CN102657853A - 初始t细胞来源的肿瘤特异性杀伤细胞的制备及其应用 - Google Patents
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- CN102657853A CN102657853A CN2012101271586A CN201210127158A CN102657853A CN 102657853 A CN102657853 A CN 102657853A CN 2012101271586 A CN2012101271586 A CN 2012101271586A CN 201210127158 A CN201210127158 A CN 201210127158A CN 102657853 A CN102657853 A CN 102657853A
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Abstract
本发明涉及一种初始T细胞来源的肿瘤特异性杀伤细胞的制备方法及其应用，本发明的特异性杀伤细胞制备方法如下：步骤1，外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和总T细胞；步骤2，DC细胞经过培养加入病人自体肿瘤相关全抗原至成熟，得DC疫苗；步骤3，T细胞分离出初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将两种初始T细胞按1∶1混合，经INF-γ冲击后，应用CD3单抗和IL-2扩增，制备CIK；步骤4，步骤3得到的扩增细胞的半数细胞加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数细胞继续CIK培养，分别收获CIK和CTL效应细胞；步骤5，取1-2×107步骤2得到的DC疫苗和0.5×109步骤4得到的CIK以及0.5×109CTL效应细胞混合，制备成用于治疗的细胞制剂。DC疫苗复苏、洗涤后，和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗新技术，特别涉及一种初始T细胞来源的新型肿瘤特异性杀伤细胞(DC-CIK-CTL)的制备方法极其应用技术。
背景技术
近年来“细胞免疫治疗”作为一种全身治疗新技术应用于临床，并获得了有效率高、副反应小的良好效果，因而成为继手术、放疗、化疗之后的第四大肿瘤治疗模式。
细胞免疫治疗的基本方法是采取外周血T细胞，进行体外扩增、激活，制备成肿瘤杀伤细胞，然后回输病人体内进行治疗。体外扩增制备的NK、TIL、CTL、或DC-CIK等效应细胞均可用于肿瘤的细胞免疫治疗，其目的是应用这些效应细胞特异性或非特异性杀伤肿瘤细胞，达到控制肿瘤进程，改善生存质量，延长生存期，争取肿瘤根治的目的。目前国际国内应用的效应细胞主要是TIL、DC、CIK、NK，DC-CIK、CTL、或DC-CIK-CTL等。
效应细胞的制备目前仍以外周血分离的总T细胞为主，而外周血总T细胞是由初始T、中枢记忆T、和效应记忆T细胞三个亚群组成。基础研究证实，三个T细胞亚群均可用来制备效应细胞，但就其扩增能力、增值活力、肿瘤杀伤能力来说，初始T优于中枢记忆T，中枢记忆T优于效应记忆T细胞。近期有研究表明，初始CD8+T细胞制备的效应细胞，肿瘤杀伤能力明显增强(Blood，2010，Sept.14，Online)。我们的研究证实，肿瘤的细胞免疫是个非常复杂的免疫过程，CD4+和CD8+T细胞在肿瘤免疫中分别担当重要功能。初始CD4+T和初始CD8+T细胞混合制备的效应细胞，较单纯初始CD8+T细胞制备的效应细胞杀伤能力更佳，同时能够产生更持久的免疫记忆，使效应细胞对肿瘤产生持续的免疫杀伤，因而形成本专利发明。
本发明提供一种最新的效应细胞制备方法，即应用CD4+和CD8+混合的初始T细胞，制备DC-CIK-CTL效应细胞，同时提供一种应用复合制剂对肿瘤微环境进行干扰，从而打破肿瘤免疫耐受，在此基础上进行效应细胞回输治疗的新技术。应用按比例混合的初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞制备效应细胞是个全新的新理念、新技术，其特点和优势是：①、CD4+和CD8+初始T细胞的体外扩增能力明显高于总T细胞，有利于体外大批量制备肿瘤特异性杀伤细胞；②、CD4+和CD8+初始T细胞的KLRG1和CD57明显低表达，代表着细胞可以抵抗终末分化，使发生终末分化的时间显著后延，保持更长的生存时间和功能潜力；③、CD4+和CD8+初始T细胞端粒较长，因而扩增潜能较大，更适合临床细胞免疫治疗效应细胞的制备。
本发明的方法是：外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和总T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞则进一步分离出初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将两种初始T细胞按1∶1混合，经INF-γ冲击后，应用CD3单抗和IL-2扩增至第7天制备CIK。半数细胞移瓶后加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数细胞继续CIK培养，至第10天分别收获CIK和CTL效应细胞，混合移入含有2.0g人血白蛋白的250ml 0.9％氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是：环磷酰胺(CTX)600-1200mg静脉滴入，1次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。
发明内容
本发明的主要目的在于：解决目前DC-CIK方法肿瘤杀伤率低、临床有效率低的瓶颈问题，应用本技术，可以显著提高肿瘤的杀伤效率，提高临床有效率和客观疗效。
为保证上述技术的实施，本发明提供了一种特异性肿瘤杀伤细胞的制备方法，本发明的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和总T细胞；
步骤2，DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗；
步骤3，T细胞分离出初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将两种初始T细胞按1∶1混合，经INF-γ冲击后，应用CD3单抗和IL-2扩增至第7天，制备CIK；
步骤4，步骤3得到的扩增细胞的半数细胞加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数细胞继续CIK培养，至第10天分别收获CIK和CTL效应细胞；
步骤5，取1-2×107步骤2得到的DC疫苗和0.5×109步骤4得到的CIK以及0.5×109CTL效应细胞混合，制备成用于治疗的细胞制剂。
