KR20030032961A - 내츄럴 킬러 ｔ 세포의 증폭 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 과립구 콜로니 자극 인자에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻을 수 있는 단핵 세포 분획을 인터루킨 2 등의 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-글리코실세라마이드의 존재하에서 배양함으로써, 인간 Vα24+내츄럴 킬러 T 세포를 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법으로 증폭된 인간 Vα 24+내츄럴 킬러 T 세포를 포함하는 세포 분획은 암 치료제로서 유용하다.
Description
NKT 세포는 성숙 림프구의 예외적인 서브세트이며, NK 세포와 T 세포의 수용체를 모두 발현하는 세포이다 (Annu. Rev. Immunol., 15, 535-562, 1997; J. Exp. Med., 182, 633-638, 1995). 마우스에서는 NK1.1과 TCRαβ를 발현하며, 골수 (J. Immunol., 145, 3209-3215, 1990)와 간장 (J. Exp. Med., 180, 699-704, 1994)에 분포되어 있다. 이들은 비변이의 α쇄를 포함하는 극히 한정된 T 세포 수용체 (TCR) 레파토리를 발현하고 있다 (J. Exp., Med., 180, 1097-1106, 1994; Int. Immunol., 7, 1157-1161, 1995). 이러한 점에서 NKT 세포의 리간드는 다양하지 않고, TAP (항원 가공 관련 트랜스포터: transporter associated with antigen processing)와는 독립적인 경로를 통해 가공된 특정한 항원을 제시할 것으로 여겨지는 비전형적인 MHC 클라스 I 분자라고 시사되고 있다. 최근 연구에서 이러한MHC 클라스 Ib 분자 중 하나로서 CD1d가 NKT 세포의 리간드인 것이 판명되었다. N 부위를 제외하고 재배열된 비변이의 Vα24JαQTCR을 발현하는 인간 T 세포는 최근 마우스의 Vα14-Jα281+NKT 세포와 동족체인 것으로 유추되고 있다 (J. Exp. Med., 180, 1097-1106, 1994). 또한, 마우스 Vα14-Jα281+세포와 Vα24JαQTCR+NKT 세포는 α-갈락토실세라마이드(α-GalCer)로 처리된 CD1d 항원 제시 세포 (APC)의 자극을 받아 증식되는 것이 시사되어 있다. 활성화된 NKT 세포는 여러가지 종양 세포주에 대하여 NK 형태의 퍼포린 의존적인 세포 상해성을 나타내며 (Cancer Res., 59, 5102-5105, 1999), 또한 한 실험 모델에서 종양 전이를 저지하는 것 (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5690-5693, 1998)이 보고되었다.
면역 요법에 관해서는, 1980년대에는 LAK (림포카인으로 활성화된 킬러: Lymphokine-activated killer) 세포 요법이나 TIL (종양 침윤성 림프구: Tumor-infiltrating lymphocytes) 요법을 비롯한 여러가지 면역 요법이 사이토카인의 주사를 수반하여 또는 수반하지 않고 실시되어 왔다. 그러나, 이들 임상 연구의 결과는 세포 의료의 임상 효과에 관해서는 기대를 결여하는 것으로, 임상적인 가치를 발견할 수 없었다. 1990년대에 들어서는 인간 암에 대한 면역 응답의 분자 성분 동정에 있어서 중요한 진전이 보여, 수지형 세포 (DC) 요법이나 세포 장해성 T 세포 (CTL) 요법 등, 몇가지 상이한 면역 요법에 관한 접근이 임상 시험에서 시도되었다.
NKT 세포는 상술한 바와 같이 NK 세포, T 세포 및 B 세포 등 다른 림프구와는 달리 NK 수용체와 비변이의 T 세포 수용체를 갖는 세포이다. 이 새로운 계통의 림프구는 대량의 인터루킨 4 (IL-4)와 인터페론 γ (IFNγ)를 생산할 수 있으며, 강한 살종양 활성을 나타내는 것이 알려져 있다. 따라서, NKT 세포의 역할은 암의 면역 요법에 있어서 중요하며, 이 세포의 능력을 이용한 새로운 면역 요법의 전개가 기대되고 있으며, 이미 체외에서의 Vα24+NKT 세포의 증폭에 관한 몇가지 연구가 보고되었다 (Cancer Res., 59, 5102-5105, 1999; Immunology, 99, 229-234, 2000). 그러나, 가령 제대혈로부터라고 하더라도, 면역 요법을 행하는 데 충분한 만큼의 수의 세포를 얻는 것은 곤란하였다.
본 발명은 인간 Vα24+내츄럴 킬러 T (NKT) 세포의 증폭 방법 및 그 방법에 의해 증폭된 인간 Vα24+NKT 세포 및 그 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획의 용도에 관한 것이다.
