CN105112374B - 一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞技术领域，涉及一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基及其应用。所述体外扩增培养基包括IMEM基础培养基，还包括如下组分：血清、血小板生成素、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、白介素‑1、白介素‑6、干细胞生长因子和小檗碱。本发明提供的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基具有造血干细胞增殖率高的优点，而且能显著提高造血干细胞移植到受体内的植入能力和造血系统的重建能力，能较好的保持造血干细胞的特性，是一种理想的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，涉及一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基及其应用。
背景技术
造血干细胞（Hematopoietic stem cells, HSCs）是血液系统中的成体干细胞，是一个异质性的群体，具有长期自我更新的能力和分化成各类成熟血细胞的潜能。由于造血干细胞具有多向分化的潜能，将造血干细胞移植到体内是治疗白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤、代谢性疾病、自身免疫性疾病及先天免疫缺陷等严重危害人类健康疾病的有效方法，可以有效的减轻患者的痛苦。但是，由于造血干细胞在体内的数量极少，大大的限制了造血干细胞在临床中的应用。
骨髓、外周血和脐血是造血干细胞的重要来源，介于胎肝和成人骨髓之间的脐血具有采集方便、干细胞含量丰富、移植物抗宿主病发生率低的优点而成为造血重建的重要干细胞来源。虽然脐血造血干细胞相对骨髓造血干细胞含量丰富，但是其数量也无法满足临床的需求，尤其是对较大体重的患者进行造血干细胞移植时，常出现由于造血干细胞数量不足而导致移植延迟的情况。因此，寻找一种安全有效的体外扩增造血干细胞数量的方法，使其数量满足临床的需求，是当前亟需解决的难题。
目前，造血干细胞的体外增殖途径主要有两种，一种是通过基质的灌注进行体外培养，第二种是通过添加细胞因子进行体外培养。由于基质是模仿造血干细胞在体内的生长环境，能够提供造血干细胞各种生长所需的成分，还能调节其生长分化方向，所以在基质支持下的进行灌注体外培养，造血干细胞的生长效果较好。但是，基质含有各种细胞和各种蛋白成分，成分复杂且不明确，对后期造血干细胞的分离造成较大难度，而且成本较高，大大的限制了基质在造血干细胞体外扩增的应用。而通过添加细胞因子进行造血干细胞的体外培养容易出现缺氧、营养不足、氧化等现象，导致造血干细胞的自我更新能力丧失，尤其是在其移植到体内后，容易出现缺乏相应的抗氧化、抗缺血等物质，造成造血干细胞的干性的丢失，造成移植的失败。
中国专利申请201010580960.1公开了一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用，所述的培养体系包括1640培养基、胎牛血清FBS、血小板生成素、干细胞因子SCF、人FMS样酪氨酸激酶3配体Flt-3L和生长因子PNT。该培养体系在体外抗氧化能力较低，降低造血干细胞的干性。
因此，研究和开发出一种造血干细胞增长速率高、安全方便、能够显著提高造血干细胞移植到受体内的植入能力和造血系统重建能力的体外培养基是目前亟需解决的难题。
小檗碱（berberine，BBR）是黄连的主要活性成分，故又名黄连素，分子式为C20H19O5N，为黄色针晶或核晶。它是一种广谱抗菌药物，对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌以及真菌均有抑制和杀灭作用。有研究发现小檗碱不仅在治疗肿瘤、糖尿病、心血管疾病、高血脂、脑缺血性损伤等多方面的药理作用，近年来还不断发现小檗碱的其他方面的药理作用，但是小檗碱对造血干细胞的体外增殖的作用，尚未见报导。
发明内容
