CN111500535B - 用于体外培养人自然杀伤细胞的方法和培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外富集、活化、扩增培养人自然杀伤细胞(NK细胞)的方法，其通过对培养板的预包被以及使用包含特殊因子组合的活化培养基和扩增培养基，能够高效地扩增和活化NK细胞。本发明还提供用于本发明的方法的培养基，包括活化培养基和扩增培养基；以及包含所述培养基的试剂盒。

Description

用于体外培养人自然杀伤细胞的方法和培养基

技术领域

本发明属于细胞培养和细胞分化领域，特别涉及一种高效提升人NK细胞体外扩增和分化效率的方法。

背景技术

自然杀伤(natural killer，NK)细胞由造血干细胞分化而来，作为机体的第一道防线识别并攻击外来病原体和体内肿瘤细胞，是固有免疫系统的重要组成部分。同时，NK细胞与获得性免疫系统的B细胞和T细胞均为淋巴细胞家族成员，其被激活后所释放出的IFNγ能够诱导细胞表面MHC类分子的表达，放大抗原提呈作用，因此NK细胞能作为桥梁连接起固有免疫与获得性免疫两大系统。

NK细胞表面不表达特异性抗原识别受体，不受MHC分子的限制，无需预先致敏就能通过多种方式直接杀伤肿瘤细胞，这些方式包括：1.释放穿孔蛋白和颗粒酶素致使肿瘤细胞溶解；2.释放TNF作用于肿瘤细胞表面的TNF受体，致使细胞凋亡；3.NK细胞表面配体(FasL或TRAIL)能与肿瘤细胞表面受体(Fas或TRAILR)结合并诱导其凋亡；4.NK细胞表面的Fc受体(CD16，FcRIIIγ)能与抗体结合，发挥抗体依赖的细胞毒(ADCC)作用。

基于T细胞或NK细胞的改造与回输的细胞治疗是目前肿瘤免疫治疗的研究热点，这两类细胞的临床前和临床实验数据均体现出了对肿瘤细胞的强杀伤性。与T细胞不同，NK细胞表面无MHC分子，使用异源细胞进行过继免疫治疗时也不会造成移植物抗宿主反应(GvHD)，如此一来扩大了适用NK细胞免疫回输治疗的病人范围。

但是，NK细胞仅占血液中淋巴细胞含量的10-15％，使用普通培养基进行体外培养后，NK细胞活化效率低、扩增缓慢且细胞生存周期短，难以达到临床应用的要求。目前，体外大量扩增NK细胞的方法包括在培养基中加入异源动物血清；与滋养层细胞K562共培养；使用生存周期长，扩增效率高的NK-92细胞系；使用磁珠分选出淋巴细胞中的NK细胞再进行体外扩增以提高收获纯度。然而这些方法具有各自的弊端和局限性，比如培养周期长，不可控因素多，操作繁琐，不适用于NK细胞过继免疫治疗的临床使用。例如，异源动物血清的加入增加了安全性方面的风险，难以满足对于临床细胞疗法的要求；K562与NK-92均为肿瘤细胞系，即使辐照后再进行回输也不能保证其安全性；磁珠分选操作繁琐、成本较高。因此，找到一种兼具简便、安全、高效、稳定的方法用于人NK细胞的扩增就成了目前NK细胞临床免疫治疗亟待解决的关键。

发明内容

本发明的发明人开发了一种NK细胞的培养方法，其中不使用滋养层细胞和异源血清，通过在基础培养基中添加多种因子的特定组合即可得到高纯度、高扩增率(expansionrate)、高杀伤活性的NK细胞，由此能够大幅提升人NK细胞体外扩增和活化效率，同时兼具简便、安全、稳定的特性，具有良好的临床应用价值，由此解决了上述问题。

因此，在第一方面，本发明涉及一种体外富集、活化、扩增培养人NK细胞的方法，包括以下步骤：

(1)使用novonectin、抗-CD16单抗和抗-NKG2D单抗预包被培养容器；

(2)将PBMC细胞接种到步骤(1)中预包被的容器中，并使用活化培养基进行活化培养，其中所述活化培养基包含基础培养基和活化因子组合，所述基础培养基为SCGM培养基，所述活化因子组合包含干细胞生长因子(SCF)、白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)、FLT3L、4-1BBL和烟酰胺；和

(3)使用扩增培养基进行扩增培养，其中所述扩增培养基包含基础培养基和扩增因子组合，所述基础培养基为SCGM培养基，所述扩增因子组合包含干细胞生长因子(SCF)、白介素2(IL-2)和白介素15(IL-15)。

在一个实施方案中，所述方法的步骤(1)的预包被在4℃下进行12-16小时。在另一个实施方案中，所述方法的步骤(1)的预包被在37℃下进行1-3小时。在一个优选的实施方案中，所述预包被在37℃下进行约2小时。

