WO2021131261A1 - 細胞群及びその取得方法 - Google Patents

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WO2021131261A1
WO2021131261A1 PCT/JP2020/039003 JP2020039003W WO2021131261A1 WO 2021131261 A1 WO2021131261 A1 WO 2021131261A1 JP 2020039003 W JP2020039003 W JP 2020039003W WO 2021131261 A1 WO2021131261 A1 WO 2021131261A1
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cell group
serum
cell
medium
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里佳 田中
吉田　裕明
知也 長田
三奈子 古賀
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学校法人順天堂大学
株式会社リィエイル
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    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)

Definitions

  • the present invention relates to a cell group and a method for obtaining the cell group.
  • the cell group of the present invention is selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor for mononuclear cells derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood. It is obtained by culturing in a medium containing 4 or less factors and serum.
  • the present invention also selects mononuclear cells from bone marrow, cord blood or peripheral blood from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor 4 or less.
  • a therapeutic composition for ischemic, inflammatory or refractory wounds comprising a group of cells obtained by culturing in a medium containing serum.
  • the vascular endothelial cell differentiation dynamics analysis method revealed the existence of endothelial cell-like large colony (differentiated EPC colony) -forming cells and endothelial cell-like small colony (undifferentiated EPC colony) forming cells, and the therapeutic effect of cell transplantation.
  • Patent Document 2 Further, a method for efficiently amplifying CD34 and / or CD133-positive cells from bone marrow mononuclear cells has been shown (Patent Document 3).
  • a method for amplifying a cell group enriched with vascular endothelial progenitor cells or anti-inflammatory / immune tolerance-inducing cells from a mononuclear cell fraction derived from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood (hereinafter, In this specification, it may be referred to as "QQ-MNC method")).
  • the methods include (1) stem cell factor (SCF), (2) interleukin 6 (IL-6), and (3) FMS-like tyrosine kinase 3 ligand.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • the present inventors have obtained mononuclear cells derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood from stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor.
  • stem cell factor interleukin 6
  • FMS-like tyrosine kinase 3 ligand FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
  • thrombopoietin vascular endothelial growth factor
  • An object of the present invention is to provide a cell group.
  • the cell group of the present invention is selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor for mononuclear cells derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood. It is obtained by culturing in a medium containing 4 or less factors and serum.
  • the present invention also aims to provide a method for obtaining a cell group.
  • mononuclear cells derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood are selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor 4 Including culturing in a medium containing the following factors, as well as serum.
  • composition of the present invention also comprises mononuclear cells derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood, stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor. It contains a group of cells obtained by culturing in a medium containing 4 or less factors selected from the group and serum.
  • Mononuclear cells derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood are selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor of 4 or less.
  • Aspect 2 The cell group according to Aspect 1, wherein the medium comprises 3 or 4 factors selected from stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor.
  • the medium comprises 3 or 4 factors selected from stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor.
  • the serum is bovine or human serum.
  • Aspect 4 The cell group according to any one of aspects 1-3, wherein the serum is contained in the medium at a concentration of 0.5% by volume or more and 10% by volume.
  • Aspect 5 Aspect 1-4 in which the total number of cells having CD206 (+), CD34 (+) or CD3 (+) is 60% or more, and the total number of cells having CCR2 ( ⁇ ) is 95% or more.
  • [Aspect 6] The cell group according to Aspect 5, wherein 50% or more of the cells are CXCR4 (+) in CD206 (+).
  • [Aspect 7] The cell group according to Aspect 5 or 6, wherein 80% or more of the cells are CXCR4 (+) in CD206 (+).
  • the total number of cells having CD206 (+), CD34 (+) or CD3 (+) is 60% or more, and the total number of cells having CCR2 ( ⁇ ) is 95% or more.
  • a composition for treating an ischemic disease, an inflammatory disease or a refractory wound which comprises the cell group according to any one of aspects 1-7.
  • Aspect 15 The therapeutic composition according to aspect 14, wherein the ischemic disease is limb ischemia.
  • Aspect 16 The therapeutic composition according to aspect 14 or 15, wherein the ischemic disease is limb ischemia with an ulcer.
  • Aspect 17 The therapeutic composition according to any one of aspects 14-16, which promotes angiogenesis and / or wound healing.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry (FACS) fractionation of the constituent cell components of RE-01 prepared from the peripheral blood of a healthy person.
  • FACS flow cytometry
  • FIG. 2 shows the analysis results of flow cytometry (FACS) regarding the constituent cell components of RE-01 prepared from the peripheral blood of a healthy person different from that of FIG.
  • FIG. 3 shows the analysis results of flow cytometry (FACS) on the constituent cell components of RE-01 prepared from the peripheral blood of a 53-year-old diabetic female patient.
  • a cell group (MNC-QQ) obtained by culturing in a serum-free medium containing five types of factors was used.
  • FIG. 1 shows the results of flow cytometry (FACS) fractionation of the constituent cell components of RE-01 prepared from the peripheral blood of a healthy person.
  • FIG. 2 shows the analysis results of flow cytometry (FACS) regarding the constituent cell components of RE-01 prepared from the peripheral blood of a healthy person different from that of FIG.
  • FIG. 3 shows the analysis results
  • FIG. 4 shows the results of examining the angioplasty ability of RE-01 using human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • FIG. 4A shows the time change of the number of formed lumens from the start of culturing
  • FIG. 4B shows the number of formed lumens 2.75 hours after the start of culturing
  • FIG. 4C shows the number of fluorescently labeled test cells incorporated into the luminal structure 2.75 hours after the start of culture.
  • FIG. 5 shows the results of flow cytometry (FACS) fractionation of the constituent cellular components of RE-01 prepared from peripheral blood of patients with severe lower limb ischemia.
  • FACS flow cytometry
  • the present invention relates to a cell group.
  • the cell group of the present invention is selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor for mononuclear cells derived from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood. It is obtained by culturing in a medium containing 4 or less factors and serum.
  • the above cell group is obtained by culturing mononuclear cells derived from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood.
  • the "mononuclear cell” used for obtaining the above cell group is a general term for cells having a round nucleus contained in peripheral blood, bone marrow, umbilical cord blood, etc., and is a lymphocyte, monocyte, macrophage, vascular endothelial progenitor cell. , Hematopoietic stem cells, etc. are included.
  • mononuclear cells by collecting bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood from an animal and extracting the fraction by, for example, using a blood collection tube for mononuclear cell separation or by subjecting it to density gradient centrifugation. Is obtained.
  • the density gradient centrifugation method is not particularly limited as long as a mononuclear sphere fraction is formed.
  • Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich) may be used.
  • the animal species from which bone marrow, cord blood or peripheral blood is derived is not particularly limited.
  • Animal species include mammals in general, including humans, to whom cell transplantation therapy is applied for diseases such as ischemic disease, inflammatory disease, or refractory wound. In view of the purpose of clinical application, it is preferably human.
  • the target from which bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood is derived is not particularly limited. As one aspect, it may be, for example, a healthy person, a diabetic patient, or a patient with severe lower limb ischemia.
  • SCF Stem cell factor
  • SCF Stem cell factor
  • a glycoprotein consisting of 248 amino acids and having a molecular weight of about 30,000.
  • SCF may be any type of SCF as long as it is useful for culturing mononuclear cells for the acquisition of the above cell population. It is preferably a soluble type.
  • the origin of SCF is not particularly limited. Non-limitingly, a recombinant that is expected to have a stable supply is preferable, and a human recombinant is particularly preferable. Commercially available ones are known.
  • the concentration of SCF in the culture medium also varies depending on the type of SCF used, and is not particularly limited as long as it is useful for culturing mononuclear cells.
  • human recombinant SCF it is not limited, for example, 10 to 1000 ng / mL, preferably 50 to 500 ng / mL, and more preferably about 100 ng / mL.
  • Interleukin 6 is a glycoprotein with a molecular weight of 210,000 isolated as a factor that induces the final differentiation of B cells into antibody-producing cells.
  • IL-6 is generally known to be involved in immune response, proliferative differentiation of hematopoietic and nervous system cells, acute phase reaction and the like.
  • the IL-6 used for acquiring the cell group is not particularly limited and is appropriately selected. When used for culturing human mononuclear cells, human IL-6 is preferable, and a recombinant that is expected to have a stable supply is particularly preferable. Commercially available ones are known.
  • the concentration of IL-6 in the culture medium also varies depending on the type of IL-6 used, and is not particularly limited as long as it is useful for culturing mononuclear cells.
  • human recombinant IL-6 it is not limited, for example, 1 to 500 ng / mL, preferably 5 to 100 ng / mL, and more preferably about 20 ng / mL.
  • FL FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
  • FL FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
  • FL FMS-like tyrosine kinase 3 ligand
  • the FL used for obtaining the cell group may be any type of FL as long as it is useful for culturing mononuclear cells. Commercially available ones are known.
  • the concentration of FL in the culture medium also varies depending on the type of FL used, and is not particularly limited as long as it is useful for culturing mononuclear cells.
  • a human recombinant Flt-3 ligand it is not limited, for example, 10 to 1000 ng / mL, preferably 50 to 500 ng / mL, and more preferably about 100 ng / mL.
  • Thrombopoietin is a type of hematopoietic cytokine, and is known to act specifically on the process of making megakaryocytes from hematopoietic stem cells and promote the production of megakaryocytes.
  • the origin of TPO used for obtaining the above cell group is not particularly limited.
  • a recombinant that is expected to be stably supplied is preferable, and a human recombinant is particularly preferable. Commercially available ones are known.
