CN110272871B - 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可刺激单个核细胞使其诱导扩增为γδT细胞的组合物，及使用该组合物对单个核细胞(PBMCs)在体外大量扩增γδT细胞的方法及其应用。通过加入唑来膦酸诱导活化，仅利用IL‑2即可刺激诱导扩增γδT细胞，获得的γδT细胞具有数量大、纯度高、细胞活性强等特点，该方法操作步骤简单，且大大降低了培养成本，更有利于后续大量生产培养扩增γδT细胞，方便用于肿瘤的细胞免疫治疗，具有很好的推广价值和临床应用价值。

Description

一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用
技术领域：
本发明涉及一种可刺激单个核细胞使其诱导扩增为γδT细胞的组合物，及使用该组合物对单个核细胞(PBMCs)在体外大量扩增γδT细胞的方法。
背景技术：
肿瘤是目前对人类健康造成威胁的重大疾病之一，无论死亡率和发病率均居高位。肿瘤免疫疗法是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法，也是目前最受关注和治疗效果最好的疗法。粘膜(表皮)组织作为物理屏障含有广泛的细胞类型包括非淋巴系和淋巴系免疫细胞，特别是T细胞。
研究已经证明T细胞，特别是表达γδ受体的T细胞在维持粘膜组织平衡和阻止病原微生物感染和恶性癌变等表皮组织压力中发挥关键作用。γδT细胞主要在胸腺中发育成熟，通过V(D)J基因重组产生γδT细胞受体(TCR)。通过特异性的基因重排，从一个共同淋巴细胞前体(common lymphoidprecursor,CLP)分化为表达αβ受体和γδ受体的T细胞系。γδT细胞通过关联CD3复合物传导TCR信号，在健康成年人的外周血中，γδT细胞只占循环T细胞的1-10％；αβT细胞占循环T细胞的90％以上，并且通过关联CD3复合物直接传导胞内信号。与αβTCR不同，γδTCR可以直接结合抗原且不依赖MHC分子介导的抗原呈递，因此在γδT细胞表面不表达CD4和CD8分子。广泛的研究表明，根据δ链的表达情况，γδT细胞可以分为三大类，表达Vδ1链的γδT细胞主要分布在粘膜表面的内皮层，很少一部分分布在外周血中。Vδ1型γδT细胞在抵抗损伤、感染和恶性转化表皮完整性中发挥重要作用。γδT细胞另一类主要的亚群是表达Vδ2链的γδT细胞，而且Vδ2链几乎只与Vγ9链配对，是健康成年人中主要的循环γδT细胞，可以达到外周血循环γδT细胞的50-90％。有趣的是，一旦被激活，Vδ2T细胞获得专职抗原呈递细胞(APCs)的特性,包括表达共刺激分子、粘附分子、和抗原呈递分子(例如，CD80,CD86,CD11b,CD18,CD54和MHCⅡ)。第三类γδT细胞亚群表达Vδ3链,约占循环T细胞的0.2％，包括CD4+,CD8+和CD4-CD8-亚群。Vδ3γδT细胞不稳定表达CD56、CD161、HLA-DR和NKG2D。
与αβT细胞不同，γδT细胞不易受抗原加工和呈递缺失的影响，因此γδT细胞具有很高的临床肿瘤免疫治疗潜在应用价值。γδT细胞在肿瘤免疫监视和抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。Girardi等人的研究表明表皮定位的γδT细胞在阻止小鼠表皮形成中发挥重要作用，γδT细胞缺失的小鼠易得皮肤癌(Science.2001；294(5542):605-609.)。Liu等人的研究表明，与对照组小鼠相比，通过尾静脉注射同基因型的γδT，可以显著降低前列腺肿瘤荷瘤小鼠肿瘤的发病率并显著延长荷瘤小鼠的生存期(J Immunol.2008；180(9):6044-6053.)。Zhao等人的研究表明，在无性细胞瘤和精原细胞瘤中，肿瘤组织相关的肉芽肿性炎症中积累大量的γδT浸润性T淋巴细胞，这些浸润的γδT细胞具有杀伤自体肿瘤细胞的活性，可以通过识别Vδ的单克隆抗体阻断γδT细胞的杀伤活性；γδT细胞分泌大量的促炎性因子，例如IFN-γ和TNF-α(Immunol Invest.1995；24(4):607-618.)。Todaro等人的研究表明，γδT细胞可以杀死结直肠癌肿瘤干细胞，肿瘤干细胞在肿瘤起始、生长、转移、抵抗传统肿瘤治疗手段从而复发中发挥重要作用(J Immunol.2009；182(11):7287-7296.)。目前已经从多种肿瘤(包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肾癌等)分离的浸润性T淋巴细胞(TILs)鉴定出γδT细胞(J Immunol.2005；174(3):1338-1347.；J Immunol.2005；175(8):5481-5488.；Mol Immunol.2007；44(4):302-310.)。
由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度不高。因此，发明一种实用高效、成本低、技术简单、可大量扩增高纯度、高细胞毒活性的γδT细胞成为目前迫切需要解决的问题。
