JP2017012010A - 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
1.1.血液からの末梢血液単核細胞(PMBC)及び自家血漿の分離
血液は、健常者の静脈から採血して準備した。そのとき、採血容器は、ヘパリンが含まれた採血チューブを使用した。患者から採取した血液を、フィコール(Ficoll)(#17−1440〜02,GE Healthcare、または同等以上)が込められたチューブ(#352070,BD、または同等以上)2個に、それぞれ30mlずつ用心深く移して入れた。血液が込められたチューブを2,500rpmで10分間、break off状態で遠心分離した後、上層の血漿部分を新たなチューブに移し入れた。
前記実施例1.1.で得られる全ての細胞懸濁液を、1,500rpm、5分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。2ないし8℃で保管しておいたCryostor CS10またはALyS505NK−EX+Albumin+DMSO混合液に細胞を浮遊させ、細胞数が1〜100×106cells/mlになるようにした。浮遊した細胞を2ml凍結バイアル(cryogenic vial)に1mlずつ分注した後、CRF(controlled rate freezers)を使用し、0℃で10〜15分間の条件、−12℃で5〜10分間の条件、及び−42℃で0.5〜1分間の条件で、第1段階凍結させ、第1凍結段階後、−25℃で1〜3分の条件、及び−15℃で1〜3分の条件で凍結させ、第2凍結段階後、−42℃で20〜40分の条件、及び−120℃で20〜50分の条件で凍結させるか、あるいは4〜−40℃範囲で3℃/mで、第1段階凍結し、第1凍結段階後、−40〜−90℃範囲で5℃/mの条件で、第2段階凍結させ、第2凍結段階後、−90〜−120℃範囲で5℃/mの条件で凍結させた。凍結した細胞をLN2タンクに移して保管した(−130℃以下)。
ヒートブロックを37℃になるようにセッティングした後、Tフラスコに、10%血漿(plasma)が添加された培養液を入れた。細胞濃度によって、培養液ボリュームは、例えば、4ml、6ml、8ml、10mlなどに多様に調節する。前記実施例1.2.で凍結しておいた凍結バイアルをヒートブロックに入れ、凍結されたPBMCを解かした。凍結されたPBMCが半分ほど解けたとき、培養液が込められたTフラスコに移した。次に、37℃、5% CO2インキュベータに入れ、一日の間培養した。培養されたPBMCをチューブに集めた後、Ca/Mgfree DPBSを添加し、1,500rpm、5分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。遠心分離によって分離された細胞を、少量の培養液に浮遊させた後、細胞数を測定した。凍結保管された細胞の解凍後、生存率は、表1に記載する。表1から分かるように、本発明によって凍結保管された後で解凍したPMBCは、93%以上が生存しており、高い生存率が維持されるということを確認することができた。
2.1.フィブロネクチン及びガンマグロブリンでコーティングされた培養フラスコの準備
2.1.1.フィブロネクチン培養フラスコ及びガンマグロブリンコーティング培養フラスコ(1)
15mlチューブに、0.1mlフィブロネクチン(#FC−010,Millipore)及び0.121mlガンマグロブリン(#020A1004,緑十字)を入れた後、Ca/Mg遊離DPBS 9.779mlを添加した。製造されたコーティング液を、ピペットを利用して、T75フラスコ(#156499,Nunc)に入れ、16時間以上2〜8℃で反応させた。細胞培養前、残余コーティング液をCa/Mg遊離DPBSで洗浄した後で除去した。
実施例2.1.1において、フィブロネクチンの量10μl、ガンマグロブリンの量1.21mlのみを異ならせ、実施例2.1.1と同一に、フィブロネクチン及びガンマグロブリンでコーティングされた培養フラスコを準備した。
15mlチューブに、0.2mlフィブロネクチン(#FC−010,Millipore)を入れ、Ca/Mg遊離DPBSに10mlになるまで加えた。その後、実施例2.1.1.と同一の過程によって、フィブロネクチンだけでコーティングされた培養フラスコを準備した。
2.2.1.NK細胞の一次培養(1)