  • the concentration of TPO in the culture medium varies depending on the type of TPO used and is not particularly limited as long as it is useful for culturing mononuclear cells, but in the case of human recombinant TPO, it is not limited, for example, 1 to 1. It is 500 ng / mL, preferably 5 to 100 ng / mL, more preferably about 20 ng / mL.
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • EPC vascular endothelial progenitor cells
  • VEGF165 is preferred.
  • the origin of VEGF is not particularly limited. A recombinant that is expected to be stably supplied is preferable, and a human recombinant is particularly preferable. Commercially available ones are known.
  • the concentration of VEGF in the culture medium also depends on the type of VEGF used and is not particularly limited as long as it is useful for culturing mononuclear cells.
  • human recombinant VEGF165 it is not limited, for example, about 5 to 500 ng / mL, preferably about 20 to 100 ng / mL, and more preferably about 50 ng / mL.
  • Various factors added to the culture medium used for culturing mononuclear cells may also be unified with factors derived from animals of the same species as animals from which mononuclear cells are derived, without limitation.
  • a cell culture suitable for allogeneic transplantation such as allogeneic transplantation can be obtained. It is also possible to obtain a cell culture suitable for allogeneic transplantation by using mononuclear cells derived from an individual intended for cell transplantation.
  • Culture medium can be prepared. For example, after dissolving the necessary components in a commercially available culture medium to a predetermined concentration, sterilize by filtration sterilization or the like, or aseptically add and dilute the stock solution sterilized by filtration sterilization or the like to the commercially available culture medium. This allows the culture medium to be prepared. Filtration sterilization can be performed according to a method usually practiced in the art, for example, using a 0.22 ⁇ m or 0.45 ⁇ m millipore filter or the like.
  • a medium usually used in the art can be used, and for example, a culture medium known as a growth medium for hematopoietic stem cells can be used.
  • a culture medium known as a growth medium for hematopoietic stem cells can be used.
  • the basal medium used as the culture medium include Stemline II, DMEM, MEM, IMDM, RPMI, SCGM, EBM and the like.
  • the medium for culturing mononuclear cells is selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor 4 In addition to the following factors, it includes serum.
  • the type of serum is not particularly limited. In one embodiment, but not limited, the serum is bovine or human serum. In one embodiment, the serum is fetal bovine serum and / or human serum albumin.
  • the concentration of serum in the medium is also not particularly limited. In one embodiment, the serum is contained in the medium in an amount of 0.1% by volume or more, 0.3% by volume or more, and 0.5% by volume or more. There is no particular upper limit to the concentration of serum in the medium. In one embodiment, it is within 30% by volume, within 20% by volume, within 10% by volume, and within 5% by volume. Non-limitingly, serum is contained in the medium at a concentration of 0.1% by volume or more and 20% by volume, and in the medium at a concentration of 0.5% by volume or more and 10% by volume.
  • Mononuclear cell culture is performed by adding a cell suspension containing mononuclear cells to a medium containing the factors and serum described above.
  • the cell suspension the body fluid itself containing mononuclear cells (for example, bone marrow fluid, umbilical cord blood, peripheral blood) can also be used.
  • the culture conditions for mononuclear cells are not particularly limited, and can be carried out under the conditions usually carried out in the art. Non-limitingly, for example, it is cultured at about 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • the culture period is not limited, for example, 3 days or more, 5 days or less, 6 days or less, 7 days or less, and 10 days or less. For example, 3 days-10 days, 3 days-6 days.
  • the concentration of mononuclear cells in the medium is not particularly limited as long as the culture of mononuclear cells is possible, but for example, about 0.1 to 10 ⁇ 10 6 cells / ml, more preferably about 0.5 to 5 ⁇ 10. 6 cells / ml.
  • the "cell group” is a general term for cells obtained as a result of culturing mononuclear cells in a medium containing the above-mentioned factors and serum.
  • the culture medium used for culturing mononuclear cells contains 4 or less of the factors selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor. ..
  • the medium comprises two or more factors, or three or more factors, selected from stem cell factors, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligands, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor. In one embodiment, the medium comprises 2 or more and 4 or less factors selected from the above 5 factors. In one embodiment, the medium comprises 3 or 4 factors selected from stem cell factors, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligands, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor.
  • the culture medium used for culturing mononuclear cells is, for example, i) a combination of FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoetin and vascular endothelial growth factor, or , Ii) Includes a combination of stem cell factor, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, and vascular endothelial growth factor.
  • the medium more preferably comprises a combination of about 80-120 ng / ml FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, about 15-25 ng / ml thrombopoietin and about 40-60 ng / ml vascular endothelial growth factor.
  • mononuclear cells derived from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood are selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoetin and vascular endothelial growth factor 4 or less.
  • the cell group obtained by culturing in a medium containing the factor and serum is a cell group of CD206 (+), CD34 (+) or CD3 (+) from the cell group of mononuclear cells before culturing. Also includes many.
  • the proportion of cells that are CD206 (+), CD34 (+) or CD3 (+) is amplified by 1.5 times or more, 2 times or more and 3 times or more by culture.
  • the total number of cells having CD206 (+), CD34 (+) or CD3 (+) in the cell group is 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more of the whole cell group. 90% or more.
  • the cell group contains more cells that are CCR2 ( ⁇ ) than the cell group of mononuclear cells before culturing.
  • the proportion of cells having CCR2 ( ⁇ ) is amplified by 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more by culturing.
  • CCR2 ( ⁇ ) cells account for 60% or more, 80% or more, 90% or more, and 95% or more of the entire cell group.
  • 60% or more cells are CD206 (+), CD34 (+) and CD3 (+), and 95% or more cells are CCR2 ( ⁇ ).
  • CD206 positivity containing anti-inflammatory macrophages M2 increases CD206 positivity containing anti-inflammatory macrophages M2; CD34-positive cells and CD133-positive cells including vascular endothelial progenitor cells (EPC) increase; T cells, especially CD3-positive cells such as Helper T cells and Angiogenic T cells, increase.
  • EPC vascular endothelial progenitor cells
  • CCR2-positive cells B cells (CD19-positive cells) and NK cells (CD56-positive cells), which are inflammatory monocytes / macrophages, decreased.
  • mononuclear cells derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood are selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor.
  • the cell group obtained by culturing in a medium containing the following 4 or less factors and serum shows a higher recovery rate than the cell group obtained by the QQ-MNC method.
  • the survival rate is high. It is also excellent in stability after recovery. These bring about a higher therapeutic effect.
  • mononuclear cells derived from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood are selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoetin and vascular endothelial growth factor 4 or less.
  • the cells containing CXCR4 (+) in CD206 (+) are contained in a larger amount than the cell group of mononuclear cells before culturing.
  • the proportion of cells that are CXCR4 (+) in CD206 (+) is amplified by 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times or more by culture.
  • the number of cells that are CXCR4 (+) in CD206 (+) is 50% or more, 60% or more, 70% or more, and 80% or more. In one embodiment, 50% or more of the cells are CXCR4 (+) in CD206 (+). In one embodiment, 80% or more of the cells are CXCR4 (+) in CD206 (+).
  • the cell group of the present invention is a cell group containing more cells that are CXCR4 (+) in this CD206 (+) than the cell group obtained by the QQ-MNC method.
  • the present invention also relates to a method for obtaining a cell group.
  • mononuclear cells derived from bone marrow, cord blood or peripheral blood are selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor 4 Including culturing in a medium containing the following factors, as well as serum.
  • cell group “mononuclear sphere”, “stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor”, “serum”, “medium”, etc. This is as described in “1. Cell group” above.
  • the cell group obtained by the above method 80% or more of the cells are CD206 (+), CD34 (+) and CD3 (+), and 95% or more of the cells are CCR2 ( ⁇ ). Is.
  • 50% or more of the cells are CXCR4 (+) in CD206 (+).
  • the medium comprises 3 or 4 factors selected from stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor.
  • the serum is bovine or human serum. In one embodiment, the serum is fetal bovine serum. In one embodiment, the serum is contained in the medium at a concentration of 0.5% by volume or more and 10% by volume.
  • the present invention further relates to therapeutic compositions for ischemic, inflammatory or refractory wounds.
  • the therapeutic composition of the present invention includes the cell group described in "1. Cell group”.
  • the mononuclear cells from which the cell group is derived may be derived from a subject using the therapeutic composition (autologous) or from a subject other than the subject using the therapeutic composition (allogeneic).
  • Ischemia is a disease that occurs when blood flow in a tissue decreases due to a decrease in blood volume, causing tissue damage such as cell degeneration, atrophy, and fibrosis. Ischemia is roughly classified into obstructive ischemia, compressive ischemia, convulsive ischemia, and compensatory ischemia depending on the cause. Persistent ischemia results in cell degeneration, atrophy, and fibrosis. "Ischemia disease” includes limb ischemia, ischemic ulcer, ischemic heart disease, cerebral infarction and the like.
  • Cerebral infarction (or cerebral infarction) causes cerebral ischemia due to obstruction or narrowing of the arteries that feed the brain, and the brain tissue becomes necrotic or nearly necrotic due to lack of oxygen or nutrients. It is classified into cerebral thrombosis and cerebral embolism.
  • Extratremity ischemia is a disease in which the arteries that supply blood to the limbs are narrowed or occluded, and when this arteriosclerosis obliterans becomes severe, it becomes severe limb ischemia, and symptoms such as pain and intractable ulcers. In the worst case, disconnection may be required.
  • the limbs are lower limbs in one aspect.
