KR20120091012A - 내추럴킬러 세포의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 의해, 내추럴킬러 세포 및/또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단을 생물응답 변형제 및 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 존재 하에서 확대 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 내추럴킬러 세포를 함유하는 세포집단의 제조방법 등이 제공된다.

Description

내추럴킬러 세포의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCTION OF NATURAL KILLER CELLS}
본 발명은 의료분야에 있어서 유용한 고순도 내추럴킬러 세포집단을 취득하는 방법에 관한 것이다.
또, 본원은 2009년 9월 11일 출원의 일본국 특허출원 제2009-210178호에 대해서 우선권을 주장하는 것으로, 일본국 특허출원 제2009-210178호의 전체 내용을 본원에 포함시키는 것이다.
내추럴킬러 세포(NK세포)는 면역반응의 일익을 담당하는 림프구계의 세포이다. 이 세포에는 여러 가지 기능이 있지만, 특히 종양세포를 죽이는 강한 활성이 있기 때문에, 체내에서는 종양화된 혹은 종양화되고 있는 이상한 세포를 제거하는 면역 감시 기구의 중요 멤버로 생각되고 있다. 따라서 이 세포를 종양치료에 유효 이용하려고 하는 연구는 이전부터 이루어져 왔다.
예를 들면, 림포카인의 1종인 인터류킨(IL)-2을 대량으로 배양액에 첨가하고, 말초혈 단핵구세포(PBMC)를 배양하면, 인간의 경우에는 1주간 전후에서 소위 림포카인 활성화 킬러 림프구(LAK세포)가 증식되게 되지만, 이 중에는 NK세포가 많이 포함되어 있는 것은 잘 알려져 있다. LAK 세포는 종양의 양자 면역요법에 널리 사용되고 있다. 또 LAK세포는 감염증에도 유효한 것이 알려지고 있어, 항생물질로는 고치기 어려운 감염증 대책으로 주목받고 있다.
지금까지, 생체　외에서의 NK세포의 배양방법이 수많이 보고되고 있고(예를 들면, 비특허문헌 1), 보조세포(accessory cell)를 사용하는 방법과 사용하지 않는 방법으로 나눌 수 있다. 보조세포를 사용하지 않는 방법은 예를 들면 PBMC를 IL-2 또는 IL-15 등에 의해 자극하는 방법이다. 그러나, 이 방법은 많은 경우 확대 배양율 및 배양후의 NK세포 함유율이 낮고, PBMC의 도너에 의해 치료에 필요한 NK세포가 수득되지 않는 경우가 있다. 또, 대량의 NK세포를 얻기 위해서 배양기간을 연장하면, 세포 상해활성이 저하되는 것이 보고되어 있다.
한편, 보조세포를 사용하는 방법은, 예를 들면 B임파종 세포주인 K562세포, 악성 임파종 세포주인 Daudi세포, Wilms 종양 세포주인 HFWT세포 등에 방사성선 조사를 실시한 것을 사용하는 방법이다. 또 이것들의 종양세포에 사이토카인 발현 유전자를 도입한 보조세포를 사용하는 방법도 보고되고 있다. 그러나, 이들 보조세포는 종양세포인 점, 비자기의 세포인 점, 및 유전자 도입세포인 점으로부터, 보조세포와 혼합배양한 NK세포를 생체에 주입하는 것을 생각하면, 안전성의 확보에 많은 주의를 필요로 한다. 또 방사선 조사한 PBMC를 보조세포로 사용하는 방법도 보고되고 있다(특허문헌 1). 그러나, 이 방법은 NK세포를 함유하는 세포집단으로서 CD3 양성세포를 제거하는 공정을 필요로 하고, 추가로 도너로부터 대량의 PBMC를 조제할 필요가 있다. 이 방법의 확대 배양율은 배양 개시후 22일에서 최대 약 140배이다.
또, 암의 면역요법에 있어서, 생체의 면역기구를 조절하고, 여러 질병에 대한 치료효과가 기대되는 물질인 생물응답 변형제가 사용되고 있다. 그러나, 이것들 약제는 기대되었을 정도의 림프구 기능을 활성화하지 않는 것이 알려져 있다. 이 때문에 림프구 기능의 활성화를 필요로 하고 있는 환자에게 그것들을 직접 투여해서 동기능을 활성화시키는 것과 같은 치료는 일반적으로는 이루어지지 않고 있고, 한정된 증례에 대해서만 사용되고 있는 것이 현재의 실상이다. 그 작용 메카니즘은 종양세포에 대해서 직접적인 작용을 하는 것이 아니고, 생물응답 변형제를 투여하는 생체고유의 면역세포를 활성화하고, 면역세포의 작용을 통해서 항종양 효과를 발휘하는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 생물응답 변형제의 투여에 의한 효과는 그 투여를 받은 생체가 본래 가지는 면역상태에 크게 좌우되고, 생체의 배경인자의 영향을 받으며, 항종양 효과의 개체차이, 및 환자의 임상상태에 의한 작용의 강도에 차이가 인정되기 쉽다고 알려져 있다.
국제공개 제2007/103901호 팸플릿
Cho D 및 Campana D, Korean J Lab Med, 2009년, 제29권, 제89-96쪽
높은 치료 효과가 기대되는 NK세포에 대해서, 고순도의 NK세포를 효율적으로 취득하는 방법은 확립되지 않고 있는 것이 현재의 상태이다. 따라서 NK세포의 제조를 위해서 더 한층의 세포증식 방법의 개발이 요구되고 있었다.
본 발명자들은 림프구의 배양, 특히 확대 배양의 제반 조건에 대해서 집중적인 연구 수행 결과, NK세포의 효율이 좋은 확대 배양방법을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다.
[1] 내추럴킬러 세포 및/또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단을 생물응답 변형제 및 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 존재 하에서 확대 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 내추럴킬러 세포를 함유하는 세포집단의 제조방법.
[2] 상기 [1]에서, 생물응답 변형제가 세균유래 제제인 방법.
[3] 상기 [2]에서, 생물응답 변형제가 OK-432, BCG, Streptcoccus pyogenes , Corynebacterium parvum 및 이것들의 세포벽 골격으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 세균유래 제제인 방법.
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포가 말초혈 단핵구 세포, T세포, T세포 서브셋 및 B세포로 이루어지는 그룹에서 선택되는 세포에 증식능을 빼앗는 처리를 가한 것인 방법.
[5] 상기 [4]에서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포가 인위적으로 확대 배양된 T세포에 증식능을 빼앗는 처리를 가한 것인 방법.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포가 내추럴킬러 세포 또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포와 동일한 개체에 유래하는 세포인 방법.
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 존재 하에서 확대 배양하는 공정에 있어서, 당해 세포를 첨가하는 것을 복수 회 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
[8] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에서, 내추럴킬러 세포 및/또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포로서 말초혈 단핵구 세포가 사용되는 방법.
[9] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 수득되는 세포집단.
[10] 상기 [9]에 기재된 세포집단에서 분리되는 NK세포를 함유하는 세포아 집단.
[11] 상기 [9]에 기재된 세포집단 및/또는 상기 [10]에 기재된 세포아 집단을 함유하는 의약.
[12] 의약의 제조를 위한, 상기 [9]에 기재된 세포집단 및/또는 상기 [10]에 기재된 세포아 집단의 사용.
[13] 유효량의 상기 [9]에 기재된 세포집단 및/또는 상기 [10]에 기재된 세포아 집단을 대상에 투여하는 공정을 포함하는 질병의 치료방법 또는 예방방법.
[14] 상기 [9]에 기재된 세포집단 및/또는 상기 [10]에 기재된 세포아 집단을 동결하고, 동결한 세포집단 및/또는 세포아 집단을 해동 후, 사이토카인 존재 하에서 배양하는 공정을 포함하는 내추럴킬러 세포를 함유하는 세포집단 및/또는 세포아 집단의 제조방법.
[15] 내추럴킬러 세포 및/또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 단리 및/또는 순화한 세포집단을 생물응답 변형제의 존재 하에서 확대 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 내추럴킬러 세포를 함유하는 세포집단의 제조방법.
본 발명에 의해, 신규한 NK세포의 제조방법이 제공된다. 당해 방법은 세포 증식율이 높고, 강한 세포 상해활성을 나타내는 세포를 수득할 수 있기 때문에, 본 발명에 의해 수득되는 NK세포는 예를 들면 양자면역 요법에 호적하게 사용하는 것이 가능하다. 따라서 본 발명의 방법은 의료분야에로의 막대한 공헌이 기대된다.
본 명세서에 있어서 「NK세포」란 항원감작없이 MHC 비구속성으로 종양세포, 바이러스 감염세포 등을 상해하고, 생체의 항상성 유지를 위해서 작용하는 대형과립 림프구를 포함하는 세포집단을 의미한다. 대표적인 표면 마커로서 CD56, CD94 및 CD16이 알려져 있다. 또, CD3에 대해서 음성이다.
본 명세서에 있어서 「말초혈 단핵구 세포(PBMC)」란 말초혈 유래의 림프구 및 단구를 포함하는 세포집단을 의미하고, T세포, B세포, NK세포 등을 포함한다.
본 명세서에 있어서 「피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드」란 분자 내에 피브로넥틴 유래의 아미노산 서열, 또는 그 일부를 함유하는 폴리펩티드를 의미하고, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴의 프래그먼트가 예시된다. 피브로넥틴 또는 피브로넥틴의 프래그먼트는 천연유래의 단리된 폴리펩티드, 인위적으로 합성된 폴리펩티드, 또는 유전자 공학적으로 조제된 재조합 폴리펩티드의 어느 것일 수도 있다. 피브로넥틴은 예를 들면, Ruoslahti E.들[J. Biol. Chem., 제256권, 제14호, 제7277?7281쪽 (1981)]의 개시에 의거하여, 천연기원의 물질로부터 실질적으로 순수한 형태로 제조할 수 있다. 여기에서, 본 발명에 사용되는 피브로넥틴, 또는 피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는 이것들이 천연에 있어서 피브로넥틴과 함께 존재하는 다른 단백질을 실질적으로 함유하지 않고 있다. 상기의 폴리펩티드는 각각 단독으로, 혹은 복수의 종류의 것을 혼합해서 본 발명에 사용할 수 있다.
또, 피브로넥틴에는 많은 스플라이싱 베리언트의 존재가 알려져 있지만, 본 발명에 사용되는 폴리펩티드는 본 발명의 소망하는 효과를 발현하는 것이라면, 어느쪽의 베리언트 유래의 아미노산 서열을 가지는 것일 수도 있다. 예를 들면, 혈장유래의 피브로넥틴의 경우, 세포 결합 도메인의 상류에 존재하는 ED-B라 불리는 영역, 및 세포 결합 도메인과 헤파린 결합 도메인 사이에 존재하는 ED-A라고 불리는 영역이 결실하고 있는 것이 알려져 있지만, 이러한 혈장유래의 피브로넥틴의 아미노산 서열을 가지는 것도 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 피브로넥틴 프래그먼트, 및 그 프래그먼트의 조제에 관한 유용한 정보는 J. Biochem., 제110권, 제284?291쪽(1991), EMBO J., 제4권, 제7호, 제1755?1759쪽(1985), 및 Biochemistry, 제25권, 제17호, 제4936?4941쪽(1986), 국제공개 제2007/142300호 팸플릿 등에서 얻을 수 있다. 또 피브로넥틴을 코딩하는 핵산서열 및 피브로넥틴의 아미노산 서열은 GenbaNK Accession No.NM_002026, NP_002017에 개시되어 있다.
피브로넥틴의 도메인 구조는 7가지로 나뉘어져 있고, 또 그 아미노산 서열 중에는 3종류의 유사 서열이 포함되어 있다. 이것들의 각 서열의 반복으로 전체가 구성되어 있다. 3종류의 유사 서열은 I형, II형 및 III형으로 각각 불리고, 이 중, III형은 71?96개의 아미노산 잔기로 구성되고 있고, 이것들의 아미노산 잔기의 일치율은 17?40%이다. 피브로넥틴 중에는 14개의 III형의 서열이 존재하지만, 그 중, 8번째, 9번째 및 10번째(이하, 각각 III-8, III-9 및 III-10라고 언급한다.)는 세포 결합 도메인에, 또 12번째, 13번째 및 14번째(이하, 각각 III-12, III-13 및 III-14라고 언급한다.)는 헤파린 결합 도메인에 함유되어 있다. 또 헤파린 결합 도메인의 Ｃ말단측에, IIICS라고 불리는 영역이 존재한다. IIICS에는 25아미노산으로 이루어지는 VLA-4에 대해서 결합 활성을 가지는 CS-1이라고 불리는 영역이 존재한다. 본 발명에 사용할 수 있는 피브로넥틴 프래그먼트는 III-7, 8, 9, 11, 12, 13 또는 CS-1 중 어느 하나의 도메인을 포함하는 프래그먼트일 수 있고, 또 복수의 도메인이 반복해서 연결된 프래그먼트일 수도 있다. 예를 들면, VLA-5으로의 리간드를 포함하는 세포 접착 도메인, 헤파린 결합 도메인, VLA-4로의 리간드인 CS-1도메인 등을 함유하는 프래그먼트가 본 발명에 사용된다. 상기 프래그먼트로서는 예를 들면, 상기한 J. Biochem., 제110권, 284?291쪽(1991)에 기재된 CH-271, CH-296, H-271, H-296, 및 이것들의 유도체나 개변물이 예시된다. 상기의 CH-296은 레트로넥틴(등록상표)의 명칭으로 시판되고 있다.
본 명세서에 있어서 「생물응답 변형제」란 Biological response modifier(BRM) 라고도 불리는 생체에 있어서 비특이적인 면역 응답능을 향상시키는 1군의 물질을 의미한다. 생물응답 변형제에는 세균 유래 제제[OK-432, BCG(Bacillus Calmette Guerin), Streptcoccus pyogenes, Corynebacterium parvum 및 이것들의 세포벽골격]이나 담자균 유래 다당(lentinan, 시조필란, PSK 등), 합성물질(피란코폴리머, 레바미솔 등), 사이토카인류가 알려져 있다. 「OK-432」란 A군 3형 용혈성 연쇄구균(Streptococcus pyogenes)의 약독성 자연변이주(Su주)를 페니실린으로 처리한 세균유래 제제의 일반명을 의미한다. 본제제는 Picibanil(등록상표)의 상품명으로 시판되고 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 명세서에 있어서 「증식능을 빼앗는 처리」란 세포의 증식능을 상실시키거나, 혹은 저하시키는 처리라면 특별하게 한정은 없고, 예를 들면 화학적처리 및/또는 물리적 처리에 의해 실시할 수 있다. 상기의 화학적 처리로서는 예를 들면 화학약제(포르말린 등) 또는 항암제(유사 분열 인히비터, 예를 들면 마이토마이신C 등)에 의한 처리가 예시된다. 또 상기의 물리적 처리로서 방사선, 온열(가열ㆍ가온), 동결ㆍ해동 또는 초음파에 의한 처리가 예시된다. 예를 들면 방사선의 조사에 의해 상기의 처리를 실시하는 경우, 예를 들면 γ선이나 X선이 사용될 수 있다.
증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포는 세포분열, DNA합성과 같은 증식에 관계하는 능력을 잃었거나, 혹은 당해 능력이 저하된 세포이기 때문에, 처리하지 않는 세포와 비교해서 증식능이 저하되어 있다. 예를 들면 방사선 처리를 실시한 세포는 증식능이 저하되어 있지만, 처리 직후는 생세포와 동일한 형태 및 형질을 나타내고, 사이토카인 등의 단백질을 분비하는 대사능을 유지하고 있다.
1. NK세포의 제조방법
본 발명의 NK세포의 제조방법은 NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단을 생물응답 변형제 및 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 존재 하에서 확대 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이다. 본 발명의 NK세포의 제조방법에 의하면, 종래의 방법에 비해서 확대 배양율, NK세포의 함유율, 및 NK세포가 가지는 세포 상해활성이 매우 높은 세포집단을 안정적으로 조제하는 것이 가능하다. 여기에서 확대 배양율이란 배양 개시시와 비교한 증식 배율을 의미하고, 배양 개시시의 세포수로 배양 종료시의 세포 수를 나누고, 추가로 계대 시에 계대에 사용한 세포수의 비율로 나누어서 산출한 배율이다.
본 발명의 방법의 특징의 하나로서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 사용을 들 수 있다. 증식능을 빼앗는 처리를 가하는 세포에는 특별하게 한정은 없다. 본 발명의 호적한 형태에 있어서는, PBMC, T세포, T세포 서브셋(예를 들면 CD4양성 T세포, CD8양성 T세포 등), B세포 또는 이것들의 세포를 배양해서 조제되는 세포집단이 사용된다.
PBMC의 제조방법에 특별하게 한정은 없다. 혈액 혹은 혈액으로부터 혈장을 분리해서 수득되는 혈구 성분으로부터 공지의 방법, 예를 들면 밀도구배 원심 분리법에 의해 제조 할 수 있다. B세포, T세포 또는 T세포 서브셋은 PBMC 또는 기타의 생체시료(말초혈, 골수액, 제대혈 등)로부터 공지의 방법으로 분리할 수 있다. 또, 상기의 세포를 배양해서 세포수를 늘리는 것에 의해 수득되는 세포집단도 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들면, T세포 혹은 T세포의 전구세포를 함유하는 세포집단을 확대 배양조작에 적용해서 수득되는 T세포집단이 예시된다. 상기의 T세포집단의 조제 시에, 전출의 피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 추가로 공존해 두는 것에 의해, T세포의 증식 효율이 향상한다. 즉, 소량의 재료(혈액 또는 PBMC)로부터 대량의 T세포를 취득할 수 있다.
상기 피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 공존 하에서의 T세포의 확대 배양은 아래와 같이 실시된다.
피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 존재 하에서 배양하는 세포집단은 T세포 또는 T세포의 전구세포를 함유하는 세포집단일 수 있고, 말초혈, 골수액, 제대혈, 림프액 등의 체액을 사용할 수 있다. 또한 이것들의 체액, 각 장기 또는 기관으로부터 분리한 세포집단, 예를 들면 PBMC, T세포, T세포 서브셋 또는 이것들의 혼합물을 사용할 수 있다. 또, 치료를 목적으로 해서 생체에 이식되는 NK세포를 조제할 때는, 이것들의 세포 또는 세포집단은 후술하는 「NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포」와 동일한 개체, 즉 동일한 도너 유래의 것으로 할 수 있다. 특히 적합하게는 「NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포」와 「증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포」는 함께 환자 자신에 유래하는 것이 바람직하다.
피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 존재 하에서의 세포집단의 배양은 국제공개 제03/080817호 팸플릿에 상세하게 기재되고 있고, 이것을 참조해서 실시할 수 있다. 피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 존재 하에서의 세포집단의 배양은 확대 배양율이 매우 높아 대량의 세포를 용이하게 조제할 수 있다.
상기 T세포확대 배양에 있어서의 배양 개시시의 세포농도로서는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 1?1×108cells/㎖, 적합하게는 10?5×107cells/㎖, 더 적합하게는 1×102?2×107cells/㎖가 예시된다.
상기 T세포 확대 배양에 사용되는 배지로서는 세포배양에 사용되는 공지의 배지를 사용할 수 있으며, 각종 사이토카인류, 적당한 단백질 또는 다른 성분을 추가로 포함하고 있을 수 있다. 사이토카인류로서는 예를 들면 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IFN-γ 등이 예시된다. 적합하게는 IL-2을 함유하는 배지가 사용된다. IL-2의 배지 중의 농도에는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 적합하게는 0.01?1×105U/㎖, 더 적합하게는 1?1×104U/㎖ 일 수도 있다. 또한 적당한 단백질로서는 예를 들면 항CD3 항체 또는 항IL-4 항체가 예시된다. 본 발명에 사용되는 항CD3 항체로서는 특별히 본 발명을 한정하나 것은 아니지만, 적합하게는 항 인간 CD3 모노클로널 항체, 더 적합하게는 OKT3[Science, 1979년, 제206권, 제347?349쪽]이 예시된다. 또 렉틴 등의 림프구 자극인자를 첨가할 수도 있다. 또, 파미드로네이트, 졸레드로네이트 등의 비스포스폰산계의 화합물, 이소펜테닐 2인산, 2-메틸-3-부테닐-1-피로인산 등의 피로인산 모노 에스테르계 화합물, 포스포할로하이드린류, 포스포에폭사이드류 등을 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 당해 성분의 배지 중의 농도는 소망하는 효과가 수득되는 것이라면, 특별히 한정되는 것은 아니다.
또, 배지 중에 혈청 또는 혈장을 첨가할 수도 있다. 이것들의 배지 중에로의 첨가량은 특별하게 한정은 없지만, 0초과?20용량%, 바람직하게는 0초과?10용량%이다. 예를 들면 자기유래의 혈청 또는 혈장을 사용할 수 있다.
