CN111690606B - 体外激活扩增人体自然杀伤细胞及杀伤率检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种体外激活扩增人体自然杀伤细胞的方法，包括：步骤一：分离外周血单个核细胞；步骤二：取步骤一中获得的单个核细胞于无血清培养基中以0.5*106细胞/mL的浓度进行培养，并加入500U/mL的rhIL‑2；步骤三：在培养的0‑5天向培养基中加入CD3抗体和CD16抗体，并将最终浓度调整至10ng/mL，在培养的第5天将含有CD3抗体的培养基冲洗干净，并加入含有500U/mL的IL‑2、10ng/mL的IL7、10ng/mL的IFN‑γ、30ng/mL的HGF和无血清免疫细胞培养基进行细胞培养；步骤四：进行NK细胞的计数统计。本发明的扩增方法能够更加迅速且简便的进行扩增，提高增殖率。

Description

体外激活扩增人体自然杀伤细胞及杀伤率检测方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种体外激活扩增人体自然杀伤细胞及杀伤率检测方法。
背景技术
自然杀伤(natural killer cell，NK)细胞占人外周血淋巴细胞的5％至20％，其来源于CD34+造血祖细胞，是T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，是人体免疫系统的第一道防线，在机体抗病毒感染和抗肿瘤免疫中起重要作用。NK细胞成熟的确切生理部位和驱动其功能特征发展的机制尚未完全阐明，但最近的研究表明，这些发生在骨髓和淋巴结中。
NK细胞具有大颗粒淋巴细胞的形态，并且在表型上由CD56的表达以及CD3和T细胞受体分子的缺乏来定义，大约10％的NK细胞表达非常高水平的CD56，并且还具有与IgG的Fc部分结合的受体FcgRIII(CD16)的暗淡表达。多数认为这部分细胞主要通过分泌细胞因子和趋化因子发挥免疫调节作用，尽管在血液、骨髓和脾脏中较少见，但该细胞亚群在次级淋巴组织中占主导地位。血液中剩余的90％NK细胞表达较低水平的CD56和较高水平的CD16，这部分细胞似乎主要在直接细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中起作用，NK细胞可以通过穿孔素颗粒酶途径或在其细胞表面表达死亡受体配体来直接诱导凋亡，这些配体包括与肿瘤坏死因子(TNF) 相关的凋亡诱导配体(TRAIL)或Fas配体，它们通过各自的受体直接触发细胞凋亡。
NK细胞可以杀死靶细胞，而无需事先敏化，这种作用由刺激信号和抑制信号进行平衡调节，NK细胞表面上的许多信号受体都与主要的组织相容性复合物MHCⅠ类和MHCⅡ类分子结合。众所周知的机制是通过增加靶细胞中I类MHC或人类白细胞抗原(HLA)的表达来抑制NK活性，NK细胞表达杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)，其中大多数识别靶细胞上特定的相应HLA I类分子，并传递抑制信号，而来自HLA的这些抑制信号可能会覆盖激活信号并抑制NK细胞的功能。最近出现的一个概念是，NK细胞和HLA分子之间的相互作用对于它们的功能成熟以及对自身分子具有耐受性的NK细胞的产生也可能很重要，这一过程被称为“许可”。
目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法：1、采用饲养细胞(基因修饰)的方法培养PBMC中的NK细胞；2、采用免疫磁珠的方法从PBMC中将NK细胞分离出来再培养；3、单纯的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增。采用饲养细胞培养NK细胞可以获得高纯度大量的NK细胞，但引入了人源细胞，存在安全隐患；采用免疫磁珠的方法可以快速的获得少量NK细胞，但只能用于NK细胞研究，量少不适用于临床，且成本高，操作复杂；现有的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增的方法仅能使NK细胞扩增倍数在150倍左右，NK细胞纯度在60％左右，且数量和纯度上都无法满足治疗性的要求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种体外激活扩增人体自然杀伤细胞及杀伤率检测方法，具有可大量扩增活力、品质、毒杀活性较佳的NK 细胞的优点。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种体外激活扩增人体自然杀伤细胞的方法，包括：
步骤一：分离外周血单个核细胞，并用磷酸盐缓冲液洗涤；