  • the ischemic disease is limb ischemia.
  • Ischemic disease is limb ischemia with ulcers.
  • Inflammatory disease is a general term for diseases that cause symptoms due to abnormalities such as tissue damage caused by some cause. Inflammatory diseases include Crohn's disease, liver cirrhosis, hepatitis, ulcerative colitis, inflammatory bowel disease and the like.
  • the therapeutic composition promotes angiogenesis and / or wound healing. Therefore, it can be applied to diseases that can be treated by angiogenesis and / or wound healing.
  • Disease that can be treated by angiogenesis and / or wound healing includes, for example, ischemic disease (for example, ischemic heart disease such as myocardial infarction and angina, lower limb ischemia such as lower limb ischemic arteriosclerosis, and Burger. (Burger's disease), vascular injury. It can also be used to heal wounds such as skin ulcers or to create artificial blood vessels.
  • ischemic disease for example, ischemic heart disease such as myocardial infarction and angina
  • lower limb ischemia such as lower limb ischemic arteriosclerosis
  • Burger. Burger.
  • vascular injury vascular injury. It can also be used to heal wounds such as skin ulcers or to create artificial blood vessels.
  • the effect of applying the therapeutic composition can be confirmed by a method known per se.
  • the disease that can be treated by angiogenesis is a lower limb ischemic disease
  • the therapeutic effect after transplantation can be evaluated, for example, by examining the lower limb blood flow rate and the necrosis improvement rate.
  • the increase in blood flow can be measured by measuring the values of the laser Doppler imaging analysis.
  • the necrosis improvement rate can be visually measured as a rim salvage score.
  • the mode of use of the above therapeutic composition is not particularly limited.
  • the cell group itself which is the active ingredient, may be used, or the cell group may be suspended in a liquid medium.
  • the liquid medium may be any liquid that can be injected into humans, and for example, isotonic electrolyte infusion, phosphate buffer, physiological saline, or DMEM, which is a serum-free medium, can be used.
  • the liquid medium may contain a compound such as albumin that is preferable for cell survival.
  • Patient-derived serum is preferably used as a compound containing albumin. Further, in the case of cryopreservation, it may be suspended in a frozen cell preservation solution or the like.
  • the application target of the above therapeutic composition is not particularly limited as long as it is a target that requires treatment of ischemic disease, inflammatory disease or intractable wound.
  • Kit further relates to a kit for culturing mononuclear cells derived from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood and obtaining a cell group.
  • the kit contains a medium containing 4 or less factors selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor, and serum.
  • factors selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor, and serum.
  • factors selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor, and serum.
  • serum serum
  • cell group “mononuclear sphere”, “stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin and vascular endothelial growth factor”, “serum”, “medium”, etc. As explained in “1. Cell group”.
  • the present invention also relates to a method for treating an ischemic disease, an inflammatory disease or a refractory wound, which comprises applying the cell group described in "1. Cell group" to a subject in need.
  • the present invention further relates to the use of the cell group described in "1.
  • Cell Group in a method for treating an ischemic disease, an inflammatory disease or a refractory wound, including application to a subject in need, or With respect to its use in therapeutic compositions for ischemic diseases, inflammatory diseases or refractory wounds.
  • Example 1 Culture of RE-01 cell group
  • mononuclear cells were isolated from peripheral blood and cultured.
  • the centrifuge tube from which the cells were collected was made up with EDTA-PBS, and then centrifuged (300 xg, room temperature, 15 minutes), and the cells were collected as a sediment.
  • the recovered cells were incubated in ACK hemolytic buffer (15 mL / tube) (Gibco, Thermo-Fisher) for 5 minutes at room temperature to remove contaminating erythrocytes.
  • the composition of the ACK hemolytic buffer is NH 4 Cl 8,290 mg / l; KHCO 3 1,000 mg / l; EDTA. A Na 2 ⁇ 2H 2 O 37mg / l. Then, the operation of measuring up with EDTA-PBS and collecting cells by centrifugation (200 xg, room temperature, 10 minutes) or (100 xg, room temperature, 15 minutes) was repeated twice.
  • the cell concentration was adjusted to 1x10 6 / mL, and 2 mL was seeded in each well of the 6-well culture plate.
  • the cells were cultured under normal culture conditions (37 ° C., 5% CO 2 ) for 5 days. After completion of the culture for 5 days, the cells were collected in a centrifuge tube and centrifuged at 250 xg ( ⁇ 1000 rpm) for 7-10 minutes three times. After centrifugation, the cell counting, viability measurements, except for samples for QC (check) test, and the remaining cells were suspended in Plasmalyte A, 2.5% human albumin serum, to a concentration of 8x10 5 cells / mL Adjusted to.
  • the obtained cell group may be referred to as "RE-01".
  • Example 1 Flow cytometric analysis
  • a cell group (referred to as "RE-01") obtained by culturing from peripheral blood of a healthy person using a medium containing three types of factors and serum.
  • flow cytometric analysis was performed.
  • FACS buffer composition: 2% 2 mM was added FBS EDTA-PBS cells were suspended in (1.5 ⁇ 10 6 cells / 300 [mu] L-FACS buffer) to FC blocking reagent (manufactured by Mirutenyi Inc.) 10 ⁇ L added And incubated at 4 ° C. for 30 minutes. The cells after incubation were dispensed into equal volumes of staining reaction tubes (100 ⁇ L / tube ⁇ 3 tubes). 2 ⁇ L of each primary antibody was added to each aliquot and cultured at 4 ° C. for 20 minutes.
  • FACS buffer 5 ⁇ 10 5 cells / 200 ⁇ 300 [mu] L-FACS buffer.
  • Flow cytometric measurements were performed using a BD FACSAria TM III cell sorter (manufactured by BD).
  • each cell surface marker was examined using an antibody against each cell surface marker in the obtained cell group.
  • the antibody against each cell surface marker the following commercially available ones were used.
  • Anti-CD206 antibody PE / Cy7-labeled anti-human CD206 (MMR) antibody (manufactured by BioLegend);
  • Anti-CD34 antibody PE-labeled anti-human CD34 antibody (manufactured by BioLegend);
  • Anti-CD3 antibody Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 antibody (manufactured by BioLegend);
  • Anti-CXCR4 antibody APC-labeled anti-human CD184 (CXCR4) antibody (manufactured by BD);
  • Anti-CCR2 antibody PerCP / Cy5.5-labeled human CD192 (CCR2) antibody (manufactured by BioLegend).
  • RE-01 is larger depending on the size of the cell component (horizontal axis: FSC) and the density of the cell component such as granules contained in the cell (vertical axis: SSC) in the Scatter analysis by FACS. It is divided into three living cell populations (referred to in this specification as "A region”, “B region”, and “C region”, respectively). In peripheral blood mononuclear cells before culturing, only regions A and B appear, and region C is not seen. The A region mainly contains lymphocytes, and the B region contains monocytes.
  • vascular endothelial progenitor cells CD34-positive cells migrate from the A region to the B region, and M2 macrophages (CD206). A C region containing a large amount of positive cells) appears.
  • FIG. 2 results of flow cytometric analysis of RE-01 obtained by culturing mononuclear cells collected from another healthy person using a medium containing the three factors and serum described in Example 1 are shown in FIG. 2. Shown in. Similarly, in the case of healthy individuals of different individuals, three regions A, B, and C appeared. Also, the total number of cells that are CD206 (+), CD34 (+) or CD3 (+) is 86.57%, and CCR2 (+) is 0.33%, which is CCR2 ( ⁇ ). The cells were 99.67%. Furthermore, the percentage of cells with CXCR4 (+) in CD206 (+) was 92.97%.
  • Stemline (registered trademark) II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium (Cat No. S0192, manufactured by Sigma-Aldrich) was used. No serum added, 100 units / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL streptomycin with 50 ng / mL VEGF 165 , 20 ng / mL TPO, 100 ng / mL Flt-3 ligand, 100 ng / mL SCF, 20 ng / mL IL-6 It was prepared by adding each factor of the above aseptically.
  • the obtained cells were prepared in a growth medium at 1x10 6 / mL, 2 mL was seeded in each well of a 6-well culture plate, and the cells were cultured under normal culture conditions (37 ° C., 5% CO 2 ) for 7 days. After completion of the culture for 7 days, the cells were collected in a centrifuge tube and centrifuged at 250 xg ( ⁇ 1000 rpm) for 7-10 minutes three times. After centrifugation, the cell counting, viability measurements, except for samples for QC (check) test, the remaining cells PlasmaLyte [0073] A, the concentration of the suspension to 8x10 5 cells / mL in 2.5% human albumin serum It was prepared to be.
  • the obtained cell group may be referred to as "MNC-QQ".
  • Example 2 Flow cytometry analysis
  • a cell group obtained by culturing from peripheral blood of a diabetic patient using a medium containing three types of factors and serum, and none containing the above five types of factors (1).
  • Flow cytometry was performed on the cell group (MNC-QQ) obtained by culturing with a serum medium, and the two were compared. Specifically, the expression of each cell surface marker was examined using an antibody against each cell surface marker in the obtained cell group.
  • RE-01 had a higher recovery rate and survival rate after culturing than MNC-QQ. Furthermore, the proportion of cells in the C region, which is a new cell group formed after culturing, was high, and in particular, the proportion of CD206 + cells, which is one of the cell types responsible for the effectiveness of the cell group, was high. Even more surprisingly, the proportion of CXCR4 + in CD206 + was remarkably high, and it was found that the cell groups of RE-01 and MNC-QQ had different cell compositions.