在一个实施方案中，所述方法的步骤(2)中以约1×10⁵至约1×10⁷个细胞/ml数量级，优选约1×10⁶个细胞/ml数量级的密度接种PBMC细胞。

在一个实施方案中，所述方法的步骤(1)使用预包被溶液进行预包被。在优选的实施方案中，所述预包被溶液包含10-100μg/mL，优选10-50μg/mL，更优选15-40μg/mL，甚至更优选20-30μg/mL，最优选25μg/mL的novonectin。在另外的优选实施方案中，所述预包被溶液包含0.5-20μg/mL，优选1-10μg/mL，更优选1.5-5μg/mL，最优选约2μg/mL的抗-CD16单抗。在另外的优选实施方案中，所述预包被溶液包含0.5-20μg/mL，优选1-15μg/mL，更优选2.5-10μg/mL，最优选约5μg/mL的抗-NKG2D单抗。在更优选的实施方案中，所述预包被溶液包含浓度为10-100μg/mL的novonectin、终浓度为0.5-20μg/mL的抗-CD16单抗和/或终浓度为0.5-20μg/mL的抗-NKG2D单抗。在具体的实施方案中，所述预包被溶液包含约25μg/mL的novonectin，约2μg/mL的抗-CD16单抗和/或约5μg/mL的抗-NKG2D单抗。

在一个实施方案中，步骤(2)的活化培养可以进行约4-8天，优选约5-7天，更优选约6天。在优选的实施方案中，在活化培养过程中可以补充一次或多次活化培养基，如每2-4天，优选每3天补充一次活化培养基。

在一个实施方案中，步骤(3)的扩增培养过程中可以补充扩增培养基，如每2-4天补充一次，优选每3天补充一次扩增培养基。在具体的实施方案中，所述扩增培养进行至少10天，如至少20天，优选约20至约1个月，如约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。

在一个实施方案中，所述活化培养基中的活化因子组合包含或其组成为5-200ng/mL的干细胞生长因子(SCF)、10-1000U/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-15、5-200ng/mL的FLT3L、5-50ng/mL的4-1BBL和0.1-5mg/mL的烟酰胺。在进一步的实施方案中，所述扩增培养基中的扩增因子组合包含或其组成为5-200ng/mL的SCF、10-1000U/mL的IL-2和5-50ng/mL的IL-15。在具体的实施方案中，所述活化培养基中的活化因子组合包含或其组成为约20ng/mL的SCF、约200U/mL的IL-2、约20ng/mL的IL-15、约20ng/mL的FLT3L、约20ng/mL的4-1BBL和约0.6mg/mL的烟酰胺；和/或所述扩增培养基中的扩增因子组合包含或其组成为约20ng/mL的SCF、约200U/mL的IL-2和约20ng/mL的IL-15。

在另一个实施方案中，所述活化培养基中的活化因子组合包含或其组成为5-200ng/mL的干细胞生长因子(SCF)、10-1000U/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、5-200ng/mL的FLT3L、5-50ng/mL的4-1BBL和0.1-5mg/mL的烟酰胺。在进一步的实施方案中，所述扩增培养基中的扩增因子组合包含或其组成为5-200ng/mL的SCF、10-1000U/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7和5-50ng/mL的IL-15。在具体的实施方案中，所述活化培养基中的活化因子组合包含或其组成为约20ng/mL的SCF、约200U/mL的IL-2、约20ng/mL的IL-15、约20ng/mL的IL-7、约20ng/mL的FLT3L、约20ng/mL的4-1BBL和约0.6mg/mL的烟酰胺；和/或所述扩增培养基中的扩增因子组合包含或其组成为约20ng/mL的SCF、约200U/mL的IL-2、约20ng/mL的IL-7和约20ng/mL的IL-15。

在进一步的实施方案中，所述活化因子组合和/或扩增因子组合进一步包含IL-18、Poly I:C或唑来膦酸中的一种或多种，优选一种。优选地，所述活化因子组合和/或活化因子组合中使用的IL-18的浓度为5-50ng/mL，优选20ng/mL。优选地，所述活化因子组合和/或活化因子组合中使用的Poly I:C的浓度为5-50μg/mL，优选10μg/mL。优选地，所述活化因子组合和/或活化因子组合中使用的唑来膦酸的浓度为0.5-20μg/mL，优选5μg/mL。

在一些实施方案中，所述活化因子组合由扩增因子组合和FLT3L、4-1BBL和烟酰胺组成。

在本发明的实施方案中，所述活化因子或扩增因子的浓度是以培养基的体积为参照确定的。

在一些实施方案中，步骤(2)中接种所用的细胞来自人的血液样品，优选外周血。在示例性实施方案中，从受试者采集约10mL的血液样品。在具体的实施方案中，接种所用的所述细胞是使用Ficoll淋巴细胞分离液从血液样品中分离的单个核细胞。

在一个实施方案中，所述培养容器选自96孔板、24孔板、12孔板、6孔板、T25培养瓶、T75培养瓶、T175培养瓶、T225培养瓶、100mm培养皿、150mm培养皿。在优选的实施方案中，所述培养容器为24孔板。

在一个实施方案中，基于流式细胞术分析鉴定的结果，本发明的方法获得的NK细胞中表型为CD3^-CD56⁺、CD3^-CD16⁺和CD16⁺CD56⁺的NK细胞比例均在80％以上，优选85％以上，优选90％以上。在优选的实施方案中，本发明的方法获得的NK细胞中有95％以上的细胞为CD3^-CD56⁺。