发明内容：
针对上述存在的问题，本发明提出了一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用，通过加入唑来膦酸诱导活化，仅利用IL-2即可刺激诱导扩增γδT细胞，获得的γδT细胞具有数量大、纯度高、细胞活性强等特点，该方法操作步骤简单，可操作性强，成本低廉，具有很好的推广价值和临床应用价值。
为了实现上述的目的，本发明采用以下的技术方案：
一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物，该组合物包括唑来膦酸和IL-2。
优选的，唑来膦酸的浓度为1-100μM、IL-2的浓度为500～3000U/mL。
优选的，唑来膦酸浓度为2.5μM、IL-2浓度为500U/mL。
优选的，单个核细胞来源于外周血、脐带血、骨髓或诱导性多能干细胞(iPSC)。
优选的，一种使用上述的组合物刺激诱导单个核细胞体外扩增为γδT细胞的方法，包括以下步骤：
1)单个核细胞的制备：采集外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离获得PBMCs，并用PBS缓冲液重悬洗涤细胞两次；
2)γδT细胞的诱导：加入含5％-10％自体血浆，1-100μM的唑唻磷酸和500～3000U/mL IL-2的GT-T551 H3体外刺激4天后进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
3)每2～3天根据计数结果补液，14～21天收获γδT细胞。
优选的，步骤2)中加入的唑来膦酸终浓度为2.5μM和IL-2终浓度为500U/mL。
优选的，在一个实施案例中所述的外周血单个核细胞(PBMCs)的浓度为1×106cells/mL。
在一个实施方案中也可以使用其他磷酸抗原代替唑来膦酸，包括异戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛儿焦磷酸酯(GPP),牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP),异戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP),焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的双磷酸酯。
优选的，在一个实施案例中培养基中加入的自体血清的比例为10％。
本发明所用原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种仅由IL-2和唑来膦酸，便可获得大量高增殖能力、高纯度和高细胞活性的γδT细胞，培养扩增方法简单，容易操作，大大降低了培养成本，更有利于后续大量生产培养扩增γδT细胞，后续方便用于肿瘤的细胞免疫治疗。
附图说明：
图1是本发明扩增培养γδT细胞生长曲线；
图2本发明扩增培养第7、14和21天γδT细胞的扩增倍数；
图3本发明扩增培养的γδT细胞的流式分析图；
图4本发明扩增培养的γδT细胞对NCI-H1975细胞的杀伤作用。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：γδT细胞的诱导
从外周血中分离单个核细胞(PBMCs)并扩增γδT细胞：
①使用前30分钟开启生物安全柜；
②使用前从冰箱中取出D-PBS，室温放置30分钟；
③将40ml外周血液样品(肝素抗凝)转移到两个无菌50ml离心管，每管15ml，然后向每管加入30ml无菌D-PBS，反复颠倒离心管，充分混匀；
④另取两个50ml无菌离心管，分别加入15ml Ficoll-Paque Plus溶液，然后分别缓慢的加入25ml步骤3中稀释后的血液(由步骤3中两个无菌管中吸取)，形成分层，20℃，400×g,离心30分钟；
⑤将步骤4中的两个50ml离心管放入生物安全柜，然后使用10ml吸管吸取15ml血浆，装入一个新的无菌50ml离心管中，56℃灭活30分钟待用；
⑥吸取每一个50ml离心管中的白细胞层(PBMCs)，转入一个新的无菌50ml离心管；
⑦向步骤6装有PBMCs细胞悬液的离心管中加入无菌PBS至50ml，并用无菌移液管混匀，20℃，400×g，离心10分钟；
⑧弃上清，每管加入10ml无菌PBS，缓慢重悬PBMCs，合二为一后补加无菌PBS至50ml，混匀，取20μl细胞悬液用于计数；根据计数结果取出100万细胞用于表型检测；
⑨剩余细胞20℃，400×g，离心10分钟；
⑩加入含10％自体血浆，2.5μM的唑唻磷酸和500U/mL IL-2的GT-T551 H3重悬细胞后转移至培养瓶；
Figure BDA0002060868810000051
用含10％自体血浆，2.5μM的唑唻磷酸和500U/mL IL-2的GT-T551 H3调整细胞浓度至1×106cells/ml；