  • RE-01 or MNC-QQ (1x10 5 pieces) collected in 1.5 mL tubes was suspended in 500 ⁇ L of basal medium (Stemline II), 5 ⁇ L of acLDL labeled with Alexa Fluor 488 was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 60 minutes. .. After completion of the incubation, 1 mL of FACS buffer was added to the tube and mixed by inversion. Then, a 5-minute centrifugation operation (250 xg, 4 ° C.) was performed, and the cells were collected as a sediment. The recovered cells (RE-01) were suspended in 300 ⁇ L of FACS buffer and stored cooled in ice until measurement. Immediately before the measurement, DAPI (2 ⁇ L) was added, and the percentage of cells incorporating acLDL and DAPI was determined by measurement using a flow cytometer.
  • Angioplasty ability mononuclear cells collected from the blood of a healthy person were cultured in a serum medium in the same manner as in Example 1, and a group of illuminated cells (RE-01) was used. The angioplastic ability was examined.
  • a cell group obtained by culturing in a serum-free medium containing five types of factors was used.
  • Human umbilical vein endothelial cells capable of forming a lumen (obtained from Lonza, Basel, Switzerland) were used in 8-10 passages and co-cultured with cells of each group and HUVEC.
  • FIG. 4A shows the time change of the number of formed lumens from the start of culturing
  • FIG. 4B shows the number of formed lumens 2.75 hours after the start of culturing
  • FIG. 4C shows the number of fluorescently labeled test cells incorporated into the luminal structure 2.75 hours after the start of culture.
  • the lumen forming ability when HUVEC and RE-01 were co-cultured for a certain period of time was improved as compared with the case where HUVEC alone was cultured or HUVEC and MNC-QQ were co-cultured.
  • RE-01 had more cells incorporated into the formed luminal structure.
  • RE-01 has higher in vitro angioplasty ability than MNC-QQ cultured in a serum-free medium for a longer period of time (7 hours) in vitro.
  • Example 4 Culture and characterization of RE-01 cell group
  • mononuclear cells were isolated and cultured from the peripheral blood of a patient with severe lower limb ischemia. Furthermore, the characteristics of the obtained cell group were evaluated.
  • peripheral blood was collected from a patient with severe lower limb ischemia using a blood collection tube for mononuclear cell separation manufactured by BD Vacutainer (registered trademark) CPT (trademark) BD.
  • CPT registered trademark
  • the blood collection tube was centrifuged as it was, and then transported and stored in a refrigerator until the start of culture after arrival.
  • the area above the gel barrier in the CPT TM blood collection tube containing mononuclear cells and plasma was collected in a centrifuge tube, and the inside of the blood collection tube such as on the gel barrier was washed with a small amount of EDTA-PBS and collected in the same centrifuge tube.
  • the centrifuge tube from which the cells were collected was made up with EDTA-PBS, and then centrifuged (300 xg, room temperature, 15 minutes), and the cells were collected as a sediment.
  • the recovered cells were incubated in ACK hemolytic buffer (15 mL / tube) (Gibco, Thermo-Fisher) for 5 minutes at room temperature to remove contaminating erythrocytes.
  • the composition of the ACK hemolytic buffer is NH 4 Cl 8,290 mg / l; KHCO 3 1,000 mg / l; EDTA. A Na 2 ⁇ 2H 2 O 37mg / l. Then, the operation of measuring up with EDTA-PBS and collecting cells by centrifugation (200 xg, room temperature, 10 minutes) or (100 xg, room temperature, 15 minutes) was repeated twice.
  • the mononuclear cells collected in (1) are collected in 1 mL of growth medium (50 ng / mL VEGF 165 , 20 ng / mL TPO, 100 ng / mL Flt-3 ligand, 100 units / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL.
  • growth medium 50 ng / mL VEGF 165 , 20 ng / mL TPO, 100 ng / mL Flt-3 ligand, 100 units / mL penicillin, 100 ⁇ g / mL.
  • Iscove's Modified Dulvecco's Medium IMDM
  • streptomycin 0.5% FBS
  • human albumin serum 0.5% human albumin serum
  • the cells were cultured under normal culture conditions (37 ° C., 5% CO 2 ) for 5 days. After completion of the culture for 5 days, the cells were collected in a centrifuge tube and centrifuged at 250 xg ( ⁇ 1000 rpm) for 7-10 minutes three times. After centrifugation, the cell counting, viability measurements, except for samples for QC (check) test, and the remaining cells were suspended in Plasmalyte A, 2.5% human albumin serum, to a concentration of 8x10 5 cells / mL Adjusted to.
  • FACS buffer composition: 2% 2 mM was added FBS EDTA-PBS cells were suspended in (1.5 ⁇ 10 6 cells / 300 [mu] L-FACS buffer) to FC blocking reagent (manufactured by Mirutenyi Inc.) 10 ⁇ L added And incubated at 4 ° C. for 30 minutes. The cells after incubation were dispensed into equal volumes of staining reaction tubes (100 ⁇ L / tube ⁇ 3 tubes). 2 ⁇ L of each primary antibody was added to each aliquot and cultured at 4 ° C. for 20 minutes.
  • FACS buffer 5 ⁇ 10 5 cells / 200 ⁇ 300 [mu] L-FACS buffer.
  • Flow cytometric measurements were performed using a BD FACSAria TM III cell sorter (manufactured by BD).
  • each cell surface marker was examined using an antibody against each cell surface marker in the obtained cell group.
  • the antibody against each cell surface marker the following commercially available ones were used.
  • Anti-CD206 antibody PE / Cy7-labeled anti-human CD206 (MMR) antibody (manufactured by BioLegend);
  • Anti-CD34 antibody PE-labeled anti-human CD34 antibody (manufactured by BioLegend);
  • Anti-CD3 antibody Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 antibody (manufactured by BioLegend);
  • Anti-CXCR4 antibody APC-labeled anti-human CD184 (CXCR4) antibody (manufactured by BD);
  • Anti-CCR2 antibody PerCP / Cy5.5-labeled human CD192 (CCR2) antibody (manufactured by BioLegend).
  • Fig. 5 The results are shown in Fig. 5. As shown in FIG. 5, in the cell group in which mononuclear cells isolated from the peripheral blood of a patient with severe lower limb ischemia were cultured, three regions A, B, and C appeared as in Example 2. Also, the total number of cells that are CD206 (+), CD34 (+) or CD3 (+) is 83.72%, and CCR2 (+) is 1.63%, which is CCR2 ( ⁇ ). The cells were 98.37%. Furthermore, the percentage of cells with CXCR4 (+) in CD206 (+) was 83.72%.
  • the RE-01 cell group As described above, even from patients with severe lower limb ischemia, the RE-01 cell group, particularly CD206 (+), was cultured using a medium containing three types of factors and serum, as in the case of healthy subjects or diabetic patients in Example 1. , CD34 (+) or CD3 (+) total 80% or more, CCR2 ( ⁇ ) cells 95% or more, and CXCR4 (+) in CD206 (+). It was revealed that the RE-01 cell group, in which 80% or more of the cells were obtained, was obtained.
  • the present invention provides a new cell group having high angiogenic ability and wound healing ability.
  • the cell group of the present invention can be used, for example, as a therapeutic agent for patients with intractable limb ischemic diseases. This makes it possible to bring about life innovation such as improvement of patient QOL and reduction of the burden of long-term care, such as avoidance of amputation, and has great social significance.
  • the provision of new cell groups can lead to the construction of new therapeutic strategies and can provide insights into vascular lesions in general.
  • this cell group surprisingly achieves a stable high recovery rate and survival rate in a short culture period compared to the existing QQ-MNC method, and is more stable after production. Therefore, it can be a great industrial advantage.