因此本发明还包括，含有本发明特异性DC-CIK-CTL细胞的细胞制剂。如加入含有2.0g人血白蛋白的250ml 0.9％氯化钠中，制备成DC-CIK-CTL输液用制剂。
本发明的另一个内容是，用本发明的细胞制剂治疗肿瘤病人，其方法是将本发明制备的特异性DC-CIK-CTL细胞制剂回输到肿瘤病人体内。
本发明还包括制备一种干扰微环境制剂，该制剂为注射用环磷酰胺(CTX)，注射用CTX，以干扰肿瘤微环境为目的，而不以抗肿瘤为目的，该制剂的制备方法依据制剂学常规技术制备即可，如制备成水针或粉针，也可直接制备成输液剂。以上制剂的剂量范围分别为可一次性用于病人的剂量，如静脉注射用CTX一次用量为400-600mg/m2，制备成的制剂可直接输注，也可加入含有0.9％氯化钠或5％-10％的葡萄糖注射液中给病人输注。
本发明的细胞制剂和干扰微环境制剂的使用方法如下：
环磷酰胺(CTX)600-1200mg静脉滴入，1次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。
以下详细介绍本发明的初始T细胞来源的新型DC-CIK-CTL的制备方法：外周血单状核细胞采集：
应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4℃冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数。
DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞。
DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，次日补充10-15％的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗。
初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1)、可应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选。采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响。
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD4+T cell isolation kit II，human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用。
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD8+T cell isolation kit，human试剂盒说明书分两步进行分选。第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞。第二步，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用。
2)、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的
进行分选。
细胞分选系统包括CliniMACS Plus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除。使用
仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选，分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗。
将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACS Plus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体，然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACS Plus仪器将按照程序自动开始分选。总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞。将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1∶1混合备用。CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50％的CIK培养基，第5天补充IL-2培养基，以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上。第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。
CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中加入IL-2培养基。加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5∶1，继续培养3天获取CTL。
高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次祛除细胞碎片，移入含1％人血白蛋白2.0g，IL-220万单位的回输用生理盐水200ml中，4℃保存备用。
或取1-2×107DC疫苗和0.5×109CIK以及0.5×109CTL效应细胞混合，制备成用于治疗的细胞制剂。
附图说明：
图1.DC疫苗的制备流程示意图。
图2.DC培养扩增过程的不同阶段DC细胞镜下形态和电镜形态。
图3.携带肿瘤抗原的DC细胞在第一信号和第二信号的共同参与下，激活T细胞，制备肿瘤特异性CTL的示意图。
图4.DC细胞激活T细胞的电镜示意图。
图5.干扰肿瘤微环境后，外周血Treg显著降低，第4天到第10天保持在低水平，11天后回升(P＜0.01)。
图6.干扰肿瘤微环境后，外周血IL-10水平显著降低(P＜0.01)。
图7.干扰肿瘤微环境后，外周血TGF-β水平显著降低(P＜0.01)。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1、采血前注意事项：
因为放化疗会在较大程度上影响外周血和骨髓初始T细胞的含量和功能，所以，根治手术后病人在放化疗前采集外周血单壮核细胞较为适宜，放化疗后病人需在放化疗结束1个月后采集比较适宜。外周血白细胞数量较低时，可应用注射用重组人粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)皮下注射进行骨髓动员。多发骨髓转移或骨髓造血功能低下的肿瘤病人，外周血初始T细胞含量和功能较差，不宜实施外周血单状核细胞采集。
2、外周血单状核细胞采集：