배양에 사용되는 세포 배양기재로서는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 배양접시, 플라스크, 백, 바이오리액터 등을 사용할 수 있다 .또, 백으로서는 예를 들면 세포 배양용 CO2 가스 투과성 백을 사용할 수 있다. 또 공업적으로 대량의 림프구를 제조하는 경우에는 바이오리액터의 사용이 유리하다. 또, 배양은 개방계 또는 폐쇄계의 어느 것으로 실시 할 수 있지만, 수득되는 림프구의 안전성의 관점에서 폐쇄계로 배양을 실시하는 것이 바람직하다.
배양은 공지의 배양조건으로 수행할 수 있고, 통상의 세포배양에 사용되는 조건을 적용 할 수 있다. 예를 들면 37℃, 5% CO2 등의 조건으로 배양할 수 있다. 또, 적당한 시간간격으로 세포 배양액에 신선한 배지를 첨가해서 희석하거나, 배지를 신선한 것으로 교환하거나, 또는 세포 배양기재를 교환할 수 있다. 사용되는 배지, 동시에 사용되는 기타 성분 등은 후술하는 바와 같이, 제조하는 림프구의 종류에 따라 적당하게 설정할 수 있다. 배양기간은 예를 들면 1?40일, 적합하게는 2?35일, 더 적합하게는 3?30일인 것이 바람직하고, 더 높은 확대 배양율을 실현시키는 관점에서 3?25일의 배양기간이 바람직하다.
상기 배양에 있어서 사용되는 피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 비롯한 성분은 배지 중에 용해해서 공존시킬 수도 있고, 적절한 고상, 예를 들면 세포 배양기재, 비드, 멤브레인, 슬라이드 글래스 등의 세포 배양용 담체에 고정화할 수도 있다. 예를 들면, 항CD3 항체의 고정화는 국제공개 제97/18318호 팸플릿에 기재된 방법에 따르고, 피브로넥틴 유래의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 고정화는 국제공개 제00/09168호 팸플릿에 기재의 방법을 따라서 실시할 수 있다.
증식능을 빼앗는 처리에는 항암제, 예를 들면 마이토마이신C를 사용할 수 있다. 항암제 처리의 조건은, 처리된 세포의 증식능이 약해지거나, 혹은 저하되는 처리조건이라면 특별하게 한정은 없다. 마이토마이신C의 농도는 예를 들면 1?100㎍/㎖, 바람직하게는 2?50㎍/㎖, 적합하게는 5?30㎍/㎖이다. 처리온도는 예를 들면 30?40℃, 바람직하게는 35?38℃이다. 처리시간은 예를 들면 0.1?2시간, 바람직하게는 0.5?1시간이다.
또, γ선 또는 X선과 같은 방사선의 조사에 의해 증식능을 빼앗는 처리를 실시하는 경우, 방사선의 조사량은 조사된 세포의 증식능이 약해지는 량이면 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면, 100?20000R(0.88?176Gy), 바람직하게는 1000?8000Gy)(8.8?70Gy)이다.
또, 온열처리에 의해 증식능을 빼앗는 처리를 실시하는 경우, 처리온도 및 처리시간은 세포의 증식능이 약해지는 양이라면 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 40?55℃, 바람직하게는 42?50℃이고, 예를 들면 0.1?8시간, 바람직하게는 0.2?4시간이다.
NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단의 배양에 있어서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 세포농도로서는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 1?1×108cells/㎖, 적합하게는 1×101?5×107cells/㎖, 더 적합하게는 1×102?2×107cells/㎖가 예시된다.
본 발명의 방법은 NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단을 생물응답 변형제 및 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 존재 하에서 확대 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에는 NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단이 사용된다. 여기에서, NK세포로 분화될 수 있는 세포란 당해 세포로 분화되는 능력을 가지고 있는 세포일 수도 있고, 특별하게 한정은 없다. 당해 세포집단으로서 말초혈, 골수액, 제대혈, 림프액 등의 체액, 혹은 이것들의 체액, 각 장기 또는 기관으로부터 분리한 세포집단(예를 들면, PBMC, 제대혈 단핵구, 골수세포, 조혈간 세포 등)을 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 세포 또는 세포집단으로서 생체로부터 채취된 것을 그대로 혹은 동결 보존한 것 모두 사용할 수 있다. 또, 상기 세포집단으로부터 다양한 유도 조작 또는 분리 조작을 거쳐서 수득된 세포집단, 예를 들면 PBMC등으로부터 특정한 세포표면 마커에 의거하여 분리된 세포의 서브셋, 예를 들면 단리된(isolated) NK세포집단 또는 CD3 양성세포를 제거한 세포집단을 본 발명에 사용할 수도 있다. 또 순화한 (purified) NK세포집단 또는 NK세포주를 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 예를 들면, NK세포의 함유율이 낮은 PBMC으로부터 직접 배양을 시작하여도, NK세포 함유율이 높고, 또한 세포 상해활성이 강한 세포집단을 효율적으로 얻을 수 있는 것에 특징이 있다.
본 발명의 방법에 있어서의 NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단의 배양기간은 예를 들면, 3?40일, 적합하게는 5?35일, 더 적합하게는 10?30일 바람직하고, 더 높은 확대 배양율을 실현시키는 관점에서 14?25일의 배양기간이 바람직하다.
또, NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단의 배양에 있어서, NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포농도에는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 1?1×108cells/㎖, 적합하게는 1×101?5×107cells/㎖, 더 적합하게는 1×102?2×107cells/㎖가 예시된다. 당해 세포집단과 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포집단의 세포수의 비는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 1:0.1?20, 적합하게는 1:1?10이다.
증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포집단은 NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단의 배양 개시시에 배지에 첨가된다. 또, 배양 개시시 이외에, 배양 도중에, 예를 들면, 1회, 2회 또는 3회 첨가하고, 배양 개시시에 부가해서 수회 첨가하는 것에 의해, NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단을 자극하고, 확대 배양율을 더욱 향상시킬 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 예를 들면 NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단의 배양개시 후, 5?9일째의 사이의 호적한 시기 및/또는 11?15일째의 사이의 호적한 시기에 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포를 재첨가할 수 있다. 또 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포집단은 사용할때 까지 적당한 방법에 의해 동결 보관할 수도 있다.
본 발명의 방법의 다른 하나의 특징인 생물응답 변형제는 소망의 NK세포 증식유도 활성을 가지는 것이라면 특별하게 한정은 없다. 호적한 형태에 있어서, 본 발명에는 미생물유래 제제인 생물응답 변형제가 사용되고, 특히 적합하게는 OK-432, BCG, Streptcoccus pyogenes , Corynebacterium parvum 또는 이것들의 세포벽 골격이 사용된다.
배지로의 생물응답 변형제의 첨가량에는 특별하게 한정은 없고, 확대 배양에 적용되는 세포 및 병용되는 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포집단의 사용량에 따라서, 적절한 량을 선택할 수 있다. 특히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, OK-432를 사용하는 경우, 0.001?1KE/㎖, 바람직하게는 0.005?0.5KE/㎖, 더욱 바람직하게는 0.01?0.2KE/㎖의 최종농도로 OK-432이 배지에 첨가된다. 통상, 생물응답 변형제는 배양 개시시에 배지에 첨가될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 사용되는 배지에 대해서, 생물응답 변형제 및 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 사용을 제외하고 특별하게 한정은 없고, 림프구의 배양에 적합한 공지의 배지를 사용할 수 있다. 예를 들면, NK세포 배양용으로서 시판되고 있는 배지(CellGenix사의 CellGro SCGM, TAKARA BIO INC.의 GT-T502 등)을 사용할 수 있다. 또 본 발명의 유효성분 이외에 적당한 단백질, 사이토카인류 또는기타 성분을 포함할 수도 있다. 적합하게는, IL-2를 함유하는 배지가 본 발명에 사용된다. IL-2의 배지 중의 농도는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 0.01?1×105U/㎖, 적합하게는 0.1?1×104U/㎖이다.
배지 중에 혈청 또는 혈장을 첨가할 수 있다. 이것들의 배지 중으로의 첨가량은 특별하게 한정은 없지만, 0초과?20용량%, 바람직하게는 0초과?5용량%이다. 제조된 NK세포를 함유하는 세포집단 또는 당해 세포집단으로부터 분리된 세포아 집단이 생체에 이입되는 경우, NK세포 및/또는 NK세포로 분화될 수 있는 세포와 유래를 동일하게 하는 (즉, 동일개체 유래의) 혈청 또는 혈장을 사용하는 것이 바람직하다. 또 혈액유래 단백질, 예를 들면 혈청알부민을 배지에 첨가할 수 있다. 이 경우, 단리된 혈액유래 단백질, 즉 혈액유래의 다른 성분을 실질적으로 함유하지 않는 혈액유래 단백질이 호적하게 사용된다. 또 입수 가능한 재조합 혈액유래 단백질을 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서의 배양의 과정에서, 적당한 시간간격 혹은 세포수의 증가에 따라, 세포 배양액의 희석, 배지의 교환 혹은 세포 배양기재의 교환을 실시할 수도 있다.
이밖에, 본 발명의 제조방법은 NK세포 또는 LAK세포를 배양하기 위한 일반적인 조건 등에 준해서 실시할 수도 있다. 예를 들면, Klin Padiatr, 2005년, 제217권, 제345?350쪽; Journal of Experimental Medicine, 1982년, 제155권, 제1823?1841쪽; Current Protocols in Immunology, 보유 17, UNIT7.7을 따를 수 있다.
본 발명은 내추럴킬러 세포 및/또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 단리 및/또는 순화한 세포집단을, 생물응답 변형제의 존재 하에서 확대 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 내추럴킬러 세포를 함유하는 세포집단의 제조방법을 추가로 제공한다. 예를 들면, 순화된 CD3음성 CD56양성 세포를 OK-432의 존재 하에서 배양하는 내추럴킬러 세포를 함유하는 세포집단의 제조방법이 제공된다. 이 제조방법에 있어서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 존재 하에서 배양하는 것에 의해, 내추럴킬러 세포를 함유하는 세포집단의 확대 배양율이 향상한다.
2. 본 발명의 제조방법에 의해 수득되는 NK세포를 함유하는 세포집단, 당해 세포집단을 함유하는 의약, 당해 세포집단의 사용, 및 당해 세포집단을 사용한 치료방법 또는 예방방법
또, 본 발명은 상기 본 발명의 NK세포의 제조방법으로 수득된 NK세포를 함유하는 세포집단 및 상기 세포집단으로부터 분리된 세포아 집단을 제공한다. 또 본 발명은 당해 세포집단 및/또는 세포아 집단을 유효성분으로 함유하는 의약(치료제), 당해 세포집단 및/또는 세포아 집단의 의약의 제조를 위한 사용, 및 유효량의 당해 세포집단 및/또는 세포아 집단을 대상으로 투여하는 공정을 포함하는 질병의 치료방법 또는 예방방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 의해 수득되는 NK세포를 함유하는 세포집단 및/또는 세포아 집단(이하, 단순하게, '본 발명의 세포집단' 으로 기재한다.)은 종래의 방법에 의해 수득되는 세포집단과 비교해서, NK세포의 함유율, 항체 의존성 세포 상해활성(ADCC)을 포함하는 세포 상해활성, 및 멀티펑션(multifunction)능이 매우 높은 세포집단이다. 특히, 본 발명의 세포집단에서는 NK세포의 표면 마커인 CD3음성, 또한 CD56양성의 세포가 적어도 50%이상을 차지한다. 또 본 발명의 세포집단은 세포 상해활성이 높은 CD16 및 CD56이 양성인 세포를 많이 포함하고, 함축성, 세포집단의 적어도 50%, 바람직하게는 60%이상, 더 바람직하게는 70%이상이 CD16양성 또한 CD56양성의 세포이다. 또, 본 발명의 세포집단은 성숙한 NK세포인 CD94 및 CD56이 양성인 세포를 많이 포함하고, 세포집단의 적어도 50%, 바람직하게는 60%이상, 더 바람직하게는 70%이상이 CD94양성 또한 CD56양성의 세포이다. 또 본 발명의 세포집단은 NK세포의 세포 상해활성에 관여하고 있다고 하는 NKp44 및 NKG2D, NK세포 공통의 표면항원 마커인 NKp46, 활성화 NK세포에서 발현하는 CD25, 림프구의 호밍에 관여하는 CD62L, activation inducer molecule(AIM)로서도 알려지고, 백혈구의 활성화 초기에 표출되어, NK세포에서는 표적세포 융해작용에 관여하는 CD69, 혹은 케모카인인 CXCL9 및 CXCL10의 리간드이고, 이것들의 케모카인 발현 암세포로의 높은 유주능이나 집적능을 나타낸다고 생각되는 CXCR3을 발현하는 세포를 많이 포함하는 고기능성 NK세포집단이다.
NK세포의 멀디펑션능은 일반적으로, 인터페론(IFN)-γ 혹은 종양괴사인자(TNF)-α 등의 사이토카인의 생산, 또는 CD107a 등의 세포 표면항원에 의해 세포집단의 면역응답을 평가하는 것이 가능하다. 본 발명에서 제조되는 NK세포를 함유하는 세포집단은 복수의 사이토카인 생산 또는 세포표면항원을 나타내는 세포를 고함유하고, 멀티펑션을 가지는 멀티펑션성 세포집단으로서 세포면역요법에 있어서 매우 유용하다.
또, 본 발명의 세포집단을 적당한 사이토카인 예를 들면 인터페론α(IFN-α)과 공존시키는 것에 의해, 그 세포 상해성을 증강시킬 수 있고, 당해 처리된 세포집단은 다양한 암세포에 대해서 세포 상해성을 발휘하는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 세포집단에 유전자를 도입할 수도 있다. 예를 들면 표적물질에 대한 친화성 단백질[예를 들면 T세포 수용체(TCR), 항체, 리셉터 등], 세포표면항원, 효소, 시그널전달분자(예를 들면 사이토카인), 이것들의 기능적 도메인(예를 들면 항체 또는 TCR의 가변영역, 싱글-스트랜드항체, 리셉터의 시그널전달 도메인), 또는 이것들의 기능적 도메인을 가지는 키메라 단백질을 코딩하는 유전자를 도입할 수 있다. 또, 유전자의 도입수단에는 특별하게 한정은 없고, 공지의 유전자 도입방법에 의해 적절한 것을 선택해서 사용할 수 있다. 상기의 유전자도입방법으로서는 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 또는 그 벡터를 사용하지 않는 방법의 어느 것이나 본 발명에 사용할 수 있다. 그것들의 방법의 상세에 대해서는, 이미 많은 문헌이 공표되어 있다.
본 발명의 세포집단은 동결 보존할 수 있다. 본 발명의 세포집단의 동결ㆍ해동을 실시하는 경우, 해동 후의 세포집단을 재배양하는 것에 의해, 동결하기 전의 세포 상해활성을 지닌 세포로 복귀시킬 수 있다. 당해 세포집단의 배양은 예를 들면 1일(하룻밤) 실시할 수 있다. 재배양시에 적당한 사이토카인, 예를 들면, IL-2을 공존시키는 것에 의해 그 세포 상해능을 더욱 증강시킬 수 있다.
본 발명의 NK세포를 함유하는 세포집단으로부터 분리되는 세포아 집단으로서는 예를 들면 CD16, CD56, NKp44, NKG2D, NKp46, CD25, CD62L, CD69, CXCR3 및 CD94으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1개의 NK세포의 표면 마커를 지표로 하여 NK세포로부터 분리한 세포아 집단을 들 수 있다.
본 발명의 세포집단을 함유하는 의약(치료제)은 양자면역요법에 대한 사용에 적합한 양자면역요법에 있어서, 환자의 치료에 적합한 본 발명의 세포집단은 예를 들면 경정맥적으로 환자에 투여된다. 당해 의약은 후술하는 질병 및 도너 림프구 수주에서의 사용에 있어서 매우 유용하다. 당해 의약은 제약분야에서 공지의 방법에 따른다. 예를 들면 본 발명의 세포집단을 유효성분으로 하고, 공지의 비경구투여에 적합한 유기 또는 무기의 담체, 부형제, 안정제 등과 혼합하는 것에 의해 조제할 수 있다. 또, 의약에 있어서의 본 발명의 세포집단의 함유량, 의약의 투여량 및 당해 의약에 관한 여러 조건은 공지의 양자면역요법에 따라서 적당하게 결정할 수 있고, 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 본 발명의 세포집단을 성인 1일당, 적합하게는 1×105?1×1012cells/일, 더 바람직하게는 5×105?5×1011cells/일, 더욱 바람직하게는 1×106?1×1011cells/일 투여하는 것이 예시된다. 통상, NK세포를 포함하는 세포집단은 주사, 점적 등에 의해 정맥, 동맥, 피하, 복강, 종양 내 등으로 투여된다.
본 발명의 의약의 투여에 있어서, 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 치료하려고 하는 질병에 대해서 백신으로 기능할 수 있는 성분과 함께 투여할 수도 있다. 예를 들면 암의 치료에 있어서, 종양항원, 항원을 제시할 수 있는 능력을 가지는 세포, 항원이 제시된 세포, 인위적 조작에 의해 증식능을 잃은 종양조직 유래의 세포, 종양조직으로부터의 추출물 등을 투여할 수도 있다. 또 당해 의약의 투여에 있어서, 림프구 자극인자, 예를 들면 항CD3 항체, 항CD28 항체, 사이토카인(IL-2, IL-15, IL-7, IL-12, IFN-γ, IFN-α, IFN-β 등), 케모카인 등을 적당하게 투여할 수도 있다. 본 발명의 의약은 이것들의 림프구 자극인자에 의해 처리한 본 발명의 세포집단을 유효성분으로 함유하는 것 일 수도 있다. 또, 본원명세서에 있어서 림프구 자극인자는 림프구 증식인자를 포함한다.
본 발명의 세포집단이 투여되는 질병으로서, 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 암, 백혈병 등의 악성 종양질병, 간염, 인플루엔자, HIV 등의 바이러스, 세균 또는 진균이 원인이 되는 감염성 질병(예를 들면 결핵, MRSA, VRE 또는 심재성 진균증)이 예시된다. 또 본 발명의 방법에 의해 제조되는 NK세포를 함유하는 세포집단은 골수이식 또는 방사선 조사후의 감염증 예방, 재발 백혈병의 관해를 목적으로 한 도너 림프구 수주, 항암제 치료, 방사선 치료, 항체요법, 온열요법, 다른 면역요법 등과 같은 종래의 치료법과 조합시켜서 이용할 수 있다.
본 발명의 세포집단의 의약의 제조에 있어서의 사용, 예를 들면 암성 질병이나 감염성 질병치료용의 의약의 제조에 있어서의 사용도 본 발명에 포함된다.
또 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 세포집단도 본 발명에 포함된다.
또 본 발명의 다른 형태로서, 상기 의약을 사용한 질병의 치료방법이 제공된다. 당해 질병의 치료방법은 본 발명의 세포집단을 사용하는 것을 특징으로 하고, 당해 의약의 투여의 제반 조건에 대해서는 공지의 양자면역요법 또는 전술한 의약의 투여의 개시에 따라서 실시할 수 있다.
이하에, 실시예를 나타내서 본 발명을 더 구체적이며, 상세하게 설명하지만, 실시예는 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 OK-432 및 Autologous-Irradiated cell(AIC)을 사용한 NK세포 배양
(1) PBMC의 분리 및 보존
인폼 컨센트가 수득된 인간 정상인 도너에 있어서, 성분채혈을 실시하였다(여기에서 말하는 성분채혈이란 단핵구 채취를 목적으로 한 채혈이다). 수득된 성분 채혈액을 둘베코 PBS(Invitrogen Corporation제 또는 NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.제; 이하, 'DPBS' 라고 기재한다.) 또는 1% 인간 혈청 알부민(제제명: Buminate: Baxter제, 이하, 'HAS' 라고 기재한다.)을 포함하는 생리식염수(이하, 1% HSA/생리식염수라고 기재한다. )로 약 2배 희석한 후, Ficoll-Paque PREMIUM 또는 Ficoll-Paque PLUS(모두, GEHealthcare Bioscience제) 15㎖ 상으로 희석한 성분 채혈액을 30㎖씩 각각 중층하여, 700×g, 실온에서 20분간 원심하였다. 원심후, 분리한 층 중, PBMC층을 피펫으로 회수하고, RPMI1640 배지 또는 1% HSA/생리식염수를 사용해서 45㎖로 필업한 후, 650×g, 4℃에서 10분간 원심하고, 상청액을 제거하였다. 마찬가지로, 600×g, 500×g으로 단계적으로 원심G을 떨어뜨리면서 차례로 원심 조작을 실시하고, 계 3회 세정을 반복하고, PBMC를 채취하였다.
채취한 PBMC는 8% HSA를 포함하는 CP-1(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.제)과 RPMI1640배지(Invitrogen Corporation제, Sigma Corporation제 또는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제)의 등량 혼합액으로 이루어지는 보존액(이하, 'CP1/HAS' 라고 기재한다.)에 현탁하고, 액체질소 중에서 보존하였다. NK세포 확대 배양시에는 이들 보존 PBMC를 37℃ 워터배스 중에서 급속해동하고, 10㎍/㎖ DNAase(Calbiochem제)를 포함하는 RPMI1640 배지 또는 0.5% 인간 AB형 혈청(Lonza제)을 포함하는 GT-T551(TAKARA BIO INC.제; 이하, 0.5 HGT-T551이라고 기재한다)로 세정후, 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 산출해서 각 실험에 적용하였다.