步骤二：取步骤一中获得的外周血单个核细胞于无血清培养基中以 0.5*106细胞/mL的浓度进行培养，并加入500U/mL的rhIL-2；
步骤三：在培养的0-5天向培养基中加入CD3抗体和CD16抗体，并将最终浓度调整至10ng/mL，在培养的第5天将含有CD3抗体的培养基冲洗干净，并加入含有500U/mL的IL-2、10ng/mL的IL7、10ng/mL的IFN-γ、 30ng/mL的HGF和无血清免疫细胞培养基进行细胞培养；
步骤四：进行NK细胞的计数统计。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤四之后还进行NK细胞增殖能力检测步骤，包括：
取所述步骤三中得到的NK细胞吹打重悬并进行计数，将浓度调整为 5x105个/mL；
将上述步骤得到的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔定容100 μL；
选取其中15孔分为5组，每组3孔，采用细胞计数仪进行计数，每2 天记录一组数据，取3孔计数的平均值作为增殖数量，计数至第10天后进行生长曲线的绘制。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤一中外周血单个核细胞利用淋巴细胞分离液通过梯度离心法进行分离。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤一中对外周血单个核细胞进行洗涤后，还通过台盼蓝排除法对获得的细胞活力进行评估。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤四中具体包括：
分别在培养的第0、5至6、9至10、14至15及20天，对细胞进行染色以评估细胞总数；
通过流式细胞检测法确定NK细胞的百分比，按照标准公式最终得到 NK细胞的绝对细胞计数。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤四中利用锥虫蓝染料对细胞进行染色。
作为本发明的一种优选方案，所述通过流式细胞检测法确定NK细胞的百分比具体包括：
取2×105细胞于15mL离心管中，平均分配5×104细胞至4管1.5mL 离心管中，每管加入1mL含1％BSA的磷酸盐洗涤液，室温下以1200rpm离心5min，弃去上清后，用100μL含1％BSA的磷酸盐洗涤液重悬细胞沉淀；
将所述4管1.5mL离心管分别标记为管1-1、管1-2、管2-1和管2-2，于管1-1中加入2μLCD3抗体、于管1-2加入2μL相对应的同型对照抗体，于管2-1中加入2μL CD56抗体、于管2-2加入2μL相对应的同型对照抗体；
室温避光孵育15min后，分别于所述4管1.5mL离心管中加入1mL磷酸盐洗涤液，以1200rpm离心5min，弃去上清后用100μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，再利用流式细胞仪分析细胞表面CD3、CD56抗体的表达情况以确定NK细胞的百分比。
作为本发明的一种优选方案，所述标准公式为：绝对细胞计数＝细胞总数×NK细胞的百分比。
另一方面，本发明还提供一种自然杀伤细胞杀伤率的检测方法，包括：
将100μL、2×104个肿瘤细胞K562铺板于96孔细胞培养板中，取三组实验孔、每组5个复孔，按照效靶比为5、10、20的顺序分别在各组实验孔中加入经权利要求1-8中任一项的所述方法获得的NK细胞；
设计试验对照组，所述试验对照组包括空白对照组、靶细胞对照组和效应细胞对照组，所述空白对照组中加入肿瘤细胞K562的培养基和NK细胞的培养基，所述靶细胞对照组中加入对应数量的肿瘤细胞K562和NK细胞的培养基，所述效应细胞对照组加入对应数量的NK细胞和肿瘤细胞K562 的培养基；
将各实验孔和试验对照组培养4h后，加入12.5μL CCK-8，再培养3h 后，利用酶标仪检测个实验孔和试验对照组的A450值；
根据核算公式计算NK细胞的杀伤率。
作为本发明的一种优选方案，所述核算公式为：NK细胞杀伤率(％) ＝[1-(效靶细胞混合组A450值-效应细胞对照组A450值)/(靶细胞对照组 A450值-空白对照组A450值)]*100％。
综上所述，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的扩增方法由于能够从外周血制备NK细胞，因而具有对供体和患者侵袭性低的优点，且相比于现有的扩增方法，能够更加迅速且简便的进行扩增，提高增殖率，且扩增数量得到大幅度提升。
2、本发明通过抽取健康人类个体的周边血液，并取出其中的周边血液单核细胞(PBMCs)进行NK细胞的增殖，相比于现有的扩增方法，可以使 NK细胞的活力、品质、与毒杀活性均处于健康而良好有效的状态。