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Abstract

本発明は、細胞群及びその取得方法を提供する。本発明の細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる。

Description

細胞群及びその取得方法
　本発明は、細胞群及びその取得方法、に関する。本発明の細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、ものである。本発明はまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる細胞群を含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物、に関する。
　近年、虚血性疾患を対象として、骨髄単核球移植治療や末梢血幹細胞採取による血管内皮前駆細胞（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ；ＥＰＣ）を用いた細胞移植治療法がおこなわれるようになった。それゆえ、ＥＰＣを大量に培養する技術が特に求められていた。ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性細胞からの血管内皮前駆細胞の生体外増幅方法は、効率的なＥＰＣの培養技術を提供することを可能にした（特許文献１）。さらに血管内皮細胞分化動態解析方法によって内皮細胞様大コロニー（分化型ＥＰＣコロニー）形成細胞と内皮細胞様小コロニー（未分化型ＥＰＣコロニー）形成細胞が存在することが明らかになり細胞移植による治療効果を予測、把握することを可能にした（特許文献２）。また骨髄単核球からＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３陽性細胞を効率的に増幅させる方法を示した（特許文献３）。
　国際公開ＷＯ２０１４／０５６１１５４に示されるように、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球画分から血管内皮前駆細胞又は抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化した細胞群を増幅させる方法（以下、本明細書において、「ＱＱ−ＭＮＣ法」）と呼称する場合がある）を記載している。当該方法は、（１）幹細胞因子（Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ；ＳＣＦ），（２）インターロイキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６；ＩＬ−６），（３）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　３　ｌｉｇａｎｄ；ＦＬ），（４）トロンボポエチン（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ；ＴＰＯ）及び（５）血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）の５つの因子を含む無血清培地で、単核球を培養することにより、ＥＰＣを含む細胞群を生体外で増幅する、というものである。
国際公開　ＷＯ２００６／０９０８８２ 国際公開　ＷＯ２００６／０９０８８６ 国際公開　ＷＯ２００６／０９３１７２ 国際公開ＷＯ２０１４／０５６１１５４
　本発明者らは、鋭意研究に努めた結果、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で、培養することにより、血管再生能及び創傷治癒能を有し、かつ、ＱＱ−ＭＮＣ法によって得られる細胞群とは異なる新たな細胞群の取得に成功し、本発明を想到した。
　本発明は、細胞群を提供することを目的とする。本発明の細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、ものである。
　本発明はまた、細胞群の取得方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養する、ことを含む。
　本発明はさらに、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物を提供することを目的とする。本発明の組成物は、本発明はまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる細胞群を含む。
　限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］　骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、細胞群。
［態様２］　培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、態様１に記載の細胞群。
［態様３］　血清が、ウシ又はヒトの血清である、態様１又は２に記載の細胞群。
［態様４］　血清が、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる、態様１−３のいずれか１項に記載の細胞群。
［態様５］　ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（−）である細胞が９５％以上である、態様１−４のいずれか１項に記載の細胞群。
［態様６］　ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、態様５に記載の細胞群。
［態様７］　ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上である、態様５又は６に記載の細胞群。
［態様８］　骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養する、ことを含む、態様１−７のいずれか１項に記載の細胞群の取得方法。
［態様９］　細胞群において、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％％以上であり、そして、ＣＣＲ２（−）である細胞が９５％以上である、態様８に記載の方法。
［態様１０］　細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、態様８又は９に記載の方法。
［態様１１］　培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、態様８−１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］　血清がウシ胎児血清である、態様８−１１のいずれか１項に記載の方法。
［態様１３］　血清が、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる、態様８−１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］　態様１−７のいずれか１項に記載の細胞群を含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物。
［態様１５］　虚血性疾患が、四肢虚血である、態様１４に記載の治療用組成物、
［態様１６］　虚血性疾患が、漬瘍を伴う四肢虚血である、態様１４又は１５に記載の治療用組成物。
［態様１７］　血管新生及び／又は創傷治癒を促進する、態様１４−１６のいずれか１項に記載の治療用組成物。
図１は、健常人の末梢血より調製したＲＥ−０１の構成細胞成分に関するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による分画の結果を示す。比較例として、培養前の末梢血単核球のＦＡＣＳの結果も示す。 図２は、図１とは別の健常人の末梢血より調製したＲＥ−０１の構成細胞成分に関するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）の解析結果を示す。 図３は、５３歳糖尿病女性患者の末梢血より調製したＲＥ−０１の構成細胞成分に関するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）の解析結果を示す。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ−ＱＱ）を用いた。 図４は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いて、ＲＥ−０１の血管形成能を調べた結果を示す。比較例として、ＲＥ−０１の代わりに、ＭＮＣ−ＱＱを用いた場合、ＨＵＶＥＣのみの場合を調べた。図４Ａは、形成した管腔数の培養開始からの時間変化、図４Ｂは、培養開始から２．７５時間後の形成した管腔数を示す。図４Ｃは、培養開始から２．７５時間後の管腔構造中に取り込まれている蛍光標識された試験細胞数を示す。 図５は、重症下肢虚血の患者の末梢血より調製したＲＥ−０１の構成細胞成分に関するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による分画の結果を示す。
　１．細胞群
　本発明は、細胞群に関する。
　本発明の細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することによって得られる。
　上記細胞群は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を培養することによって得られる。上記細胞群の取得のために用いられる「単核球」とは、末梢血、骨髄又は臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞の総称で、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。例えば、動物から骨髄、臍帯血又は末梢血を採取し、それを例えば単核球分離用採血管を用いることにより、又は密度勾配遠心法に付して該分画を抽出することにより単核球が得られる。密度勾配遠心法としては、単核球分画が形成されれば特に限定されない。例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてもよい。
　骨髄、臍帯血又は末梢血が由来する動物種は、特に限定されない。動物種には、虚血性疾患、炎症性疾患、又は難治性創傷等の疾患に対する細胞移植療法が適用されるヒトを含む哺乳動物一般が含まれる。臨床応用という目的に鑑みれば、好ましくはヒトである。
　骨髄、臍帯血又は末梢血が由来する対象は特に限定されない。一態様として、例えば、健常者、糖尿病患者、又は、重症下肢虚血の患者であってもよい。
　幹細胞因子（ＳＣＦ）は、２４８個のアミノ酸からなる分子量約３０，０００の糖タンパク質である。選択的スプライシングにより可溶型と膜結合型が存在するが、上記細胞群の取得のためにＳＣＦは単核球の培養に有用である限りいずれのタイプのＳＣＦでもよい。好ましくは可溶型である。ＳＣＦの由来等は特に限定されない。非限定的に、安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＳＣＦの濃度は、用いるＳＣＦの種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されない。ヒト組換えＳＣＦの場合であれば、非限定的に、例えば１０~１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０~５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　インターロイキン６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への最終分化を誘導する因子として単離された分子量２１万の糖タンパク質である。ＩＬ−６は、一般に、免疫応答、造血系や神経系細胞の増殖分化、急性期反応等に関与することが知られている。上記細胞群の取得のために用いるＩＬ−６は、特に限定されず、適宜選択される。ヒトの単核球の培養に用いる場合には、ヒトＩＬ−６が好ましく、安定した供給が見込まれる組換え体が特に好ましい。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＩＬ−６の濃度は、用いるＩＬ−６の種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されない。ヒト組換えＩＬ−６の場合であれば、非限定的に、例えば１~５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５~１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
　ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬ）は、初期造血制御において重要な役目を担う受容体型チロシンキナーゼのリガンドとして知られている。いくつかの選択的スプライシングによる産物が知られているが、造血系幹細胞の増殖を刺激するという報告がある。上記細胞群の取得のために用いるＦＬは、単核球の培養に有用である限り、いずれのタイプのＦＬであってもよい。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＦＬの濃度は、用いるＦＬの種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されない。ヒト組換えＦｌｔ−３リガンドの場合であれば、非限定的に、例えば１０~１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０~５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、造血系サイトカインの一種であり、造血幹細胞から巨核球が作られる過程に特異的に作用し、巨核球の産生を促進することが知られている。上記細胞群の取得のために用いるＴＰＯの由来等は特に限定されない。安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＴＰＯの濃度は、用いるＴＰＯの種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されないが、ヒト組換えＴＰＯの場合であれば、非限定的に、例えば１~５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５~１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬである。
