧＡ４、ＤＰＰ４、ＭＰＯ、ＣＥＢＰＡ、およびＧＡＴＡ１からなる群から選択される１以上または全てのマーカー遺伝子の発現が下方制御されている、請求項１７に記載の組成物。

     
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