CN102154208A - Cd133+脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞的制法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法、该CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗脑胶质瘤药物中的应用，以及包括该CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。由本发明提供的CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞以及包括该CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的免疫组合物制备的药物，能够在体内和体外杀死引起脑胶质瘤复发的脑胶质瘤干细胞，从而为克服脑胶质瘤耐药性、根治脑胶质瘤的复发和转移提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗脑胶质瘤药物中的应用、以及包括该树突状细胞的疫苗。特别地，本发明涉及CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞及其制备方法、该CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗脑胶质瘤药物中的应用、以及包括该CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。
背景技术
目前脑胶质瘤的治疗方法包括手术治疗、放射治疗和化疗。但现有的脑胶质瘤治疗方法不能根治脑胶质瘤。主要原因是构成脑胶质瘤的细胞中含脑胶质瘤干细胞，其具有细胞的生物学特性，即自我更新、多潜能分化、高耐药性的(例如对化疗药物的高耐药性的及对放射治疗的高耐辐射性)及极少数的脑胶质瘤干细胞还驱动脑胶质瘤的形成。因此脑胶质瘤干细胞是脑胶质瘤发生和发展(脑胶质瘤的生长、脑胶质瘤产生耐药性的、脑胶质瘤复发和脑胶质瘤转移等)的真正元凶。
现有技术已尝试使用树突状细胞免疫治疗方法来治疗癌症，即从患者脑胶质瘤中将脑胶质瘤细胞分离出来，通过裂解该脑胶质瘤细胞得到抗原，并将该抗原负载到患者的树突状细胞上。如此得到的靶向脑胶质瘤细胞的树突状细胞，可以用于治疗癌症。例如：CN1705489A中公开了将肿瘤细胞制备得到的抗原负载到树突状细胞上，并用所得树突状细胞治疗癌症的方法。
现有技术仅公开了如何得到相关脑胶质瘤干细胞，但并未教导对获取的脑胶质瘤干细胞进行处理。并且，现有技术的上述方法虽然以脑胶质瘤细胞为靶标，但是该方法仍然存在脑胶质瘤在放疗和化疗后耐药性、复发率和转移率高的问题。
发明内容
为了克服现有以脑胶质瘤细胞为靶标的癌症免疫治疗方法仍然存在脑胶质瘤在放疗和化疗后耐药、复发和转移的问题，本发明的目的是提供一种CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞及其制备方法、该CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞在制备抗脑胶质瘤药物中的应用、制备该CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的试剂盒，以及包括该CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的疫苗。
多数认为经与大剂量化疗药物接触后，脑胶质瘤细胞会被全部杀死，但是后来发现，在一定范围内经与大剂量化疗药物接触后，脑胶质瘤细胞不但不会被完全杀死，而且还存在少量的脑胶质瘤干细胞，起着对脑胶质瘤的耐药性、复发和转移。
本发明提供了一种CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法，该方法包括：通过裂解CD133+脑胶质瘤干细胞得到脑胶质瘤干细胞抗原组合物，将树突状细胞与CD133+脑胶质瘤干细胞抗原组合物接触得到负载脑胶质瘤抗原的抗癌树突状细胞，其中，所述CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞通过以下方法制备，该方法包括：
所述分选方法为在分离分选中使用CD133单克隆抗体偶联的免疫磁珠或通过CD133流式抗体进行流式细胞仪的分选技术，在组织直接来源和培养扩增后的脑胶质瘤干细胞进行分离分选得到的脑胶质瘤干细胞。
所述脑胶质瘤干细胞经过热休克和反复冻融得到脑胶质瘤干细胞抗原组合物；将所述的脑胶质瘤干细胞抗原组合物与树突状细胞接触，制备得到CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞。