在一个实施方案中，本发明的方法获得的NK细胞与靶细胞Nalm6-GFP-luc在效靶比1:1时，24h对靶细胞的杀伤率达到90％以上。

第二方面，本发明提供用于NK细胞的扩增培养基，所述扩增培养基包含基础培养基和扩增因子组合，所述基础培养基为SCGM培养基，所述扩增因子组合包含干细胞生长因子(SCF)、白介素2(IL-2)和白介素15(IL-15)或由干细胞生长因子(SCF)、白介素2(IL-2)和白介素15(IL-15)组成。在一个实施方案中，所述扩增培养基中的扩增因子组合包含或其组成为5-200ng/mL的SCF、10-1000U/mL的IL-2和5-50ng/mL的IL-15。在具体的实施方案中，所述扩增培养基中的扩增因子组合包含或其组成为约20ng/mL的SCF、约200U/mL的IL-2和约20ng/mL的IL-15。在进一步的实施方案中，所述扩增培养基进一步包含IL-7，优选5-100ng/mL的IL-7，更优选约20ng/mL的IL-7。在更进一步的实施方案中，所述扩增培养基还包含IL-18，优选5-50ng/mL，更优选20ng/mL的IL-18。

第三方面，本发明提供用于NK细胞的活化培养基，所述活化培养基包含基础培养基和活化因子组合，所述基础培养基为SCGM培养基，所述活化因子组合包含干细胞生长因子(SCF)、白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)、FLT3L、4-1BBL和烟酰胺。在一个具体的实施方案中，所述活化培养基中的活化因子组合包含或其组成为5-200ng/mL的干细胞生长因子(SCF)、10-1000U/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-15、5-200ng/mL的FLT3L、5-50ng/mL的4-1BBL和0.1-5mg/mL的烟酰胺。在更具体的实施方案中，所述活化培养基中的活化因子组合包含或其组成为约20ng/mL的SCF、约200U/mL的IL-2、约20ng/mL的IL-15、约20ng/mL的FLT3L、约20ng/mL的4-1BBL和约0.6mg/mL的烟酰胺。在进一步的实施方案中，所述活化培养基中的活化因子组合进一步包含IL-7，优选5-100ng/mL的IL-7，更优选约20ng/mL的IL-7。在更进一步的实施方案中，所述活化培养基中的活化因子组合还包含IL-18、Poly I:C或唑来膦酸中的一种或多种，优选一种，其中IL-18的浓度优选5-50ng/mL，更优选20ng/mL，Poly I:C的浓度优选5-50μg/mL，更优选10μg/mL，唑来膦酸的浓度优选0.5-20μg/mL，更优选5μg/mL。

第四方面，本发明提供用于NK细胞培养的试剂盒，包含第二方面的扩增培养基和/或第三方面的活化培养基。在优选的实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于预包被培养容器的预包被溶液，所述预包被溶液包含novonectin、抗-CD16单抗和抗-NKG2D单抗。

第五方面，本发明提供如本发明第二方面的扩增培养基、第三方面的活化培养基或第四方面的试剂盒在NK细胞培养中的用途。

第六方面，本发明涉及通过本发明第一方面的方法获得的细胞群体，在通过流式细胞术分析时，所述细胞群体中表型为CD3^-CD56⁺、CD3^-CD16⁺和CD16⁺CD56⁺的NK细胞比例均在80％以上，优选85％以上，优选90％以上。在优选的实施方案中，本发明的方法获得的NK细胞中有95％以上的细胞为CD3^-CD56⁺。在优选的实施方案中，所述细胞群体中的NK细胞与靶细胞Nalm6-GFP-luc在效靶比1:1时，24h对靶细胞的杀伤率达到90％以上。在具体的实施方案中，所述细胞群体用于细胞治疗，例如针对肿瘤或病毒感染的细胞治疗。

附图说明

图1A-B是NK细胞增殖曲线，A)使用了组合I的培养基；B)使用了组合V的培养基；

图2A-E是使用五种不同的培养基组合时，第37天测定的NK细胞流式表型。

图3是使用本发明的方法培养至第25天NK细胞对Nalm6-GFP-luc的杀伤率，其中以柱状图显示了在效靶比为1:1时，24小时和48小时的杀伤率。

图4是使用本发明的方法培养至第25天NK细胞的细胞因子释放量的柱状图。

发明详述

本申请中的术语均按照所属技术领域普通技术人员的通常理解来释义，除非另有特殊说明。

术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可表示给定值的最多20％，最多10％，最多5％或最多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，例如在本发明涉及接种细胞数量时，该术语可以表示数值的一个数量级，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。在申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意味着在特定值的可接受误差范围内。

“单个核细胞”特别是“外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell,PBMC)”指外周血中具有单个细胞核的多种细胞，包括淋巴细胞如T细胞、B细胞、NK细胞，和单核细胞。基于所含细胞核的数量，可以区分单个核细胞和血液中的其他细胞类型，如不含细胞核的细胞(例如红细胞和血小板)以及含有多个细胞核的细胞(例如粒细胞)。人类PBMC中的大多数为淋巴细胞，淋巴细胞中含量最多的是T细胞。通常可以使用Ficoll和密度梯度离心法从血液样本中将PBMC与其他类型的细胞进行分离。

“NK细胞”即“自然杀伤细胞”，作为一种细胞毒性淋巴细胞，是固有免疫系统中非常重要的一员。NK细胞在PBMC中至多占到15％。不同于T细胞等免疫细胞对主要组织相容性复合物(MHC)的依赖，NK细胞能够在不存在MHC和抗体的情况下识别出应激细胞，进而更加快速地诱发免疫反应，展现杀伤效果。NK细胞水平的变化常被用作评估和监测免疫功能、治疗效果、疾病进程特别是恶性肿瘤和病毒感染的指标。