実施例1で用意した細胞懸濁液を取り、前記実施例2.1.で製造されたコーティングフラスコに入れ、自家血漿1.5ml、抗NKp46(#MAB1850,R&D)溶液0.03ml、IL−18(#B003−2,R&D)0.075ml、Alys505NK−EX(#01410P10,CSTI)13.4625mlを添加し、CO2インキュベータで2〜3日間培養した。その後、フラスコに、自家血漿1.5ml及びAlys505NK−EX13.5mlを添加し、CO2インキュベータで1〜2日間培養した。
実施例2.2.と全ての手続きは同一であるが、抗NKp46(同上)溶液を3μl、IL−18(同上)を37.5μl、Alys505NK−EXを2回添加し、総35.95mlを使用したことだけ異にして実施した。
実施例2.2.と全ての手続きは同一であるが、抗NKp46(同上)溶液を15μl、IL−12(#554613,BD)を7.5μl、Alys505NK−EXを2回添加し、総26.98mlを使用したことだけ異にして実施した。
実施例2.2.と全ての手続きは同一であるが、抗NKp46(同上)溶液を15μl、IL−12(同上)を7.5μl、IL−18(同上)を37.5μl、Alys505NK−EXを2回添加し、総26.94mlを使用したことだけ異にして実施した。
実施例2.2.と全ての手続きは同一であるが、抗NKp46(同上)溶液を0.03ml、IL−12(同上)を7.5ml、IL−15(#247−IL−0025,R&D)を12.5μl、IL−18を37.5μl、Alys505NK−EXを2回添加し、総26.913mlを使用したことだけ異にして実施した。
2.3.1.NK細胞の二次培養(1)
実施例2.2.1の一次培養後、培養基で細胞が培養されているT75フラスコを取り出して細胞を集めた後、T175フラスコ(#159910,Nunc)に移した。自家血漿3ml及びAlys505NK−EX(#01410P10、CSTI)27mlをT175フラスコに添加し、CO2インキュベータで1〜2日間培養した。その後、自家血漿6ml、抗NKp46溶液0.12ml、IL−18 0.03ml、Alys505NK−EX(#01410P10,CSTI)53.85mlを添加した後、さらにCO2インキュベータで1〜2日間培養した。
実施例2.3.1と全ての手続きは同一であるが、抗NKp46(#MAB1850,R&D)溶液0.06ml、IL−18(#B003−2,R&D)0.06ml、Alys505NK−EX 53.88mlを使用したことだけ異にし、実施例2.2.2の培養物の二次培養を実施した。
実施例2.3.1と全ての手続きは同一であるが、抗NKp46(#MAB1850,R&D)溶液0.12ml、IL−12(#554613,BD)0.03ml、Alys505NK−EX 53.85mlを使用したことだけ異にし、実施例2.2.3の培養物の二次培養を実施した。
実施例2.3.1と全ての手続きは同一であるが、抗NKp46(#MAB1850,R&D)溶液0.06ml、IL−12(同上)0.03ml、IL−18(同上)0.02ml、Alys505NK−EX 44.89mlを使用したことだけ異にし、実施例2.2.4の培養物の二次培養を実施した。
実施例2.3.1と全ての手続きは同一であるが、抗NKp46(#MAB1850,R&D)溶液0.06ml、IL−12(同上)0.03ml、IL−15(同上)0.06ml、IL−18(同上)0.02ml、Alys505NK−EX 62.83mlを使用したことだけ異にし、実施例2.2.5の培養物の二次培養を実施した。
前記実施例2.3.で培養されたT175フラスコの細胞、及び自家血漿を300IU/mlIL−2を含む培養液に入れ、CO2インキュベータで培養した。2〜3日後、新たな同一ボリュームの培養液(300IU/mlのIL−2を含む培養液)を、細胞が培養されている細胞懸濁液と混ぜた後、CO2インキュベータで培養した。
前記培養(一次培養、二次培養及び三次培養のいずれも)で、IL−2が添加された培養液の代わりに、IL−2が添加されていない免疫細胞培養液に、IL−2を所定量でそれぞれ添加して使用することもできる。
3.1.培養された細胞の総細胞数とNK細胞増殖倍数との確認
前記実施例2.4.で培養された細胞をいずれも収去した後、1,500rpmで5分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、リン酸緩衝食塩水に浮遊させた。細胞浮遊液から10μlを取り、リン酸緩衝食塩水で希釈した後、希釈液10μlを取り、トリパンブルー10μlと混ぜた後、血球計算板(hemocytometer)に載せ、細胞数及び生存率を測定した。細胞数は、(生細胞数+死滅細胞数)×1/4×2×希釈倍数×全体積×104の数式で求め、細胞生存率は、生細胞数÷(生細胞数+死滅細胞数)×100の数式で求めた。