3、本发明在NK细胞增殖过程中对增殖的NK细胞进行刺激，能够更有效的保证NK细胞的毒杀伤活性。
4、本发明在NK细胞增殖过程中，采用自体血清进行培养，使NK细胞肿瘤治疗方案更加安全，同时采用不同干细胞培养基混合培养NK细胞，有效降低了NK细胞增殖成本，也为NK细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方案。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中NK细胞扩增阶段在显微镜观察下的示意图。
图2为本发明实施例中流式细胞仪检测结果示意图。
图3为本发明实施例中NK细胞的扩增倍数曲线图。
图4为本发明实施例中NK细胞对肿瘤细胞K562杀伤率的统计示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一种体外激活扩增人体自然杀伤细胞的方法，包括：
步骤一：分离外周血单个核细胞(PBMC)，并用磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferedSaline，PBS)洗涤。
具体的，本实施方式中外周血单个核细胞利用淋巴细胞分离液通过梯度离心法进行分离，同时在对外周血单个核细胞进行洗涤后，还通过台盼蓝排除法对获得的细胞活力进行评估。
步骤二：取步骤一中获得的外周血单个核细胞于无血清培养基中以 0.5*106细胞/mL的浓度进行培养，并加入500U/mL的rhIL-2。
步骤三：在培养的0-5天向培养基中加入CD3抗体和CD16抗体，并将最终浓度调整至10ng/mL，在培养的第5天将含有CD3抗体的培养基冲洗干净，并加入含有500U/mL的IL-2、10ng/mL的IL7、10ng/mL的IFN-γ (Interferon-γ,IFN-γ)、30ng/mL的HGF(肝细胞生长因子)和无血清免疫细胞培养基进行细胞培养，如图1所示，图1示出了NK细胞在扩增阶段的生长示意图。
步骤四：进行NK细胞的计数统计，该步骤具体包括如下过程：
分别在培养的第0、5至6、9至10、14至15及20天，对细胞进行染色以评估细胞总数，具体为利用锥虫蓝染料对细胞进行染色；
通过流式细胞检测法确定NK细胞的百分比，按照标准公式最终得到 NK细胞的绝对细胞计数，标准公式为：绝对细胞计数＝细胞总数×NK细胞的百分比。
本实施方式中，通过流式细胞检测法确定NK细胞的百分比具体包括：
取2×105细胞于15mL离心管中，平均分配5×104细胞至4管1.5mL 离心管中，每管加入1mL含1％BSA的磷酸盐洗涤液，室温下以1200rpm离心5min，弃去上清后，用100μL含1％BSA的磷酸盐洗涤液重悬细胞沉淀；
将4管1.5mL离心管分别标记为管1-1、管1-2、管2-1和管2-2，于管1-1中加入2μLCD3抗体、于管1-2加入2μL相对应的同型对照抗体，于管2-1中加入2μL CD56抗体、于管2-2加入2μL相对应的同型对照抗体；
室温避光孵育15min后，分别于4管1.5mL离心管中加入1mL磷酸盐洗涤液，以1200rpm离心5min，弃去上清后用100μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，再利用流式细胞仪分析细胞表面CD3、CD56抗体的表达情况以确定 NK细胞的百分比。
步骤五：NK细胞增殖能力检测步骤，该步骤具体包括：
取步骤三中得到的NK细胞吹打重悬并进行计数，将浓度调整为5x105个/mL；
将上述步骤得到的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔定容100 μL；
选取其中15孔分为5组，每组3孔，采用细胞计数仪进行计数，每2 天记录一组数据，取3孔计数的平均值作为增殖数量，计数至第10天后进行生长曲线的绘制，如图3所示，图3为NK细胞扩增倍数的曲线图。
另一方面，本发明还提供一种自然杀伤细胞杀伤率的检测方法，包括：
将100μL、2×104个肿瘤细胞K562铺板于96孔细胞培养板中，取三组实验孔、每组5个复孔，按照效靶比为5、10、20的顺序分别在各组实验孔中加入经权利要求1-8中任一项的方法获得的NK细胞；
设计试验对照组，试验对照组包括空白对照组、靶细胞对照组和效应细胞对照组，空白对照组中加入肿瘤细胞K562的培养基和NK细胞的培养基，靶细胞对照组中加入对应数量的肿瘤细胞K562和NK细胞的培养基，效应细胞对照组加入对应数量的NK细胞和肿瘤细胞K562的培养基；
将各实验孔和试验对照组培养4h后，加入12.5μL CCK-8，再培养3h 后，利用酶标仪检测个实验孔和试验对照组的A450值；
根据核算公式计算NK细胞的杀伤率，具体核算公式为：NK细胞杀伤率(％)＝[1-(效靶细胞混合组A450值-效应细胞对照组A450值)/(靶细胞对照组A450值-空白对照组A450值)]*100％。