为解决现有技术中的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基存在细胞增殖率低，且在体外培养的脐带血造血干细胞移植到受体内的植入能力和造血重建能力低的缺陷，本发明的目的在于提供一种造血干细胞增殖率高、而且能显著提高造血干细胞移植到受体内的植入能力和造血系统的重建能力，能较好的保持干造血细胞的干性的脐带血造血干细胞体外扩增培养基，以解决上述问题。
本发明提供了一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基，包括IMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：血清 0.05-0.5mg/mL、血小板生成素15-35ng/mL、干细胞因子100-150ng/mL、FMS样酪氨酸激酶3配体 30-60ng/mL、白介素-1 0.1-0.6ng/ml、白介素-60.2-1ng/ml、干细胞生长因子0.1-1ng/ml和小檗碱2-10ug/ml。
优选地，所述脐带血造血干细胞的体外扩增培养基，包括IMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：血清 0.05-0.2mg/mL、血小板生成素20-30ng/mL、干细胞因子110-130ng/mL、FMS样酪氨酸激酶3配体 35-55ng/mL、白介素-1 0.1-0.5ng/ml、白介素-6 0.4-1ng/ml、干细胞生长因子0.2-0.8ng/ml和小檗碱2-8ug/ml。
优选地，所述的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基，包括IMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：血清 0.1mg/mL、血小板生成素25ng/mL、干细胞因子120ng/mL、FMS样酪氨酸激酶3配体 45ng/mL、白介素-1 0.3ng/ml、白介素-6 0.6ng/ml、干细胞生长因子0.5ng/ml和小檗碱5ug/ml。
进一步地，所述血清为胎牛血清。
进一步地，所述FMS样酪氨酸激酶3配体为人FMS样酪氨酸激酶3配体。
另外，本发明还提供了脐带血造血干细胞的体外扩增培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入血清、血小板生成素、干细胞因子、FMS样酪氨酸激酶3配体、白介素-1、白介素-6 、干细胞生长因子和小檗碱，混匀，过膜除菌即得。
本发明提供的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基的组分中，胎牛血清为脐血带造血干细胞体外扩增提供了所需的养分，可以有效促进脐血带造血干细胞的生长；血小板生成素是调节细胞增殖的主要调节因素，对脐带血造血干细胞具有明显的扩增作用；干细胞因子可以诱导造血干细胞的增生、延长其存活期；人FMS样酪氨酸激酶3配体、白介素-1和白介素-6是早期造血因子，可以刺激脐带血造血细胞的活性；干细胞生长因子可以促进脐带血造血干细胞的快速增殖，提高其增殖能力，并能够维持干细胞的特性和细胞良好的生长状态。
小檗碱是一种常见的异喹啉生物碱，分子式C20H18NO4，其CAS号为2086-83-1。经试验发现：小檗碱具有促进脐带血造血干细胞体外扩增的作用，同时对体外扩增的脐带血造血干细胞具有抗缺氧和抗凋亡的作用，可以有效的保护体外扩增的脐带血造血干细胞的增殖能力。
此外，本发明还提供了脐带血造血干细胞的体外扩增培养基在脐带血造血干细胞体外扩增培养中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基具有造血干细胞增殖率高，能较好的保持干细胞的干性，可以有效的维持脐带血造血干细胞的自我更新能力的优点，而且经该培养基培养的脐带血造血干细胞移植到受体体内其植入能力和造血系统的重建能力显著提高，促进体外扩增的脐带血造血干细胞在临床中的应用。
附图说明
图1为含不同浓度小檗碱培养基对CD34+CD38-Lin-细胞密度图；
图2为含不同浓度小檗碱培养基对CD34+CD38-Lin-细胞的体外增殖图；
图3为脐带血造血干细胞体外扩增的培养基的抗氧化抗凋亡图；