(2) PBMC AIC의 조제
실시예 1-(1)에서 조제한 필요량의 PBMC를 5% 인간 AB형 혈청, 0.1mM NEAA mixture, 1mM Sodium pyruvate, 2mM L-글루타민(모두 Lonza사제), 1% 페니실린-스트렙토마이신(GibcoBRL제) 또는 100㎍/㎖ 황산 스트렙토마이신(Meiji Co., LTD.제)을 포함하는 RPMI1640 배지(이하, 5HRPMI라고 기재한다.)에 현탁후, X선 조사장치를 사용하여 3400R(29.8Gy)의 X선을 조사하였다(이 X선 조사후의 세포를 이하, PBMC AIC라고 기재한다.). 조제한 PBMC AIC를 2×106cells/㎖가 되도록 5HRPMI에 현탁하였다.
(3) NK세포의 확대 배양
5HRPMI에 2×106cells/㎖가 되도록 실시예 1-(1)에서 조제한 PBMC(PBMC AIC와 동일 도너 유래)를 현탁후, Responder세포로 하였다. 24-well 세포배양 플레이트(Becton, Dickinson and Compnay제 또는 Corining Incorporation제)에, 상기 Responder세포 및 PBMC AIC를 0.5㎖/웰씩 첨가하고, 합계 1㎖/웰로 하였다(AIC 자극군). 이때, PBMC AIC를 첨가하지 않는 군(AIC 비자극군)을 제작하였다.
각 웰에 OK-432(제제명 Picibanil: Chugai Pharmaceutical Co., LTD.제)를 최종농도 0.05KE/㎖가 되도록 첨가하였다. 모든 웰에 최종농도 500U/㎖가 되도록 IL-2(제제명 Proleukin: Chiron제 또는 Novartis제)을 첨가하고, 이것들의 플레이트를 5% CO2 존재 하, 37℃에서 배양을 개시하였다(배양 0일째). 2일째에는 각 웰에 5HRPMI를 1㎖씩 첨가하고, 최종농도 500U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다.
4일째에는 각 웰에 최종농도 500U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째, 9일째에는 각 웰의 세포액을 5HRPMI를 사용해서 각각 3배 희석하고, 각 웰에 최종농도 500U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가한 후, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2㎖를 옮겼다. 배양개시 11일째에는 4배 희석하고, 새로운 12-well 세포배양 플레이트(Becton, Dickinson and Compnay제 또는 Corining Incorporation제)에 희석한 세포액 4㎖를 옮긴 후, 최종농도 500U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 배양개시 14일째까지 배양을 계속하고, 배양 개시후 14일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 1에 나타낸다. 또, 이하의 표 중, -는 무첨가, +는 첨가를 각각 의미한다. 또 실시예에 있어서, AIC 첨가는 AIC자극과 동의이고, AIC비첨가는 AIC비자극과 동의이다.
Figure pct00001
표 1에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 AIC를 조합하는 것에 의해서, PBMC AIC 첨가군(AIC 자극군)은 PBMC AIC 무첨가군(AIC 비자극군)과 비교해서 높은 확대 배양율을 나타냈다.
즉, 확대 배양시에 OK-432 및 AIC를 조합하는 것에 의해서, 높은 확대 배양율로 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
(4) CD3음성 CD56양성 세포(NK세포)함유 비율의 해석
실시예 1-(3)에서 조제한 배양 개시후 14일째의 세포에 대해서 CD3음성 CD56양성세포 함유비율(이하, NK세포 함유비율이라고 기재한다.)을 플로우 사이토미터(Cytomics FC500: Beckman Coulter Inc.제)로 해석하였다. 즉, 배양 개시후 14일째의 세포를 DPBS로 세정한 후, 세포를 1% 소혈청 알부민(Sigma Corporation제, 이하, BSA라고 기재)을 포함하는 DPBS(이하, 1% BSA/DPBS라고 기재) 중에 현탁하고, FITC 표지 또는 PC5표지 마우스 항 인간 CD3항체 및 RD1 표지 마우스 항 인간 CD56항체(모두 Beckman Coulter Inc.제)을 첨가하였다. 마찬가지로, 각 세포집단의 일부에, 네거티브 컨트롤로서 FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1/PC5 표지 마우스 IgG1(Beckman Coulter Inc.제)을 첨가하였다. 각각의 항체를 첨가 후, 4℃에서 30분 인큐베이트하였다. 인큐베이트후, 세포를 0.1% BSA를 포함하는 DPBS(이하, 0.1% BSA/DPBS라고 기재)로 세정하고, 재차 DPBS에 현탁하였다. 이것들의 세포를 Flow cytometry에 적용하고, CD3음성 또한 CD56양성 세포군을 NK세포로 하여, NK세포 함유비율을 산출하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
표 2에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 AIC를 조합시킨 배양에 의해, PBMC AIC 무첨가군과 비교해서 높은 NK세포 함유비율의 세포집단이 수득되었다.
(5) 세포 상해활성의 측정
실시예 1-(3)에서 조제한 배양 개시후 14일째의 세포에 대해서, 세포 상해활성을 측정하였다. 세포 상해활성은 Calcein-AM을 사용한 세포 상해활성 측정법[(Lichtenfels R. et al.), J. Immunol. Methods , 제172권, 제2호, 제227?239쪽(1994)]으로 평가하였다. 즉 만성 골수성 백혈병 세포주 K562세포(Health Science Research Resources Bank JCRB0019), Burkitt 임파종 세포주 Daudi세포(Health Science Research Resources Bank JCRB9071), Burkitt 임파종 세포주 Raji(Health Science Research Resources Bank IFO50046)을 각각 1?2×106cells/㎖가 되도록 5% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에 현탁후, 최종농도 25㎛가 되도록 Calcein-AM(DOJINDO LABORATORIES제)을 첨가하고, 37℃에서 1시간 배양하였다. 세포를 Calcein-AM을 포함하지 않는 배지에서 세정 후, Calcein 표지 표적세포로 하였다.
실시예 1-(3)에서 조제한 배양 개시후 14일째의 세포를 이펙터 세포로 하여 1×106cells/㎖, 3×105cells/㎖ 또는 1×105cells/㎖가 되도록 5HRPMI로 희석 후, 96-well 세포배양 플레이트(Corining Incorporation제)의 각 웰에 100㎕/웰씩 분주해 두고, 이것들에 1×105cells/㎖가 되도록 조제한 Calcein 표지 표적세포를 100㎕/웰씩 첨가하였다. 이때, Calcein 표지 표적세포(T)에 대한 이펙터 세포(E)의 비, 즉 E/T비는 10, 3, 1의 3가지로 하였다. 상기 세포현탁액이 들어 간 플레이트를 400×g으로 1분간 원심후, 37℃, 5% CO2 존재 하에서 4시간 인큐베이트하였다. 그 후에 각 웰로부터 배양 상청액 100㎕를 채취하고, 형광 플레이트리더(Mithras LB 940: Berthold제)(여기 485nm / 측정 535nm)에 의해 배양 상청액 중에 방출된 Calcein량을 측정하였다. 「세포 상해활성(%)」은 이하의 수학 식(1)에 따라서 산출하였다.
세포 상해활성(%) = {(각 웰의 측정값 - 최소 방출량) / (최대 방출량 - 최소 방출량)} × 100 (1)
상기 식에 있어서, 최소방출량은 Calcein표지 표적세포만 함유하는 웰의 Calcein방출량이고, Calcein표지 표적세포로부터의 Calcein 자연방출량을 나타낸다. 또 최대방출량은 Calcein 표지 표적세포에 0.1%계 면활성제 Tritox X-00(나카라이테스크사제)을 첨가해서 세포를 완전 파괴하였을 때의 Calcein 방출량을 나타내고 있다. 세포 상해활성 측정결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
표 3에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 AIC를 조합시킨 배양으로 수득된 세포집단은 AIC를 조합시키지 않고 수득된 세포집단과 동등한 세포 상해활성을 발휘하였다.
즉, 배양시에 OK-432 및 AIC를 조합하는 것에 의해, 높은 세포 상해활성을 발휘하는 NK세포를 포함하는 세포집단이 효율적으로 확대되어, 대량으로 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 2 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포배양(AIC에 대한 X선 조사량의 비교)
(1) PBMC AIC의 조제
실시예 1-(2)와 동일한 방법으로 PBMC AIC를 조제하였다. 단, X선 조사량을 3400R(29.8Gy) 및 8000R(70.2Gy)로 하여, 2종의 PBMC AIC를 각각 조제하였다.
(2) NK세포의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, OK-432를 첨가하지 않는 군, PBMC AIC를 첨가하지 않는 군 및 PBMC AIC의 대신에, 등량의 PBMC(X선 미조사)을 첨가하는 군을 제작하였다. 배양개시 7일째에는 각 웰의 세포액을 5HRPMI를 사용해서 2배 희석하고, 각 웰에 최종농도 500U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가한 후, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 세포액 2㎖을 옮겼다. 9일째 및 13일째에 동일 계대조작을 실시하였다. 또, 9일째 및 11일째의 세포액의 희석배율은 각각 4배 및 2배로 하였다. 각 계대일에 최종농도 500U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 14일째까지 배양을 계속하고, 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
표 4에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 PBMC AIC를 조합시켰을 경우의 확대 배양율은 OK-432 무첨가군, PBMC AIC 무첨가군 및 PBMC(X선 조사 없음) 첨가군과 비교해서 높고, 또 수득된 세포집단에 있어서의 NK세포 함유비율도 높은 것이었다. 또, PBMC AIC 조제시에 조사하는 X선 조사량에 관계 없이, 그 효과가 발휘되었다. 즉, 배양시에 OK-432 및 AIC를 조합하는 것에 의해, 고율로 NK세포를 포함하는 세포집단을 높은 확대 배양율로 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 3 OK-432 및 각종 AIC를 사용한 NK세포 배양(PBMC AIC와 RN-T AIC의 비교)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
12-well 세포배양 플레이트에 최종농도 5㎍/㎖의 항 인간 CD3항체(제제명: Orthoclone OKT3주, Janssen Pharmaceuticla K.K.제) 및 최종농도 25㎍/㎖의 레트로넥틴(등록상표명, TAKARA BIO INC.제)을 포함하는 ACD-A액(TERUMO CORPORATION제)을 0.45㎖/웰씩 첨가해서 필요 웰수 제작하고, 5% CO2 존재 하, 37℃에서 5시간 인큐베이트하였다. 또, 항CD3항체/레트로넥틴 고정화 플레이트는 사용 직전에 DPBS로 2회, RPMI1640 배지로 1회 세정하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
1 인간 AB형 혈청(Lonza제)을 포함하는 GT-T551(TAKARA BIO INC.제; 이하, 1HGT-T551라고 기재)에, 1×106cells/㎖가 되도록 실시예 1-(1)에서 조제한 PBMC를 현탁하였다. 실시예 3-(1)에서 조제한 항 인간 CD3항체/레트로넥틴 고정화 플레이트에 1HGT-T551을 4.77㎖/웰 첨가해 두고, 상기의 세포현탁액을 0.53㎖/웰씩 첨가해서 필요 웰수 제작하였다. 계속해서 최종농도 200U/㎖가 되도록 각 웰에 IL-2를 첨가하고, 이것들의 플레이트를 5% CO2 존재 하, 37℃에서 배양을 개시하였다(배양 0일째). 배양개시 4일째에, 배양액을 1HGT-T551을 사용해서 적당하게 희석후, T75 세포배양 플라스크(Corining Incorporation제)에 옮겼다. 이 플라스크에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하고, 7일째까지 배양을 계속하였다(이하, 항CD3항체/레트로넥틴 자극에 의해 확대 배양해서 수득된 T세포를 RN-T로 기재한다).
(3) PBMC 및 RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 1-(2)와 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다. 단, AIC으로서 실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 조제한 PBMC 및 실시예 3-(2)에서 조제한 배양개시 7일째의 RN-T의 각각에, 3400R(29.8Gy)의 X선을 조사하였다(이하, 이 X선 조사후의 RN-T를 RN-T AIC라고 기재한다). 조제한 PBMC AIC 및 RN-T AIC를 2×106cells/㎖가 되도록 1% 인간 AB형 혈청을 포함하는 CellGro SCGM(CellGenix제; 이하, 1HCellGro라고 기재한다) 또는 5% 인간 AB형 혈청을 포함하는 CellGro(이하, 5HCellGro라고 기재한다)에 현탁하고, 이하의 실험에서 사용하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 배지로서 1HCellGro 또는 5HCellGro를 사용하고, AIC로서 실시예 3-(3)에서 조제한 PBMC AIC 및 RN-T AIC를 사용하였다.
배양개시 2일째에, 각 웰에 1HCellGro 또는 5HCellGro를 1㎖씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 5일째에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에, 각 웰의 세포액을 1HCellGro 또는 5HCellGro를 사용해서 3배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2㎖를 옮겼다. 9일째 및 13일째에 동일한 계대조작을 실시하였다. 또, 9일째 및 13일째째의 세포액의 희석 배율은 각각 5배 및 4배로 하였다. 이렇게 해서, 배양개시 16일째까지 배양을 계속하였다. 각 계대일에는 각각 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 배양 개시후 16일째에 트리판블루 염색법에 의해 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
표 5에 나타내는 바와 같이, RN-T AIC의 사용에 의해, PBMC AIC 첨가군과 비교해서 동등한 확대 배양율이 수득되었다. 수득된 세포집단에 있어서의 NK세포 함유비율에도 차이는 인정되지 않았다. 즉, NK세포배양 시에 OK-432과 PBMC AIC 또는 RN-T AIC를 조합하는 것에 의해, 배양용 배지 중의 혈청농도에 관계 없이, 고율로 NK세포를 포함하는 세포집단이 효율적으로 수득되는 것이 분명하게 되고, 저혈청 농도에서의 확대 배양법이 확립되었다.
실시예 4 OK-432 및 각종 AIC를 사용한 NK세포배양(AIC에 의한 재자극-1)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 3-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양기간은 19일간으로 하고, 배양개시 4일째 이후, 1HGT-T551을 사용해서 적당하게 희석하고, 각 계대일 별로 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가해서 배양을 계속하였다.
(3) RN-T AIC의 조제
실시예 3-(3)과 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다. 실시예 4-(2)에서 배양된 RN-T에 대해서, 배양개시 6, 13 및 19일째에 회수한 세포에 X선 조사장치를 사용해서 3400R(29.8Gy)의 X선을 조사하여 1HCellGro에 현탁해서 이하의 실험에 사용하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 배지로서 1HCellGro를 사용하고, AIC로서 실시예 4-(3)에서 조제한 각 RN-T AIC를 사용하였다.
배양개시 2일째에, 각 웰에 1HCellGro를 1㎖씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다.
5일째에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에, 각 웰의 세포액을 1HCellGro를 사용해서 3배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2㎖을 옮겼다. 9, 13, 16 및 20일째에 동일한 계대조작을 실시하였다. 또, 9, 13, 16 및 20일째의 세포액의 희석배율은 각각 5배, 3배, 5배 및 2배로 하였다. 각 계대일에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 배양개시 7일째 및 13일째에, 각각 실시예 4-(3)에서 조제한 RN-T AIC를 1×106cells/웰씩 첨가하였다. 배양 개시후 16일째, 20일째 및 22일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 6에 나타낸다.
표 6에 나타내는 바와 같이, NK세포확대 배양기간에서 RN-T AIC에 의한 자극을 조합하는 것에 의해서, 배양개시 16일째, 20일째 및 22일째에 있어서 높은 NK세포확대 배양율이 수득되었다.
또 NK세포의 배양기간 동안에 있어서의 RN-T AIC에서의 자극 회수가 많아짐에 따라서 높은 NK세포확대 배양율이 수득되었다.
즉, AIC에 의한 자극에 의해 NK세포의 증식성이 높아지게 되는 것이 분명하게 되고, 따라서 NK세포 배양 시에 RN-T AIC를 조합하는 것에 의해, 높은 확대 배양율로 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 5 OK-432 및 각종 AIC를 사용한 NK세포배양(AIC에 의한 재자극-2)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 3-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 4-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T AIC의 조제
실시예 3-(3)과 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다. 실시예 5-(2)에 있어서 배양개시 7 및 14일째에 각각 회수한 RN-T에, X선 조사장치를 사용해서 3400R(29.8Gy)의 X선을 조사하고, 5HCellGro에 현탁하고, 이하의 실험에 사용하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 배지로서 5HCellGro를 사용하고, AIC로서 실시예 5-(3)에서 조제한 각 RN-T AIC를 사용하였다.
배양개시 2일째에, 각 웰에 5HCellGro를 1㎖씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다.
5일째에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에, 각 웰의 세포액을 5HCellGro를 사용해서 3배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2㎖을 옮겼다. 동일한 계대조작을 9일째, 13일째, 16일째 및 20일째에 실시하고, 22일째까지 배양을 계속하였다. 또, 9, 13, 16 및 20일째의 세포액의 희석 배율은 각각 3배, 2 .5배, 4배 및 2배로 하였다. 각 계대일에 각 웰에 5HCellGro를 1㎖씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에 실시예 5-(4)에서 조제한 RN-T AIC를 1×106cells/웰씩 첨가하였다. 배양 개시후 20일째 및 22일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure pct00007
표 7에 나타내는 바와 같이, NK세포확대 배양 도중에 RN-T AIC에 의한 자극을 재차 수행하는 것에 의해서, 당해 조작을 수행하고 있지 않은 군과 비교해서 높은 확대 배양율이 수득되었다.
즉, NK세포배양 시에 OK-432과 RN-T AIC에 의한 복수 회 자극을 조합하는 것에 의해, 높은 확대 배양율로 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
(5) CD3음성 CD56양성 세포(NK세포) 함유비율의 해석
실시예 1-(4)와 동일한 방법으로, 실시예 5-(4)에서 조제한 배양 개시후 22일째의 세포에 대해서, NK세포 함유비율을 측정하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure pct00008
표 8에 나타내는 바와 같이, NK세포확대 배양 도중에 RN-T AIC에 의한 자극을 재차 제공하는 것에 의해, 이러한 자극을 수행하지 않은 군과 동등한 높은 NK세포 함유비율이 수득되었다. 즉, RN-T AIC에 의한 복수 회의 자극을 실시하여도, NK세포 함유비율은 저하되지 않았다.
(6) 세포 상해활성의 측정
실시예 1-(5)과 동일한 방법으로 실시예5-(4)에서 조제한 배양 개시후 22일째의 세포에 대해서, 그 세포 상해활성을 측정하였다. 단, 표적세포로서 K562 및 Daudi를 사용하였다. 세포 상해활성 측정의 결과를 표 9에 나타낸다.
Figure pct00009
표 9에 나타내는 바와 같이, NK세포확대 배양 도중에 RN-T AIC에 의한 자극을 재차 실시한 세포군에는, 배양개시 0일째에만 RN-T AIC에 의한 자극 실시한 군보다도 높은 세포 상해활성이 부여되는 것이 분명하게 되었다.
즉, NK세포 배양시에 OK-432와 복수 회의 RN-T AIC자극을 조합하는 것에 의해, 더 높은 세포 상해활성을 발휘하는 NK세포를 포함하는 세포집단이 효율적으로 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 6 OK-432 및 각종 AIC를 사용한 NK세포배양(X선 조사량의 비교)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 3-(1)과 동일한 방법에 따라서 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 4-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양기간은 14일간으로 하였다.
(3) RN-T AIC의 조제
실시예 3-(3)과 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다. 실시예 6-(2)에 있어서 배양개시 7 및 14일째에 각각 회수한 RN-T에 X선 조사장치를 사용해서 1000R(8.8Gy), 2000R(17.6Gy), 3400R(29.8Gy) 또는 5500R(48.2Gy)의 X선을 조사하고, 5HCellGro에 현탁하고, 이하의 실험에 사용하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 배지로서 5HCellGro를 사용하고, AIC로서 실시예 6-(3)에서 조제한 각 RN-T AIC를 사용하였다.
배양개시 1일째 또는 3일째에, 각 웰에 5HCellGro를 1㎖씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다.
4일째 또는 5일째에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에, 각 웰의 세포액을 5HCellGro를 사용해서 9배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2㎖을 옮기고, 각각 실시예 6-(3)에서 조제한 RN-T AIC를 1×106cells/웰씩 첨가하였다. 상기 세포액을 희석하고, 희석한 세포액 2㎖을 새로운 플레이트에 옮기는 계대조작을, 11일째, 14일째, 15일째, 17일째 또는 18일째에 실시하고, 배양개시 21일째까지 배양을 계속하였다. 또, 11, 14, 15, 17 및 18일째의 세포액의 희석 배율은 각각 5배, 3배, 4배, 4배 및 2배로 하였다. 각 계대일에 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에는 각각 실시예6-(3)에서 조제한 RN-T AIC를 1×106cells/웰씩 첨가하였다. 배양 개시후 21일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure pct00010
표 10에 나타내는 바와 같이, NK세포 확대 배양 도중에 RN-T AIC에 의한 자극을 재차 제공하는 것에 의해, 이러한 자극을 수행하지 않은 군과 비교해서, 높은 NK세포 확대 배양율이 수득되었다. RN-T AIC 조제시의 X선 조사량을 1000, 2000, 3400 또는 5500R로 바꾸어도 그 효과는 발휘되었다.