도 1은 IL-2와 α-GalCer에 응답하여 증폭된 PBMC와 G-PBSC로부터의 Vα 24+NKT 세포의 대표적인 유세포 분석 프로필 (flow cytometric profile)을 나타낸다. 좌측: 배양 후, 중앙: α-GalCer(+), 우측: α-GalCer(-).
도 2는 PBMC와 G-PBSC를 100 U/㎖의 IL2와 α-GalCer의 존재하에서 12일간 배양했을 때의 배양 전후의 Vα24+NKT 세포수를 나타낸다.
도 3은 α-GalCer로 활성화된 Vα24+NKT 세포의 FACS 프로필을 나타낸다. PBMC 또는 G-PBSC를 100 U/㎖의 IL2와 α-GalCer의 존재하에서 12일간 배양한 배양 세포의 표현형을 분석하였다.
도 4는 α-GalCer로 활성화된 Vα24+NKT 세포의 세포 상해 활성을 나타낸다.세포 상해성은 Molt-4 T 림프종 (1×104: 좌측 패널)과 K562 골수성 백혈병 (1×104: 우측 패널)의 세포에 대하여51Cr 방출에 의해 측정되었다.
도 5는 IL2와 α-GalCer에 응답하여 증폭된 PBMC와 G-PBSC로부터의 Vα24+NKT 세포수의 변화를 나타낸다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 증폭 방법 및 제조 방법은, G-CSF에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻을 수 있는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)을 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 한다.
G-PBSC는 예를 들면 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
암 환자에게 G-CSF 2-16 ㎍/kg/day를 5 내지 10일간 피하 투여하면, 투여 후 대략 4일부터 말초혈 중에서 조혈 줄기세포의 지표인 CD34+세포와 CFU-GM (콜로니 형성 유닛 - 과립구 대식세포: Colony-forming unit-granulocyte macrophage)의 수가 증가하여 각각 5일 내지 6일째에 최고치를 나타낸다. 따라서, G-CSF 투여 개시부터 4일째 내지 12일째에 말초혈 간세포 채취 (어페리시스)에 의해 말초혈 간세포 (PBSC)를 포함하는 세포 분획 (조 G-PBSC)을 채취한다. 또한, 밀도 구배 등의 방법을 이용함으로써 단핵 세포 분획 (G-PBSC)을 제조한다. 건강한 사람으로부터도동일한 방법으로 G-PBSC를 제조할 수 있다.
말초혈로부터 얻어지는 단핵 세포의 분획에는, 주로 단핵구나 림프구 (T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포) 등의 단핵 세포와 과립구가 포함되어 있으며, 적혈구, 혈소판 등은 제거되어 있다.
일반적으로 건강한 사람의 말초혈 중의 조혈 줄기세포는 0.02 ％ 정도이다. 이에 대하여 G-CSF 투여에 의해 동원된 건강한 사람의 말초혈 중에서는 0.5 내지 1 ％ 정도로 증가되며, 화학 요법 후에 G-CSF 투여에 의해 동원된 암 환자의 말초혈 중에서는 2 내지 7 ％ 정도로 증가된다. 따라서, G-CSF에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 말초혈로부터 얻어지는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)에는, G-CSF에 의해 동원되지 않은 말초혈로부터 얻어지는 단핵 세포 분획 (PBMC)에 비해 조혈 줄기세포가 많이 포함되게 된다.
배양은 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer를 배지에 첨가하는 것 외에는 PBSC의 통상의 배양 조건으로 행할 수 있다. 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer의 첨가량 및 배양 시간은, Vα24+NKT 세포가 증폭되는 데 충분한 정도면 되며, 통상적으로 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인의 종류에 따라 상이하지만, 사이토카인의 농도가 50 내지 200 U/㎖, α-GlyCer의 농도가 10 내지 200 ng/㎖, 배양 시간이 2 내지 40일이다. Vα24+NKT 세포의 증폭은 형광 항체 염색된 세포를 유세포 분석법에 의해 분석함으로써 측정할 수 있다.
α-GlyCer는 갈락토스, 글루코스 등의 당류와 세라마이드가 α 결합된 스핀고 당지질이며, W0 93/05055 (1993년 3월 18일 공개), W0 94/02168 (1994년 2월 3일 공개), W0 94/09020 (1994년 4월 28일 공개), W0 94/24142 (1994년 10월 27일 공개), 및 W0 98/44928 (1998년 10월 15일 공개)에 개시되어 있는 것을 들 수 있다. 그 중에서도 (2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-2-헥사코사노일-2-아미노 -1,3,4-옥타데칸트리올이 바람직하다.
림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인으로서는 IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18 등을 들 수 있다. 이 사이토카인은 1종을 사용할 수도 있고, 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있다. 그 중, IL-2를 포함하는 것, 즉 IL-2 또는 IL-2와 그 밖의 사이토카인의 조합인 것이 바람직하다.
배양에 사용하는 배지로서는, 예를 들면 2 mM 글루타민, 1 ％ 피루브산, 2 ％ 중탄산염, 100 U/㎖ 페니실린, 100 U/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 RPMI-1640에 10 ％ FCS (소태아 혈청)를 첨가한 것을 들 수 있다.