人NK细胞表面表达CD16(FcγRIII)和CD56，其可以作为NK细胞的标志物。与NKT细胞(天然杀伤T细胞)不同，人NK细胞不表达CD3，所以CD3可以作为区别NKT和NK细胞的标志物。因此，本领域会通过CD3^-CD16⁺CD56⁺三者来表征并鉴定血液中的NK细胞。

NK细胞受体可以基于功能进行区分。激活性受体如NCR(天然细胞毒性受体)、CD16，抑制性受体如KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、CD94/NKG2。NK细胞的活化取决于抑制性受体和激活性受体刺激之间的平衡。例如，如果抑制性受体信号更突出，那么NK细胞的活性将被抑制；相反，如果激活信号占优，那么NK细胞的活性将被活化。NK细胞的ADCC活性依赖于CD16，因此CD16的表达对于NK细胞的杀伤效果十分重要，所以培养获得更大比例的CD16⁺NK细胞是理想的。

由于NK细胞在PBMC中占比较少，在用于细胞治疗时通过培养进行活化和扩增就变得十分必要。

本发明的培养方法的关键步骤包括对培养板进行预包被，然后使用活化培养基和扩增培养基这两种含有特定因子组合的培养基对NK细胞进行活化和扩增。

在本发明的培养方法中，在接种细胞进行培养之前包括预包被步骤，其中使用包含特定因子组合的预包被溶液对培养容器进行预包被。预包被溶液的用量取决于培养容器的体积和表面积。例如，当使用24孔培养板进行培养时，每孔使用200-400μL预包被溶液，优选约300μL预包被溶液进行预包被。所述预包被溶液中的特定因子包含novonectin、抗-CD16单抗和抗-NKG2D单抗，或由novonectin、抗-CD16单抗和抗-NKG2D单抗组成。

“Novonectin”是人纤连蛋白(fibronectin)片段，其通过与NK细胞表面受体相互作用促进对NK细胞的吸附。在本发明中用于预包被培养容器时，可以将novonectin包含在预包被溶液中，其浓度为10-100μg/mL，优选15-75μg/mL，更优选20-50μg/mL，最优选约25μg/mL。

“CD16”即FcγRIII，是NK细胞表面的一种Fc受体，属于免疫球蛋白超家族。该受体与抗体分子的Fc端结合后能激活NK细胞并促进其增殖，能介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，裂解并杀伤肿瘤细胞。本发明使用的抗CD16抗体不限于具有特定序列的抗体，只要其能够特异性结合人CD16并激活其功能即可。在使用预包被溶液进行预包被时，抗CD16抗体的可为0.5-20μg/mL，优选1-10μg/mL，更优选1.5-5μg/mL，最优选约2μg/mL。

“NKG2D”是NK细胞表面的一类激活性受体，属于C型凝集素家族，介导NK细胞的杀伤功能。该受体的胞内端与DAP10二聚体偶联，经下游分子PI3K和Grb2-Vav1作用，介导胞内信号转导(Garrity et al.,2005；Upshaw et al.,2006)。NKG2D受体与配体结合后，能够激活NK细胞并促进其增殖。本发明使用的抗NKG2D抗体不限于具有特定序列的抗体，只要其能够特异性结合人NKG2D并激活其功能即可。在使用预包被溶液进行预包被时，抗NKG2D抗体的可为0.5-20μg/mL，优选1-15μg/mL，更优选1.5-10μg/mL，最优选约5μg/mL。

在申请人先前涉及NK细胞培养的申请中，预包被过程使用了1-10μg/mL的4-1BBL。在本发明的方法中，申请人发现将4-1BBL以低得多的浓度如20ng/mL包含在活化培养基中，能够获得卓越的效果，同时大大降低了4-1BBL的使用浓度和用量。

本发明的培养方法中使用了两种培养基，即活化培养中的“活化培养基”和扩增培养中的“扩增培养基”。本发明的“活化培养基”可以包含基础培养基和多种活化因子的组合。本发明的“扩增培养基”可以包含基础培养基和多种扩增因子的组合。通过添加特定的因子组合来促进NK细胞的扩增和活化是本发明的重要方面。

在本发明的上下文中，“基础培养基”指为培养的细胞提供基本营养和能量需求的培养基，通常包含无机盐、碳水化合物、氨基酸、维生素等营养物质，以及缓冲液。本发明的基础培养基是适用于培养NK细胞的培养基。在优选的实施方案中，本发明的基础培养基是适合于细胞治疗应用的基础培养基，例如无血清培养基，更优选无血清、无动物来源物质的培养基。在具体的优选实施方案中，所述基础培养基是SCGM培养基(

20802-0500)，其为一种无血清、无动物来源物质的培养基。

的SCGM培养基是符合GMP(Good Manufacturing Practice；药品生产质量管理规范)标准的培养基，因此适用于培养用于细胞治疗的细胞产品。

在本发明的上下文中，为了表述方便使用了“活化因子”和“扩增因子”这两个术语，分别表示活化培养基和扩增培养基中含有的补充剂、添加剂的组合，因此这两种组合可以含有一种或多种相同的成分。适合添加的补充剂、添加剂可以包括细胞因子、维生素、NK细胞活化剂等。