应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml。分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清(方法：加入10％葡萄糖酸钙2.5ml吹打混匀，56℃水浴35分钟，2500转/分离心5分钟，收集上清)，4℃冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液(Ficoll，1.077)15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层(单状核细胞)。分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清。加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清。重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数(细胞总数量6-10×109)。
3、DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化。将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞(待初始T细胞分选)，剩余贴壁细胞即为DC细胞。
4、DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml(含GM-CSF 50ug/500ml，IL-430ug/500ml，庆大霉素2.0万单位/500ml)，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天。第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml(自体肿瘤相关抗原制备方法：新鲜肿瘤组织0.5cm3，剪除周边组织后庆大霉素-生理盐水洗涤3-5遍，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，冻融法制备细胞裂解物，过网后蛋白定量)，次日补充10-15％的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、HLA-DR、HLA-ABC表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗(附图1，2)。
5、初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1)、应用美国BD(Becton，Dickinson)、美国R&D(Research andDevelopment System)、或德国美天旎(MiltenyiBiotec)等公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选。建议采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响。
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照CD4+T cell isolation kit II，human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗(包括anti-CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD45RO、CD56、CD123、TCRγ/δ、HLA-DR及CD235a)作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用。
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照CD8+T cell isolation kit，human试剂盒说明书分两步进行分选。第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗(包括anti-CD45RO、CD56、CD57及CD244)作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞。第二步，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用。
2)、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的
进行分选。
细胞分选系统包括CliniMACS Plus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除。使用
仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选。分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗。
按说明书步骤，将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACSPlus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体。然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACS Plus仪器将按照程序自动开始分选。总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞。将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1∶1混合备用。
6、CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml(含IFN-γ1000U/ml；庆大霉素2万单位/500ml)，将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。次日，补充50％的CIK培养基(AIM-V无血清培养基500ml，含CD3单抗25ug，庆大霉素2万单位)。第5天补充IL-2培养基(AIM-V无血清培养基500ml，含IL-215ug，庆大霉素2万单位)。以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上。第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。
5、CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中加入IL-2培养基，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5∶1，继续培养3天获取CTL(附图3，4)。
6、高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次去除细胞碎片，移入200ml回输用生理盐水瓶，(含1％人血白蛋白2.0g，IL-220万单位)，制备成高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂(细胞数量控制在1-2×109，4℃环境输送病房备用。