즉, NK세포 배양 시에 X선 조사량이 다른 RN-T AIC를 조합시켜도, 높은 확대 배양율로 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
(5) CD3음성 CD56양성 세포(NK세포) 함유비율의 해석
실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 실시예 6-(4)에서 조제한 배양 개시후 21일째의 세포에 대해서, NK세포 함유비율을 측정하였다. 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure pct00011
표 11에 나타내는 바와 같이, NK세포확대 배양 도중에 RN-T AIC에 의한 자극을 재차 제공한 군에서는, 아무것도 자극하지 않는 군과 동등한 높은 NK세포 함유비율이 수득되었다. 또 RN-T AIC조제시의 X선 조사량을 1000, 2000, 3400 또는 5500R로 바꾸어도 그 효과는 발휘되었다.
즉, NK세포배양 시에 OK-432과 AIC를 조합하는 것에 의해, 고함유 비율로 NK세포를 포함하는 세포집단이 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 7 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포 배양(배양용 기본배지의 비교-1)
(1) PBMC를 사용한 AIC의 조제
실시예 1-(2)와 동일한 방법으로 PBMC AIC를 조제하였다.
(2) NK세포의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 기본배지로서 5HRPMI, 5% 인간AB형 혈청 및 0.2% HSA를 포함하는 GT-T503(TAKARA BIO INC.제; 이하, 5H0.2%HSA/GT-T503라고 기재) 또는 5HCellGro를 사용하였다.
배양개시 7일째에 각 웰의 세포액을 각각의 배양용 기본배지를 사용해서 3배 희석하고, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가한 후, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2㎖을 옮겼다. 9일째에, 마찬가지로 3배 희석한 세포액 2㎖을 새로운 24세포배양 플레이트에 옮기고, 추가로 11일째에 5배 희석한 세포액 4㎖을 새로운 12-well 세포배양 플레이트에 옮겼다. 각 계대일에 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2을 각각 첨가하였다. 배양개시 15일째까지 배양을 계속하고, 배양 개시후 15일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 12에 나타낸다.
Figure pct00012
표 12에 나타내는 바와 같이, OK-432, PBMC AIC 및 CellGro를 조합시켰을 경우, 다른 배지와 비교해서 높은 확대 배양율이 수득되었다.
(3) CD3음성 CD56양성세포(NK세포) 함유비율의 해석
실시예 7-(2)에서 조제한 배양 개시후 15일째의 세포에 대해서, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 13에 나타낸다.
Figure pct00013
표 13에 나타내는 바와 같이, 어느 배지에서도 70% 이상의 비율로 NK세포를 포함하는 세포집단이 수득되었지만, 사용한 중에서는 CellGro 사용군의 NK세포 함유비율이 가장 높았다.
실시예 8 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포 배양(배양용 기본배지의 비교-2)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 3-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 6-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 8-(2)에서 조제한 RN-T를 사용하고, 실시예 5-(3)와 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다. 단, X선 조사후의 RN-T AIC은 1HCellGro, 1% 인간 AB형 혈청을 포함하는 GT-T502(TAKARA BIO INC.제; 이하, 1HGT-T502라고 기재), 1% 인간 AB형 혈청 및 0.2% HSA를 포함하는 GT-T503(TAKARA BIO INC.제; 이하, 1H0.2%HAS/GT-T503라고 기재)에 각각 현탁하고, 이하의 실험에 사용하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 기본배지로서 배양 개시시에는 1HCellGro를 사용하고, 배양개시 7일째 또는 9일째 이후의 배지를 1HGT-T502 또는 1H0.2% HSA/GT-T503으로 변경하는 군도 설정하였다. 또 배양개시 14일째에 배지를 1HGT-T502으로 변경하는 군, 추가로 배양 개시시로부터 종료시까지 1HCellGro와 1HGT-T502을 비율 1:1로 혼합한 기본배지(이하, 1HCellGro/GT-T502라고 기재)를 사용하는 군도 설정하였다.
배양개시 4일째에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에, 각 웰의 세포액을 각 배양용 배지를 사용해서 3배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 세포액 2㎖을 옮겼다. 동일한 계대를 9일째, 14일째 및 18일째에 실시하고, 22일째까지 배양을 계속하였다. 또, 9, 14 및 18일째의 세포액의 희석 배율은 각각 5배, 3배 및 2배로 하였다. 각 계대일에 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 배양개시 7일째에 각각 실시예 8-(3)에서 조제한 RN-T AIC를 1×106cells웰씩 첨가하였다.
배양 개시후 14일째, 18일째 및 21일째에 트리판블루 염색법에 의해 생 세포수를 각각 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 14에 나타낸다.
Figure pct00014
표 14에 나타내는 바와 같이, NK세포확대 배양초기에 OK-432, RN-T AIC 및 CellGro를 조합하는 것에 의해서, 배양기간 도중에 기본배지를 변경하여도 배양개시 14, 18 및 21일째에 있어서 높은 확대 배양율이 각각 수득되었다. 또 1HCellGro/GT-T502과 같은 기본배지 2종으로 이루어지는 혼합배지(희석한 CellGro)을 사용하여도, 마찬가지로 높은 확대 배양율이 수득되었다.
(5) CD3음성 CD56양성 세포(NK세포) 함유비율의 해석
실시예 8-(4)에서 조제한 배양 개시후 21일째의 세포에 대해서, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 15에 나타낸다.
표 15에 나타내는 바와 같이, NK세포확대 배양초기에 OK-432, RN-T AIC 및 CellGro를 조합하는 것에 의해서, 배양기간 도중에 기본배지를 변경하여도 배양개시 14, 18, 21일째에 있어서 높은 NK세포 함유비율이 수득되었다. 또 1HCellGro/GT-T502과 동일한 기본배지 2종으로 이루어지는 혼합배지(희석한 CellGro)을 사용하여도 마찬가지로, 높은 NK세포 함유비율이 수득되었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 배양 도중에 배지를 변경하였을 경우라도 본 발명에 의하면, 높은 비율로 NK세포를 포함하는 세포집단을 효율적으로 취득할 수 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 9 가스 투과성 배양백을 사용한 NK세포배양
(1) 항 인간CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 CultiLife(등록상표) 215의 제작
배양면적을 86㎠가 되도록 실링한 가스 투과성 배양백 CultiLife 215(TAKARA BIO INC.제)에 최종농도 5㎍/㎖의 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴을 포함하는 ACD-A액을 10.4㎖첨가하고, 5% CO2 존재 하, 37℃에서 5시간 인큐베이트하였다. 항CD3항체/레트로넥틴 고정화 CultiLife 215를 사용 직전에 1% HSA/생리식염수로 3회 세정하였다.
(2) 신선혈액에서의 PBMC 분리
인폼 컨센트가 수득된 인간 정상인 도너에서, 30㎖분의 헤파린 첨가 채혈을 실시하였다. 수득된 혈액을 700×g, 실온에서 20분간 원심하고, 원심후의 상청액인 혈장분획과 PBMC를 포함하는 세포분획으로 분리하였다. 혈장분획은 56℃에서 30분간 비활성화 처리를 실시하고, 900×g, 4℃에서 30분간 원심하고, 그 상청액을 비활성화된 자기혈장(이하, 혈장이라고 기재)으로 하여, 이후의 공정에서 사용하였다.
PBMC를 포함하는 세포분획을 1%HSA/생리식염수를 사용하여, 각각 20㎖에 필업하고, 희석하였다. 수득된 희석 세포액을 Ficoll-Paque PREMIUM 20㎖ 상에 각각 중층하고, 700×g, 실온에서 20분간 원심하였다. 원심후, 분리한 층중 PBMC층을 피펫으로 회수하고, 1% HSA/생리식염수를 사용해서 20㎖로 필업하고, 650×g, 4℃에서 10분간 원심해서 상청액을 제거하였다. 마찬가지로, 600×g 및 500×g으로 단계적으로 원심G를 떨어뜨리면서 차례로 원심조작을 실시하고, 계 3회 세정을 반복하고, 수득된 PBMC를 1HGT-T551에 현탁후, 생 세포수 및 생존률을 트리판블루 염색법으로 산출하고, 각 실험에 적용하였다.
(3) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 9-(2)에서 분리한 PBMC 1.2×107cells를 1HGT-T551120㎖에 현탁하고, 실시예 9-(1)에서 제작한 항CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 CultiLife 215에 첨가하였다. 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하고, 5% CO2 존재 하, 37℃에서 배양을 개시하였다 (배양 0일째). 배양개시 4일째에, 각 CultiLife 215 내의 세포액을 현탁하고, 40㎖을 배양면적을 430㎠가 되도록 실링한 아무것도 고정화 하지 않는 가스 투과성 배양백 CultiLife(등록상표) Eva(TAKARA BIO INC.제)에 옮겼다. 이때, 1HGT-T551을 292.6㎖ 첨가하고, CultiLife Eva 내의 총액량을 336㎖으로 하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가한 후, 5% CO2 중 37℃에서 배양하였다. 배양을 7일째까지 계속하고, 7일째에 필요량의 배양 RN-T를 분취(AIC재료로서, 이후의 공정에서 사용한다)후, 백 내에 남은 세포액과 등량의 무혈장 GT-T551 및 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 11 일째에 CultiLife Eva 내의 세포액을 무혈장 GT-T551을 사용해서 2배 희석한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 14일째에 필요량의 RN-T를 분취하고, AIC재료로 하여, 이후의 공정에서 사용하였다.
(4) RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 9-(3)에서 조제한 RN-T를 사용하고, 실시예 5-(3)와 동일한 방법으로AIC를 조제하였다. 배양개시 7일째의 RN-T를 사용해서 조제한 RN-T AIC를 2×106cells/㎖가 되도록 0.8%혈장을 포함하는 CellGro(이하, 0.8% 혈장/CellGro라고 기재)에 현탁하고, 또, 배양개시 14일째의 RN-T를 사용해서 조제한 RN-T AIC를 4×106cells/㎖가 되도록 0.8%혈장/CellGro에 현탁하였다.
(5) NK세포집단의 확대 배양
가스 투과성 배양백 CultiLife(등록상표) Spin(TAKARA BIO INC.제)에, 실시예 9-(2)에서 조제한 PBMC 및 실시예 9-(4)에서 조제한 RN-T AIC(배양개시 7일째의 RN-T를 사용해서 조제한 것)을 각각 3×107cells씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2을, 최종농도 0.05KE/㎖가 되도록 OK-432을 각각 첨가하고, 0.8% 혈장/CellGro를 사용해서 최종적으로 총액량을 30㎖로 하였다. 세포액을 첨가한 배양백을 5% CO2 존재 하, 37℃에서 배양을 개시하였다(배양 0일째). 배양개시 2일째에, 배양백에 0.8%혈장/CellGro를 30㎖ 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 4일째에, 배양백에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에, 배양백 내의 총 세포수를 트리판블루 염색법에 의해 산출 후, 세포액 30㎖를 CultiLife 215로 옮기고, 실시예 9-(4)에서 조제한 RN-T AIC(배양개시 14일째의 RN-T를 사용한 것)을 세포수 비가 1:1이 되도록 첨가하였다. 이 배양백에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가한 후, 0.8%혈장/CellGro를 사용해서 총액량이 180㎖가 되도록 하였다. 11일째에, CultiLife 215 내의 세포액 90㎖를 CultiLife Eva로 바꾸고, 0.8%혈장 및 0.2%HSA를 포함하는 GT-T503(이하, 0.8%혈장/0.2%HSA/GT-T503라고 기재)을 사용해서 5배 희석하여 총액량을 450㎖로 한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 13일째에는 CultiLife Eva 내의 세포액 225㎖을 0.26%혈장 및 0.2%HSA를 포함하는 GT-T503(이하, 0.26%혈장/0.2%HSA/GT-T503라고 기재)을 사용해서 3배 희석하여 총액량을 675㎖로 한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가한 후, CultiLife Eva로 바꾸었다. 배양은 16일째까지 계속하였다. 배양 개시후 13 및 16일째에 각각 샘플링한 세포에 대해서 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 16에 나타낸다.
Figure pct00016
표 16에 나타내는 바와 같이, 가스 투과성 배양백을 사용해서 배양을 실시하여도, 높은 확대 배양율이 수득되는 것이 분명하게 되었다.
(6) CD3양성 CD56음성세포(T세포), CD3음성 CD56양성세포(NK세포) 및 CD16양성CD56양성 세포 함유비율의 해석
실시예 9-(5)에서 조제한 배양 개시후 16일째의 세포에 대해서, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 단, PC5 표지 마우스 항 인간C D16항체(Beckman Coulter Inc.제)을 조합시키고, CD3양성 CD56음성 세포(T세포) 및 CD16양성 CD56양성 세포 함유비율에 대해서도 함께 해석하였다. 결과를 표 17에 나타낸다.
Figure pct00017
표 17에 나타내는 바와 같이, 가스 투과성 배양백을 사용해서 OK-432 및 RN-T AIC를 사용하는 배양을 실시하여도, 높은 NK세포 함유비율이 수득되었다. 또 배양후에 수득되는 NK세포에서는 높은 비율로 CD16이 발현하고 있어, 항체 의존성 세포 상해활성의 발휘에 중요한 역할을 하는 CD16분자를 발현하는 고기능성 NK세포를 고함유하는 것이 확인되었다. 또 수득된 세포집단 중에서는 약간의 T세포밖에 인정을 되지 않았다.
(7) 세포 상해활성의 측정
실시예 9-(5)에서 조제한 배양 개시후 16일째의 세포에 대해서, 실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 세포 상해활성을 측정하였다. 단, 표적세포로서 하기 표의 K562, Daudi, 식도편평상피암 세포주 T.Tn , 유선암유래 세포주 MCF7, 폐암 세포주 A549, 흑색종 세포주 A375, 위암세포주 MKN45 및 대장암세포주 HT29를 사용하고, E/T비 30, 10, 3, 1에 대해서 측정을 실시하였다. 세포 상해활성측정의 결과를 표 18에 나타낸다.
Figure pct00018
표 18에 나타내는 바와 같이, OK-432, RN-T AIC 및 가스 투과성 배양백을 사용해서 실시한 배양에 의해 수득된 세포집단은 각종 표적세포에 높은 세포 상해활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다. 또 그 활성은 NK세포 감수성 세포주로서 알려지는 Ｋ562, 및 MHC classI 비발현 세포주로서 알려지는 Daudi 뿐만 아니라, 다양한 MHC classI 발현 세포주에 대해서도 확인되고, 이것들의 세포집단이 다양한 암 세포주에 대해서 세포 상해활성을 발휘하는 고기능성 NK세포인 것이 확인되었다.
즉 본 발명에 의해 CD3음성 CD56양성 CD16양성의 표현형을 나타내고, 높은 세포 상해성을 가지는 세포집단을 높은 순도로 얻는 것이 가능하게 되었다.
실시예 10 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포 배양(Allogeneic-Irradiated cell과의 비교)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 3-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 6-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다. 단, NK세포배양을 실시할 때에 재료가 되는 PBMC를 제공하는 도너와 동일 도너 유래 PBMC으로부터 RN-T를 배양하는 것(이하, 자기 RN-T라고 기재), 및 다른 도너 유래 PBMC으로부터 RN-T를 배양하는 것(이하, 비자기 RN-T라고 기재)을 각각 배양하였다.
(3) RN-T를 사용한 X선 조사세포의 조제
실시예 10-(2)에서 조제한 자기 RN-T 및 비자기 RN-T 각각을 사용하고, 실시예 5-(3)과 동일한 방법으로 X선 조사세포를 조제하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 배지로서 5HCellGro를 사용하고, AIC로서 실시예 10-(3)에서 조제한 자기 RN-TX선 조사세포(RN-T AIC과 동의) 및 비자기 RN-TX선 조사세포를 사용하였다.
배양개시 2일째에, 각 웰에 5HCellGro를 1㎖씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 4일째에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에, 각 웰의 세포액을 5HCellGro를 사용해서 3배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 세포액 2㎖을 옮겼다. 9일째에, 각 웰의 세포액을 동일하게 3배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2㎖을 옮겼다. 추가로, 11일째에, 각 웰의 세포액을 동일하게 2.5배 희석하고, 새로운 12-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 4㎖을 옮겼다. 각 계대일에 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 이것들의 세포의 배양은 15일째까지 계속하였다. 배양 개시후 11 및 15일째에 각각 샘플링한 세포에 대해서 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 19에 나타낸다.
Figure pct00019
표 19에 나타내는 바와 같이, 사용하는 RN-T가 자기 또는 비자기인 것에 관계없이 동등한 확대 배양율이 수득되었다.
다른 도너의 2종의 림프구 세포를 혼합하면, 자기세포를 혼합하였을 때에는 일어나지 않는 비자기 혼합 임파구 반응(Allogeneic mixed lymphocyte reaction; 이하, Allo-MLR로 기재한다)에 의해, 비자기 항원을 인식해서 림프구가 증식하는 것이 일반적으로 알려지고, X선 조사 비자기 세포는 피더세포로서 범용되고 있다. 그러나, X선 조사 비자기 세포 대신에, X선 조사자기세포인 RN-T AIC를 NK세포 배양 시에 사용하였을 경우에도 동일한 NK세포 확대 배양 효과가 수득된 것은, 놀랄만한 일이다. 추가로, 배양후의 NK세포를 당해 도너에 투여하는 의료의 안전성의 점으로부터도, 자기유래의 RN-T AIC를 NK 배양시에 사용하는 것은, 그 안전성을 현저하게 향상시키게 된다.
(5) CD3음성 CD56양성 세포(NK세포) 및 CD16양성 CD56양성 세포 함유비율의 해석
실시예 10-(4)에서 조제한 배양 개시후 15일째의 세포에 대해서, 실시예 9-(6)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율 및 CD16양성 CD56양성 세포 비율을 해석하였다. 결과를 표 20에 나타낸다.
Figure pct00020
표 20에 나타내는 바와 같이, 자기 RN-T AIC를 사용하였을 경우, 비자기 RN-TX선 조사세포 첨가군과 비교해서 높은 NK세포 함유비율 및 CD16양성 NK세포 함유비율이 수득되었다.
즉, OK-432 및 자기RN-T AIC를 조합시킨 NK세포 배양방법은 높은 NK세포 함유비율 및 CD16양성 NK세포비율을 가지며, 안정성이 높은 NK세포가 수득되는 방법인 것이 분명하게 되었다.
실시예 11 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포배양(배양 NK세포의 분화 스테이지)
(1) PBMC를 사용한 X선 조사세포의 조제
실시예 1-(1)에서 조제한 PBMC를 사용하고, 실시예 3-(3)과 동일한 방법으로 PBMC AIC를 조제하였다. 조제한 PBMC AIC를 5HCellGro에 현탁하고, 이하의 실험에서 사용하였다.
(2) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 배지로서 5HCellGro를 사용하고, AIC로서 실시예 11-(1)에서 조제한 PBMC AIC를 사용하였다.
배양개시 7일째에, 각 웰의 세포액을 5HCellGro를 사용해서 8배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 세포액 2㎖을 옮겼다. 이때, 각 웰에 실시예 11-(1)에서 조제한 PBMC AIC 1×106cells를 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 동일한 계대조작을 10일째 및 15일째에 실시하였다. 또, 10일째 및 15일째의 세포액의 희석율은 각각 6배 및 3배로 하였다. 또, 18일째에, 각 웰의 세포액을 동일하게 4배 희석하고, 새로운 12-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액을 4㎖ 옮겼다. 각 계대일에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 이것들의 세포를 배양개시 22일째까지 배양을 계속하고, 그 일부에 대해서 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과(확대 배양율)을 표 21에 나타낸다.
Figure pct00021
(3) CD3음성 CD56양성 세포(NK세포), CD16양성 CD56양성세포, CD34음성 CD117음성 세포, 및 CD94양성 CD56양성 함유비율의 해석
실시예 11-(2)에서 조제한 배양 개시후 22일째의 세포에 대해서, 실시예 9-(6)과 동일한 방법으로 NK세포 함유비율 및 CD16양성 CD56양성 세포 비율을 해석하였다. 단, 이때, FITC 표지 마우스 항 인간 CD34항체(Becton, Dickinson and Compnay제), PE 표지 마우스 항 인간 CD117항체(R&D systems제) 및 FITC 표지 마우스 항 인간 CD94항체(eBioscience제)를 사용하여, CD34양성 CD117양성 세포 및 CD94양성 CD56양성 함유 비율에 대해서도 마찬가지로 해석하였다. 결과를 표 22에 나타낸다.
Figure pct00022
표 22에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 PBMC AIC를 조합시킨 방법으로 수득되는 세포집단 중에 있어서, CD56양성, CD16양성, CD34음성, CD117음성 또한 CD94양성세포가 대부분을 차지하고 있었다.