“白细胞介素”、“白介素”或“IL”在本文可以互换使用。作为一类包含几十个成员的细胞因子，多种白介素参与了免疫细胞如T淋巴细胞和B淋巴细胞以及造血细胞的发育和分化。多篇研究显示多种白介素如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21可用于NK细胞的体外(in vivo)或离体(ex vivo)培养以提高细胞存活率、促进分化和增殖(Becknell B andCaligiuri MA,Adv Immunol 2005,86:209-39；Ni J et al.,J Exp Med 2012,209:2351-65；和Sivori S et al.,Eur J Immunol 2003,33:3439-47)。

本发明的扩增因子组合和活化因子组合中也都包含多种白介素。具体而言，本发明的扩增因子组合和/或活化因子组合至少包含选自IL-2、IL-7、IL-15和IL-18中的一种或多种白介素，优选至少两种。基于大量的实验，发明人发现优选在扩增因子组合和活化因子组合中至少包含IL-2和IL-15。更优选地，本发明的扩增因子组合和/或活化因子组合中包含IL-2、IL-7和IL-15。在另一个实施方案中，本发明的扩增因子组合和/或活化因子组合中包含IL-2、IL-7、IL-15和IL-18。在优选的实施方案中，扩增培养基和活化培养基中包含的白介素的种类相同。在更进一步的实施方案中，扩增培养基和活化培养基中包含的白介素的种类和浓度都相同。这样的设计能够简化制备扩增培养基和活化培养基的过程，例如可以先制备包含同样的基础培养基和细胞因子组合如白介素组合的母液或扩增培养基，然后通过向其中添加额外所需的因子来进一步配制活化培养基。

NK细胞表面具有IL-2中亲和性受体，IL-2能够诱导NK的杀伤活性的增强(Schleypen et al.,2006)。另外，IL-2还可诱导NK细胞表达IL-2Rα链，新表达的α链与原先细胞表面的β链和γ链结合形成高亲和性受体，在IL-2存在下刺激NK细胞发生增殖。在本发明中，IL-2在活化培养基或扩增培养基中的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为10-1000U/mL，优选50-750U/mL，更优选100-500U/mL，还更优选150-250U/mL，最优选约200U/mL。

IL-7Rα是在CD56^brightNK细胞表面广泛分布的受体，IL-7与之结合后，通过提高胞内BCL2蛋白的表达量来抑制NK细胞凋亡，延长NK细胞的生存周期(Michaud and Dardari，2009)。在本发明中，IL-7在活化培养基或扩增培养基中的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为5-100ng/mL，优选7.5-75ng/mL，更优选10-50ng/mL，还更优选15-25ng/mL，最优选约20ng/mL。

IL-15作用于NK细胞表面IL-2Rβ受体，经STAT5信号通路传导，同样能够提升NK细胞的存活(Gotthardt and Sexl，2017)。在本发明中，IL-15在活化培养基或扩增培养基中的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为5-50ng/mL，优选7.5-40ng/mL，更优选10-30ng/mL，还更优选15-25ng/mL，最优选约20ng/mL。

在一个具体的实施方案中，本发明的扩增和活化培养基中还包括IL-18。IL-18可促进NK细胞的增殖、分化及成熟，促进NK细胞释放细胞因子(Tohru et al.,2010)。在本发明中，IL-15在活化培养基或扩增培养基中的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为5-50ng/mL，优选7.5-40ng/mL，更优选10-30ng/mL，还更优选15-25ng/mL，最优选约20ng/mL。

除了多种白介素，本发明的活化因子组合和扩增因子组合中的必要成分还包括干细胞因子(SCF)。SCF的受体c-kit和FLT3L均属于酪氨酸激酶受体家族成员，SCF与c-kit的结合对维持体内NK细胞的数目以及造血干细胞向淋巴细胞各亚型的分化至关重要。SCF作用于c-kit后能促使NK细胞前体向NK细胞进行分化并扩增，同时能够维持并增强NK细胞的存活(Colucci and Santo,2018)。在本发明中，SCF在活化培养基或扩增培养基中的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为5-200ng/mL，优选10-100ng/mL，更优选15-50ng/mL，最优选约20ng/mL。

因此，本发明中使用的扩增因子组合至少包含SCF、IL-2和IL-15，或由SCF、IL-2和IL-15组成。优选地，扩增因子组合至少包含SCF、IL-2、IL-7和IL-15，或由SCF、IL-2、IL-7和IL-15组成。在另一个实施方案中，扩增因子组合至少包含SCF、IL-2、IL-7、IL-15和IL-18，或由SCF、IL-2、IL-7、IL-15和IL-18组成。各个因子的浓度如前文所述。

不同于扩增培养基，活化培养基为了使NK细胞活化可包含更多的因子。除了上述白介素和干细胞生长因子之外，活化培养基中的活化因子组合中还包括三种必要成分，即FLT3L、4-1BBL和烟酰胺。在此基础上，在另一个实施方案中，所述活化因子组合中还包括Poly I:C或唑来膦酸之一。

烟酰胺(NAM)是一种B族维生素，在本发明中起到促进NK细胞增殖、存活及分泌细胞因子的作用。在用于本发明的活化培养基中时，FLT3L的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为0.1-5ng/mL，优选0.2-2.5ng/mL，更优选0.5-1ng/mL，最优选约0.6ng/mL。