　血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に特異的に作用する増殖因子であり、主に血管周囲の細胞で産生されることが知られている。選択的スプライシングによってサイズの異なる数種のＶＥＧＦタンパク質が産生されるが、上記細胞群の取得のために用いるＶＥＧＦはＥＰＣのコロニー形成を可能にする限りいずれのタイプのＶＥＧＦでもよい。好ましくはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦの由来等は特に限定されない。安定した供給が見込まれる組換え体が好ましく、特に好ましくはヒト組換え体である。商業的に入手可能なものが知られている。培養培地中のＶＥＧＦの濃度は、用いるＶＥＧＦの種類によっても異なり、単核球の培養に有用である限り特に限定されな。ヒト組換えＶＥＧＦ１６５の場合であれば、非限定的に、例えば約５~５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２０~１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
　単核球の培養に用いる培養培地に添加される各種因子はまた、非限定的に、単核球が由来する動物と同種の動物に由来する因子で統一してもよい。このように単核球及び各種因子の由来を統一することで、同種異系移植等の同種移植に好適な細胞培養物が得られる。また、細胞移植が意図される個体由来の単核球を用いることで、同種同系移植に好適な細胞培養物を得ることも可能である。
　上記した各成分は培養培地で所定の濃度に溶解するか、あるいはあらかじめ各成分の濃縮液（ストック溶液）を調製し、培養培地で所定の濃度に希釈することによって、単核球を培養するための培養培地を調製することができる。例えば市販の培養培地に必要な成分を所定の濃度となるよう溶解した後、濾過滅菌等により滅菌するか、あるいは濾過滅菌等により滅菌したストック溶液を無菌的に市販の培養培地に添加、希釈することによって培養培地を調製することができる。濾過滅菌は当分野で通常実施されている方法に準じて行うことができ、例えば０．２２μｍや０．４５μｍのミリポアフィルター等を用いて行う。
　本発明で用いられる「培養培地」は、当分野で通常用いられている培地を利用することができ、例えば造血幹細胞の増殖用培地として知られている培養地を用いることができる。培養培地として用いられる基礎培地としては、例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ　ＩＩ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ＳＣＧＭ、ＥＢＭ等が挙げられる。
　上記細胞群を取得するために、単核球を培養するための培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子の他に、血清、を含む。
　血清の種類は特に限定されない。非限定的に、一態様において、血清は、ウシ又はヒトの血清である。一態様において、血清は、ウシ胎児血清及び／又はヒト血清アルブミンである。培地中における血清の濃度も特に限定されない。一態様において、血清は培地中に、０．１容量％以上、０．３容量％以上、０．５容量％以上含まれる。培地中の血清の濃度の上限は特にない。一態様において、３０容量％以内、２０容量％以内、１０容量％以内、５容量％以内である。非限定的に、血清は、培地中に０．１容量％以上２０容量％の濃度、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる。
　単核球培養は、単核球を含有する細胞懸濁液を、上述した因子及び血清を含む培地に添加することにより行われる。細胞懸濁液としてはまた、単核球を含有する体液自体（例えば、骨髄液、臍帯血、末梢血）を用いることもできる。単核球の培養条件は特に限定されず、通常当分野で実施される条件で実施することができる。非限定的に、例えば、５％ＣＯ２雰囲気下、約３７℃で培養される。培養期間は、非限定的に例えば、３日間以上であり、５日間以内、６日間以内、７日間以内、１０日間以内である。例えば、３日間−１０日間、３日間−６日間である。単核球の培地中の濃度は、単核球の培養を可能とする限り特に限定されないが、例えば約０．１~１０×１０６細胞／ｍｌ、より好ましくは約０．５~５×１０６細胞／ｍｌである。
　本明細書において、「細胞群」とは、単核球を上述した因子及び血清を含有する培地で培養した結果得られる細胞の総称である。
　単核球の培養に用いる培養培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される因子のうち、４以下の因子を含む。
　一態様において、培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される、２以上の因子、又は３以上の因子を含む。一態様において、培地は、上記５因子から選択される、２以上４以下の因子を含む。一態様において、培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される、３因子又は４因子を含む。
　非限定的に、単核球の培養に用いる培養培地は、従って本発明の培養方法で用いられる培養培地は例えば、ｉ）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子の組み合わせ、あるいは、ｉｉ）幹細胞因子、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、及び血管内皮細胞増殖因子の組み合わせを含む。培地は、より好ましくは、約８０~１２０ｎｇ／ｍｌのＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、約１５~２５ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン及び約約４０~６０ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞増殖因子の組み合わせを含む。
　一態様において、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することによって得られる細胞群は、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞を、培養前の単核球の細胞群よりも多く含む。非限定的に、培養により、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の割合が、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上に増幅される。非限定的に、細胞群中、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が細胞群全体の、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上である。そして細胞群は、ＣＣＲ２（−）である細胞を、培養前の単核球の細胞群よりも多く含む。非限定的に、培養により、ＣＣＲ２（−）である細胞の割合が、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上に増幅される。非限定的に、細胞群中、ＣＣＲ２（−）である細胞が、細胞群全体の６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上である。非限定的に、一態様において、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）及びＣＤ３（＋）である細胞が６０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（−）である細胞が９５％以上である。
　骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することにより、安定的に、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）及びＣＤ３（＋）をより多く含む細胞群を得ることができる。さらにＱＱ−ＭＮＣ法によって得られる細胞群よりも、抗炎症性マクロファージＭ２を含むＣＤ２０６陽性中のＣＸＣＲ４陽性細胞の割合が顕著に増える。非限定的に、本発明者らは、上記培養により、以下の効果の観察されることが見いだされた。
　抗炎症性マクロファージＭ２を含むＣＤ２０６陽性が増加する；
　血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）と含むＣＤ３４陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞が増加する；
　Ｔ細胞、特にＨｅｌｐｅｒ　Ｔ細胞やＡｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　Ｔ細胞などのＣＤ３陽性細胞が増加する。
　一方、炎症性単球／マクロファージであるＣＣＲ２陽性細胞、Ｂ細胞（ＣＤ１９陽性細胞）及びＮＫ細胞（ＣＤ５６陽性細胞）は減少することが観察された。
　非限定的に、一態様において、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することによって得られる細胞群は、ＱＱ−ＭＮＣ法によって得られる細胞群よりも、より高い回収率を示す。さらに、生存率が高い。そして、回収後の安定性にも優れている。これらは、より高い治療効果をもたらすものである。
　一態様において、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養することによって得られる細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞を、培養前の単核球の細胞群よりも多く含む。非限定的に、培養により、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞の割合が、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上に増幅される。非限定的に、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上である。一態様において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である。一態様において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上である。
　本発明の細胞群は、ＱＱ−ＭＮＣ法によって得られる細胞群よりも特にこのＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞をより多く含む細胞群である。
　２．細胞群の取得方法
　本発明はまた、細胞群の取得方法に関する。
　本発明の方法は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養する、ことを含む。
　「細胞群」、「単核球」、「幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子」の各因子、「血清」、「培地」等については、上記「１．細胞群」で説明した通りである。
　細胞群における、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）及びＣＤ３（＋）である細胞の割合、ＣＣＲ２（−）である細胞の割合、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞の割合、についても、上記「１．細胞群」で説明した通りである。
　一態様において、上記方法によって得られる細胞群において、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）及びＣＤ３（＋）である細胞が８０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（−）である細胞が９５％以上である。
　一態様において、上記方法によって得られる細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である。
　一態様において、上記方法において、培地は、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む。
　一態様において、上記方法において、血清は、ウシ又はヒトの血清である。一態様において、血清はウシ胎児血清である。一態様において、血清は、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる。
　３．治療用組成物
　本発明は、さらに、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物に関する。本発明の治療用組成物は、「１．細胞群」で説明した細胞群を含む。細胞群が由来する単核球は、治療用組成物を使用する対象に由来しても（自家）、治療用組成物を使用する対象以外に由来しても（他家）よい。
　「虚血性疾患」は、血量の減少によって組織内の血流が下がり、細胞の変性、萎縮、線維化などの組織障害が生じることによって起こる疾患である。虚血はその原因により、閉塞性虚血、圧迫性虚血、痙攣性虚血、代償性虚血に大別される。虚血が持続すると細胞の変性、萎縮、線維化が生じる。「虚血性疾患」には、四肢虚血、虚血性潰瘍、虚血性心疾患、脳梗塞等が含まれる。「脳梗塞」（又は脳軟化症）は、脳を栄養する動脈の閉塞、又は狭窄のため、脳虚血を来たし、脳組織が酸素、又は栄養の不足のため壊死、又は壊死に近い状態になる事をいう、脳血栓及び脳塞栓に分類される。「四肢虚血」は、手足に血液を供給する動脈が狭窄又は閉塞する疾患であり、この閉塞性動脈硬化症が重症化すると、重症の四肢虚血となり、疼痛などの症状及び難治性の潰瘍が生じ、最悪の場合、切断が必要になる場合もある。非限定的に、四肢は一態様において下肢である。
　非限定的に、一態様において、虚血性疾患は、四肢虚血である。虚血性疾患は、潰瘍を伴う四肢虚血である。
　「炎症性疾患」は、なんらかの原因により組織損傷などの異常が生じることで症状を起こす疾患の総称である。炎症性疾患には、クローン病、肝硬変、肝炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患等が含まれる。
　上記治療用組成物は、血管新生及び／又は創傷治癒を促進する。よって、血管新生及び／又は創傷治癒により治療できる疾患に適用することができる。「血管新生及び／又は創傷治癒により治療できる疾患」としては、例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、狭心症等の虚血性心疾患、下肢虚血性動脈硬化症等の下肢虚血、バージャー（Ｂｕｒｇｅｒ）病）、血管損傷が挙げられる。また、皮膚潰瘍等の創傷を治癒するため、あるいは人工血管の作製に使用できる。治療用組成物の適用の効果は、自体公知の方法により確認できる。例えば血管新生により治療できる疾患が下肢虚血性疾患である場合には、移植後の治療効果を例えば下肢血流量及び壊死改善率を調べることによって評価することができる。血流量の増加の測定はレーザドップラーイメージング解析の値を測定することによって行うことができる。また壊死改善率はリムサルベージスコアとして目視により測定することができる。