7、打破肿瘤免疫耐受基础上回输治疗：
方法1：细胞培养的第9天，病人开始做细胞免疫治疗前处理(干扰肿瘤微环境)，方法为：应用环磷酰胺(CTX)400-600mg，静脉滴注，1次/日，连续2天。细胞培养第11天，细胞回输治疗，方法为：采用带滤器输血袋，生理盐水100ml静脉点滴(冲袋)，换细胞制剂200ml静脉输注，速度40-60滴/分，期间每5-10分钟轻柔摇晃输液瓶(袋)，保持细胞混悬状态。细胞输注完成后，换生理盐水100ml静脉点滴(冲洗输液器)。细胞回输治疗每日2次，上下午分开，共6次3天完成。细胞回输当日起，IL-2100万U肌肉注射，2次/日，连续5天。CTX处理前1天和处理后4天分别采取外周血(抗凝)，流式细胞学(FCM)检测Treg(CD4+CD25+)水平，ELISA法检测IL-10和TGF-β水平(附图5-7)。
方法2：应用COBE Spectra血液成分分离机采取外周血单状核细胞的同时，按照程序说明书设定程序，采取造血干细胞，实验室扩增后冻存备用。细胞回输治疗前，应用全身放疗(TBI)技术对病人实施肿瘤微环境干扰，方法是：设定放疗剂量12cGy，分三天完成或一次完成，干扰后病人移入层流病房。第二天进行细胞回输治疗，方法是：采用带滤器输血袋，生理盐水100ml静脉点滴(冲袋)，换细胞制剂200ml静脉输注，速度40-60滴/分，期间每5-10分钟轻柔摇晃输液瓶(袋)，保持细胞混悬状态。细胞输注完成后，换生理盐水100ml静脉点滴(冲洗输液器)。细胞回输治疗每日2次，上下午分开，共6次3天完成。细胞回输当日起，IL-2100万U肌肉注射，2次/日，连续5天。TBI处理前一天和处理后第四天，分别采取外周血(抗凝)，流式细胞学(FCM)检测Treg(CD4+CD25+)水平，ELISA法检测IL-10和TGF-β水平。治疗结束后继续层流病房内支持治疗，至外周血白细胞数量恢复，移出层流病房。两周内白细胞不能恢复正常者，立即进行造血干细胞回输治疗，方法是：将治疗前采取的造血干细胞实验室复苏，保证细胞数量为1-2×109，加入50ml离心管，用生理盐水洗涤3-6次去除细胞碎片，移入200ml回输用生理盐水瓶，(含1％人血白蛋白2.0g，IL-220万单位)，制备成造血干细胞细胞制剂，静脉回输，1次/日，连续3天。
Claims (10)
1.一种初始T细胞来源的肿瘤特异性杀伤细胞的制备方法，步骤如下
步骤1，外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和总T细胞；
步骤2，DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗；
步骤3，T细胞分离出初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将两种初始T细胞按1∶1混合，经INF-γ冲击后，应用CD3单抗和IL-2扩增至第7天，制备CIK；
步骤4，步骤3得到的扩增细胞的半数细胞加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数细胞继续CIK培养，至第10天分别收获CIK和CTL效应细胞；
步骤5，取1-2×107步骤2得到的DC疫苗和0.5×109步骤4得到的CIK以及0.5×109CTL效应细胞混合，制备成用于治疗的细胞制剂。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤1方法如下：外周血单状核细胞采集：
应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4℃冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数，DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤2方法如下：DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关全抗原50ug/ml，次日补充10-15％的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、HLA-DR、HLA-ABC表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤3方法如下：初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1)、可应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响，
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD4+T cell isolation kit II，human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用，
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD8+T cell isolation kit，human试剂盒说明书分两步进行分选，第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞，第二部，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用，
2)、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的
进行分选，
细胞分选系统包括CliniMACS Plus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或去除，使用
仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选，分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗，
将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACS Plus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以去除多余的抗体，然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACS Plus仪器将按照程序自动开始分选，总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1∶1混合备用，CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50％的CIK培养基，第5天补充IL-2培养基，以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤4方法如下：CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中加入IL-2培养基，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5∶1，继续培养3天获取CTL。