本发明还提供了一种CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为本发明所述的CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞。
本发明还提供了本发明的CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞疫苗在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。
由于本发明的脑胶质瘤干细胞经过分选，由此得到的脑胶质瘤干细胞更具有特异的靶向性，因此，由本发明提供的CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的药物，能够在体内和体外杀死引起脑胶质瘤复发的脑胶质瘤干细胞，从而为脑胶质瘤的根治提供了可能。
附图说明
图1为制备例1和2的脑胶质瘤干细胞通过流式细胞术检测的细胞流式图；
图2CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞，流式细胞仪检测负载DC表型变化情况。
图3显示了由所示经分选后的制备例1和未分选的制备例1所得两种抗原组合物分别负载树突状细胞，得到两种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，由该两种CTL细胞分别对化疗药物分选的以及未分选的脑胶质瘤细胞产生的应答结果对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种CD133+脑胶质瘤干细胞的制备方法，其中，该方法包括：
对脑胶质瘤干细胞进行分离分选的步骤，
所述分离分选通过使脑胶质瘤干细胞通过分选完成，所述分选方法选自免疫磁珠法、流式细胞术、亲和板结合分离法和免疫溶解法中。
优选地，所述分离分选通过使脑胶质瘤干细胞通过分选完成，所述分选方法选自免疫磁珠法和流式细胞术中。
本发明提供的CD133+脑胶质瘤干细胞的制备方法可以在分离分选中使用CD133单克隆抗体偶联的免疫磁珠或通过CD133流式抗体进行流式细胞仪的分选技术，在组织直接来源和培养扩增后的脑胶质瘤干细胞进行分离分选得到的脑胶质瘤干细胞。
本发明适用于所有能够从中分离出脑胶质瘤干细胞的各种脑胶质瘤。例如，所述脑胶质瘤可以选自由星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、转移性脑胶质瘤和复发性脑胶质瘤所组成的组中。其中，所述转移瘤性癌可以选自移瘤性脑胶质瘤和复发性脑胶质瘤所组成的组中。
所述方法还包括从离体脑胶质瘤组织和/或脑胶质瘤干细胞系中分离脑胶质瘤干细胞。手术从患者体内取出的脑胶质瘤组织，属于废弃的离体脑胶质瘤组织。本发明可以适用常规的方法得到脑胶质瘤干细胞，并从中分离出脑胶质瘤干细胞。此外，由现有商业上能够买到的细胞系培养物也能从中得到相应的脑胶质瘤干细胞，即可以从美国典型物保藏中心(ATCC)买到、并且能够从中分离出相应的脑胶质瘤干细胞的细胞株系。
脑胶质瘤干细胞通常借用正常细胞标志和/或脑胶质瘤干细胞标志进行检测。例如NS可确定细胞分化程度，是细胞标志的重要核蛋白。此外，脑胶质瘤干细胞常表现出基因组不稳定性，经化疗药物后，尽管可消灭绝大多数脑胶质瘤细胞，使瘤体变小甚至消失，但是残留的极少数脑胶质瘤干细胞可能已被赋予细胞样的生物学特性，易发生恶性突变，产生药物抵抗和放射抵抗。
本发明还提供了一种脑胶质瘤干细胞抗原组合物的制备方法，该方法包括用生理盐水洗涤并重悬脑胶质瘤干细胞，然后裂解脑胶质瘤干细胞的步骤，其中，所述脑胶质瘤干细胞本发明的脑胶质瘤干细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的脑胶质瘤干细胞抗原组合物在注射给患者时残留的培养基组分不会引起患者不适即可。
裂解本发明的脑胶质瘤干细胞可以使用本领域常规的各种裂解方法实现。出于不在裂解脑胶质瘤干细胞后增加新的物质的考虑，优选所述裂解脑胶质瘤干细胞的步骤包括热休克和/或反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在37～50℃下保持1h-6h，优选包括在40～45℃下保持1h-4h；所述反复冻融的次数为3-5次，每两次的间隔时间是10min-2h，优选为20min-1h，所述冷冻的温度范围是零下120℃-零下196℃(可以使用液氮、干冰等来实现)，优选零下120℃-零下196℃，所述融化的温度范围是10℃-37℃，优选为20℃-37℃。由于经热休克后，本发明的脑胶质瘤干细胞会产生热休克蛋白，裂解后仍然存在所述热休克蛋白。热休克蛋白的存在有助于负载后的树突状细胞免疫应答。因此，更优选所述裂解脑胶质瘤干细胞的步骤包括热休克和反复冻融；所述热休克裂解的条件包括在40-45℃下保持1h-3h；所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是20min-1h，所述冷冻的温度范围是零下196℃，所述融化的温度范围是25℃。