　上記治療用組成物の使用態様は特に限定されない。有効成分たる細胞群そのものであってもよいし、細胞群を液状媒体に懸濁したものであってもよい。液体媒体はヒトに注入可能な液体であればいずれであってもよく、例えば、等張電解質輸液やリン酸緩衝液や生理食塩水あるいは無血清培地であるＤＭＥＭなども利用可能である。また液体媒体にはアルブミンなど細胞の生存に好ましい化合物が含まれてもよい。好ましくはアルブミンを含む化合物として患者由来の血清があげられる。また凍結保存する場合には凍結細胞保存液などで懸濁したものであってもよい。
　上記治療用組成物の適用対象は、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療が必要である対象であれば、特に限定されない。非限定的に、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ネズミ、モルモット等が含まれる。
　４．キット
　本発明はさらにまた、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を培養し、細胞群を取得するためのキットに関する。
　上記キットは、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地を含む。各因子、血清は、培地に予め添加されていてもよいし、あるいは、別々の容器に格納されており、使用時に培地に添加されてもよい。
　「細胞群」、「単核球」、「幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子」の各因子、「血清、「培地」等については、上記「１．細胞群」で説明した通りである。
　５．治療方法等
　本発明はまた、「１．細胞群」で説明した細胞群を、必要のある対象に適用することを含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療方法に関する。
　本発明はさらに、「１．細胞群」で説明した細胞群の、必要のある対象に適用することを含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療方法への使用、あるいは、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物への使用、に関する。
　「虚血性疾患」、「炎症性疾患」又は「難治療性創傷」、「細胞群の適用態様」、「適用対象」等については、「３．治療用組成物」に記載した通りである。
　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
　実施例１　ＲＥ−０１細胞群の培養
　本実施例において、末梢血より単核球を単離し培養した。
　（１）単核球の単離
　健常人もしくは糖尿病患者のボランティアから、ＢＤ　バキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）ＢＤ社製）単核球分離用採血管を用いて１００ｍＬの末梢血を採取した。採血後、そのまま採血管を遠心した後、輸送、到着後培養開始までは冷蔵で保管した。単核球及び血漿を含むＣＰＴ（商標）採血管内のゲルバリアより上を遠心管へ回収し、少量のＥＤＴＡ−ＰＢＳでゲルバリア上など採血管内を洗いこみ、同じ遠心管へ回収した。細胞を回収した遠心管をＥＤＴＡ−ＰＢＳでメスアップしたのち、遠心分離（３００ｘｇ、室温、１５分間）し、沈査として細胞を回収した。回収された細胞は、混入する赤血球を除くためＡＣＫ溶血緩衝液（１５ｍＬ／管）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ社製）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＣＫ溶血緩衝液の組成は、ＮＨ４Ｃｌ　８，２９０ｍｇ／ｌ；ＫＨＣＯ３　１，０００ｍｇ／ｌ；ＥＤＴＡ．Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ　３７ｍｇ／ｌである。その後、ＥＤＴＡ−ＰＢＳでメスアップし、遠心分離（２００ｘｇ、室温、１０分間）又は（１００ｘｇ、室温、１５分間）で細胞を回収する操作を２回繰り返した。
（２）血清培地での培養
　（１）で回収した単核球細胞を、１ｍＬの増殖培地（５０ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦ１６５、２０ｎｇ／ｍＬ　ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ−３リガンド、１００単位／ｍＬ　ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、０．５％　ＦＢＳを添加した　ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）　ＩＩ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ−アルドリッチ社製、Ｃａｔ　Ｎｏ．Ｓ０１９２））に懸濁し、その一部を使用してトリパンブルーを用いた細胞数計数を行った。得られた細胞増殖培地中で、細胞濃度を１ｘ１０６／ｍＬに調製し、６穴培養プレートの各ウェルに２ｍＬずつ播種した。通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で５日間培養した。５日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（~１０００ｒｐｍ）で７−１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞数計測、生存率測定、ＱＣ（確認）試験用のサンプルを除き、残りの細胞はＰｌａｓｍａＬｙｔｅ　Ａ、２．５％　ヒトアルブミン血清に懸濁し、８ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度になるように調整した。以下、得られた細胞群を「ＲＥ−０１」と呼称する場合がある。
　実施例２　ＲＥ−０１細胞群の特性評価
　（１）フローサイトメトリー解析
　本実施例では、実施例１において、健常人の末梢血から３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（「ＲＥ−０１」と呼称する。）について、細胞群の特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリー解析を行った。
　ＦＡＣＳ緩衝液（組成：２％　ＦＢＳを添加した２ｍＭ　ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）中に懸濁した細胞（１．５×１０６細胞／３００μＬ−ＦＡＣＳ緩衝液）にＦＣブロッキング試薬（ミルテニィ社製）を１０μＬ添加し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の細胞群を、染色反応用チューブに等量ずつ分注した（１００μＬ／チューブ×３チューブ）。各アリコートに各一次抗体を２μＬ添加し、４℃で２０分間培養した。その後１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁した（５×１０５細胞／２００~３００μＬ−ＦＡＣＳ緩衝液）。フローサイトメトリー計測は、ＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）　ＩＩＩセルソーター（ＢＤ社製）を用いて行った。
　具体的には、得られた細胞群における各細胞表面マーカーに対する抗体を用いて各細胞表面マーカーの発現を調べた。なお、各細胞表面マーカーに対する抗体は、いずれも下記の市販のものを使用した。
　抗ＣＤ２０６抗体：ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ２０６　（ＭＭＲ）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）；
　抗ＣＤ３４抗体：ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｉｏ　Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
　抗ＣＤ３抗体：Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ７００標識抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏ　Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
　抗ＣＸＣＲ４抗体：ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）抗体（ＢＤ社製）；
　抗ＣＣＲ２抗体：ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識ヒトＣＤ１９２　（ＣＣＲ２）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）。
　結果を図１に示す。図１に示すように、ＲＥ−０１は、ＦＡＣＳによるＳｃａｔｔｅｒ解析において構成する細胞成分のサイズ（横軸：ＦＳＣ）と細胞内に含まれる顆粒等細胞構成成分の密度（縦軸：ＳＳＣ）により大きく３つの生細胞集団に分けられる（本明細書において、各々「Ａ領域」、「Ｂ領域」，「Ｃ領域」と呼称する）。培養前の末梢血単核球では、Ａ、Ｂ領域のみが現れ、Ｃ領域は見られない。Ａ領域には主にリンパ球が含まれ、Ｂ領域には単球が含まれる。増殖培地（実施例１の（２）血清培地）を用いた培養によって得られたＲＥ−０１では、血管内皮前駆細胞（ＣＤ３４陽性細胞）がＡ領域からＢ領域へ移動するほか、Ｍ２マクロファージ（ＣＤ２０６陽性細胞）を多く含むＣ領域が現れる。
　また、別の健常人から採取した単核球から実施例１に記載の３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られたＲＥ−０１のフローサイトメトリー解析の結果をを図２に示す。異なる個体の健常人の場合も同様に、Ａ、Ｂ、Ｃの３領域が現れた。また、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が８６．５７％であり、そして、ＣＣＲ２（＋）が０．３３％であることからＣＣＲ２（−）である細胞が９９．６７％であった。さらに、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞は９２．９７％であった。
　実施例３　ＲＥ−０１細胞群とＭＮＣ−ＱＱ細胞群との比較
　（１）ＲＥ−０１とＭＮＣ−ＱＱの培養
　健常人と糖尿病患者から採取した単核球を、実施例１と同様に、３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養し、ＲＥ−０１を得た。
　比較例として、ＲＥ−０１細胞と同様に単核球を単離したのち、ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）　ＩＩ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（シグマ−アルドリッチ社製、Ｃａｔ　Ｎｏ．Ｓ０１９２）を用いた。血清は添加せず、１００単位／ｍＬ　ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシンに５０ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦ１６５、２０ｎｇ／ｍＬ　ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ−３リガンド、１００ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ−６の５種類の各因子を無菌的に添加することにより調製した。得られた細胞を増殖培地で１ｘ１０６／ｍＬに調製し、６穴培養プレートの各ウェルに２ｍＬずつ播種し、通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で７日間培養した。７日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（~１０００ｒｐｍ）で７−１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞数計測、生存率測定、ＱＣ（確認）試験用のサンプルを除き、残りの細胞はＰｌａｓｍａＬｙｔｅ［００７３］　Ａ、２．５％　ヒトアルブミン血清に懸濁して８ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度になるように調製した。以下、得られた細胞群を「ＭＮＣ−ＱＱ」と呼称する場合がある。
　（２）フローサイトメトリー解析
　実施例１において、糖尿病患者の末梢血から３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群と、上記（１）の５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ−ＱＱ）について、フローサイトメトリーを行い、両者を比較した。具体的には、得られた細胞群における各細胞表面マーカーに対する抗体を用いて各細胞表面マーカーの発現を調べた。
　結果を図３に示す。ＲＥ−０１はＭＮＣ−ＱＱと比較して、培養後の回収率及び生存率が高かった。さらに、培養後に新たにできる細胞群であるＣ領域の細胞の割合が多く、特に細胞群の有効性を担う細胞種のひとつであるＣＤ２０６＋細胞の割合が多かった。さらに驚くべきことにＣＤ２０６＋中のＣＸＣＲ４＋の割合が顕著に多く、ＲＥ−０１とＭＮＣ−ＱＱの細胞群はその細胞組成が異なっていることが分かった。
　（３）ａｃＬＤＬ取り込み能
　実施例１において糖尿病患者の末梢血単核球より調製された、３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＲＥ−０１）と、比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ−ＱＱ）を用いてそのａｃＬＤＬ（アセチル化低密度リポタンパク質）取り込み能を検討した。
　１．５ｍＬチューブに回収したＲＥ−０１又はＭＮＣ−ＱＱ（１ｘ１０５個）を基礎培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ　ＩＩ）５００μＬ中に懸濁し、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ４８８で標識されたａｃＬＤＬ　５μＬを添加、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベート終了後のチューブにＦＡＣＳ緩衝液１ｍＬを加え、転倒混和した。その後、５分間の遠心操作（２５０ｘｇ、４℃）を行い、細胞を沈査として回収した。回収した細胞（ＲＥ−０１）を３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し測定まで氷中冷却保存した。測定直前にＤＡＰＩ（２μＬ）を添加し、フローサイトメーターを用いた測定にてａｃＬＤＬ及び　ＤＡＰＩを取り込んだ細胞の割合を求めた。
　結果を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、全体、特にＣ領域においてａｃＬＤＬの取り込みが高いことが判明した。このことは、２つの細胞群（ＲＥ−０１及びＭＮＣ−ＱＱ）について、実施例２で示した組成の違いが機能の違いに結びつくことを裏付けるものである。