图4为脐带血造血干细胞体外扩增培养基处理CD34+CD38-Lin-细胞后移植的植入能力和造血系统重建能力图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。本发明培养基中的成分均为常规市售产品，例如：IMEM基础培养基购于南京森贝伽生物科技有限公司，货号为12440053 Gibco；胎牛血清购于北京祥云兴业科技有限公司，货号为10099133 Gibco；白介素-1和白介素-6均购于上海意杰生物科技有限公司，货号分别为 PHC0015和PHC0064。
其中，本发明中，培养基1：本发明实施三提供的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基；培养基2：包括IMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：血清 0.1mg/mL、血小板生成素25ng/mL、干细胞因子120ng/mL、FMS样酪氨酸激酶3配体 45ng/mL、白介素-1 0.3ng/ml、白介素-6 0.6ng/ml和干细胞生长因子0.5ng/ml。
实施例一、含不同浓度小檗碱的培养基对CD34+CD38-Lin-细胞体外增殖的影响
1、试验材料：从华侨医院妇产科采集脐血，单个核细胞分离试剂盒，购于北京索莱宝科技有限公司的（货号：P9260）。
2、试验方法：将采集的脐血用单个核细胞分离试剂盒进行单个核细胞分离，得到脐血的单个核细胞，然后采用免疫磁珠细胞分选分离出CD34+CD38-Lin-细胞，并用流式方法鉴定细胞纯度。
用IMEM基础培养基将小檗碱释成2、5、7、10 ug/ml的药物溶液，将P1代分离的细胞以104个/mL的密度接种于96孔板中，分别用含不同浓度小檗碱的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基，每孔100μL，以不加小檗碱的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基为正常细胞组。置于37℃，5％CO2条件下培养7天后，收集全部细胞数计数，并计算CD34+CD38-Lin-细胞的总密度。
3、试验结果：分离细胞的总密度如图1所示，随着小檗碱浓度的增加分离细胞的总密度呈现出先升后降的趋势，当小檗碱的浓度为5ug/ml时，分离细胞的总密度的达到峰值，当浓度大于5ug/ml时随着浓度的增加而分离细胞的总密度降低。CD34+CD38-Lin-细胞占总细胞比率如图2所示，随着小檗碱浓度的增加CD34+CD38-Lin-细胞的比率呈现出先升后降的趋势，当小檗碱的浓度为5ug/ml时，CD34+CD38-Lin-细胞的比率达到峰值。
实施例二、脐带血造血干细胞的体外扩增培养基
脐带血造血干细胞体外扩增的培养基，包括IMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：胎牛血清 0.05mg/mL、血小板生成素15ng/mL、干细胞因子100ng/mL、人FMS样酪氨酸激酶3配体 33ng/mL、白介素-1 0.2ng/ml、白介素-6 0.2ng/ml、干细胞生长因子0.2ng/ml和小檗碱2ug/ml。
制备方法：向IMEM基础培养基中，按所述浓度加入胎牛血清、血小板生成素、干细胞因子、人FMS样酪氨酸激酶3配体、白介素-1、白介素-6、干细胞生长因子和小檗碱，混匀，过膜除菌即得。
实施例三、脐带血造血干细胞的体外扩增培养基
脐带血造血干细胞体外扩增的培养基，包括IMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：胎牛血清 0.1mg/mL、血小板生成素25ng/mL、干细胞因子120ng/mL、人FMS样酪氨酸激酶3配体 45ng/mL、白介素-1 0.3ng/ml、白介素-6 0.6ng/ml、干细胞生长因子0.5ng/ml和小檗碱5ug/ml。
制备方法与实施例二类似。
实施例四、脐带血造血干细胞的体外扩增培养基
脐带血造血干细胞体外扩增的培养基，包括IMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：胎牛血清 0.4mg/mL、血小板生成素35ng/mL、干细胞因子150ng/mL、人FMS样酪氨酸激酶3配体50ng/mL、白介素-1 0.6ng/ml、白介素-6 0.8ng/ml、干细胞生长因子1ng/ml和小檗碱10ug/ml。
制备方法与实施例二类似。
实施例五、小檗碱体外抗缺氧和抗凋亡的试验