裂解完成后，通常通过离心和过滤的步骤除去裂解液中过大的细胞碎片，例如，通过600rpm离心1min除去，然后上清用0.45μm滤膜过滤。所述组合物的基本成分包括生理盐水。裂解得到的本发明的抗原组合物可以在-80℃中保存。
本发明还提供了本发明的脑胶质瘤干细胞抗原组合物在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。
其中，所述脑胶质瘤干细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养脑胶质瘤干细胞的培养基，例如DMEM/F12等。所述脑胶质瘤干细胞培养体系包括脑胶质瘤干细胞和3mL-50mL的脑胶质瘤干细胞基础培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养。
所述组合物来自细胞浓度为1×105到1×108细胞/mL、优选为1×106到5×107细胞/mL的本发明的脑胶质瘤干细胞。细胞浓度过大可能会引起患者过度的免疫应答反应，反之细胞浓度过小，则不足以引起患者的免疫应答反应。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％，优选为2-3重量体积％。
本发明还提供了一种抗癌树突状细胞的制备方法，该方法包括：将正常树突状细胞与脑胶质瘤干细胞抗原组合物接触，得到负载脑胶质瘤干细胞抗原的树突状细胞，其中，所述脑胶质瘤干细胞抗原组合物为本发明所述的脑胶质瘤干细胞抗原组合物。优选所述正常树突状细胞与制备脑胶质瘤干细胞抗原组合物的脑胶质瘤干细胞来自同一个体。这样可以最大限度地避免由于免疫排斥反应而引起的副作用。
其中在裂解脑胶质瘤干细胞制备被负载的所述抗原组合物前，所述脑胶质瘤干细胞经用于培养树突状细胞的培养基洗涤三次。所述树突状细胞负载脑胶质瘤干细胞抗原时，正常树突状细胞与脑胶质瘤干细胞抗原组合物接触的时间可以是本领域常规使用的任意的接触时间，优选是1-24h，更优选是2-12小时。
本发明还提供了由上述的方法得到的抗癌树突状细胞。
本发明还提供了一种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其中，所述树突状细胞为本发明的抗癌树突状细胞。
在制备树突状细胞疫苗之前，用生理盐水洗涤并重悬所述抗癌树突状细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的树突状细胞疫苗在注射给患者时残留的培养基组分不会引起患者不适即可。所述组合物包括1×105到5×107个/mL本发明的抗癌树突状细胞；优选为5×105到1×107个/mL。所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％，优选为2-3重量体积％。
本发明还提供了本发明的抗癌树突状细胞在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。
所述脑胶质瘤干细胞抗原组合物来自细胞浓度为1×105到1×108细胞/mL，优选为1×106到5×107细胞/mL的本发明的脑胶质瘤干细胞。所述细胞浓度过大造成浪费，反之细胞浓度过小，则不足以使树突状细胞负载上足够的抗原。
所述树突状细胞基础培养基可以是本领域任何能够用于培养树突状细胞的培养基，例如RPMI/1640等。所述树突状细胞培养体系包括脑胶质瘤干细胞和1mL-100mL、优选30-80mL的树突状细胞基础培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养。其中，所述巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度100IU/mL-2500IU/mL。所述白介素-4在脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度100IU/mL-1500IU/mL。所述干扰素α在脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度100IU/mL-2000IU/mL。所述脑胶质瘤坏死因子α在脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞时添加到树突状细胞基础培养基中，终浓度0.5ng/mL-100ng/mL。