Figure BDA0002060868810000052
将细胞培养瓶放置于5％CO2、37℃细胞培养箱中进行细胞培养。
实施例2：培养基换液
①将GT-T551 H3培养基放入37℃水浴锅中温浴，或室内平衡1小时至室温；
②将细胞培养瓶转入生物安全柜中，将细胞轻轻吹匀后取20μl细胞悬液进行计数；
③在第4天时，将所有细胞转入无菌50ml离心管中，20℃，400×g,离心5分钟；
④将原培养基上清转移至无菌50ml离心管中，备用；根据计数结果，计算出将细胞浓度调整为1×106cells/ml时所需培养基体积。加入半量原培养基上清重悬细胞后转移支培养瓶中，加入半量新鲜的含10％自体血浆和500U/mL IL-2的GT-T551 H3培养基，摇匀；
⑤将细胞培养瓶放入细胞培养箱，5％CO2、37℃继续培养；
在第5、6、8、10、12、14、16、18和20天更换扩增培养基，具体操作如下：
⑥将GT-T551 H3培养基放入37℃水浴锅中温浴，或室内平衡1小时至室温；
⑦将细胞培养瓶转入生物安全柜中，将细胞轻轻吹匀后取20μl细胞悬液进行计数；
⑧根据计数结果,加入新鲜的含10％自体血浆(自体血浆直至用完为止)和500U/mL IL-2的GT-T551 H3培养基，调整细胞浓度为1×106cells/ml；
⑨将细胞放入细胞培养箱，5％CO2、37℃继续培养。
在培养第0、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、17和21天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图1所示，接种一千万细胞，扩增21天，细胞总数可达约200亿，完全满足临床应用需要。统计第7天、第14天和第21天γδT细胞扩增倍数，结果参见图2。
实施例3：扩增培养的γδT细胞表型检测
①取培养第21天的细胞至2个1.5mL的EP管中，每管1×106个细胞，补加PBS至1ml，混匀，400×g离心5分钟，弃上清；
②分别加入1mLPBS洗一遍，400×g离心5分钟，弃上清；
③分别加入100μL的PBS，一管加入对照抗体Percp mouse IgG 1,K isotype ctrl和FITC mouse IgG 1,K isotype ctrl，另一管加入检测抗体Percp anti-human CD3和FITC anti-human gamma delta TCR荧光抗体，混匀后4℃放置30分钟；
④PBS洗两遍，每次1ml，弃上清，最终用200μLPBS重悬细胞后转移至5ml流式管中。
使用AECANovocyte流式细胞仪对培养得到的γδT细胞进行检测，CD3阳性的细胞群为γδT细胞，如图3所示，培养21天的细胞，γδT细胞的纯度可达98.14％。
实施例4：扩增得到的γδT细胞杀伤活性检测
使用艾森生物的实时无标记细胞功能分析仪检测不同效靶比γδT细胞对人非小细胞肺腺癌细胞NCI-H1975杀伤活性。
①消化NCI-H1975细胞，调整细胞悬液浓度至1×105cells/mL；
②铺细胞于实时无标记细胞功能分析仪E-Plate 8板上，每孔加入300μL，37℃培养18-24小时；
③将100μL的γδT细胞悬液或等体积的培养基(空白对照)以不同的效靶比5:1；10:1；20:1加入培养板内；
④将E-Plate 8检测板置于实时无标记细胞功能分析仪检测台上实时监测，观察γδT细胞对NCI-H1975细胞的杀伤活性(图4)。
分析实验结果，在加入γδT细胞的时间点，均一化细胞指数值，获得均一化细胞指数(NCI),统计加入γδT细胞4小时后的NCI值，计算不同比例(20:1,10:1,5:1和0:1)γδT细胞对人非小细胞肺腺癌细胞NCI-H1975的杀伤活性，如图4所示，由此方法培养扩增的γδT细胞对非小细胞肺腺癌细胞NCI-H1975的杀伤活性，且杀伤活性随γδT细胞比例增加而增强。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种刺激诱导外周血单个核细胞体外扩增为γδT细胞的方法，包括以下步骤：
1)外周血单个核细胞的制备：采集外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞，并用PBS缓冲液重悬洗涤细胞两次；
2)γδT细胞的诱导：加入仅添加10％的自体血浆、终浓度为2.5μM的唑唻磷酸和终浓度为500U/mL的IL-2的GT-T551 H3体外刺激4天后进行半量换液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
3)每2～3天根据计数结果补液，14～21天收获γδT细胞。
2.根据权利要求1所述的刺激诱导单个核细胞体外扩增为γδT细胞的方法，其特征在于：所述的外周血单个核细胞的浓度为1×106cells/mL。
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