FLT3L指FLT3(Fms样酪氨酸激酶3)的配体，是酪氨酸激酶受体家族成员，其在本发明中促进人类造血干细胞分化。在用于本发明的活化培养基中时，FLT3L的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为5-200ng/mL，优选10-100ng/mL，更优选15-50ng/mL，最优选约20ng/mL。

4-1BBL指4-1BB的配体，其与NK细胞表面的4-1BB(一类共刺激分子，属于TNF受体超家族)结合后，用于本发明中时能够增强NK细胞表面活化受体Nkp46的表达，增强NK细胞的增殖和杀伤。在用于本发明的活化培养基中时，FLT3L的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为5-50ng/mL，优选10-100ng/mL，更优选15-50ng/mL，最优选约20ng/mL。

因此，本发明中使用的活化因子组合可以包含如上所述的任何一种扩增因子组合和烟酰胺、4-1BBL、FLT3L，或由如上所述的任何一种扩增因子组合和烟酰胺、4-1BBL、FLT3L组成。各个因子和成分的浓度如前文所述。

在一个实施方案中，所述活化因子组合可进一步包含Poly I:C或唑来膦酸。

“Poly I:C”或“Poly(I:C)”指聚肌胞苷酸，是Toll样受体3的配体，在本发明中其可以包含在活化培养基中，与其他细胞因子协同作用激活NK细胞，诱导NK细胞释放细胞因子。在用于本发明的活化培养基中时，Poly I:C的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为5-50μg/mL，优选7.5-25μg/mL，最优选约10μg/mL。

“唑来膦酸”也可以被添加到活化培养基中，与其他因子一起发挥激活NK细胞的作用。在用于本发明的活化培养基中时，唑来膦酸的添加量以在培养基中的终浓度计算，可以为0.5-20μg/mL，优选1-15μg/mL，更优选2.5-10μg/mL，最优选约5μg/mL。

多种培养器皿都可以用于本发明的培养方法，包括但不限于多孔板、培养瓶、培养皿，例如96孔板、24孔板、12孔板、6孔板、T25培养瓶、T75培养瓶、T175培养瓶、T225培养瓶、100mm培养皿、150mm培养皿。在优选的实施方案中，本发明的培养容器为24孔板。

通过本发明的培养方法获得的细胞群体中NK细胞的表型可以通过本领域技术人员已知的方法来鉴定，如通过流式细胞术使用对于NK细胞的理想表型有指向性的抗体来进行，所述抗体包括抗CD3单抗、抗CD16单抗和抗CD56单抗。

本发明的培养方法具有多种有益效果，包括但不限于：

1.本发明中用于扩增人NK细胞所使用的生物试剂成分明确，用量确定，且培养过程中不涉及任何异源血清和滋养层细胞，仅使用含抗体和因子的基础培养基，极大程度提升了制备所得NK细胞的稳定性和安全性。

2.本发明直接使用健康人外周血中的单个核细胞进行培养，无需对NK细胞进行纯化，操作简便，节约成本。

3.本发明方法从人单个核细胞诱导所得的NK细胞纯度高，扩增效率强，存活时间长，对肿瘤细胞的杀伤效果明显，能够满足NK细胞过继免疫治疗的临床使用。

实施例

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1:人血样中NK细胞的体外扩增和活化

按照如下方法使用本发明的活化培养基体外扩增并活化NK细胞。

培养板的预包被

使用novonectin、抗-CD16单抗和抗-NKG2D单抗预先包被24孔板。具体来说，将novonectin(Cytocares，CH38)、抗-CD16单抗(Cytocares，GMP-A091)和抗-NKG2D单抗(Cytocares，NC008)分别按终浓度25μg/mL、2μg/mL和5μg/mL溶于PBS中，在24孔板每孔加入300μL，并将24孔板于37摄氏度培养箱放置2h。

人外周血单个核细胞的分离

由健康志愿者捐献得到10mL外周血。用10mL PBS将外周血倍比稀释，混匀。使用移液枪吸取经稀释的外周血，沿管壁将血样缓慢加至装有20mL Ficoll淋巴细胞分离液的50mL离心管中。将离心机温度设置在25摄氏度，转速400g，离心35min，升速5，降速3，进行离心。离心后吸取白膜层(单个核细胞层)并将其加入50mL离心管，使用PBS定容至20mL，并重悬细胞。将离心机温度设置在25摄氏度，以转速1500rpm离心10min，升速9，降速9，进行离心。离心后弃去离心管内容物中的上清，再加入PBS定容至10mL，重悬细胞并计数。

细胞表型分析

取200μL细胞液，在1500rpm离心5min，弃去上清，再用50μL染色缓冲液(stainingbuffer)(PBS+0.5％FBS)重悬细胞。加入2μL FcR阻断剂(Biolegend，422302)，在25摄氏度封闭10min。加入2μL 7AAD(BD，559925)、10μL FITC-抗CD3(BD，555339)、10μL PE-抗CD16(BD，555407)和5μL APC-抗CD56(Biolegend，362504)，混匀后在冰浴中避光孵育30min。在离心管中加入1mL染色缓冲液，在1500rpm离心5min，弃去上清，重复2次。用200μL染色缓冲液重悬之后，进行流式分析，计算初始状态下CD3^-/CD16⁺/CD56⁺细胞即NK细胞在PBMC中所占比例。