所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％，优选为2-3重量体积％。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，其包括给患者施用选自由本发明的脑胶质瘤干细胞抗原组合物、本发明的抗癌树突状细胞以及本发明的树突状细胞疫苗所组成的组中的药物。
优选所述施用的方式为注射。具体地，施用脑胶质瘤干细胞抗原组合物的方式选自由脑胶质瘤组织内注射、静脉注射、皮下注射和皮内注射中的一种或几种；施用所述树突状细胞疫苗的方式为在淋巴结部位皮下或皮内注射。优选施用所述树突状细胞疫苗的方式为在腹部沟或腋下进行皮下或皮内注射。
所述脑胶质瘤干细胞抗原组合物优选来自细胞浓度为1×105到1×108细胞/mL的本发明的脑胶质瘤干细胞，其有效量为0.1mL-5mL/个体；所述树突状细胞疫苗优选包括1×105到5×107个/mL本发明的抗癌树突状细胞，其有效量为0.1mL-2mL/个体。更优选所述脑胶质瘤干细胞抗原组合物优选来自细胞浓度为1×105到1×108细胞/mL的本发明的脑胶质瘤干细胞，其有效量为0.2mL-2mL/个体；所述树突状细胞疫苗优选包括1×105到5×107个/mL本发明的抗癌树突状细胞，其有效量为0.5mL-2mL/个体。
以上所述脑胶质瘤干细胞抗原组合物和所述树突状细胞疫苗都是一次注射的剂量，一个疗程四次注射，间隔一周。两种组合物一般在注射完第一针后的第三天到第七天起效。所述有效的标准是：起免疫促进的细胞因子如白介素2、白介素12、干扰素γ和脑胶质瘤坏死因子α等的升高；起免疫抑制的细胞因子如白介素6、白介素10、转化生长因子β和表皮细胞生长因子等的降低；以及T淋巴细胞亚群变化，即：CD3、CD4、CD8的阳性率的升高或改善，CD16/56阳性率的升高，以及CD4CD25FoxP3三阳性率的降低。一个疗程结束后，可以间隔三个月后继续给药，可以治疗两个或四个疗程；如有必要，间隔时间为六个月或1年还可继续再治疗，只要患者一直存活在。
其中，所述有效标准还可以分为以下三个等级：
1.患者血液细胞因子检测：
起免疫促进的细胞因子如白介素2、白介素12、干扰素γ和脑胶质瘤坏死因子α等的升高；起免疫抑制的细胞因子如白介素6、白介素10、转化生长因子β和表皮细胞生长因子等的降低；以及T淋巴细胞亚群变化，即：CD3、CD4、CD8的阳性率的升高或改善，CD16/56阳性率的升高，以及CD4CD25FoxP3三阳性率的降低等。
2.患者脑胶质瘤标志物检测，如甲胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白等脑胶质瘤特异抗原的表达的降低，主要是通过酶免和化学发光检测等。
3、影像学检测，如CT、核磁共振和B超检测，能检测到治疗前后脑胶质瘤组织缩小。
优选所述脑胶质瘤干细胞和/或所述树突状细胞来自于同一患者，这样可以最大限度地避免免疫排斥反应造成的副作用。
此外，本发明提及的细胞可以是商业上可供的细胞系。并且现有长期冷冻保藏细胞的技术已经非常成熟，比如在液氮(零下196℃)下冻存细胞，例如脐带血细胞保藏。本领域技术人员完成可以利用上述技术保藏本发明涉及的脑胶质瘤组织、脑胶质瘤干细胞和树突状细胞，树突状细胞可以来源外周血、骨髓和脐带血等。
以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
实施例1：脑胶质瘤组织中的脑胶质瘤干细胞的分离和培养
脑胶质瘤组织来自26岁男性患者，该患者经病理检查确诊为IV级脑胶质瘤。与该患者签署了知情同意书，在进行手术时采集其脑胶质瘤组织。用眼科剪将脑胶质瘤组织剪碎成为约1mm3的小块。所得剪碎的组织小块用0.25％胰酶溶液以1克∶0.5mL的重量体积比消化5分钟后，加入是胰酶溶液体积五分之一的小牛血清(美国Hyclone公司)终止，以1000rpm离心收集消化好的组织小块，倾去胰酶溶液上清，然后用含0.1％dispase(分散酶，美国西格玛)(11U/mg)和0.01％DNAse(DNA酶，上海生工)的HBSS(汉斯缓冲液，上海生工)以1克∶1mL的重量体积比洗涤三次，所得离心沉淀用胰酶(美国西格玛)以1克∶1mL的体积比在37℃下混匀接触10分钟，然后在1000rpm下离心5min收集细胞，用以1克∶1mL的重量体积比用杜尔贝可改良伊格尔-F12培养基重悬。所得重悬液用40-mm分子筛(美国BD公司)过滤。用所述孔径的分子筛过滤，截留的是大片细胞碎片和未被消化的细胞团，滤出的是细胞悬液。