将实施例一中通过免疫磁珠方法筛选的CD34+CD38-Lin-造血干细胞按照8*104/ml密度接种到96孔板，100ul/孔，在37℃，5％CO2条件下培养12小时，将CD34+CD38-Lin-造血干细胞分为3组，分别为对照组、模型组和试验组，各组CD34+CD38-Lin-造血干细胞处理如下：对照组：除去96孔板内的上清后，加入培养基2，100ul/孔，于37℃，5％CO2条件下孵育1h，除去上清后，用IMEM培养基洗两遍，再向孔内加入培养基2，于37℃，5％CO2条件下孵育6h；模型组：除去96孔板内的上清后，加入培养基2，100ul/孔，于37℃，5％CO2条件下孵育1h，除去上清后，用IMDM培养基洗两遍，加入IMDM培养基，100ul/孔，于37℃，5% CO2，95% N2条件下孵育6h；试验组：除去96孔板内的上清后，加入培养基1，100ul/孔，于37℃，5％CO2条件下孵育1h，除去上清后，用IMDM培养基洗两遍，向孔内加入含有小檗碱浓度为5ug/ml的IMDM培养基，于37℃，5% CO2，95% N2条件下孵育6h。
接着在上述3组细胞中加入浓度为5 mg/ml 的MTT检测液，10ul/孔，于37℃孵育4h，在570nm波长，630nm波长检测OD值，计算细胞存活率。试验结果如图3所示，小檗碱对体外培养的CD34+CD38-Lin-细胞有抗缺氧、抗凋亡的保护作用，有利于CD34+CD38-Lin-细胞在体外的培养。
实施例六、脐带血造血干细胞体外扩增培养基对移植植入能力和造血系统重建能力的影响
按照实施例一中通过免疫磁珠方法筛选出CD34+CD38-Lin-造血干细胞，以IMEM基础培养基重悬。将分离的CD34+CD38-Lin-造血干细胞移植到C57BL/6 小鼠中，按照每只小鼠移植800个CD34+CD38-Lin-细胞进行细胞移植，一共分为4组，第一组：移植当天分离的CD34+CD38-Lin-造血干细胞，第二组：移植在培养基2中置于37℃，5%CO2条件下培养7天的CD34+CD38-Lin-造血干细胞，第三组：移植在培养基1中置于37℃，5%CO2条件下培养7天的CD34+CD38-Lin-造血干细胞，第四组的操作如第一组所示，然后前三组每隔2天向小鼠腹腔注射生理盐水，第四组每隔2天向小鼠腹腔注射5ug/ml的小檗碱，移植4周后检测小鼠外周血中人源CD45+细胞。
结果如图4所示，人源脐带CD34+CD38-Lin-细胞经本发明的干细胞培养基扩增后再进行细胞移植可以显著的增强细胞的植入能力，并且能够很好的实现造血系统的重建，说明本发明的体外扩增培养基可以显著提高造血干细胞移植到受体体内的植入能力和造血系统的重建能力，而且能较好的保持干细胞的特性，是一种理想的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基。
Claims (3)
1.一种脐带血造血干细胞的体外扩增培养基，其特征在于，由如下组分组成：IMEM基础培养基，胎牛血清 0.05-0.5mg/mL、血小板生成素15-35ng/mL、干细胞因子100-150ng/mL、人FMS样酪氨酸激酶3配体 30-60ng/mL、白介素-1 0.1-0.6ng/ml、白介素-6 0.2-1ng/ml、干细胞生长因子0.1-1ng/ml和小檗碱2-10ug/ml。
2.如权利要求1所述的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基，其特征在于，由如下组分组成：IMEM基础培养基，胎牛血清 0.05-0.2mg/mL、血小板生成素20-30ng/mL、干细胞因子110-130ng/mL、人FMS样酪氨酸激酶3配体 35-55ng/mL、白介素-1 0.1-0.5ng/ml、白介素-60.4-1ng/ml、干细胞生长因子0.2-0.8ng/ml和小檗碱2-8ug/ml。
3.如权利要求2所述的脐带血造血干细胞的体外扩增培养基，其特征在于，由如下组分组成：IMEM基础培养基，胎牛血清 0.1mg/mL、血小板生成素25ng/mL、干细胞因子120ng/mL、人FMS样酪氨酸激酶3配体 45ng/mL、白介素-1 0.3ng/ml、白介素-6 0.6ng/ml、干细胞生长因子0.5ng/ml和小檗碱5ug/ml。
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