実施例1で用意した細胞懸濁液を取り、前記実施例2.1.で製造されたコーティングフラスコに入れ、自家血漿1.5ml、抗NKp46(#MAB1850,R&D)溶液0.03ml、IL−18(#B003−2,R&D)0.075ml、IL−2が添加されていないAlys505NK−EX(#01400P10,CSTI)13.4625mlを添加し、IL−2は、0ないし10,000IU/ml濃度で添加し(図3参照)、CO2インキュベータで全14日間培養した。14日間培養した細胞を、1,500rpmで5分間遠心分離して上澄み液を除去した後、リン酸緩衝食塩水に浮遊させた。浮遊した細胞から、10μlの検体を採取し、リン酸緩衝食塩水で希釈した後、希釈液10μlを取り、トリパンブルー10μlと混ぜた後、血球計算板(hemocytometer)に載せ、細胞数を測定した。細胞数測定方法は、実施例3.1.と同一である。NK細胞の数は、流細胞分析を介して得られたNK細胞の比率を介して計算した。100IU/mlのIL−2濃度を1にし、残りのIL−2濃度処理によるNK細胞の増殖倍数を計算した。
1.7mlチューブに、1μlフィブロネクチン(#FC−010,Millipore)及び1.21μlガンマグロブリン(#020A1004,緑十字)を入れた後、Ca/Mg遊離DPBS 97.79μlを添加した。製造されたコーティング液を、ピペットを利用して、96ウェルプレート(#167008,unc)に入れ、16時間以上、2ないし8℃で反応させた。細胞培養前、残余コーティング液をCa/Mg遊離DPBSで洗浄した後で除去した。実施例1で用意した細胞懸濁液を取り、製造され96ウェルプレートに入れ、自家血漿10μl、抗NKp46(#MAB1850,R&D)溶液0.2μl、IL−2 1,000IU/mlが添加されたAlys505NK−EX(#01410P10,CSTI)89.8μlを添加し、IL−12は、0ないし10ng/ml濃度で添加し(図4A参照)、IL−18は、0ないし300ng/ml濃度で添加し(図4B参照)、CO2インキュベータで総48時間培養した。48時間後、上澄み液を新たなチューブに移し、1,500rpmで5分間遠心分離し、上澄み液だけ新たなチューブに移した。NK細胞の活性は、IFN−gamma ELISAキット(#DIF50,R&D)を利用して、IFN−gamma分泌量で確認した。
流細胞分析器(flowcytometry)を利用して、実施例2で培養されて収去されたNK細胞の表面抗原を分析した。具体的には、収去された細胞を、Ca/Mg遊離DPBSに浮遊させ、1,500rpmで5分間遠心分離した後、上澄み液を除去して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットに、蛍光物質を含む抗体(CD3−FITC,CD56−APC)をそれぞれ加えた後、4℃で20分間インキュベーションした。FACS緩衝液を加え、8,000rpmで1分間1回遠心分離し、流細胞分析器(FACSCalibur,BD)で分析した。
1)抗癌物質発現程度の分析
実施例2で製造されたNK細胞の抗癌物質発現程度を確認するために、流細胞分析器(flowcytometry)を利用して分析した。具体的には、収去された細胞を、Ca/Mg遊離DPBSに浮遊させ、1,500rpmで5分間遠心分離した後、上澄み液を除去して細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットを、Fixation/Permeabilization solution(#51−2090KZ,BD)で処理した後、蛍光物質を含む抗体(Perforin−PE,GranzymeB−PE,TRAIL−PE)をそれぞれ加えた後、4℃で30分間インキュベーションした。Perm/Wash buffer(#51−2091KZ,BD)を加え、8,000rpmで1分間2回遠心分離し、流細胞分析器(FACSCalibur,BD)で分析した。
対象癌細胞として、白血病(chronic myelogenous leukemia)細胞株であるK562、及び多様な固形癌細胞株(Hep3B,OVCAR3,HepG2,A704,DU145)を収去し、1,500rpmで5分間遠心分離し、上澄み液を除去した後、Ca/Mg遊離DPBSで洗浄した。洗浄された細胞ペレットに培養液を添加し、5×105cells/ml濃度で細胞を準備した。用意された細胞を、CFSE(#c34554,Life technologies)で処理し、CO2インキュベータで10分間インキュベーションした。Ca/Mg遊離DPBSで2回洗浄した後、製造されたNK細胞と共に処理し、CO2インキュベータで4時間インキュベーションした。インキュベーションが終わり、10分間全7AADを処理し、インキュベーションが終わった後、細胞をエッペンドルフ試験管に収去し、流細胞分析器(FACSCalibur,BD)で癌細胞殺傷能を分析した。癌細胞殺傷能の数値は、下記公式で計算した。