如图4所示，图4示出了NK细胞对肿瘤细胞K562杀伤率的统计示意图，根据图示可知，当效靶比上升时，杀伤率逐渐上升，效靶比为20时，杀伤率达到93％，杀伤效果明显。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明的扩增方法由于能够从外周血制备NK细胞，因而具有对供体和患者侵袭性低的优点，且相比于现有的扩增方法，能够更加迅速且简便的进行扩增，提高增殖率，且扩增数量得到大幅度提升。
2、本发明通过抽取健康人类个体的周边血液，并取出其中的周边血液单核细胞(PBMCs)进行NK细胞的增殖，相比于现有的扩增方法，可以使 NK细胞的活力、品质、与毒杀活性均处于健康而良好有效的状态。
3、本发明在NK细胞增殖过程中对增殖的NK细胞进行刺激，能够更有效的保证NK细胞的毒杀伤活性。
4、本发明在NK细胞增殖过程中，采用自体血清进行培养，使NK细胞肿瘤治疗方案更加安全，同时采用不同干细胞培养基混合培养NK细胞，有效降低了NK细胞增殖成本，也为NK细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方案。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种体外激活扩增人体自然杀伤细胞的方法，其特征在于，包括：
步骤一：分离外周血单个核细胞，并用磷酸盐缓冲液洗涤；所述外周血单个核细胞利用淋巴细胞分离液通过梯度离心法进行分离；对外周血单个核细胞进行洗涤后，还通过台盼蓝排除法对获得的细胞活力进行评估；
步骤二：取步骤一中获得的外周血单个核细胞于无血清培养基中以0.5x106细胞/mL的浓度进行培养，并加入500U/mL的rhIL-2；
步骤三：在培养的0-5天向培养基中加入CD3抗体和CD16抗体，并将最终浓度调整至10ng/mL，在培养的第5天将含有CD3抗体的培养基冲洗干净，并加入含有500U/mL的IL-2、10ng/mL的IL7、10ng/mL的IFN-γ、30ng/mL的HGF和无血清免疫细胞培养基进行细胞培养，获得人体自然杀伤细胞；
步骤四：进行NK细胞的计数统计。
2.检测体外激活扩增的人体自然杀伤细胞的方法，其特征在于，以权利要求1所述的方法制备体外激活扩增的人体自然杀伤细胞；之后进行NK细胞的计数统计及进行NK细胞增殖能力检测的步骤，包括：
取所述步骤三中得到的NK细胞吹打重悬并进行计数，将浓度调整为5x105个/mL；
将上述步骤得到的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔定容100μL；
选取其中15孔分为5组，每组3孔，采用细胞计数仪进行计数，每2天记录一组数据，取3孔计数的平均值作为增殖数量，计数至第10天后进行生长曲线的绘制。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：
分别在培养的第0、5至6、9至10、14至15及20天，对细胞进行染色以评估细胞总数；
通过流式细胞检测法确定NK细胞的百分比，按照标准公式最终得到NK细胞的绝对细胞计数。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤四中利用锥虫蓝染料对细胞进行染色。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述通过流式细胞检测法确定NK细胞的百分比，具体包括：
取2×105细胞于15mL离心管中，平均分配5×104细胞至4管1.5mL离心管中，每管加入1mL含1%BSA的磷酸盐洗涤液，室温下以1200rpm离心5min，弃去上清后，用100μL含1%BSA的磷酸盐洗涤液重悬细胞沉淀；
将所述4管1.5mL离心管分别标记为管1-1、管1-2、管2-1和管2-2，于管1-1中加入2μLCD3抗体、于管1-2加入2μL相对应的同型对照抗体，于管2-1中加入2μL CD56抗体、于管2-2加入2μL相对应的同型对照抗体；
室温避光孵育15min后，分别于所述4管1.5mL离心管中加入1mL磷酸盐洗涤液，以1200rpm离心5min，弃去上清后用100μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，再利用流式细胞仪分析细胞表面CD3、CD56抗体的表达情况以确定NK细胞的百分比；通过流式细胞检测法确定NK细胞的百分比，按照标准公式最终得到NK细胞的绝对细胞计数，标准公式为：绝对细胞计数=细胞总数×NK细胞的百分比。
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