NK세포는 그 표면항원의 발현에 의해 4개의 분화단계로 나눌 수 있음이 알려져 있지만, 그 중에서도 특히 CD56양성, CD16양성, CD34음성, CD117음성 또한 CD94양성세포는 최종분화 단계의 세포에 보여지는 표현형으로, 높은 세포 상해활성을 발휘하는 성숙화 NK세포인 것이 알려져 있다.
즉, 본 발명의 방법에 의해, 성숙화한 NK세포가 효율적으로 수득되는 것이 분명하게 되고, 본 발명에 의해 성숙 NK세포의 효율 좋은 제조방법이 제공되었다.
실시예 12 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포 배양(OK-432, AIC 유효성의 비교)
(1) 항 인간CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 3-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 6-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양개시 7일째 이후는 무혈장 GT-T551을 사용하였다.
(3)RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 12-(2)에서 조제한 RN-T를 사용하여, 실시예 5-(3)와 동일한 방법으로 RN-T AIC를 조제하였다. 단, 배양개시 7일째의 RN-T는 0.8% 인간 AB형 혈청을 포함하는 CellGro(이하, 0.8HCellGro라고 기재)에 현탁하고, 14일째의 RN-T는 0.8% 인간 AB형 혈청을 포함하는 GT-T502(이하, 0.8HGT-T502라고 기재)에 현탁한 후, 이하의 실험에 사용하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, OK-432 또는 RN-T AIC를 첨가하지 않는 군도 설정하였다. 또 배양용 기본배지로서 배양 개시시로부터 4일째까지는 0.8HCellGro를 사용하고, 7일째에는 0.8HGT-T502을, 13일째에는 0.29% 인간 AB형 혈청을 포함하는 GT-T502(이하, 0.29HGT-T502라고 기재)를 사용하였다. 배양개시 1일째에는, 각 웰에 0.8HCellGro1㎖ 및 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 4일째에는, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에는, 각 웰의 세포액을 0.8HGT-T502를 사용해서 6배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 세포액 2㎖을 옮겼다. 동일한 계대조작을 11일째 및 13일째에 각각 실시하고, 17일째까지 배양을 계속하였다. 또, 10일째 및 15일째의 세포액의 희석은 각각 0.8HGT-T502에 의한 5배 희석, 0.29HGT-T502에 의한 3배 희석으로 하였다. 배양개시 7일째에는 일부조건에 대해서는, 실시예 12-(3)에서 조제한 RN-T AIC를 1×106cells/웰씩 첨가하였다.
배양 개시후 11일째, 13일째 및 17일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 각각 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 23에 나타낸다.
Figure pct00023
표 23에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 RN-T AIC를 조합하는 것에 의해서, OK-432 무첨가군, AIC 무첨가군, OK-432 및 AIC 무첨가군과 비교해서, 11, 13 및 17일째에 있어서 높은 확대 배양율이 수득되었다.
(5) CD3음성 CD56양성 세포(NK세포) 함유비율, CD3양성 CD56음 성세포(T세포) 함유비율, 및 CD16양성 CD56양성 세포(NK세포) 함유비율의 해석
실시예 12-(4)에서 조제한 배양 개시후 17일째의 세포에 대해서 실시예 9-(6)과 동일한 방법으로, NK세포 함유비율, CD3양성 CD56음성 세포 비율, 및 CD16양성 CD56양성 세포를 해석하였다. 결과를 표 24에 나타낸다.
Figure pct00024
표 24에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 RN-T AIC를 조합하는 것에 의해서, OK-432 무첨가군, AIC 무첨가군, OK-432 및 AIC 무첨가군과 비교하여, 높은 NK세포 함유비율이 수득되었다. 또 OK-432 무첨가군, AIC 무첨가군, OK-432 및 AIC 무첨가군에 있어서는 NK세포의 비율이 낮고, 특히 AIC 무첨가군, OK-432 및 AIC 무첨가군에서는 CD3양성CD56음성 즉 T세포가 우위하게 증식하고 있었다. 이것들의 군에 대해서, OK-432 및 RN-T AIC를 조합시킨 군에서는, NK세포가 매우 높은 비율로 증식하고 있고, 또한 수득된 NK세포는 항체의존성 세포 상해활성을 발휘하기 위해서 중요한 분자인 CD16을 고발현하고 있었다. 즉, OK-432 및 AIC를 조합하는 것에 의해, 높은 NK함유율 및 CD16양성비율을 가지는 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
(6) NK세포확대 배양율의 해석
배양개시 전의 PBMC 및 실시예 12-(4)에서 조제한 배양 개시후 17일째의 세포에 대해서, 각각 실시예 9-(6)과 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 또 실시예 12-(4)에서 수득된 확대 배양율(총세포 환산)을 사용하여, 배양 개시시의 NK세포수와 비교하여, 배양 17일째에 있어서의 NK세포확대 배양율을 산출하였다(이하의 수학 식(2)을 참조). 결과를 표 25에 나타낸다.
NK 세포 확대 배양율 (배) = 확대 배양율(총 세포환산) × (배양 17일째의 NK세포 함유비율 / 배양 개시시의 NK세포 함유비율) (2)
Figure pct00025
표 25에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 RN-T AIC를 조합하는 것에 의해서, OK-432 무첨가군, AIC 무첨가군, OK-432 및 AIC 무첨가군과 비교하여, 높은 NK세포확대 배양율이 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 13 확대 배양후의 NK세포집단의 표면항원의 해석
(1) NK세포집단의 확대 배양
실시예 9-(5)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양13일째에는 CultiLife Eva 내의 세포액 225㎖을 0.29% 혈장 및 0.2% HSA를 포함하는 GT-T503(이하, 0.29%혈장/0.2%HSA/GT-T503라고 기재한다)을 사용해서 3배 희석하여 총액량을 675㎖로 한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하고, CultiLife Eva로 대체하였다. 배양 15일째에, 배양백에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 배양 18일째에, CultiLife Eva 내의 세포액 338㎖을 0.29%혈장/0.2%HSA/GT-T503을 사용해서 총액량을 675㎖로 한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하고, CultiLife Eva로 대체하였다. 배양은 20일째까지 계속하였다. 배양 개시후 18 및 20일째에 각각 샘플링한 세포에 대해서, 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 26에 나타낸다.
Figure pct00026
(2) 배양후의 NK세포의 표면항원의 해석
실시예 13-(1)에서 조제한 배양 개시후 20일째의 세포에 대해서, 실시예 9-(6)과 동일한 방법으로 T세포 함유비율, NK세포 함유비율 및 CD16양성 CD56양성 세포 함유비율을 해석하였다. 단, 이때, FITC 표지 마우스 항 인간 NKp44항체(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY제), FITC 표지 마우스 항 인간 NKp46항체(R&D Systems제), FITC 표지 마우스 항 인간 CD25항체(DakoCytomation제), 및 PC5 표지 마우스 항 인간 CD62L항체(Beckman Coulter Inc.제)를 사용하여, NKp44양성 CD56양성 세포, NKp46양 성CD56양성 세포, CD25양성 CD56양성 세포 및 CD62L양성 CD56양성 세포 함유비율 에 대해서도 해석하였다. 결과를 표 27에 나타낸다.
Figure pct00027
표 27에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 RN-T AIC를 조합시킨 방법으로 수득되는 세포집단 중은 CD56, CD16, NKp44, NKp46, CD25, CD62L을 발현하고 있었다.
NKp44 및 NKp46은 natural cytotoxicity receptor(NCR) 패밀리에게 속하고, NK세포에 의한 세포 상해활성에 각각 관여하고 있다고 한다. NKp44는 정지기 NK세포에는 발현하지 않고 활성화 NK세포에만 발현하고, NKp46은 NK세포에만 발현하는 NK세포 공통의 표면항원이며, CD25는 IL-2으로 자극되어, 활성화한 NK세포에 발현한다. CD62L은 림프구의 호밍 시에 중요한 역할을 하고, 혈류로부터 염증부위에로의 집적에도 관여하는 것이 알려져 있다.
즉, 본 발명의 방법에 의해, 성숙화 또한 활성화한 NK세포가 효율적으로 수득되는 것이 분명하게 되고, 본 발명에 의해 성숙 NK세포의 효율적인 제조방법이 제공되었다.
실시예 14 가스 투과성 배양백을 사용한 NK세포배양
(1) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 9-(2)와 동일한 방법으로 분리한 PBMC 1.2×107cells를 1HGT-T551 120㎖에 현탁하고, 실시예 9-(1)과 동일한 방법으로 제작한 항CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 CultiLife 215에 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하고, 5% CO2 존재 하, 37℃에서 배양을 개시하였다(배양 0일째). 배양개시 4일째에, CultiLife 215 내의 세포액을 현탁하고, 30㎖를 배양면적이 320㎠가 되도록 실링한 아무것도 고정화 하지 않는 가스 투과성 배양백 CultiLife Eva에 옮겼다. 이때, 1HGT-T551을 220㎖ 첨가하고, CultiLife Eva 내의 총액량을 250㎖로 하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가한 후, 5% CO2 중 37℃에서 배양하였다. 배양을 7일째까지 계속하고, 7일째에 필요량의 배양 RN-T를 분취(AIC재료로서, 이후의 공정에서 사용한다)후, 백내에 남은 세포액과 등량의 무혈장 GT-T551 및 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 11일째에 CultiLife Eva 내의 세포액을 무혈장 GT-T551을 사용해서 2배 희석한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 14일째에, 필요량의 RN-T를 분취하고, AIC재료로 하여 이후의 공정에서 사용하였다.
(2) RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 14-(1)에서 조제한 RN-T를 사용하여, 실시예 5-(3)와 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다. 배양개시 7일째의 RN-T를 사용해서 조제한 RN-T AIC를 2×106cells/㎖가 되도록, 배양개시 14일째의 RN-T를 사용해서 조제한 RN-T AIC를 4×106cells/㎖가 되도록, 각각 0.8%혈장/CellGro에 현탁하였다.
(3) NK세포집단의 확대 배양
실시예 9-(5)와 동일한 방법으로 NK세포집단의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양 개시시에는 CultiLife 215를 사용하고, 13일째의 희석조작을 14일째에 실시하였다. 배양은 18일째까지 계속하였다. 배양 개시후 18일째에 샘플링한 세포에 대해서, 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 28에 나타낸다.
Figure pct00028
표28에 나타내는 바와 같이, 가스 투과성 배양백 CultiLife 215를 배양 개시시에 사용하여도, 높은 확대 배양율이 수득되는 것이 분명하게 되었다. 즉, 배양 개시시의 가스 투과성 배양백의 종류에 의하지 않고, 소망하는 효과가 발휘되는 것이 분명하게 되었다.
(4) CD3양성 CD56음성 세포(T세포), CD3음성 CD56양성 세포(NK세포) 및 CD16양성 CD56양성 세포 함유비율의 해석
실시예 14-(3)에서 조제한 배양 개시후 18일째의 세포에 대해서, 실시예 9-(6)과 동일한 방법으로 T세포 함유비율, NK세포 함유비율 및 CD16양성 CD56양성 세포 함유비율을 해석하였다. 단, PE 표지 마우스 항 인간 NKG2D항체(Beckman Coulter Inc.제)를 조합시켜서, CD56양성 NKG2D양성 세포 함유비율에 대해서도 함께 해석하였다. 결과를 표 29에 나타낸다.
Figure pct00029
표 29에 나타내는 바와 같이, 가스 투과성 배양백 CultiLife 215을 배양 개시시에 사용해서 OK-432 및 RN-T AIC를 사용하는 배양을 실시하여도, 높은 NK세포 함유비율이 수득되었다. 또 배양 후에 수득된 NK세포에서는 높은 비율로 CD16 및 NKG2D가 발현하고 있고, 항체의존성 세포 상해활성의 발휘에 중요한 역할을 다 하는 CD16분자를 발현하는 고기능성 NK세포 및 NKG2D를 통한 높은 세포 상해활성을 나타내는 고기능성 NK세포를 고함유하는 것이 확인되었다.
(5) 세포 상해활성의 측정
실시예 14-(3)에서 조제한 배양 개시후 18일째의 세포에 대해서, 실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 세포 상해활성을 측정하였다. 단, 표적세포로서 K562 및 A549을 각각 사용하고, E/T비 10, 3, 1 및 0.3에 대해서 측정을 실시하였다. 세포 상해활성측정의 결과를 표 30에 나타낸다.
Figure pct00030
표 30에 나타내는 바와 같이, OK-432, RN-T AIC 및 가스 투과성 배양백 CultiLife 215를 배양 개시시에 사용해서 실시한 배양에 의해 수득된 세포집단은 각종 표적세포에 높은 세포 상해활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다. 또 그 활성은, NK세포 감수성 세포주로서 알려지는 Ｋ562뿐만 아니라, MHC classI 발현 세포주 A549에 대해서도 확인되고, 이것들의 세포집단이 여러 가지 암 세포주에 대해서 세포 상해활성을 발휘하는 고기능성 NK세포인 것이 확인되었다.
즉, 본 발명에 의해, CD3음성 CD56양성 CD16양성의 표현형을 나타내고, 높은 세포 상해성을 가지는 세포집단을 높은 순도로 얻는 것이 가능하게 되었다.
실시예 15 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포배양(세포 상해활성의 비교)
(1) PBMC를 사용한 AIC의 조제
실시예 1-(2)와 동일한 방법으로 PBMC AIC를 조제하였다. 단, 조제한 PBMC AIC를 2×106cells/㎖가 되도록 0.8HCellGro에 현탁하고, 이하의 실험에 사용하였다.
(2) NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(3)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양용 배지로서 0.8HCellGro를 사용하고, AIC로서 실시예15-(1)에서 조제한 PBMC AIC를 사용하였다.
배양개시 1일째에, 각 웰에 0.8HCellGro를 1㎖씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 3일째에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에, 각 웰의 세포액을 0.8HCellGro를 사용해서 6배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 1.674㎖을 옮겼다. 10일째에, 각 웰의 세포액을 0.8HGT-T502을 사용해서 5배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2㎖을 옮겼다. 각 계대일에 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 배양개시 14일째의 세포를 5HRPMI를 사용해서 1×106cells/㎖이 되도록 조제하고, 인터페론(IFN)알파(제제명 Sumiferon: Dainippon Sumitomo Pharma Co., LTD.제; 이하, IFN-α라고 기재한다)를 최종농도 1000U/㎖가 되도록 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 1시간 스탠딩(정치)하였다. 이 세포액을 세정한 후, 5HRPMI로 현탁하였다(INFα 처리). 이 때, IFN-α을 첨가하지 않는 군(IFNα 미처리)도 제작하였다.
(3) 세포 상해활성의 측정
실시예 15-(2)에서 조제한 배양 개시후 14일째의 세포에 대해서, 실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 세포 상해활성을 측정하였다. 단, 표적세포로서 K562, A549 및 HT29를 사용하고, E/T비 10, 3, 1 및 0.3에 대해서 측정을 실시하였다. 세포 상해활성 측정의 결과를 표 31에 나타낸다.
Figure pct00031
표 31에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 RN-T AIC를 사용한 배양에 의해 수득된 세포집단을 IFN-α로 처리하는 것에 의해서, 각종 표적세포에 대해서의 세포 상해활성이 증강되는 것이 분명하게 되었다. 또 이 세포집단은 그 활성이 NK세포 감수성 세포주로서 알려지는 Ｋ562뿐만 아니라, 다양한 암 세포주에 대해서 세포 상해활성을 발휘하는 고기능성 NK세포인 것이 확인되었다.
실시예 16 OK-432 및 온열 처리세포를 사용한 NK세포배양(온열처리 세포수의 비교)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 3-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T를 사용한 온열 처리세포의 조제
실시예 16-(2)에서 배양한 RN-T를 5HRPMI로 5×106cells/㎖가 되도록 조제하고, 1.5㎖ 튜브(WATSON CO., LTD.제 또는 Treff AG제)에 0.6㎖씩 옮기고, 45℃에서 1시간 워터배스를 사용해서 온열 처리를 실시하였다. 처리한 세포액을 회수, 원심한 후, 상청액을 제거하고, 0.8HCellGro로 2, 4 및 10×106cells/㎖가 되도록 각각 조정하였다(이하, 이 온열 처리후의 RN-T세포를 온열처리 RN-T라고 기재한다).
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예12-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양 개시시에는 12-well 세포배양 플레이트에, Responder 세포 및 실시예 16-(3)에서 각 세포 농도로 조정한 온열처리 RN-T를 0.95㎖/웰씩 첨가하고, 합계 1.9㎖/웰로 하였다. 이때, 온열처리 RN-T조건 및 OK-432만을 첨가하는 군(이하, 대조군이라고 기재)을 설정하였다. 실시예 12-(4)에 있어서의 13일째의 조작을 당해 실시예에 있어서는 14일째에 실시하고, 18일째까지 배양을 계속하였다. 배양용 기본배지로서 배양 개시시 7일째까지는 0.8HCellGro를 사용하고, 11일째에는 0.8HGT-T502을, 14일째에는 0.3HGT-T502을 사용하였다. 배양 개시후 18일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 32에 나타낸다.
Figure pct00032
표 32에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 온열처리 RN-T를 사용함으로써 온열처리 RN-T 첨가군은 대조군과 비교해서 높은 확대 배양율 및 NK세포 함유비율이 수득되었다. 또 이것들의 효과는 배양 개시시의 Responder 세포에 대한 온열처리 RN-T의 비에 한정되는 것은 아니고, 광범위한 조건으로 효과가 확인되었다.
즉, NK세포 배양 시에 OK-432 및 온열처리 RN-T를 조합시킴으로써 높은 확대 배양율로 고순도의 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 17 NK세포의 항체의존성 세포 상해활성(ADCC)측정
(1) NK세포집단의 확대 배양
실시예 16-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양 개시시에는 Responder 세포 및 실시예 5-(3)과 동일한 방법으로 조제한 AIC를 0.95㎖/웰씩 첨가하고, 합계 1.9㎖/웰로 하였다. 20일째까지 배양을 계속하고, 18일째에는 혈청을 포함하지 않는 GT-T502을 사용해서 2배 희석한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다.
(2) NK세포의 항체의존성 세포 상해활성(ADCC) 측정
실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 실시예 17-(1)에서 조제한 배양개시 20일째의 세포에 대해서, 세포 상해활성을 측정하였다. 단, 유방암 세포주인 BT-474, SKBR3, 및 위암 세포주NCI-N87을 사용하고, 1% BSA/DPBS를 사용해서 1×106cells/㎖가 되도록 조제한 각 세포주에 트라스투주맙(trastuzumab) 제제(제제명 허셉틴(Herceptin) 주사용: Chugai Pharmaceutical Co., LTD.제)를 최종농도 10㎕/㎖가 되도록 첨가하고, 4℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 이것을 원심, 세정한 후, 2×106cells/㎖가 되도록 5% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에서 조제한 세포액을 표적세포로 하였다. 이때, E/T비는 10, 3 및 1로 하고, 트라스투주맙(trastuzumab) 제제를 첨가하지 않는 군도 제작하였다. 세포 상해활성 측정의 결과를 표 33에 나타낸다.
Figure pct00033
트라스투주맙 제제는 암 유전자로서 작용하는 Her2(Human Epidermal Growth Factor Receptor Type2)결합 항체로, NK세포의 Fc수용체(CD16분자 등)을 통한 항체의존성 세포 상해활성(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity: ADCC)을 야기한다. 표 33에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 RN-T AIC를 사용한 배양에 의해 수득된 세포집단은 트라스투주맙 제제로 처리한 각종 표적세포에 대해서, 더욱 높은 세포 상해활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다. 또 당해 실시예에서 사용한 세포주는 Her2 고발현주이고, 이것들의 세포집단이 여러가지 Her2 발현 암 세포주에 대해서 높은 항체의존성 세포 상해활성을 발휘하는 고기능성 NK세포인 것이 확인되었다.
실시예 18 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포배양(첨가 AIC량의 비교)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 3-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다. 단, 항CD3항체/레트로넥틴 고정화 플레이트는 사용 직전에 DPBS로 2회, GT-T551로 1회 세정하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 18-(2)에서 조제한 RN-T를 사용하여 실시예 3-(3)과 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다. 단, 배양개시 7일째에 회수한 RN-T는 X선 조사후 0.8HCellGro에 현탁하고, 이하의 실험에 사용하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 12-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 첨가하는 RN-T AIC 세포수를 Responder세포에 대해서, 1배, 5배 및 10배로 각각 설정하고, 모든 군에 OK-432을 첨가하였다. 또 배양용 기본배지로서 배양 개시시로부터 11일째까지는 0.8HCellGro를 사용하고, 실시예 12-(4)에 있어서의 4, 7 및 13일째의 조작을 당해 실시예에서는 5, 8 및 15일째에 각각 실시하였다. 배양 개시후 18일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 34에 나타낸다.
Figure pct00034
표 34에 나타내는 바와 같이, 첨가하는 RN-T AIC의 비율을 5배 또는 10배로 늘리는 것에 의해, 높은 확대 배양율 및 NK세포 함유비율(%)이 수득되었다.