细胞接种和培养

将离心机温度设置在25摄氏度，以转速1500rpm离心10min，升速9，降速9。弃上清，使用活化培养基调节PBMC细胞浓度，以1×10⁶个/mL终浓度接种于已包被的24孔板。将接种后的24孔板置于CO₂含量为5％的培养箱，37摄氏度培养。所述活化培养基含基础培养基SCGM(Cell Genix，20802-0500)，SCF(Cytocares，GMP-CD53)(终浓度为20ng/mL)，IL-2(Cytocares，C013)(终浓度为200U/mL)，IL-7(Cytocares，GMP-CD47)(终浓度为20ng/mL)，IL-15(Cytocares，GMP-C016)(终浓度为20ng/mL)，FLT3L(Cytocares，DCA82)(终浓度为20ng/mL)，4-1BBL(Cytocares，CH04)(终浓度为20ng/mL)，NAM(Sigma，PHR1033)(终浓度为0.6mg/mL)。

培养至第3天，对细胞进行计数，按1×10⁶个/mL的密度接种，补充活化培养基。

培养至第6天，对细胞进行计数，按1-2×10⁶个/mL的密度接种，加入扩增培养基。所述扩增培养基含基础培养基SCGM，SCF(终浓度为20ng/ml)，IL-2(终浓度为200U/mL)，IL-7(终浓度为20ng/mL)，IL-15(终浓度为20ng/mL)。

每隔3天，对细胞进行计数，按1～2×10⁶个/mL的密度接种，补充扩增培养基。

发明人在研究过程中尝试了多种常用于NK细胞培养的可商购培养基，除了SCGM培养基外，还包括KBM502培养基(Corning公司的NK细胞无血清扩增培养基)、Vivo^TM-15培养基(Lonza公司的淋巴细胞无血清培养基)和TexMACS^TM培养基(MiltenyiBiotec公司的T细胞无血清培养基)，但是都无法获得很好的NK细胞表型，使用后三种培养基在相同条件下进行培养时，培养第25天时细胞群体中CD3^-CD56⁺、CD3^-CD16⁺和CD16⁺CD56⁺细胞的比例均低于40％。因此，本申请最优选使用SCGM培养基作为基础培养基，并且后续实验也使用SCGM培养基进行。

本实施例测试了五种不同的扩增培养基和活化培养基组合(组合I、组合II、组合III、组合IV和组合V)，其具有不同的细胞因子组合，具体如下表所示。全部五种培养基均是用SCGM培养基作为基础培养基。

表1.不同培养基组合的配方

实施例2：细胞增殖能力的测定

分别在培养的第0、6、12、18、25、31、37天取50μL细胞悬液，用PBS稀释10倍。取10μL稀释后的细胞培养液以1:1的比例加入台盼蓝。混合均匀之后，取10μL台盼蓝与细胞培养液的混合液滴入血球计数板，置于倒置显微镜在20×物镜下计算活细胞数。用当天所计活细胞数除以第0天所计活细胞数即得细胞扩增倍数。

图1A和1B分别显示了使用组合I和组合V的培养基组合进行培养而获得的结果。如上表中所示，组合I和组合V的培养基组合的区别在于组合V的活化培养基中进一步包含了5μg/mL的唑来膦酸。

如图所示，组合I(图1A)和组合V(图1B)都实现了高增殖率，最高超过60倍的增殖。相比之下使用组合I的培养基获得的细胞增殖效率更高，在培养至第25天时，细胞数量达到了最高的80倍，之后有所下降，但仍然在细胞培养至第37天时保持在50倍之上的水平。组合V的培养基组合在第31天时的增殖倍数最高，在六十多倍，在37天时下降至30倍左右。

实施例3：人单个核细胞诱导成NK细胞的转化效率

在第0天和第25天分别取培养的细胞200μL，将离心机温度设置在25摄氏度，以转速1500rpm离心5min，升速9，降速9，进行离心。弃上清，使用染色缓冲液重悬细胞细胞并计数。

将离心机温度设置在25摄氏度，以1500rpm离心5min，升速9，降速9，进行离心。弃上清，使用染色缓冲液将细胞密度稀释为1×10⁶个/mL，各管取等量细胞液加入多个1.5mLEppendorf离心管，设置阴性对照组和抗体单染组。

离心机温度设置在25摄氏度，转速1500rpm离心5min，升速9，降速9，进行离心。弃上清，在离心管中加入2μLFcR阻断剂，25摄氏度封闭10min。

在离心管中加入1mL染色缓冲液，温度25摄氏度，转速1500rpm离心5min，升速9，降速9，进行离心后弃去上清。

阴性对照管加入50μL染色缓冲液(PBS+0.5％FBS)重悬细胞；待测管加入含有三种荧光抗体(FITC-抗CD3、PE-抗CD16和APC-抗CD56抗体)的50μL染色缓冲液；单染组加入含有单个荧光抗体的50μL染色缓冲液。在4摄氏度孵育30min。