6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤5方法如下：高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后、和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次祛除细胞碎片。
7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤如下：
外周血单状核细胞采集：
应用COBE SPECTRA细胞成分分离机，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4℃冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数，DC和T细胞分离：
175cm2培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×107个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞，DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：
贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关全抗原50ug/ml，次日补充10-15％的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD80、CD83、CD86、HLA-DR、HLA-ABC表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗，
初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：
1)、可应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响，
①、初始CD4+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照CD4+T cell isolation kit II，human试剂盒说明书，首先加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行初始CD4+T细胞阴性分选，以祛除非初始T细胞及NK细胞等，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始CD4+T细胞，将所获得的CD4+T细胞离心洗涤2-3次备用，
②、初始CD8+T细胞分选：将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，按照
CD8+T cell isolation kit，human试剂盒说明书分两步进行分选，第一步，分别加入生物素偶联的鸡尾酒单抗作为一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁场进行阴性分选，以祛除非初始T细胞和NK细胞，通过分选柱进入试管底部的细胞即为初始T细胞，第二步，对所收集的初始T细胞进行CD8+磁珠标记，置于磁场进行阳性分选，收获初始CD8+T细胞，离心洗涤2-3次备用，
2)、应用临床级自动细胞分选设备如美天旎的
进行分选，
细胞分选系统包括CliniMACS Plus仪器、CliniMACS管道、CliniMACS试剂和CliniMACS缓冲液，是一个以MACS技术为基础的临床级全自动细胞分选系统，使操作者能够在完全封闭、无菌的系统内进行临床级的靶细胞富集或祛除，使用
仪器，能够实现高纯度、高回收率的靶细胞分选，分选出的靶细胞可以直接应用于实验研究和临床治疗，
将上述外周血总T细胞离心洗涤2-3次，注入CliniMACS Plus细胞准备袋，用相应细胞特异性抗体磁性标记靶细胞，洗涤细胞以祛除多余的抗体，然后，细胞准备袋与管道相连，后者依次连接CliniMACS缓冲液袋和细胞收集袋，分别设定初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞的分选程序，CliniMACS Plus仪器将按照程序自动开始分选，总T细胞将自动通过分选柱，并进行一系列洗涤步骤，最终从分选柱中洗脱靶细胞至收集袋中，收获初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞按照1∶1混合备用，CIK制备：
取175cm2培养瓶，分别加入AIM-V无血清培养基20ml，将悬浮的初始T细胞移入，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，次日，补充50％的CIK培养基，第5天补充IL-2培养基，以后根据培养液颜色适量补充IL-2培养基，每次补充40％以上，第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中，作为CTL培养，剩余半量继续作为CIK培养，
CTL制备：
第8天DC疫苗回收后，将每瓶CIK细胞的一半量移至DC培养瓶中加入IL-2培养基，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制为5∶1，继续培养3天获取CTL，
高效特异性DC-CIK-CTL细胞制剂的制备：
第10天分批取DC疫苗1-2×107复苏、洗涤后，和数量分别为0.5×109的CIK和CTL细胞混合，细胞总数量控制为1-2×109，加入50ml离心管，生理盐水离心洗涤3-6次祛除细胞碎片。
8.根据权利要求1的制备方法制备的特异性杀伤细胞。
9.含有权利要求8的特异性杀伤细胞的制剂。
10.权利要求8的特异性杀伤细胞在制备抗肿瘤制剂中的应用。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978161A (zh) * | 2012-10-24 | 2013-03-20 | 江阴齐氏生物科技有限公司 | Dc-cik细胞分离培养试剂盒及其应用 |
| CN103405758A (zh) * | 2013-07-23 | 2013-11-27 | 蔡建辉 | 一种应用脐血单状核细胞制备肿瘤特异性dc疫苗的方法 |
| CN103800898A (zh) * | 2014-03-13 | 2014-05-21 | 蔡颖 | 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 |