즉, RN-T AIC량 의존적으로 NK세포의 증식성이 높아지게 되는 것이 분명하게 되고, NK세포 배양시에 있어서 RN-T AIC가 호적하게 사용되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 19 OK-432 및 AIC를 사용해서 배양한 NK세포의 동결ㆍ해동 후의 세포 상해활성 측정
(1) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 14-(1)과 동일한 방법으로 항CD3항체/레트로넥틴 자극T세포의 확대 배양을 실시하였다.
(2) RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 19-(1)에서 조제한 RN-T를 사용하여 실시예 14-(2)와 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다.
(3) NK세포집단의 확대 배양
실시예 14-(3)와 동일한 방법으로 NK세포집단의 확대 배양을 실시하였다.
(4) NK세포의 보존
실시예 19-(3)에서 조제한 16일째의 세포를 1×108cells/vial이 되도록 실시예 1-(1)과 동일하게 CP-1/HSA를 사용해서 액체질소 중에서 보존하였다.
(5) NK세포의 해동
실시예 19-(4)에서 동결 보존한 세포를 37℃의 워터배스에서 급속 해동 후 GT-T502를 사용해서 세정하였다. 이것들의 세포를 약 2×106cells/㎖가 되도록 0.2HGT-T503을 사용해서 조정하고, 12-well 세포배양 플레이트에 4㎖씩 첨가하였다. 또 이것들의 플레이트에 IL-2를 0(비첨가군), 200 또는 1000U/㎖가 되도록 첨가하고, 5% CO2 존재 하, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다.
(6) NK세포의 세포 상해활성의 측정
실시예 19-(3) 및 (5)에서 조제한 세포를 사용하여 실시예 1-(5)와 동일한 방법에 의해 표적세포 A549 및 A375에 대해서 동결보존 전후의 세포 상해활성을 측정하였다. 단, E/T비는 10으로 하였다. 결과를 표 35에 나타낸다.
Figure pct00035
표 35에 나타내는 바와 같이, NK세포는 동결ㆍ해동 직후에 일단 세포 상해활성이 저하하지만, 하룻밤 배양하는 것에 의해서 동결ㆍ해동 직후와 비교해서 동등의 세포 상해활성이 수득되었다. 또 그 활성은, IL-2를 첨가해서 배양하는 것에 의해 더욱 증강되어, 동결전의 활성을 상회하는 높은 세포 상해활성을 나타냈다.
즉, 동결 해동후의 NK세포를 하룻밤 배양하는 것에 의해 활성이 회복하고, 추가로 IL-2를 첨가하는 것에 의해서 세포 상해활성이 높아지게 되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 20 OK-432 및 온열 처리세포를 사용한 NK세포배양(온열 처리조건의 비교-1)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T를 사용한 온열 처리세포의 조제
실시예 20-(2)에서 조제한 RN-T를 실시예 16-(3)과 동일한 방법으로 온열 처리 RN-T를 조제하였다. 단, 온열 처리시의 온도는 45 및 48℃로 하고, 처리시간은 0.5, 1, 2 또는 4시간을 설정하고, 처리시의 세포농도는 0.8HCellGro로 2×106cells/㎖가 되도록 조정하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 12-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, AIC의 대신에 온열 처리 RN-T를 사용하여 OK-432 첨가를 조합시킨 군, 및 OK-432만을 첨가하는 군(이하, 대조군이라고 기재한다)을 설정하였다. 실시예 12-(4)에서의 1 및 13일째의 조작을 당해 실시예에 있어서는 2 및 14일째에 각각 수행하고, 배양 개시후 16일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 36에 나타낸다.
Figure pct00036
표 36에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 온열 처리한 RN-T를 사용함으로써 온열 처리세포 무첨가군(대조군)과 비교해서, 높은 확대 배양율 및 NK세포 함유비율(%)이 수득되었다. 또 온열 처리시의 온도 및 시간은 특별히 한정되는 것은 아니고, 광범위한 처리조건으로 소망하는 효과가 확인되었다.
즉, NK세포 배양 시에 OK-432 및 RN-T 온열 처리세포를 조합킴으로써, 높은 확대 배양율로 고순도의 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 21 OK-432 및 온열 처리세포를 사용한 NK세포배양(온열 처리조건의 비교-2)
(1) 항 인간CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T를 사용한 온열처리세포의 조제
실시예 21-(2)에서 조제한 RN-T를, 1 또는 2×106cells/㎖가 되도록 GT-T551을 사용해서 현탁하였다. 200㎖ 분리백(TERUMO CORPORATION제)에 조제한 세포액 50㎖을 옮기고, 45℃에서 0.25 또는 0.5시간 워터배스를 사용해서 온열 처리를 실시하였다. 단, 세포농도 2×106cells/㎖의 조건에서는, 45℃에서 0.5시간의 온열 처리만 실시하였다. 온열 처리후의 세포액을 50㎖ 카니클튜브(Corining Incorporation제)에 회수하고, 440×g, 실온에서 5분간 원심하였다. 원심 후, 상청액을 제거하고, 0.8HCellGro에 2×106cells/㎖가 되도록 세포를 현탁하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 12-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양 개시시에는 12-well 세포배양 플레이트에, Responder세포 및 실시예 21-(3)에서 조제한 온열 처리 RN-T를 0.95㎖/웰씩 첨가하고, 합계 1.9㎖/웰로 하였다. 3일째에, 각 웰에 0.8HCellGro 1.9㎖를 첨가하였다. 7일째에, 각 웰의 세포액을 0.8HCellGro를 사용해서 6배 희석하고, 새로운 T25 세포배양 플라스크(FALCON제 또는 Corining Incorporation제)에 세포액 1.4㎖를 옮기고, 세워서 배양하였다. 동일한 계대조작을 11일째 및 14일째에 실시하고, 17일째까지 배양을 계속하였다. 또, 11일째 및 14일째의 세포액의 희석은 각각 0.8HGT-T502에 의한 5배 희석, 0.29HGT-T502에 의한 3배 희석으로 하였다. 배양 개시후 17일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 37에 나타낸다.
Figure pct00037
표 37에 나타내는 바와 같이, OK-432만을 첨가하고, 온열 처리세포를 첨가하지 않은 대조군과 비교해서, OK-432 및 온열 처리한 RN-T를 첨가한 군에서는, 온열 처리시의 시간 및 세포농도가 특별하게 한정되는 않고, 광범위한 처리조건으로 소망하는 효과가 확인되었다.
즉, NK세포 배양 시에 OK-432 및 RN-T 온열 처리세포를 조합하는 것에 의해서, 높은 확대 배양율과 고순도의 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 22 NK세포를 사용한 멀티펑션능의 측정
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 18-(3)과 동일한 방법으로 AIC의 조제를 실시하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 21-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 온열 처리세포의 대신에 실시예 22-(3)에서 조제한 AIC를 사용하고, 실시예 21-(4)에 있어서의 3일째의 조작을 당해 실시예에서는 2일째에 실시하고, 배양을 22일째까지 계속하였다.
(5) NK세포의 멀티펑션능의 측정
실시예 22-(4)에서 조제한 배양 개시후 22일째의 세포를, 이펙터 세포로 하여 3×106cells/㎖가 되도록 5HRPMI으로 희석후, 96-well 세포배양 플레이트의 각 웰에 100㎕/웰씩 분주해 두고, 이것들에 1×106cells/㎖가 되도록 조제한 표적세포(K562)를 100㎕/웰씩 첨가하였다. 이때, 표적세포(T)에 대한 이펙터 세포(E)의 비, 즉 E/T비는 3으로 하였다. PE/Cy5 표지 마우스 CD107a항체(abcam제)을 1㎕/웰씩 첨가하고, 37℃ 1시간 인큐베이션하였다. 또, BrefeldinA(Sigma Corporation제)를 최종농도 10㎍/㎖가 되도록 첨가후, 37℃ 3시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후의 플레이트를 250×g, 5분 원심하고, 상청액을 제거후, 1% BSA/DPBS 중에 현탁하고, ECD 표지 마우스 항 인간 CD3항체 및 PC7 표지 마우스 항 인간 CD56항체(모두, Beckman Coulter Inc.제)를 첨가하였다. 마찬가지로, 각 세포집단의 일부에는, 네거티브 컨트롤로서 FITC 표지 마우스 IgG1/RD1 표지 마우스 IgG1/PC5 표지 마우스 IgG1(Beckman Coulter Inc.제)을 첨가하였다. 각각의 항체를 첨가한 후에, 4℃에서 30분 인큐베이트하고, 그 후에 세포를 0.1% BSA/DPBS로 세정하였다. 세포내 사이토카인 측정을 위해 IntraPrep(Beckman Coulter Inc.제)을 사용하였다. 세포의 고정화 및 막투과 처리를 목적으로 해서 IntraPrepReagent를 사용한 후, FITC 표지 마우스 항 인간 TNF-α항체(BD Biosciences제) 및 PE 표지 마우스 항 인간 IFN-γ 항체(Beckman Coulter Inc.제)를 첨가하였다. 각각의 항체를 첨가한 후에, 실온에서 15분 인큐베이트하였다. 인큐베이션 후의 플레이트를 250×g, 5분 원심하고, 상청액을 제거후, 0.1% BSA/DPBS로 현탁하였다. 이것들의 세포를 Flow cytometry에 적용하고, CD3음성 및 CD56양성 세포군을 NK세포로 하여, NK세포 중의 CD107a, TNF-α 및 IFN-γ 양성율을 산출하고, 멀티펑션능의 해석을 실시하였다. CD107a, TNF-α 및 IFN-γ 중 3개를 동시에 발현하는 세포를 +++, 가운데 2개를 발현하는 세포를 ++, 가운데 1개를 발현하는 세포를 +, 모두 발현하지 않는 세포를 ?로 하여, 멀피평선성을 해석하였다. 결과를 표 38에 나타낸다.
Figure pct00038
표 38에 나타내는 바와 같이, NK세포를 표적세포와 혼합함으로써, 티펑션능이 올라가는 것이 확인되었다.
즉, 당해 배양법으로 배양한 NK세포는 높은 다기능성을 가지고, 그 기능은 종양세포와 혼합하였을 때 더욱 높아지게 되는 것이 분명하게 되어, 기능성이 높은 NK세포인 것이 나타났다.
실시예 23 OK-432 및 마이토마이신 처리 세포를 사용한 NK세포배양
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T를 사용한 마이토마이신C 처리세포의 조제
실시예 23-(2)에서 조제한 RN-T를 2×106cells/㎖가 되도록 5HRPMI를 사용해서 현탁하였다. 15㎖ 카니클튜브(Corining Incorporation제)에 조제한 세포액 5㎖을 옮기고, 마이토마이신C(제제명: 마이토마이신 쿄화S, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.제)를 최종농도 10 또는 20㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 37℃에서 0.5 또는 1.0시간 인큐베이션하였다. 반응후, 440×g, 실온에서 5분간 원심하였다. 원심후, 상청액을 제거하고, 5HRPMI를 사용해서 동일하게 2회 세정을 실시한 후, 0.8%HCellGro를 사용해서 2×106cells/㎖가 되도록 조정하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 21-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 온열 처리세포의 대신에 마이토마이신C 처리세포 조건군을 설정하였다. 또 대조군은 OK-432만 첨가하였다. 실시예 21-(4)에 있어서의 3일째의 조작을 당해 실시예에서는1일째에 실시하고, 배양을 18일째까지 계속하였다. 배양 개시후 18일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 39에 나타낸다.
Figure pct00039
표 39에 나타내는 바와 같이, OK-432만을 첨가하고, 마이토마이신C 처리세포를 첨가하지 않은 대조군과 비교해서, OK-432 및 마이토마이신C 처리한 RN-T를 첨가한 군에서는 마이토마이신C 처리시의 농도 및 시간은 특별하게 한정되지 않고, 광범위한 처리조건으로 소망하는 효과가 확인되었다.
즉, NK세포 배양 시에 OK-432 및 마이토마이신C 처리 RN-T세포를 조합시킴으로써, 높은 확대 배양율로 고순도의 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 24 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포배양(AIC 처리세포의 비교)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다. 또 항 인간 CD3항체만을 고정화하는 플레이트도 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포 및 항CD3항체 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다. 또 마찬가지로, 실시예 24-(1)에서 제작한 항 인간 CD3항체만을 고정화한 플레이트를 사용하여, 항CD3항체 자극에 의해 확대 배양한 T세포(이하 OKT3-T라고 기재)도 조제하였다.
(3) RN-T 및 OKT3-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 18-(3)과 동일한 방법으로 RN-T AIC의 조제를 실시하였다. 이때, 실시예 24-(2)에서 조제한 OKT3-T를 사용하여, AIC를 동일하게 조제하였따(이하, OKT3-T AIC라고 기재한다).
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 23-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 실시예 24-(3)에서 조제한 RN-T AIC, OKT3-T AIC, 또는 실시예 1-(2)와 동일한 방법으로 조제한 PBMC AIC를 첫날에 첨가하는 군도 설정하였다. 또 배양 7일째에도 RN-T AIC, OKT3-T AIC 또는 PBMC AIC를 1×106cells/플라스크씩 첨가하였다. 또 OK-432만을 첨가한 것을 대조군으로 하였다. 배양 개시후 18일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 1-(4)와 동일한 방법으로 NK세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 40에 나타낸다.
Figure pct00040
표 40에 나타내는 바와 같이, PBMC AIC를 사용하였을 경우와 비교해서, RN-T AIC 또는 OKT3-T AIC를 사용한 군에서는 높은 확대 배양율과 NK세포 함유비율이 수득되었다.
즉, NK세포배양 시에 사용하는 AIC를 OKT3-T 또는 RN-T으로 하는 것에 의해서, 높은 확대 배양율로 고순도의 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
또, AIC를 조제하기 위해서 PBMC를 사용하는 것은 그 만큼 혈액을 다량으로 필요로 하지만, 소량의 혈액으로부터 확대 배양한 OKT3-T 또는 RN-T를 사용함으로써, 환자본인에 대한 육체적 부담을 저감시키면서, 순도가 더 높은 고기능 NK세포를 대량으로 얻을 수 있다. 따라서 당해 발명에 의해, 육체적 부담이 더욱 적은 NK확대 배양 기술이 이용 가능하게 된다.
실시예 25 OK-432 및 온열 처리세포를 사용한 NK세포배양(온열 처리세포의 비교)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 24-(1)과 동일한 방법으로, 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트, 및 항 인간 CD3항체만을 고정화하는 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포 및 항CD3항체자극 T세포의 확대 배양
실시예 24-(2)와 동일한 방법으로 RN-T 및 OKT3-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T 및 OKT3-T를 사용한 온열 처리세포의 조제
실시예 16-(3)과 동일한 방법으로 온열 처리세포의 조제를 실시하였다. 이때, 실시예 25-(2)에서 조제한 OKT3-T를 사용해서 동일하게 온열 처리세포를 조제하였다(이하, 온열 처리 OKT3-T세포라고 기재한다).
(4) NK세포집단의 확대 배양
실시예 24-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 실시예 25-(3)에서 조제한 온열 처리 RN-T세포 및 온열 처리 OKT3-T세포를 사용하거나, 또는 대조군으로서 OK432만 첨가하는 군도 설정하였다. 배양 개시후 18일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또, 실시예 9-(6)과 동일한 방법으로 NK세포 함유비율 및 CD16양성 CD56양성 세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 41에 나타낸다.
Figure pct00041
표 41에 나타내는 바와 같이, 온열 처리 OKT3-T세포를 사용하였을 경우와 비교해서, 온열 처리 RN-T세포를 사용한 군에서는, 높은 확대 배양율 및 NK세포 함유비율, 및 16양성 CD56양성세포 함유비율이 수득되었다.
즉, NK세포배양 시에 사용하는 온열 세포를 RN-T으로 하는 것에 의해서, 더 높은 확대 배양율로 고순도, 고기능의 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다.
실시예 26 면역 부전 마우스 이종 종양모델을 사용한 인간 NK세포의 항종양 활성의 평가
(1) 마우스와 군 구성
NOD/scid 마우스(CLEA Japan, Inc.제) 7주령, 암컷 16마리를, 이하의 표 42에 나타내는 군 구성으로 하였다. 인간 NK세포 투여군은 B-D군이다. 또, 각군은 N=4로 하였다.
Figure pct00042
(2) 항 아시알로(asialo)GM1 항체의 투여
항 아시알로(asialo)GM1 항체처리는 NOD/scid 마우스에 있어서 마우스 NK세포를 제거하고, 인간 세포의 생착을 증진시키는 것이 알려져 있다. A549의 접종 전날 및 인간 NK세포 1회째 투여 전일에, 항 아시알로(asialo) GM1 항체용액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.제) 20㎕을 0.4% HAS 함유 생리식염수(Otsuka Pharmaceutical co., Ltd.제) 0.38㎖로 희석하고, 전량을 마우스의 복강 내에 투여하였다.
(3) NOD/scid -A549의 이종 종양모델
NOD/scid 마우스의 전군에 X선 조사(3Gy)하고, 마취 하에서 우서혜부를 9평방 센티미터 정도 제모하고, RPMI1640 배지에 5×107cells/㎖가 되도록 조제한 A549를 0.1㎖ 피하 접종하였다.
(4) 투여 인간 NK세포의 배양ㆍ조제
실시예 14-(3)과 동일한 방법으로 인간 NK세포의 확대 배양을 실시하였다.단, 배양 16일째에, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하고, 18일째에, CultiLife Eva 내의 세포액 338㎖을 0.2% HSA/GT-T503을 사용해서 총액량을 675㎖로 한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하고, CultiLife Eva로 대체하였다. 배양은 21일째까지 계속하였다.
(5) 인간 NK세포의 투여
종양접종 7일후, 9일후 및 12일후의 합계 3회, 이하의 처치를 실시하였다.
A군에는 4% HSA함유 생리식염수를 0.3㎖ 미정맥 투여하였다. B군에는 4% HSA함유 생리식염수로 3.33×107cells/㎖로 조제한 인간 NK세포를 0.3㎖ 미정맥 투여하였다. C군에는 실시예 (15)-2와 동일한 방법으로 IFNα 처리를 실시한 인간 NK세포를 4% HSA함유 생리식염수로 3.33×107cells/㎖로 조제하고, 0.3㎖ 미정맥 투여하였다. D군에는 4% HSA함유 생리식염수로 1.00×108cells/㎖로 조제한 인간 NK세포를 0.1㎖ 종양 내 투여하였다.
(6) NOD/scid -A549의 이종 종양모델에 있어서의 인간 NK세포 투여후의 항종양 활성의 평가
각 개체에 있어서의 종양체적을 종양 접종후 42일째에, 전자 노기스를 사용해서 측정하였다. 그 결과를 표 43에 나타낸다.
종양체적을, 이하의 수학 식(3)을 사용해서 산출하였다:
종양 체적 (㎣) = R1 × R2 × R2 × 0.5 (3)
상기 식에서, R1은 단직경, R2은 장직경을 나타낸다.
Figure pct00043
또, 각 개체에 있어서의 종양 접종후 42일째의 종양중량을 측정하였다. 결과를 표 44에 나타낸다.
Figure pct00044
표 43 및 44에 나타내는 바와 같이, 당해 배양법으로 확대 배양한 인간 NK세포를 투여한 군은, 대조군(A군)과 비교해서 종양체적 및 중량 모두 작고, 높은 항종양 활성을 가지는 것이 분명하게 되었다. 이 효과는, 인간 NK세포를 IFNα로 처리해서 투여하는 것에 의해 증강되었다. 또 종양 내 투여를 실시하였을 경우, 보다 현저한 항종양 활성이 나타나, 당해 배양법으로 확대 배양한 인간 NK세포의 높은 유효성이 인정되었다.
이상의 결과에 의해, 당해 배양법으로 배양한 인간 NK세포투여에 의한 치료가 매우 유효한 것이 확인되었다.
실시예 27 면역 부전 마우스 이종종양전이 모델을 사용한 인간 NK세포의 전이 억제 활성의 평가
(1) 마우스와 군 구성
NOD/scid 마우스 7주령, 암컷 20마리를, 이하의 표 45에 나타내는 군 구성으로 하였다. 인간 NK세포 투여군은 B-E군이다. 또, 각군은 N=4로 하였다.
Figure pct00045
(2) 항 아시알로(asialo) GM1 항체의 투여
A549 접종 전일에, 항 아시알로(asialo) GM1 항체용액 20㎕를 0.4% HSA함유 생리식염수 0.38㎖로 희석하고, 전량을 마우스의 복강 내에 투여하였다.
(3) NOD/scid -A549의 이종 종양전이 모델
NOD/scid 마우스의 전군에 X선 조사(3Gy)하고, RPMI1640 배지에 6.6×106cells/㎖가 되도록 조제한 A549을 0.3㎖ 미정맥 투여하였다.
(4) 인간 NK세포의 배양
실시예 26-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양 21일째에, CultiLife Eva 내의 세포액 338㎖를 0.2% HSA/GT-T503을 사용해서 총액량을 675㎖로 한 후, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 배양은 23일째까지 계속하였다.