在离心管中加入1mL染色缓冲液，温度25摄氏度，转速1500rpm离心5min，升速9，降速9，离心后弃上清，并重复2次。

用200μL染色缓冲液重悬细胞，使用流式细胞仪检测人单个核细胞诱导成NK细胞的转化效率。

图2A-E为采用本发明方法时，在培养的第25天的细胞流式检测NK细胞的结果，其中A-E分别代表五种不同的培养基组合，即组合I-V的培养基组合。如结果所示，本发明所获得的外周血单个核细胞CD3^-CD56⁺，CD3^-CD16⁺和CD16⁺CD56⁺比率均超过90％。说明经过25天的体外培养，NK细胞的纯度高达90％以上。

表2.根据流式细胞术测定的NK细胞比例

实施例4：NK细胞杀伤活性的测定

取培养至第25天时的细胞，台盼蓝倍比稀释染色后进行计数。

将NK细胞与Nalm6-GFP-luc细胞分别以1:1效靶比混合，NK细胞取1×10⁵个，Nalm6-GFP-luc细胞取1×10⁵个，加入96孔U型板中混匀，中提及为200μl。设置1×10⁵个Nalm6-GFP-luc细胞/孔作为对照。置于CO₂含量为5％的培养箱，37摄氏度分别培养6h、24h和48h。

Nalm6-GFP-luc细胞自身表达萤光素酶，杀伤结束后按每孔0.14mg/mL加入底物萤光素(Perkin Elmer,122799)，吹打均匀，37摄氏度孵育10min。吹打均匀后取150μL细胞悬液置于96孔白板中。萤光素酶催化萤光素氧化生成氧化-萤光素(oxy-luciferin)，同时发出绿色荧光，使用酶标仪luminescence模式在曝光时间为1s的条件下检测NK孔、Nalm6-GFP-luc孔、NK+Nalm6-GFP-luc孔的荧光强度，按照如下公式计算得到NK细胞的杀伤活性。

杀伤率＝[Nalm6-GFP-luc荧光值-(NK+Nalm6-GFP-luc)荧光值]/Nalm6-GFP-luc荧光值。

采用本发明方法和组合I的培养基进行培养，收获培养第25天的NK细胞并测定杀伤率。如图3所示，当NK细胞与靶细胞Nalm6-GFP-luc在效靶比1:1时，24h对靶细胞的杀伤率达到90％以上。

实施例5：NK细胞释放细胞因子能力测定

取培养至第25天时的细胞，计数。

将NK细胞与Nalm6-GFP-luc细胞分别以1:1效靶比混合，NK细胞取1×10⁵个，Nalm6-GFP-luc细胞取1×10⁵个，加入96孔U型板中混匀，终体积200μL。设置1×10⁵个Nalm6-GFP-luc细胞/孔作为对照。置于CO₂含量为5％的培养箱，37摄氏度分别培养6h和24h。

将96孔板中溶液吹打混匀，离心机温度设置在25摄氏度，以1500rpm离心5min，升速9，降速9。

取上清，用Cisbio法测定上清中IFN-γ和TNF-α的含量。

采用本发明方法和组合I的培养基进行培养，收获培养第25天的NK细胞，并在靶细胞Nalm6-GFP-luc存在的条件下测定6h和24h时的细胞因子释放。如图4所示，收获的NK细胞在测定的两个时间点都有明显的细胞因子IFN-γ和TNF-α的释放。

Claims (4)

1.一种体外富集、活化、扩增培养人自然杀伤细胞(NK细胞)的方法，包括以下步骤：

(1)使用novonectin、抗-CD16单抗和抗-NKG2D单抗预包被培养容器；

(2)将外周血单个核细胞(PBMC)接种到步骤(1)中预包被的容器中，并使用活化培养基进行活化培养，其中所述活化培养基通过向基础培养基添加活化因子组合获得，所述基础培养基为SCGM培养基；和

(3) 对经过步骤(2)活化的细胞使用扩增培养基进行扩增培养，其中所述扩增培养基通过向基础培养基添加扩增因子组合获得，所述基础培养基为SCGM培养基，

所述步骤(2)中的活化因子组合和步骤(3)中的扩增因子组合分别为如下组I或组IV中的任何一组：

I. 所述活化因子组合为20ng/mL的SCF、200U/mL的IL-2、20ng/mL的IL-15、20ng/mL的IL-7、20ng/mL的FLT3L、20ng/mL的4-1BBL和0.6mg/mL的烟酰胺，

所述扩增因子组合为20ng/mL的SCF、200U/mL的IL-2、20ng/mL的IL-7和20ng/mL的IL-15；或

IV. 所述活化因子组合为20ng/mL的SCF、200U/mL的IL-2、20ng/mL的IL-15、20ng/mL的IL-7、20ng/mL的FLT3L、20ng/mL的4-1BBL、0.6mg/mL的烟酰胺和10μg/mL的Poly I:C，

所述扩增因子组合为20ng/mL的SCF、200U/mL的IL-2、20ng/mL的IL-7和20ng/mL的IL-15；

所述方法不使用滋养层细胞和异源血清。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)的预包被在4℃下进行12-16小时，或在37℃下进行1-3小时。

3.权利要求1所述的方法，其中在步骤(2)中以1×10⁶个细胞/ml数量级的密度接种。

4. 权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中使用包含终浓度为10-100 μg/mL的novonectin、终浓度为0.5-20 μg/mL的抗-CD16单抗和终浓度为0.5-20 μg/mL的抗-NKG2D单抗的预包被溶液进行预包被。

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