取1份50μL(2×106个)上述得到细胞悬液分别添加到有220μL PE-CD133(BD公司)的离心管中。置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果显示，CD133+的脑胶质瘤干细胞占所得洗涤后的细胞的0.32％，见附图1中A的流式柱状图。
收集剩余的所述细胞悬液后，向其中含有5ng/mL B27、40ng/mL人表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、40ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bEGF)和30mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(Dulbecco’s modified Eagle’s medium-F12)(DMEM/F12)培养基(美国Hyclone公司)使细胞悬液浓度被稀释为2×105细胞/mL。然后将每5mL所得稀释的细胞悬液转移至25cm2灭菌塑料培养瓶中在37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
培养所得细胞呈神经球状生长，倾去培养基，然后用5mLHBSS洗涤一次，倾去洗涤液。所述洗涤过程去掉了悬浮的细胞碎片和未贴壁生长的细胞。并添加新鲜的含有8ng/mL B27、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基。当细胞生长达到培养瓶底面的90％时，用胰酶消化后，用含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基进行传代培养(1瓶传几个瓶，每瓶起始培养的细胞密度为2×105细胞/mL)。按照上述传代条件再传4代，得到神经球状的细胞。
取1瓶培养到5代的脑胶质瘤干细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用1mL1×PBS重悬，计数。取1份50μL(2×106个)上述的传代得到细胞悬液分别添加到有20μL PE-CD133(BD公司)的离心管中。置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果显示，CD133+的脑胶质瘤干细胞占所得洗涤后的细胞的7.95％，见附图1中B的流式柱状图。
实施例2：从脑胶质瘤癌细胞系U87-MG中培养的脑胶质瘤干细胞
将购自美国ATCC的肿瘤细胞系的脑胶质瘤U87-MG细胞，取1份50μL(2×106个)细胞悬液分别添加到有20μL PE-CD133(BD公司)的离心管中。置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果检出CD133+的脑胶质瘤干细胞为0.27％，见附图1中C的流式柱状图。
将上述购自美国ATCC的脑胶质瘤U87-MG细胞，用添加了5ng/mL N2、25ng/mL人表皮生长因子、40ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和30mg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基在37℃、5％CO2培养箱中培养3天。
培养所得细胞呈神经球状生长，倾去培养基，然后用5mLHBSS洗涤一次，倾去洗涤液。所述洗涤过程去掉了悬浮的细胞碎片和未贴壁生长的细胞。并添加新鲜的含有15ng/mL N2、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基。当细胞生长达到培养瓶底面的90％汇合时，用胰酶消化后，用含有15ng/mL N2、30ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔-F12(DMEM/F12)培养基进行传代培养。按照上述传代条件再传4代，得到神经球状的细胞。
取1瓶培养到5代的肿瘤干细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用1mL1×PBS重悬，计数。取1份50μL(2×106个)上述的传代得到细胞悬液分别添加到有20μL PE-CD133(BD公司)的离心管中。置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得洗涤后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测。结果显示，CD133+的脑胶质瘤干细胞占所得洗涤后的细胞的3.97％，见附图1中D的流式柱状图。