(5) 투여용 세포의 조제
배양개시 18일째, 21일째 및 23일째의 세포를, 실시예 15-(2)와 동일한 방법으로 IFNα로 처리한 군을 제작하였다(IFN-α 처리 NK세포). 단, GT-T503로 5×107cells/㎖이 되도록 조제한 세포액을 사용해서 IFNα 처리를 하였다. 마찬가지로, IL-2를 최종농도 1000U/㎖가 되도록 첨가하거나(IL-2 처리 NK세포) 또는 IFN-α과 IL-2을 각각 최종농도 1000U/㎖가 되도록 첨가(IFNα+IL-2 처리 NK세포)하는 조건을 설정하고, 각각 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 1시간 스탠딩하였다. 그 밖에, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 1시간 스탠딩만의 조건을 설정하였다.
인간 NK세포 및 각 처리 인간 NK세포를 4% HSA함유 생리식염수를 사용해서 3.33×107cells/㎖로 조제하였다.
(6) 인간 NK세포의 투여
종양 투여한 후, 3일후, 6일후 및 8일후의 계 3회, 이하의 처치를 실시하였다.
A군에는 4% HSA함유 생리식염수를 0.3㎖ 미정맥 투여하였다. B군에는 인간NK세포를, C군에는 IFNα 처리 인간 NK세포를, D군에는 IL-2 처리 인간 NK세포를, E군에는 IFNα+IL-2 처리 인간 NK세포를 각각 0.3㎖ 미정맥 투여하였다.
(7) NOD/scid -A549의 이종 종양 전이 모델에 있어서의 인간 NK세포 투여후의 항종양 활성의 평가
각 개체에 있어서의 종양 투여후 31일째의 간의 중량을 측정하였다. 그 결과를 표 46에 나타낸다.
Figure pct00046
표 46에 나타내는 바와 같이, 당해 배양법으로 확대 배양한 인간 NK세포를 투여한 군은, 대조군과 비교해서 간의 중량이 낮아, 높은 전이 억제활성을 가지는 것이 분명하게 되었다. 이상의 결과에 의해, 당해 배양법으로 배양한 인간 NK세포투여에 의한 치료가 매우 유효한 것이 확인되었다.
실시예 28 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포 확대 배양법과 OKT-3을 사용한 NK세포 확대 배양법의 비교
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T AIC의 조제
실시예 18-(3)과 동일한 방법으로 RN-T AIC를 조제하였다.
(4) OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포집단의 확대 배양
실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 PBMC의 분리를 실시하고, 동결 보존을 실시하지 않고 NK세포 확대 배양에 사용하였다. 분리한 PBMC를 0.8HCellGro로 2×106cells가 되도록 조제하고, 0.25㎖씩 48-well 세포배양 플레이트(Corining Incorporation제)에 첨가하였다. 실시예 28-(3)에서 조제한 RN-T AIC를 0.25㎖씩 첨가하고, OK-432를 최종농도 0.05KE/㎖, IL-2를 최종농도 200U/㎖가 되도록 첨가하고, 배양을 개시하였다.
배양개시 2일째에, 플레이트의 각 웰에 0.8HCellGro를 0.5㎖씩 첨가하고, 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 4일째에, 각 웰에 최종농도 200U/㎖가 되도록 IL-2를 첨가하였다. 7일째에는, 각 웰의 세포액을 0.8HCellGro를 사용해서 6배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 1.596㎖을 옮겼다. 11일째에, 각 웰의 세포액을 0.8HGT-T502를 사용해서 5배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 1.330㎖을 옮겼다. 14일째에는 0.3HGT-T502를 사용해서 3배 희석하고, 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 희석한 세포액 2.0㎖를 옮기고, 18일째까지 배양을 계속하였다. 당해 실시예에 있어서, 이하, 본법을 A법으로 기재한다.
(5) OKT-3을 사용한 NK세포집단의 확대 배양
(참고 문헌 Alici 들, BLOOD, 2008년, 제111권, 제3155-3162쪽, 및 미국공개 제2003/0068306호)
실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 PBMC의 분리를 실시하고, 동결 보존을 실시하지 않고 NK세포 확대 배양에 사용하였다. 분리한 PBMC를 5HCellGro로 0.5×106cells/㎖가 되도록 조정하고, 1㎖씩 48-well 세포배양 플레이트에 첨가하였다. OKT-3을 최종농도 10ng/㎖, IL-2를 최종농도 500U/㎖가 되도록 첨가하고, 배양을 개시하였다.
배양 5일째에 세포를 500×g으로 5분간 원심 분리한 후, 상청액을 버리고, 2㎖의 5HCellGro로 현탁하였다. 전량을 새로운 24-well 세포배양 플레이트에 첨가후, IL-2를 최종농도 500U/㎖가 되도록 첨가하였다. 배양 7일째, 9일째, 11일째, 13일째 및 15일째에 세포액 1㎖을 새로운 24-well 세포배양 플레이트로 옮기고, 1㎖의 5HCellGro를 첨가한 후, IL-2를 최종농도 500U/㎖가 되도록 첨가하였다. 18일째까지 배양을 계속하였다. 당해 실시예에 있어서, 이하, 본법을 B법으로 기재한다.
(6) 표면항원의 해석
실시예 28-(4) 및 실시예 28-(5)의 NK세포집단의 확대 배양에 있어서, 실시예 14-(4)와 동일한 방법으로 T세포 함유비율, NK세포 함유비율, CD16양성 CD56양성 세포 함유비율 및 NKG2D양성 CD56양성 세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 47에 나타낸다.
Figure pct00047
표 47에 나타내는 바와 같이, 배양후의 NK세포의 비율은 A법 쪽이 현저하게 높고, 또한 높은 비율로 CD16 및 NKG2D가 발현하고 있어, 항체의존성 세포 상해활성의 발휘에 중요한 역할을 하는 CD16 분자를 발현하는 고기능성 NK세포 및 NKG2D를 통한 높은 세포 상해활성을 나타내는 고기능성 NK세포를 고함유하는 것이 확인되었다.
(7) 세포 상해활성의 측정
실시예 28-(4) 및 실시예 28-(5)에서 조제한 배양 개시후 18일째의 세포에 대해서, 실시예 14-(5)와 동일한 방법으로 세포 상해활성을 측정하였다. 결과를 표 48에 나타낸다.
Figure pct00048
표 48에 나타내는 바와 같이, A법에서 수득된 세포집단은 각종 표적세포에 대해서, Ｂ법으로 수득된 세포집단보다도 높은 세포 상해활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다. 또 그 활성의 차이는 MHC classI 발현 세포주 A549에 대해서 현저하게 확인되고, 다양한 암 세포주에 대해서 세포 상해활성을 발휘하는 고기능성 NK세포인 것이 확인되었다.
즉 본 발명의 방법에 의해 확대 배양된 NK세포집단은 다른 배양법과 비교해서, CD3음성 CD56양성 세포의 순도가 높고, 높은 비율로 CD16 및 NKG2D를 발현하고 있고, 높은 세포 상해성을 가지는 고기능성 NK세포집단인 것이 분명하게 되었다.
실시예 29 순화한 CD3음성 CD56양성 세포의 확대 배양
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T AIC의 조제
실시예 18-(3)과 동일한 방법으로 RN-T AIC를 조제하였다.
(4) CD3음성 CD56양성 세포의 순화
실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 PBMC의 분리를 실시하고, 동결보존을 실시하지 않고 CD3음성 CD56양성 세포의 순화에 사용하였다. 5×107개의 세포를 0.4㎖의 0.5% BSA 및 2mM의 에틸렌디아민 4초산(EDTA, Nacalai Tesque, Inc.제)을 첨가한 DPBS(이하 셀렉션 버퍼라고 기재)에 현탁하고, 0.1㎖의 CD3 마이크로비즈드(Miltenyi Boitec, Inc.제)를 첨가하고, 4℃에서 15분간 인큐베이트하였다. 셀렉션 버퍼를 5㎖ 첨가하고, 300×g에서 10분간 원심 분리한 후, 상청액을 제거하고, 0.5㎖의 셀렉션 버퍼에 현탁하였다. 미리 자기장에 고정하고, 3㎖의 셀렉션 버퍼를 통과시킨 LS칼럼(Miltenyi Boitec, Inc.제)에 세포현탁액을 통과시키고, 3㎖의 셀렉션 버퍼로 칼럼을 3회 세정함으로써, 칼럼으로의 비결합 분획을 회수하고, 3.5×107개의 CD3음성 세포를 얻었다.
수득된 CD3음성 세포를 0.28㎖의 셀렉션 버퍼에 현탁하고, 70㎕의 CD56 마이크로비즈(Miltenyi Boitec, Inc.제)을 첨가하고, 4℃에서 15분간 인큐베이트하였다. 셀렉션 버퍼를 5㎖ 첨가하고, 300×g에서 10분간 원심 분리한 후, 상청액을 제거하고, 0.5㎖의 셀렉션 버퍼에 현탁하였다. 미리 자기장에 고정하고, 0.5㎖의 셀렉션 버퍼를 통과시킨 MS칼럼(Miltenyi Boitec, Inc.제)에 세포 현탁액을 통과시키고, 0.5㎖의 셀렉션 버퍼로 칼럼을 3회 세정하였다. 칼럼을 자기장으로부터 분리하고, 1㎖의 셀렉션 버퍼를 칼럼에 통과시킴으로써, 7.2×106개의 CD3음성 CD56양성 세포를 얻었다.
(5) OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포집단의 확대 배양
실시예 29-(4)에서 순화한 CD3음성 CD56양성 세포를 0.8HCellGro로 2×106cells가 되도록 조제하고, 0.25㎖씩 48-well 세포배양 플레이트에 첨가하였다. AIC는 첨가 또는 비첨가 조건으로 실시하고, 첨가 조건으로는 실시예 29-(3)에서 조제한 RN-T AIC를 0.25㎖씩 첨가하고, 비첨가 조건으로는 0.8HCellGro를 0.25㎖씩 첨가하였다. OK-432를 최종농도 0.05KE/㎖, IL-2를 최종농도 200U/㎖가 되도록 첨가하고, 배양을 개시하였다.
배양개시 2일째 이후, 배양을 실시예 28-(4)와 동일하게 실시하였다. 당해 실시예에 있어서, 이하, 본법을 A'법으로 기재한다.
(6) X-VIVO 10배지(Lonza제)을 사용한 NK세포집단의 확대 배양
(참고문헌 Koehl 들, BLOOD Cells, Molecules, and Diseases, 2004년, 제33권, 제261-266쪽)
실시예 29-(4)에서 순화한 CD3음성 CD56양성 세포를, 10% 인간 AB형 혈청을 포함하는 X-VIVO 10배지(이하 10HX-VIVO라고 기재)로 1×106cells/㎖가 되도록 조제하고, 0.5㎖씩 48-well 세포배양 플레이트에 첨가하였다. IL-2를 최종농도 1000U/㎖가 되도록 첨가하고, 배양을 개시하였다.
배양 3일째에 0.5㎖의 10HX-VIVO를 첨가하고, IL-2를 최종농도 1000U/㎖가 되도록 첨가하였다. 배양 6일째에 세포액 전량을 새로운 24-well 세포배양 플레이트로 옮긴 후, 1㎖의 10HX-VIVO를 첨가하고, IL-2를 최종농도 1000U/㎖가 되도록 첨가하였다. 9일째, 12일째 및 15일째에 배양 상청액 1㎖을 제거하고, 1㎖의 10HX-VIVO를 첨가한 후, IL-2를 최종농도 1000U/㎖가 되도록 첨가하였다. 18일째까지 배양을 계속하였다. 당해 실시예에 있어서, 이하, 본법을 Ｃ법으로 기재한다.
(7) 세포수 측정 및 표면항원의 해석
실시예 29-(5) 및 실시예 29-(6)의 NK세포집단의 확대 배양에 있어서, 배양 개시후 18일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 또 실시예 14-(4)와 동일한 방법으로 T세포 함유비율, NK세포 함유비율, CD16양성 CD56양성 세포 함유비율 및 NKG2D양성 CD56양성 세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 49에 나타낸다.
Figure pct00049
표 49에 나타내는 바와 같이, 순화한 말초혈 CD3음성 CD56양성 세포를 사용한 배양에 있어서의 확대 배양율은 X-VIVO 10배지를 사용한 확대 배양법(Ｃ법)에 비해서 OK-432를 사용한 확대 배양법(A'법) 쪽이 현저하게 높았다. A'법에 있어서 AIC를 사용한 조건으로 더 높은 확대 배양율이 되었다. 또 배양후의 NK세포의 비율 및 NKG2D 발현율은 A'법과 Ｃ법에서 동등하였지만, 항체의존성 세포 상해활성의 발휘에 중요한 역할을 하는 CD16분자의 발현은 AIC의 유무에 관계없이 A'법 쪽이 높고, 높은 세포 상해활성을 나타내는 고기능성 NK세포를 고함유하는 것이 확인되었다.
(8) 세포 상해활성의 측정
실시예 29-(5) 및 실시예 29-(6)에서 조제한 배양 개시후 18일째의 세포에 대해서, 실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 세포 상해활성을 측정하였다. 단, 표적세포로서 A549를 사용하고, E/T비 10, 3, 1 및 0.3에 대해서 측정을 실시하였다. 세포 상해활성 측정의 결과를 표 50에 나타낸다.
Figure pct00050
표 50에 나타내는 바와 같이 A'법으로 수득된 세포집단은 AIC의 사용의 유무에 관계하지 않고, MHC classI 발현 세포주 A549에 대해서 Ｃ법보다도 높은 세포장애 활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다.
즉, 본 발명에 의한 NK세포확대 배양에서는 배양개시 세포로서 순화한 말초혈 CD3음성 CD56양성 세포를 사용하였을 경우에 있어서도, 다른 배양법과 비교해서 현저하게 높은 확대 배양율을 나타내고, 높은 세포 상해성을 가지는 NK세포를 고순도로 배양할 수 있는 것이 분명하게 되었다.
실시예 30 확대 배양후의 NK세포와 말초혈유래 CD3음성 CD56양성 세포와의 활성비교
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴의 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로, 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 3-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T AIC의 조제
실시예 18-(3)과 동일한 방법으로 RN-T AIC를 조제하였다.
(4) 말초혈 CD3음성 CD56양성 세포의 순화
실시예 29-(4)와 동일한 방법으로 CD3음성 CD56양성 세포를 순화하였다.
(5) OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포집단의 확대 배양
NK세포집단의 확대 배양을 PBMC 또는 순화한 CD3음성 CD56양성 세포를 사용해서 실시하였다. PBMC를 사용한 확대 배양은 실시예 28-(4)와 동일한 방법에 의해 실시하였다. 또, 순화한 CD3음성 CD56양성 세포를 사용한 확대 배양은 실시예 29-(5)와 동일하게 실시하였다. 단, AIC 첨가조건만 실시하였다.
(6) 확대 배양후의 세포수 측정
실시예 30-(5)의 NK세포집단의 확대 배양에 있어서, 배양 개시후 18일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 51에 나타낸다.
Figure pct00051
표 51에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포집단의 확대 배양에서는 배양개시 세포가 PBMC 혹은 순화한 CD3음성 CD56양성 세포의 어느 것에서도, 동등한 확대 배양율이 수득되는 것이 분명하게 되었다.
(7) 표면항원의 해석
실시예 14-(4)와 동일한 방법으로 실시예 30-(4)의 순화한 말초혈 CD3음성 CD56양성 세포 및 실시예 30-(5)의 배양후의 세포에서, T세포 함유비율, NK세포 함유비율 및 CD16양성 CD56양성 세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 52에 나타낸다.
Figure pct00052
표 52에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포집단의 확대 배양에서는 배양개시 세포로서 PBMC 혹은 순화한 CD3음성 CD56양성세포의 어느 것을 사용하였을 경우에 있어서도, 동등하게 고순도 및 고CD16 양성율을 나타내는 고기능 NK세포가 수득되는 것이 분명하게 되었다. 또 배양 18일째의 세포는 배양전의 CD3음성 CD56양성 세포와 비교해서 CD16 발현율이 높고, 본 발명에 의해 확대 배양된 세포집단은 기능적으로 뛰어난 세포집단인 것이 나타났다.
(8) 세포 상해활성의 측정
실시예 30-(4)의 순화한 말초혈 CD3음성 CD56양성 세포 및 실시예 30-(5)의 배양후 세포를 사용해서, 실시예 14-(5)와 동일한 방법으로 세포 상해활성을 측정하였다. 결과를 표 53에 나타낸다.
Figure pct00053
표 53에 나타내는 바와 같이, OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포집단의 확대 배양에서 수득된 세포집단은 배양개시 세포로서 PBMC 혹은 순화한 CD3음성 CD56양성 세포의 어느 것을 사용하였을 경우에 있어서도, 각종 표적세포에 대해서, 순화 말초혈 CD3음성 CD56양성 세포보다도 높은 세포장애 활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다. 또 그 활성의 차이는 MHC classI 발현 세포주 A549에 대해서 현저하게 확인되고, 이것들의 세포집단이 여러 가지 암 세포주에 대해서 세포 상해활성을 발휘하는 고기능성 NK세포인 것이 확인되었다. 또, 배양개시 세포에 순화한 CD3음성 CD56양성 세포를 사용함으로써, 더 높은 세포 장애활성을 나타내는 NK세포집단이 수득되는 것이 분명하게 되었다.
즉 본 발명은 말초혈 CD3음성 CD56양성 세포의 기능성을 높이는 효과가 있는 배양법인 것이 분명하게 되었다.
실시예 31 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포배양과 각종 NK세포 배양방법과의 비교
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 12-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양기간은 15일간으로 하였다.
(3) RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 31-(2)에서 조제한 RN-T를 사용하고, 실시예5-(3)와 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다. 단, 배양개시 8일째의 RN-T를 사용해서 조제한 RN-T AIC를 2×106cells/㎖가 되도록, 배양개시 15일째의 RN-T를 사용해서 조제한 RN-T AIC는 1×106cells/㎖가 되도록, 각각 0.8HCellGro에 현탁하였다.
(4) OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포집단의 확대 배양
실시예 17-(1)과 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다. 단, 배양 7일째에는 각 웰의 세포액 1.4㎖을 새로운 T25세포 배양 플라스크로 옮기고, 0.8HCellGro를 사용해서 6배 희석하였다. 동일한 계대조작을 11일째 및 14일째에 실시하고, 16일째까지 배양을 계속하였다. 배양 11일째 및 14일째의 세포액의 희석은, 각각 0.8HGT-T502에 의한 5배 희석, 0.3HGT-T502에 의한 3배 희석으로 하였다. 배양개시 7일째에 실시예 31-(3)에서 조제한 2종의 RN-T AIC를 각각 2.5×106cells/플라스크씩 첨가하였다. 배양 개시후 16일째까지 배양을 계속하였다. 당해 실시예 및 실시예 32에 있어서, 이하, 본법을 A''법으로 기재한다.
(5) 항 인간 CD16항체 고정화 플라스크의 제작
T25 세포배양 플라스크에 최종농도 1㎍/㎖의 LEAF purified anti-human CD16(BioLegend제; 이하, 항 인간 CD16항체라고 기재한다)을 포함하는 DPBS를 0.57㎖/플라스크씩 첨가하고, 필요 개수의 플라스크를 제작하고, 5% CO2 존재 하, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 또, 항 인간 CD16항체 고정화 플라스크는 사용 직전에 DPBS로 2회 세정하였다.
(6) OK-432 및 항 인간 CD16항체를 사용한 NK세포집단의 확대 배양
(참고문헌 일본특허공개 제2007-297291호, 일본특허 제4275680호)
실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 조제한 PBMC를 1×106cells/㎖가 되도록 5%인간 AB형 혈청을 포함하는 AIM V Medium(Invitrogen Corporation제, 이하, 5HAIM V라고 기재)으로 현탁후, 실시예 31-(5)에서 제작한 항 인간 CD16항체 고정화 플라스크에 1.7㎖/플라스크씩 첨가하였다. 각 플라스크에 OK-432를 최종농도 0.01KE/㎖, IL-2를 최종농도 700U/㎖가 되도록 첨가하고, 이것들의 플라스크를 5% CO2 존재 하, 39℃에서 배양을 개시하였다(배양 0일째). 단, 1일째 이후, 이것들의 플라스크를 5% CO2 존재 하, 37℃에서 배양하였다. 4일째에, 각 플라스크의 세포액을 전량회수하고, 320×g, 실온에서 원심한 후, 상청액을 제거하였다. 각 플라스크에서 회수한 세포를 각각 1×106cells/㎖가 되도록 5HAIM V으로 현탁후, 새로운 T25 세포배양 플라스크에 전량 첨가하였다. 6일째에, 각 플라스크의 세포액을 0.1×106cells/㎖, 계 1.3㎖/플라스크가 되도록 5HAIM V를 사용해서 희석하고, 새로운 T25세포배양 플라스크에 첨가하였다. 11일째에, 각 플라스크에 5HAIM V를 2.6㎖ 첨가하고, 합계 3.9㎖/플라스크로 하였다. 상기 배양 4일째, 6일째 및 11일째에 첨가하고, 14일째에는 각 플라스크에 IL-2를 최종농도 700U/㎖가 되도록 첨가하고, 16일째까지 배양을 계속하였다. 당해 실시예에 있어서, 이하, 본법을 D법으로 기재한다.