　（４）血管形成能
　本実施例では、健常人の血液から採取した単核球について、実施例１と同様の方法で血清培地を用いて培養し照られた細胞群（ＲＥ−０１）を用いて、その血管形成能を検討した。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ−ＱＱ）を用いた。管腔形成能を持つヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ社、スイス、バーゼルより入手）を、８~１０継代で使用し、各群の細胞とＨＵＶＥＣと共培養した。９６ウェルのプレートに基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）　Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製，米国、ＮＹ））５０μｌ／ウェルを分注し、３７℃、３０分コーティングした。一方、各細胞群を、ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬで標識するために、ＩＭＤＭ　５００μｌ＋ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ　５μｌに懸濁し、３７℃、１時間インキュベートした。
　標識後、各細胞群を１ｘ１０３／２０μｌ、及び、ＨＵＶＥＣを５ｘ１０３／２０μｌになるよう、各々ＰＢＳに再懸濁した。細胞数を調整した懸濁液を、試験細胞群とＨＵＶＥＣが１：１になるよう混和し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に５０μｌずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ２下で、１０時間以上タイムラプス蛍光顕微鏡（オリンパス社製、東京、日本）庫内で培養しつつ写真撮影を行い、培養終了後に倍率１００倍で、形成した管腔数、並びに、管腔構造中に取り込まれている蛍光標識された試験細胞数を目視でカウントした。
　結果を図４に示す。図４Ａは、形成した管腔数の培養開始からの時間変化、図４Ｂは、培養開始から２．７５時間後の形成した管腔数を示す。また図４Ｃに、培養開始から２．７５時間後の管腔構造中に取り込まれている蛍光標識された試験細胞数を示す。ＨＵＶＥＣとＲＥ−０１を一定時間共培養した際の管腔形成能は、ＨＵＶＥＣのみで培養、あるいは、ＨＵＶＥＣとＭＮＣ−ＱＱとの共培養に比べ、向上していた。さらに、ＲＥ−０１はより多くの細胞が、形成された管腔構造中に取り込まれていた。すなわち、生体外においてＲＥ−０１は、無血清培地でより長時間（７時間）培養したＭＮＣ−ＱＱよりもＩｎ　ｖｉｔｒｏ血管形成能が高いことが明らかになった。このことは、２つの細胞群（ＲＥ−０１及びＭＮＣ−ＱＱ）について、実施例３で示した組成の違いが機能の違いに結びつくことを裏付けるものである。
　（５）マウス下肢虚血モデルによる効果
　健常人の血液から採取した単核球を、実施例１と同様の方法で培養した細胞群を用いて、その下肢虚血に対する治療効果をマウスの下肢虚血モデルを用いて検討した。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ−ＱＱ）を用いた。
　（６）安定性試験
　健常人の血液から採取した単核球を、実施例１と同様の方法で培養した細胞群を用いて、回収後７２時間までの安定性を細胞数及び生存率で検討を行った。比較例として、５種類の因子含む無血清培地を用いた培養によって得られた細胞群（ＭＮＣ−ＱＱ）を用いた。
　実施例４　ＲＥ−０１細胞群の培養及び特性評価
　本実施例において、重症下肢虚血の患者の末梢血より単核球を単離し培養した。さらに、得られた細胞群の特性評価を行った。
　（１）単核球の単離
　重症下肢虚血の患者の末梢血より単核球を単離した。単離は実施例１と同様に行った。
　具体的には、重症下肢虚血の患者から、ＢＤ　バキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）ＢＤ社製）単核球分離用採血管を用いて１００ｍＬの末梢血を採取した。採血後、そのまま採血管を遠心した後、輸送、到着後培養開始までは冷蔵で保管した。単核球及び血漿を含むＣＰＴ（商標）採血管内のゲルバリアより上を遠心管へ回収し、少量のＥＤＴＡ−ＰＢＳでゲルバリア上など採血管内を洗いこみ、同じ遠心管へ回収した。細胞を回収した遠心管をＥＤＴＡ−ＰＢＳでメスアップしたのち、遠心分離（３００ｘｇ、室温、１５分間）し、沈査として細胞を回収した。回収された細胞は、混入する赤血球を除くためＡＣＫ溶血緩衝液（１５ｍＬ／管）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ社製）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＣＫ溶血緩衝液の組成は、ＮＨ４Ｃｌ　８，２９０ｍｇ／ｌ；ＫＨＣＯ３　１，０００ｍｇ／ｌ；ＥＤＴＡ．Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ　３７ｍｇ／ｌである。その後、ＥＤＴＡ−ＰＢＳでメスアップし、遠心分離（２００ｘｇ、室温、１０分間）又は（１００ｘｇ、室温、１５分間）で細胞を回収する操作を２回繰り返した。
　（２）血清培地での培養
　単離した単核球を実施例１と同様に血清培地で培養した。基本培地としてｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）の代わりにＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ））を使用した点、並びに、血清としてＦＢＳに加えてヒトアルブミン血清も添加した点が、実施例１と相違する。
　具体的には、（１）で回収した単核球細胞を、１ｍＬの増殖培地（５０ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦ１６５、２０ｎｇ／ｍＬ　ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ−３リガンド、１００単位／ｍＬ　ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、０．５％　ＦＢＳ、０．５％　ヒトアルブミン血清を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ））に懸濁し、その一部を使用してトリパンブルーを用いた細胞数計数を行った。得られた細胞増殖培地中で、細胞濃度を１ｘ１０６／ｍＬに調製し、６穴培養プレートの各ウェルに２ｍＬずつ播種した。通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で５日間培養した。５日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（~１０００ｒｐｍ）で７−１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞数計測、生存率測定、ＱＣ（確認）試験用のサンプルを除き、残りの細胞はＰｌａｓｍａＬｙｔｅ　Ａ、２．５％　ヒトアルブミン血清に懸濁し、８ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度になるように調整した。
　（３）フローサイトメトリー解析
　本実施例では、（１）、（２）において、重症下肢虚血の患者末梢血から単離した単核球を３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によって得られた細胞群（実施例１と同様に「ＲＥ−０１」と呼称する。）について、細胞群の特徴をより明らかにするため、フローサイトメトリー解析を行った。
　ＦＡＣＳ緩衝液（組成：２％　ＦＢＳを添加した２ｍＭ　ＥＤＴＡ−ＰＢＳ）中に懸濁した細胞（１．５×１０６細胞／３００μＬ−ＦＡＣＳ緩衝液）にＦＣブロッキング試薬（ミルテニィ社製）を１０μＬ添加し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後の細胞群を、染色反応用チューブに等量ずつ分注した（１００μＬ／チューブ×３チューブ）。各アリコートに各一次抗体を２μＬ添加し、４℃で２０分間培養した。その後１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁した（５×１０５細胞／２００~３００μＬ−ＦＡＣＳ緩衝液）。フローサイトメトリー計測は、ＢＤ　ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）　ＩＩＩセルソーター（ＢＤ社製）を用いて行った。
　具体的には、得られた細胞群における各細胞表面マーカーに対する抗体を用いて各細胞表面マーカーの発現を調べた。なお、各細胞表面マーカーに対する抗体は、いずれも下記の市販のものを使用した。
　抗ＣＤ２０６抗体：ＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ２０６　（ＭＭＲ）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）；
　抗ＣＤ３４抗体：ＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｉｏ　Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
　抗ＣＤ３抗体：Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ７００標識抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏ　Ｌｅｇｅｎｄ社製）；
　抗ＣＸＣＲ４抗体：ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）抗体（ＢＤ社製）；
　抗ＣＣＲ２抗体：ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識ヒトＣＤ１９２　（ＣＣＲ２）抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）。
　結果を図５に示す。図５に示すように、重症下肢虚血の患者末梢血から単離した単核球を培養した細胞群でも、実施例２と同様にＡ、Ｂ、Ｃの３領域が現れた。また、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が８３．７２％であり、そして、ＣＣＲ２（＋）が１．６３％であることからＣＣＲ２（−）である細胞が９８．３７％であった。さらに、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞は８３．７２％であった。
　以上、重症下肢虚血の患者からも、実施例１の健常人もしくは糖尿病患者と同様に、３種類の因子及び血清を含む培地を用いた培養によってＲＥ−０１細胞群、特に、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が８０％以上であり、ＣＣＲ２（−）である細胞が９５％以上であり、そして、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上であるＲＥ−０１細胞群、が得られることが明らかになった。
　本発明により、高い血管再生能及び創傷治癒能を有する新たな細胞群が提供される。本発明の細胞群は、例えば、難病の四肢虚血疾患の患者の治療薬としての使用できる。これにより、例えば、切断の回避が可能になるなど、患者ＱＯＬの向上、介護負担の軽減などライフイノベーションをもたらすことが可能であり、社会的意義が大きい。また、新規な細胞群の提供は、新たな治療戦略の構築につながるとともに、血管病変全般に対する知見をもたらしうる。さらに本細胞群は高い有効性に加え、驚くべきことに、既存のＱＱ−ＭＮＣ法に比べて短い培養期間で安定的に高い回収率及び生存率を達成し、また製造後にもより安定であるため、産業上非常に大きなメリットとなりうる。

Claims (17)

  1. 　骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、細胞群。
  2. 　培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、請求項１に記載の細胞群。
  3. 　血清が、ウシ又はヒトの血清である、請求項１又は２に記載の細胞群。
  4. 　血清が、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる、請求項１−３のいずれか１項に記載の細胞群。
  5. 　ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（−）である細胞が９５％以上である、請求項１−４のいずれか１項に記載の細胞群。
  6. 　ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、請求項５に記載の細胞群。
  7. 　ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が８０％以上である、請求項５又は６に記載の細胞群。
  8. 　骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養する、ことを含む、請求項１−７のいずれか１項に記載の細胞群の取得方法。
  9. 　細胞群において、ＣＤ２０６（＋）、ＣＤ３４（＋）又はＣＤ３（＋）である細胞の合計が６０％以上であり、そして、ＣＣＲ２（−）である細胞が９５％以上である、請求項８に記載の方法。
  10. 　細胞群において、ＣＤ２０６（＋）中のＣＸＣＲ４（＋）である細胞が５０％以上である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　培地が、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチン及び血管内皮細胞増殖因子から選択される３因子又は４因子を含む、請求項８−１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　血清がウシ胎児血清である、請求項８−１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　血清が、培地中に０．５容量％以上１０容量％の濃度で含まれる、請求項８−１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　請求項１−７のいずれか１項に記載の細胞群を含む、虚血性疾患、炎症性疾患又は難治療性創傷の治療用組成物。
  15. 　虚血性疾患が、四肢虚血である、請求項１４に記載の治療用組成物。
  16. 　虚血性疾患が、潰瘍を伴う四肢虚血である、請求項１４又は１５に記載の治療用組成物。
  17. 　血管新生及び／又は創傷治癒を促進する、請求項１４−１６のいずれか１項に記載の治療用組成物。
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