实施例3：经免疫磁珠法分选脑胶质瘤干细胞的制备
取1-3瓶75cm2塑料培养瓶的培养有实施例1或2的脑胶质瘤干细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用1mL RPMI 1640培养基重悬计数，得到5×107细胞/mL的细胞悬液。
将得到的细胞用缓冲液按80μL/107个细胞重悬，加入CD133微珠20μL/107个细胞，混匀，4～8℃孵育15min，缓冲液1mL/107个细胞洗涤细胞，1500r/min离心10min，完全去除上清，用500μL缓冲液重悬，所得细胞悬液加入MS分选柱(德国美天旎)中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1500μL缓冲液冲洗MS柱，此为CD133阴性细胞。将分选柱移出磁场，1mL缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞是磁性标记的CD133阳性细胞。
实施例4：经流式细胞术分选脑胶质瘤干细胞的制备
取1-3瓶75cm2塑料培养瓶的培养有实施例1或2的脑胶质瘤干细胞，经胰酶消化，离心后细胞沉淀用1mL RPMI 1640培养基重悬计数，得到5×107细胞/mL的细胞悬液。
将分选前的标本、对照管、分选后阴性管标本及分选后阳性管标本进行流式细胞仪分析。在上述富集细胞管中加入100μL缓冲液，10μl CD133抗体混匀，4℃黑暗中孵育10min，加入1000μL缓冲液1500r/min离心10min，完全去除上清液，加入500μL缓冲液混匀，送流式细胞分选，设阴性对照和空白对照。通过流式细胞分选得到CD133阳性的细胞。
按照制备例3-4的方法分别制备脑胶质瘤干细胞。其中，不同点如表1所示：
表1
实施例5：CD133+脑胶质瘤干细胞的抗原组合物的制备
取上述实施例1-2的未分选的脑胶质瘤干细胞以及实施例3和4所得CD133+脑胶质瘤干细胞，在液氮中和室温(25℃)下反复冻融5次，通过倒置显微镜检测到所述细胞完全裂解。所得裂解液在600rpm下离心1min，收集上清用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。所述裂解液即脑胶质瘤干细胞的抗原组合物，储存在-80℃中备用。
实施例6：树突状细胞获取
来自献血者的100mL外周血经Ficoll密度梯度离心，得到单个核细胞。外周血单个核细胞用RPMI 1640培养基重悬，并加入6孔板中贴壁。在37℃、5％CO2培养箱中孵育90min后，未贴壁细胞洗涤收集下来。贴壁细胞加入完全培养基RPMI 1640诱导培养，含有5％的自体血清、2000IU/mL重组人粒细胞巨噬集落刺激因子和1500IU/mL白介素4。在培养到第三天时细胞更换新鲜培养基(含2000IU/mL GM-CSF和1500IU/mL IL-4)。培养到第五天收获未成熟DCs，成熟DCs采用完全RPMI 1640培养基在诱导到第七天得到，含0.1μg/mL脂多糖和20ng/mL脑胶质瘤坏死因子α。在第五天时添加特殊抗原(如脑胶质瘤干细胞抗原)，负载DCs。
实施例7：CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载DCs
培养5天后，3×106个未成熟DCs用实施例6所述的未经分选的或分选的脑胶质瘤干细胞裂解抗原组合物(得自1×106脑胶质瘤干细胞)在37℃、5％CO2培养箱中负载4小时。抗原负载的DCs通过离心(10min，1000rpm)收获得到。所得DCs经生理盐水洗涤3次，后重悬到生理盐水中，至浓度为3×106成熟DC/mL，并添加终浓度为质量体积比2％的人血白蛋白，从而制备成脑胶质瘤干细胞裂解抗原组合物负载的DC疫苗。
CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞通过CD86-FITC、CD80-FITC、CD83-PE和CD11c-Percp(BD公司)染色，流式细胞仪检测负载后DC表型变化。从左到右，CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载树突状细胞的比例为1∶9、1∶6和1∶3，CD11c/CD83、CD11c/CD86和CD11c/CD80的双阳性率变化比较明显，如图2所示。
实施例8：CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载DC疫苗体外杀瘤试验