(7) 항 인간 CD52항체 및 항 인간CD3항체 고정화 플레이트의 제작
24-well 세포배양 플레이트에 최종농도 0.1㎍/㎖의 항 인간 CD3항체 및 최종농도 20㎍/㎖의 RAT ANTI HUMAN CD52(AbD Serotec제; 이하, 항 인간 CD52항체라고 기재한다)을 포함하는 DPBS를 0.5㎖/웰씩 첨가해서 필요 웰수를 제작하고, 4℃에서 하룻밤 스탠딩하였다. 또, 항 인간 CD52항체/항 인간 CD3항체 고정화 플레이트는 사용 직전에 DPBS로 2회 세정하였다.
(8) 항 인간 CD3항체 및 항 인간 CD52항체를 사용한 NK세포집단의 확대 배양
(참고문헌 일본특허공개 제2006-340698호)
실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 조제한 PBMC을 1×106cells/㎖가 되도록 KBM540(COHJIN BIO CO., LTD.제)로 현탁 후, 실시예 31-(7)에서 제작한 항 인간 CD52항체/항 인간 CD3항체 고정화 플레이트에, 1㎖/웰씩 첨가하였다. 3일째에, 각 플라스크에 KBM540을 1㎖씩 첨가하고, 합계 2㎖/플라스크로 하였다. 5일째에, 각 플라스크의 세포액 1㎖을 새로운 6-well 세포배양 플레이트(Becton, Dickinson and Compnay제 또는 Corining Incorporation제)로 옮기고, KBM540을 사용해서 11배 희석하였다. 동일한 계대조작을 9일째 및 14일째에 실시하고, 각각의 세포액의 희석은 KBM540에 의한 2배 희석으로 하였다. 상기 배양 3일째, 5일째, 9일째 및 14일째에 첨가하고, 7일째 및 11일째에는 각 웰에 IL-2를 최종농도 200U/㎖가 되도록 첨가하고, 16일째까지 배양을 계속하였다. 당해 실시예에 있어서, 이하, 본법을 Ｅ법으로 기재한다.
(9) 세포수 측정
실시예 31-(4), 실시예 31-(6) 및 실시예 31-(8)의 NK세포집단의 확대 배양에 있어서, 배양 개시후 16일째에 트리판블루 염색법으로 생 세포수를 계측하고, 배양 개시시의 세포수와 비교해서 확대 배양율을 산출하였다. 결과를 표 54에 나타낸다.
Figure pct00054
(10) 배양후 세포집단의 표면항원의 해석
실시예 31-(4), 실시예 31-(6) 및 실시예 31-(8)에서 조제한 배양 개시후 16일째의 세포에 대해서, 실시예 14-(4)와 동일한 방법으로 CD3양성 CD56음성 세포(T세포), CD3음성 CD56양성 세포(NK세포), CD16양성 CD56양성 세포 함유비율 및 CD56양성 NKG2D양성 세포 함유비율을 해석하였다. 단, 이때, FITC 표지 마우스 항 인간 CD69항체(eBioscience제), 및 FITC 표지 마우스 항 인간 CXCR3 항체(R&D Systems제)를 사용하여, CD69양성 CD56양성 세포 함유비율 및 CXCR3양성 CD56양성 세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 55에 나타낸다.
Figure pct00055
표 54에 나타내는 바와 같이, 확대 배양율은 OK432 및 AIC를 사용한 확대 배양법(A''법)에서는 항 인간 CD3항체 및 항 인간 CD52항체를 사용한 확대 배양법(Ｅ법)과 동등하고, OK-432 및 항 인간 CD16항체를 사용한 확대 배양법(D법)에 비해서 높았다. 표 55에 나타내는 바와 같이, 배양후의 NK세포의 비율은 A''법에서 현저하게 높고, 더욱 높은 비율로 CD16, NKG2D, CD69 및 CXCR3을 발현하고 있었다. CD69는 activation inducer molecule(AIM)로서도 알려지고 있으며, 백혈구의 활성화 초기에 표출되고, NK세포에서는 표적세포 융해작용에 관여한다. CXCR3은 케모카인인 CXCL9 및 CXCL10의 리간드이고, 이것들의 케모카인 발현 암 세포로의 높은 유주능 및 집적능을 나타내는 것으로 생각된다. 따라서 A''법으로 수득된 NK세포에는 높은 비율로 CD16, NKG2D, CD69 및 CXCR3을 발현하는 고기능성 NK세포를 고함유하고, 또한 동시에, 생체 내에서의 암 세포에로의 유주능 및 국소에의 집적능이 높다고 생각되는 NK세포가 고함유되어 있는 것이 확인되어, 매우 뛰어난 항종양 활성을 발휘하는 것이 기대되는 NK세포집단인 것이 분명하게 되었다.
(11) 세포 상해활성의 측정
실시예 31-(4), 실시예 31-(6) 및 실시예 31-(8)에서 조제한 배양 개시후 16일째의 세포에 대해서, 실시예 14-(5)와 동일한 방법으로 세포 상해활성을 측정하였다. 세포 상해활성 측정의 결과를 표 56에 나타낸다.
Figure pct00056
표 56에 나타내는 바와 같이, A''법으로 수득된 세포집단은 각종 표적세포에 높은 세포 상해활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다. 또한 그 활성은 NK세포 감수성 세포주로서 알려지는 Ｋ562뿐만 아니라, MHC classI 발현 세포주 A549에 대해서도 확인되고, 이 세포집단이 다양한 암 세포주에 대해서 세포 상해활성을 발휘하는 고기능성 NK세포인 것이 확인되었다.
즉, 본 발명 A''법은 기지의 NK세포 배양방법인 Ｄ법 및 Ｅ법과 비교해서, CD3음성 CD56양성 CD16양성의 표현형을 나타내고, 더 높은 세포 상해성을 가지는 세포집단을 고순도로 얻는 것이 가능한 배양방법인 것이 분명하게 되었다.
실시예 32 OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포배양과 각종 NK세포 배양방법과의 비교(동일한 배양용 기본배지 조건하에서의 초기자극의 비교)
(1) 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트의 제작
실시예 18-(1)과 동일한 방법으로 항 인간 CD3항체 및 레트로넥틴 고정화 플레이트를 제작하였다.
(2) 항CD3항체/레트로넥틴 자극 T세포의 확대 배양
실시예 31-(2)와 동일한 방법으로 RN-T의 확대 배양을 실시하였다.
(3) RN-T를 사용한 AIC의 조제
실시예 31-(3)과 동일한 방법으로 AIC를 조제하였다.
(4) NK세포집단의 확대 배양(OK-432 및 AIC를 사용한 NK세포배양)
실시예 31-(4)와 동일한 방법으로 NK세포의 확대 배양을 실시하였다(A''법).
(5) 항 인간 CD16항체의 고정화 플레이트의 제작
12-well 세포배양 플레이트에 최종농도 1㎍/㎖의 항 인간 CD16항체를 포함하는 DPBS를 0.217㎖/웰씩 첨가하고, 필요 웰수를 제작하고, 5% CO2 존재 하, 37℃에서 하룻밤 인큐베이트하였다. 또, 항 인간 CD16항체 고정화 플레이트는, 사용 직전에 DPBS로 2회 세정하였다.
(6) OK-432 및 항 인간 CD16항체를 사용한 NK세포집단의 확대 배양
(참고문헌 일본특허공개 제2007-297291호, 일본특허 제4275680호)
실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 조제한 PBMC를 1×106cells/㎖가 되도록 0.8HCellGro로 현탁후, 실시예 32-(5)에서 제작한 항 인간 CD16항체 고정화 플레이트에, 1.9㎖/웰씩 첨가하였다. 각 웰에 OK-432를 최종농도 0.05KE/㎖, IL-2를 최종농도 200U/㎖가 되도록 첨가하고, 5% CO2 존재 하, 39℃에서 배양을 개시하였다(배양 0일째). 단, 1일째 이후, 5% CO2 존재 하 37℃에서 배양하였다. 2일째에, 각 웰에 0.8HCellGro를 1.9㎖씩 첨가하고, 합계 3.8㎖/웰로 하였다. 4일째에, 각 웰의 세포액을 전량회수하고, 320×g, 실온에서 원심한 후, 상청액을 제거하였다. 각 웰에서 회수한 세포를 3.8㎖의 0.8HCellGro로 현탁후, 새로운 12-well 세포배양 플레이트에 전량 첨가하였다. 7일째에, 각 플라스크의 세포액 1.4㎖을 0.8HCellGro로 6배 희석하고, 새로운 T25세포배양 플라스크에 첨가하였다. 상기 배양 2일째, 4일째 및 7일째에 첨가하고, 11일째 및 14일째에 각 플라스크에 IL-2를 최종농도 200U/㎖가 되도록 첨가하고, 16일째까지 배양을 계속하였다. 당해 실시예에 있어서, 이하, 본법을 D'법으로 기재한다.
(7) 항 인간 CD52항체 및 항 인간 CD3항체 고정화 플레이트의 제작
24-well 세포배양 플레이트에, 최종농도 0.1㎍/㎖의 항 인간 CD3항체 및 최종농도 20㎍/㎖의 항 인간 CD52항체를 포함하는 DPBS를 0.95㎖/웰씩 첨가해서 필요 웰수를 제작하고, 4℃에서 하룻밤 스탠딩하였다. 또, 항 인간 CD52항체/항 인간 CD3항체 고정화 플레이트는 사용 직전에 DPBS로 2회 세정하였다.
(8) 항 인간 CD3항체 및 항 인간 CD52항체를 사용한 NK세포집단의 확대 배양
(참고문헌 일본특허공개 제2006-340698호)
실시예 1-(1)과 동일한 방법으로 조제한 PBMC를 1×106cells/㎖가 되도록 0.8HCellGro로 현탁후, 실시예 32-(7)에서 제작한 항 인간 CD52항체/항 인간 CD3항체고정화 플레이트에, 1.9㎖/웰씩 첨가하였다. 3일째에, 각 웰에 0.8HCellGro를 1.9㎖씩 첨가하고, 합계 3.8㎖/웰로 하였다. 5일째에, 각 플라스크의 세포액 1.4㎖을 0.8HCellGro로 6배 희석하고, 새로운 T25 세포배양 플라스크에 첨가하였다. 동일한 계대조작을 9일째, 11일째 및 14일째에 실시하고, 16일째까지 배양을 계속하였다. 배양 9일째, 11일째 및 14일째의 세포액의 희석은, 각각 0.8HCellGro에 의한 2배 희석, 0.8HGT-T502에 의한 5배 희석, 및 0.3HGT-T502에 의한 3배 희석으로 하였다. 상기 배양 3일째, 5일째, 9일째, 11일째 및 14일째에 첨가하고, 7일째에 각 플라스크에 IL-2를 최종농도 200U/㎖가 되도록 첨가하고, 16일째까지 배양을 계속하였다. 당해 실시예에 있어서, 이하, 본법을 E’법으로 기재한다.
(9) 배양후의 세포집단의 표면항원의 해석
실시예 32-(4), 실시예 32-(6) 및 실시예 32-(8)에서 조제한 배양 개시후 16일째의 세포에 대해서, 실시예 31-(10)과 동일한 방법으로 CD3양성 CD56음성 세포(T세포), CD3음성 CD56양성 세포(NK세포), CD16양성 CD56양성 세포 함유비율, CD56양성 NKG2D양성 세포 함유비율, CD69양성 CD56양성 세포 함유비율 및 CXCR3양성 CD56양성 세포 함유비율을 해석하였다. 결과를 표 57에 나타낸다.
Figure pct00057
표 57에 나타내는 바와 같이, 배양후의 NK세포의 비율은 A''법이 현저하게 높고, 또한 높은 비율로 CD16, NKG2D, CD69 및 CXCR3을 발현하고 있었다. A''법으로 수득된 NK세포는 높은 비율로 CD16, NKG2D, CD69 및 CXCR 3을 발현하는 고기능성 NK세포를 고함유하고, 또한 동시에, 생체 내에서의 암 세포에로의 유주능, 및 국소에로의 집적능이 높다고 생각되는 NK세포를 고함유하는 것이 확인되어, 매우 뛰어난 항종양 활성을 발휘하는 것이 기대되는 NK세포집단인 것이 분명하게 되었다.
(10) 세포 상해활성의 측정
실시예 32-(4), 실시예 32-(6) 및 실시예 32-(8)에서 조제한 배양 개시후 16일째의 세포에 대해서, 실시예 14-(5)와 동일한 방법으로, 세포 상해활성을 측정하였다. 단, E/T비 3, 1 및 0.3에 대해서 측정을 실시하였다. 세포 상해활성 측정의 결과를 표 58에 나타낸다.
Figure pct00058
표 58에 나타내는 바와 같이, A''법으로 수득된 세포집단은 각종 표적세포에 높은 세포 상해활성을 나타내는 것이 분명하게 되었다. 또한 그 활성은 NK세포 감수성 세포주로서 알려지는 Ｋ562뿐만 아니라, MHC classI 발현 세포주 A549에 대해서도 확인되고, 이 세포집단이 다양한 암 세포주에 대해서 세포 상해활성을 발휘하는 고기능성 NK세포인 것이 확인되었다.
즉, 본 발명인 A''법은 기지의 NK세포 배양방법인 D'법 및 E'법과 비교해서, CD3음성 CD56양성 CD16양성의 표현형을 나타내고, 더 높은 세포 상해성을 가지는 세포집단을 고순도로 얻는 것이 가능한 배양방법인 것이 분명하게 되었다. 따라서 본 발명의 배양방법(NK세포 자극 방법)은 동일한 배양용 배지조건 하에서도, 기지의 NK세포 배양방법(NK세포 자극 방법)보다도 매우 뛰어난 발명으로, 높은 치료효과를 기대할 수 있는 면역요법을 제공할 수 있는 것이 시사되었다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명에 의해, NK세포의 확대 배양방법이 제공된다. 당해 방법은 세포 증식율이 높고, 본 발명에 의해 수득되는 NK세포를 함유하는 세포집단은 세포 상해활성에 있어서 뛰어나며, 양자면역요법을 비롯한 의료분야에 있어서 매우 유용하다.

Claims (12)

  1. 내추럴킬러 세포 및/또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포를 함유하는 세포집단을 생물응답 변형제 및 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 존재 하에서 확대 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 내추럴킬러 세포를 함유하는 세포집단의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 생물응답 변형제가 세균유래 제제인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 생물응답 변형제가 OK-432, BCG, Streptcoccus pyogenes, Corynebacterium parvum 및 이들의 세포벽 골격으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 세균유래 제제인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포가 말초혈 단핵구 세포, T세포, T세포 서브셋 및 B세포로 이루어지는 그룹에서 선택되는 세포에 증식능을 빼앗는 처리를 실시한 것인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포가 인위적으로 확대 배양된 T세포에 증식능을 빼앗는 처리를 실시한 것인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포가 내추럴킬러 세포 또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포로 동일한 개체에 유래하는 세포인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 증식능을 빼앗는 처리가 가해진 세포의 존재 하에서 확대 배양하는 공정에 있어서, 당해 세포를 첨가하는 것을 복수회 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 내추럴킬러 세포 및/또는 내추럴킬러 세포로 분화될 수 있는 세포로서 말초혈 단핵구 세포가 사용되는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득되는 세포집단.
  10. 제 9 항에 기재된 세포집단을 함유하는 의약.
  11. 제 9 항에 있어서, 질병의 치료에 사용하기 위한 세포집단.
  12. 유효량의 제 9 항에 기재된 세포집단을 대상으로 투여하는 공정을 포함하는 질병의 치료방법 또는 예방방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016085248A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Green Cross Lab Cell Corporation Method for culturing natural killer cells using t cells

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5572863B2 (ja) 2011-06-24 2014-08-20 国立大学法人九州大学 Ｎｋ細胞の増幅方法
CN104114694A (zh) * 2011-09-22 2014-10-22 细胞质基质私人有限公司 用于体外扩增造血干细胞和祖细胞的方法
NO2794859T3 (ko) * 2011-12-22 2018-02-17
KR101923848B1 (ko) * 2013-01-15 2018-11-29 히로유키 아베 면역세포 함유 조성물의 제조방법 및 암 치료용 조성물
JP6073417B2 (ja) * 2015-06-26 2017-02-01 チャ バイオテック カンパニー リミテッド 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物
CN105176926A (zh) * 2015-09-22 2015-12-23 上海柯莱逊生物技术有限公司 一种体外培养扩增nk细胞的方法
CN107267454A (zh) * 2016-04-07 2017-10-20 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种脐血nk细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用
CN106434554B (zh) * 2016-08-31 2019-07-26 北京同立海源生物科技有限公司 Nk细胞的制备方法
AU2018219887B2 (en) 2017-02-08 2024-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
EP4273258A3 (en) 2017-02-20 2024-01-17 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CN107164321A (zh) * 2017-06-15 2017-09-15 长春申宇细胞生物技术有限公司 一种人类冻存单个核细胞高效扩增nk细胞的方法
TWI828626B (zh) * 2017-06-30 2024-01-11 日商小野藥品工業股份有限公司 併用包含溶血性鏈球菌之菌體的製劑的療法
CN107400660B (zh) * 2017-09-26 2019-11-08 上海莱馥医疗科技有限公司 一种激活和扩增nkt细胞的方法
KR20200112868A (ko) * 2018-01-25 2020-10-05 다카라 바이오 가부시키가이샤 림프구의 제조방법
AU2019218136A1 (en) 2018-02-08 2020-08-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
WO2019165097A1 (en) * 2018-02-21 2019-08-29 Board Of Regents,The University Of Taxas System Universal antigen presenting cells and uses thereof
PL3843757T3 (pl) 2018-08-27 2024-08-05 Affimed Gmbh Kriokonserwowane komórki nk wstępnie obciążone konstruktem przeciwciała
CN109294985B (zh) 2018-10-25 2022-02-18 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 一种用于nk细胞体外扩增的培养基体系及nk细胞体外扩增的方法
CN113195710A (zh) * 2018-12-06 2021-07-30 麒麟控股株式会社 T细胞或nk细胞的制造方法、t细胞或nk细胞的培养用培养基、t细胞或nk细胞的培养方法、维持未分化t细胞的未分化状态的方法和t细胞或nk细胞的增殖促进剂
EP3922715A4 (en) * 2019-04-17 2022-03-30 CHA Biotech Co., Ltd. NATURAL KILLER CELLS WITH INCREASED ANTI-CANCER EFFECTS AND IMMUNOTHERAPEUTIC USE THEREOF
CN110317786B (zh) * 2019-07-12 2020-09-29 赛德特生物科技开发有限公司 一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞及其制备方法与应用
CN114149969B (zh) * 2021-10-18 2024-05-28 宁波市第一医院 一种选择性扩增同种反应性nk细胞的nk细胞体外培养方法
KR20230057983A (ko) 2021-10-21 2023-05-02 주식회사 이뮤니스바이오 세포 이미지 영상 처리를 통한 세포 배양액 관리 방법 및 이를 이용한 자동 세포 배양기

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0870839B1 (en) 1995-11-13 2006-05-10 Takara Bio Inc. Method for gene introduction into target cells by retrovirus
CA2340086A1 (en) 1998-08-11 2000-02-24 The United States Of America, Represented By Department Of Health And Hu Man Services A method of transducing mammalian cells, and products related thereto
KR100895231B1 (ko) 2002-03-25 2009-05-04 다카라 바이오 가부시키가이샤 세포상해성 림프구의 제조방법
KR101233648B1 (ko) 2004-09-29 2013-02-15 시즈오카켄 유청 단백, 젖 유래의 항체 또는 항체를 포함하는 기능성조성물 또는 식품
JP4886983B2 (ja) 2004-12-09 2012-02-29 アサマ化成株式会社 抗体を含有する機能性組成物
CN101243187B (zh) 2005-08-17 2012-07-11 宝生物工程株式会社 淋巴细胞的制备方法
WO2007040105A1 (ja) * 2005-09-30 2007-04-12 Takara Bio Inc. Ｔ細胞集団の製造方法
WO2007103901A2 (en) * 2006-03-06 2007-09-13 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Autologous natural killer cells and lymphodepleting chemotherapy for the treatment of cancer
WO2007142300A1 (ja) 2006-06-09 2007-12-13 Takara Bio Inc. リンパ球の製造方法
JP2008127277A (ja) 2006-11-16 2008-06-05 Osaka Prefectural Hospital Organization 免疫賦活化促進剤
JP5092801B2 (ja) 2008-03-04 2012-12-05 パナソニック株式会社 給湯機のリモコン装置

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016085248A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Green Cross Lab Cell Corporation Method for culturing natural killer cells using t cells
US11766456B2 (en) 2014-11-26 2023-09-26 GC Cell Corporation Method for culturing natural killer cells using T cells

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Publication number Publication date
CN102597223B (zh) 2017-05-10
JP5792622B2 (ja) 2015-10-14
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US20120171173A1 (en) 2012-07-05
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US9062287B2 (en) 2015-06-23
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