| CN103981144A (zh) * | 2014-03-17 | 2014-08-13 | 深圳市合一康生物科技有限公司 | 自体血清抗原致敏dc-cik细胞的制备方法 |
| CN105802908A (zh) * | 2014-12-29 | 2016-07-27 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种体外制备肿瘤抗原特异性cd8+干细胞样记忆性t淋巴细胞的方法 |
| CN110150267A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-08-23 | 南京沐赛生物技术有限公司 | 一种临床级tcr-t细胞低dmso冻存剂及冻存方法 |
| WO2019196087A1 (en) * | 2018-04-13 | 2019-10-17 | Syz Cell Therapy Co. | Methods of cancer treatment using tumor antigen-specific t cells |
| CN110628621A (zh) * | 2019-10-28 | 2019-12-31 | 合肥中科干细胞再生医学有限公司 | 一种获得肿瘤特异性t细胞的设备和方法 |
| CN113186161A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-07-30 | 南京医科大学 | 快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102091327A (zh) * | 2010-12-27 | 2011-06-15 | 蔡建辉 | 一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法 |
| CN102154206A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-08-17 | 郑骏年 | 一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的cik细胞的制备方法 |
| CN102319426A (zh) * | 2011-08-08 | 2012-01-18 | 王泰华 | 一种去除调节性t细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法 |
-
2012
- 2012-04-27 CN CN2012101271586A patent/CN102657853A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102091327A (zh) * | 2010-12-27 | 2011-06-15 | 蔡建辉 | 一种负载自体肿瘤相关全抗原的树突状细胞疫苗的制备方法 |
| CN102154206A (zh) * | 2011-01-31 | 2011-08-17 | 郑骏年 | 一种高纯度、高增殖力、高细胞毒活性的cik细胞的制备方法 |
| CN102319426A (zh) * | 2011-08-08 | 2012-01-18 | 王泰华 | 一种去除调节性t细胞的特异性肿瘤疫苗的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 任鹏涛: "肿瘤免疫治疗中CIK 细胞Treg细胞及其相关性研究", 《中国博士学位论文全文数据库，医药卫生科技辑》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978161A (zh) * | 2012-10-24 | 2013-03-20 | 江阴齐氏生物科技有限公司 | Dc-cik细胞分离培养试剂盒及其应用 |
| CN103405758A (zh) * | 2013-07-23 | 2013-11-27 | 蔡建辉 | 一种应用脐血单状核细胞制备肿瘤特异性dc疫苗的方法 |
| CN103405758B (zh) * | 2013-07-23 | 2014-12-10 | 蔡颖 | 一种应用脐血单状核细胞制备肿瘤特异性dc疫苗的方法 |
| CN103800898A (zh) * | 2014-03-13 | 2014-05-21 | 蔡颖 | 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 |
| CN103800898B (zh) * | 2014-03-13 | 2016-01-13 | 河北利同康生物科技有限公司 | 一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法 |
| CN103981144A (zh) * | 2014-03-17 | 2014-08-13 | 深圳市合一康生物科技有限公司 | 自体血清抗原致敏dc-cik细胞的制备方法 |
| CN105802908A (zh) * | 2014-12-29 | 2016-07-27 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种体外制备肿瘤抗原特异性cd8+干细胞样记忆性t淋巴细胞的方法 |
| CN105802908B (zh) * | 2014-12-29 | 2020-06-23 | 复旦大学附属肿瘤医院 | 一种体外制备肿瘤抗原特异性cd8+干细胞样记忆性t淋巴细胞的方法 |
| WO2019196087A1 (en) * | 2018-04-13 | 2019-10-17 | Syz Cell Therapy Co. | Methods of cancer treatment using tumor antigen-specific t cells |
| CN110150267A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-08-23 | 南京沐赛生物技术有限公司 | 一种临床级tcr-t细胞低dmso冻存剂及冻存方法 |
| CN110628621A (zh) * | 2019-10-28 | 2019-12-31 | 合肥中科干细胞再生医学有限公司 | 一种获得肿瘤特异性t细胞的设备和方法 |
| CN110628621B (zh) * | 2019-10-28 | 2023-12-22 | 合肥中科干细胞再生医学有限公司 | 一种获得肿瘤特异性t细胞的设备和方法 |
| CN113186161A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-07-30 | 南京医科大学 | 快速分离超高纯度人体血液中性粒细胞的方法 |
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