在6孔板内，仍以含5％小牛血清的RPMI 1640为培养基，按上述抗原负载的成熟树突状细胞∶T细胞＝1∶20的比例混合上述抗原负载的成熟树突状细胞和T细胞，同时加入GM-CSF(终浓度为800U/mL)和IL-4(终浓度为20ng/mL)，共培养7天，期间每隔1天均半量换液(含5％小牛血清、终浓度为800U/mL的GM-CSF和终浓度为20ng/mL的IL-4的RPMI 1640培养基)，得到CTL细胞。
选择相应的脑胶质瘤干细胞作为靶细胞，用51Cr标记，即靶细胞(2×106/mL)通过与300μCi51Cr在RPMI 1640培养基中37℃孵育2小时。标记好的靶细胞用1×PBS洗涤三次，并最终用RPMI 1640(含10％小牛血清)重悬到2×105的浓度。以每孔2×104个标记的靶细胞(0.1mL)添加到96孔板的孔中。
将上述产生的CTL细胞(效应细胞)分别以2∶1、4∶1、10∶1、20∶1和50∶1的效靶比加入对应的孔中，在37℃孵育4小时。孵育后，取上清75μL组分用γ放射计数器计数。特异的51Cr释放的百分比根据下述的公式进行计算。
其中，自发释放的每分脉冲数通过单独培养靶细胞(未加效应细胞)获得，最大释放的每分脉冲数是用终浓度2％NP-40(表面活性剂，上海生工)处理的单独培养靶细胞后获得的。检测的每分脉冲数通过添加效应细胞的靶细胞培养获得的。
由未经分选后的实施例1以及经分选后的实施例1所得抗原组合物负载树突状细胞，得到细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，由该CTL细胞产生的对相应脑胶质瘤干细胞的应答结果。随着效靶比不断提高，对脑胶质瘤干细胞产生的CTL应答也特异升高。并且经分选后的实施例1效果最佳。
图3显示了经分选后的实施例1和未分选的制备例1所得两种抗原组合物分别负载树突状细胞，得到两种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，由该两种CTL细胞分别对CD133+脑胶质瘤干细胞产生的应答结果对比图。其中，PGSC-DC1表示CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞对脑胶质瘤干细胞的毒性活性，GSC-DC1表示未分选的脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞对脑胶质瘤干细胞的毒性活性；PGSC-DC2表示CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞对脑胶质瘤细胞(U87-MG)的毒性活性，GSC-DC2表示未分选的脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞对脑胶质瘤细胞(U87-MG)的毒性活性。
如图3所示，CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞(PGSC-DC)对脑胶质瘤干细胞的细胞毒性活性要分别高于未分选的脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞(LTC-DC)对脑胶质瘤干细胞的细胞毒性活性。所述脑胶质瘤干细胞按照实施例2和3制备。
有关实施例3和4所得CD133+脑胶质瘤干细胞的细胞毒性活性，远远好于有关实施例1和2的未分选的脑胶质瘤干细胞的细胞毒性活性。此外有关热休克结合反复冻融裂解实施例3和4所得CD133+脑胶质瘤干细胞的细胞毒性活性，远远好于有关单纯反复冻融裂解实施例3和4所得CD133+脑胶质瘤干细胞的细胞毒性活性。
实施例9：CD133+脑胶质瘤干细胞在体内杀瘤实验中的作用
以含5％小牛血清的RPMI 1640为培养基，将3×106个的未成熟树突状细胞用上述实施例6所得的未经分选的或分选的脑胶质瘤干细胞裂解抗原组合物(得自1×106脑胶质瘤干细胞)在37℃、5％CO2培养箱中负载4小时。抗原负载的成熟树突状细胞通过1000rpm离心10min得到。将所述抗原负载的成熟树突状细胞用生理盐水洗涤3次，然后重悬至1×106个/mL的浓度，4℃下保存备用。
实施例1的脑胶质瘤干细胞建立荷脑胶质瘤鼠模型，随机分为A、B和C3组，每组10只，A组为CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞治疗组，B组为未分选的脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞为对比组(注射液制备方法与A组相同)，C组为同体积生理盐水空白组。A和B两组在第0天荷瘤鼠模型皮下输注1-2×106个/mL树突状细胞，各0.5mL，半个月后再同样剂量免疫1次。注射后分别于7、14、21、28、35d计算鼠模型荷瘤大小，C组于相同时间点在皮下注射0.5mL生理盐水并计算鼠模型荷瘤大小。
CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞疫苗对荷瘤鼠模型的抑制生长情况(mm3，
)见表3。
表3
注：*空白组与树突状细胞治疗组相比P远小于0.01；#对比组与树突状细胞治疗组相比P＜0.01。
此外，有关实施例3-4所得CD133+的脑胶质瘤干细胞的体内杀瘤活性，远远好于有关制备例1-2的未分选的脑胶质瘤干细胞的体内杀瘤活性。此外有关热休克结合反复冻融裂解实施例3-4所得CD133+脑胶质瘤干细胞的体内杀瘤活性，远远好于有关单纯反复冻融裂解实施例3-4所得CD133+脑胶质瘤干细胞的体内杀瘤活性。
Claims (15)
1.一种CD133+脑胶质瘤干细胞抗原负载的树突状细胞的制备方法，该方法包括：通过裂解脑胶质瘤干细胞得到脑胶质瘤干细胞抗原组合物，将树突状细胞与脑胶质瘤干细胞抗原组合物接触得到负载脑胶质瘤抗原的抗癌树突状细胞，其特征在于，所述脑胶质瘤干细胞通过以下方法制备，该方法包括：
对脑胶质瘤干细胞进行分离分选的步骤，
所述分离分选通过使脑胶质瘤干细胞通过分选完成，所述分选方法选自免疫磁珠法、流式细胞术、亲和板结合分离法和免疫溶解法中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞分选方法为免疫磁珠法和流式细胞术。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法包括：
对脑胶质瘤干细胞进行分离分选的步骤，
所述分选方法为在分离分选中使用CD133单克隆抗体偶联的免疫磁珠或通过CD133流式抗体进行流式细胞仪的分选技术，在组织直接来源和培养扩增后的脑胶质瘤干细胞进行分离分选得到的脑胶质瘤干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述脑胶质瘤选自由星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、转移性脑胶质瘤和复发性脑胶质瘤所组成的组中。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从离体脑胶质瘤组织和/或脑胶质瘤细胞系中分离脑胶质瘤干细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解脑胶质瘤干细胞的步骤包括热休克和/或反复冻融；所述热休克的条件包括在37～50℃下保持1h-6h；所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是10min-2h，所述冷冻的温度范围是零下120℃-零下196℃，所述融化的温度范围是10℃-37℃。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解脑胶质瘤干细胞的步骤包括热休克和反复冻融；所述热休克的条件包括在40-45℃下保持1h-4h；所述反复冻融的次数为3-5次两次的间隔时间是20min-1h，所述冷冻的温度范围是零下120℃-零下196℃，所述融化的温度范围是20℃-37℃。
8.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脑胶质瘤干细胞抗原组合物裂解自细胞浓度为1×105到1×108细胞/mL的脑胶质瘤干细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述正常树突状细胞与制备脑胶质瘤干细胞抗原组合物的脑胶质瘤干细胞来自同一个体，或脑胶质瘤干细胞来自脑胶质瘤干细胞系培养获得的。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述正常树突状细胞与脑胶质瘤干细胞抗原组合物接触的时间是1-12h。
11.由权利要求1-10中任意一项所述的方法得到的抗癌树突状细胞。
12.一种树突状细胞疫苗，所述树突状细胞疫苗包括树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞为权利要求14所述的抗癌树突状细胞。
13.根据权利要求12所述的疫苗，其中，所述疫苗包括1×105到5×107个/mL所述抗癌树突状细胞。
14.根据权利要求13所述的疫苗，其特征在于，所述组合物还包括人血白蛋白；其中，以所述组合物为基准，所述人血白蛋白的含量为1-5重量体积％。
15.权利要求14所述的抗癌树突状细胞在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。
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