Cytotoxicity(%)=(sample処理群−自然遊離)/(100−自然遊離)x100
Donor 3人の血液から分離したPBMC及び凍結PBMCで、14日間、本発明の増殖方法で培養した細胞の特性について、流細胞分析器(flowcytometry)を利用して、CD3、CD16、CD19、CD56の発現有無を確認し、K562細胞に対する細胞毒性度(cytotoxicity)を確認した。その結果、Donor 1のNK細胞数は、968倍増加し、NK細胞(CD3−CD56+)の比率が10.5%から78.8%でに上昇した(表3、図10及び図11)。
Claims (17)
- 自然殺害細胞を、
第1インターロイキンとしてIL−2と、
第2インターロイキンとして、IL−12、IL−15及びIL−18からなる群から選択される1種以上と、
抗NKp46抗体をと、含む培養液で培養する段階を含む自然殺害細胞の増殖方法。 - 前記培養は、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンの存在下で培養することを特徴とする請求項1に記載の自然殺害細胞の増殖方法。
- 前記自然殺害細胞増殖は、末梢血液単核細胞を培養することを特徴とする請求項1に記載の自然殺害細胞の増殖方法。
- 前記末梢血液単核細胞は、凍結保存された後で解凍された状態であることを特徴とする請求項2に記載の自然殺害細胞の増殖方法。
- 前記凍結は、4ないし−42℃の範囲の第1凍結段階、−42ないし−15℃範囲の第2凍結段階、及び−15ないし−120℃範囲の第3凍結段階からなる凍結方法によって行われることを特徴とする請求項3に記載の自然殺害細胞の増殖方法。
- 前記自然殺害細胞増殖方法は、
ガンマグロブリン及びフィブロネクチンがコーティングされた培養容器に、末梢血液単核細胞と培養液とを入れて培養する第1培養段階と、
前記第1培養段階において、培養された培養物に培養液をさらに添加して培養する第2培養段階と、を含む自然殺害細胞の増殖方法であり、
前記培養液は、第1インターロイキンとしてIL−2と、第2インターロイキンとして、IL−12、IL−15及びIL−18からなる群から選択される1種以上と、抗NKp46抗体と、血漿と、を含むことを特徴とする請求項1に記載の自然殺害細胞の増殖方法。 - 前記血漿は、末梢血液単核細胞が由来した末梢血液から分離したものであることを特徴とする請求項6に記載の自然殺害細胞の増殖方法。
- 第1培養段階及び第2培養段階の培養液内で、IL−2濃度は、500ないし5,000IU/mlであることを特徴とする請求項6に記載の自然殺害細胞の増殖方法。
- 前記第2培養段階後、培養物中におけるIL−2濃度を、4/5ないし1/10以下に低めて培養する第3培養段階をさらに含むことを特徴とする請求項6に記載の自然殺害細胞増殖方法。
- 第3培養段階の培養液内で、IL−2濃度は、100ないし1,500IU/mlであることを特徴とする請求項6に記載の自然殺害細胞増殖方法。
- 請求項1ないし10のうちいずれか1項に記載の増殖された自然殺害細胞をデキストラン及びアルブミンを含む溶液に懸濁して保管する段階を含む自然殺害細胞製造方法。
- 請求項1ないし10のうちいずれか1項に記載の増殖された自然殺害細胞を含む癌治療用または予防用の薬学組成物。
- 第1インターロイキンとして、IL−2と、
第2インターロイキンとして、IL−12、IL−15及びIL−18からなる群から選択される1種以上と、
抗NKp46抗体と、を含む自然殺害細胞増殖用の組成物。 - 前記組成物は、ガンマグロブリン及びフィブロネクチンをさらに含むことを特徴とする請求項13に記載の自然殺害細胞増殖用の組成物。
- 前記組成物は、末梢血液単核細胞から自然殺害細胞を増殖させるためのものであることを特徴とする請求項13に記載の自然殺害細胞増殖用の組成物。
- 前記末梢血液単核細胞は、凍結保存された後で解凍された状態であることを特徴とする請求項15に記載の自然殺害細胞増殖用の組成物。
- 前記組成物は、末梢血液単核細胞が由来した末梢血液から分離した血漿を追加して含むことを特徴とする請求項15に記載の自然殺害細胞増殖用の組成物。
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