G-CSF에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻어진 단핵 세포 분획 (G-PBSC)을 상기와 같이 배양함으로써, G-CSF에 의해 동원되지 않은 PBMC를 동일하게 배양하는 경우에 비해 Vα24+NKT 세포수가 현저하게 증가된다.
LAK 세포나 TIL을 이용한 과거의 임상 연구에서는 1×1010-11의 이펙터 세포가 환자에게 투여된 반면, 본 발명에 따르면 예를 들어 G-CSF에 의해 동원된 말초혈로부터 평균적으로 8~40×109의 단핵 세포 (MNC)가 수집되며, 이것을 IL-2와 α-GlyCer를 사용하여 12일간 배양함으로써 1×109-10의 자가(autologous) Vα24+NKT 세포를 얻을 수 있다. 이것은 이전에 행해진 임상 연구에 상당하는 것이며, 또한 면역 요법에 임상적으로 사용하기에 충분한 수이다.
따라서, 본 발명의 증폭 방법에 따르면, 많은 종류의 종양을 죽이는 기능이 알려져 있는 Vα24+NKT 세포를 실용적인 수준까지 효율적으로 증식시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획은 면역 반응을 강력하게 야기하는 것이다.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 바람직하게는 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer의 존재하에서의 배양 후, 종양 항원의 존재하에서의 배양이 더 행해진다.
종양 항원의 존재하에서의 배양은, 종양 항원을 배지에 첨가하는 것 외에는 PBSC의 통상의 배양 조건으로 행할 수 있다. 종양 항원의 첨가량 및 배양 시간은, 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer의 존재하에서의 배양으로 얻어진 세포 분획에 포함된 DC가 CTL을 유도하는 데 충분한 정도면 되며, 통상적으로는 종양 항원의 종류에 따라 상이하지만, 종양 항원의 농도가 10 내지 10000 ㎍/㎖, 배양 시간이 2 내지 14일이다. CTL의 유도는 빈도 분석 (Sharrock CE 등: Immunology Toda 11: 281-286, 1990)이나 ELISP0T법 (Pass H 등: Cancer J Sci Am 4: 316-323, 1998), 테트라머법 (Romero P 등, J Exp Med 188: 1641-1650, 1998) 등에 의해 측정할 수 있다.
종양 항원의 존재하에서의 배양에 의해, 세포 분획 중에 CTL이 유도되기 때문에 이 세포 분획은 종양 항원에 특이적인 면역 반응도 야기시킬 수 있다.
배양된 세포로부터의 Vα24+NKT 세포의 단리는, 자기 비드법 등의 공지된 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 암 치료제는, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포 또는 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획을 유효 성분으로 한다.
본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포는, 종양 항원에 비특이적인 면역 반응을 강력하게 야기하여 종양 세포를 제거할 것으로 기대된다.
본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획은, G-CSF에 의해 동원되지 않은 PBMC를 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer의 존재하에서 배양함으로써 얻어진 세포 분획에 비해 NKT 세포의 증폭이 장기적으로 지속된다.
또한, 종양 항원의 존재하에서의 배양을 더 행하여 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획은, 분획 중의 DC에 의한 CTL의 유도에 의해 종양 항원 특이적인 면역 반응도 야기시킨다. 즉, 인간 Vα24+NKT 세포의 증폭에 의한 종양 항원 비특이적인 면역 반응과, 종양 항원 특이적인 면역 반응을 모두 강력하게 야기시킨다. 종양 세포의 주요 조직 적합 항원(MHC)의 발현 수준은 종양 조직부위 (즉, 종양 세포)에 따라 상이한 것으로 보고되어 있으며, 상기 두가지 면역 반응을 야기시킴으로써 MHC를 발현하는 종양 세포에 대해서는 종양 항원 특이적인 CTL에 의한 공격과, MHC의 발현 수준이 낮거나 또는 MHC를 발현하지 않는 종양 세포에 대해서는 종양 항원 비특이적인 NKT 세포에 의한 공격을 기대할 수 있기 때문에, 이 태양의 세포 분획은 특히 암 치료에 사용하는 데 유리하다.
따라서, 본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포 또는 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획은, 암 치료제의 유효 성분으로서 유리하다.
본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포는, 다른 세포군으로부터 별도로 단리되며 종양 항원으로 처리함으로써 활성화된 DC와 조합시켜 암 치료 등의 세포 의료에 이용할 수 있다. 활성화된 DC는 PBSC에 포함된 단핵구를 GM-CSF와 IL-4나 IL-3으로 처리하는 방법 및 PBSC에 포함된 CD34 양성 조혈 줄기세포를 GM-CSF나 IFNα로 처리하는 방법으로 얻을 수도 있다.
본 발명의 암 치료제의 투여 방법으로서는 정맥내, 피하, 피내, 림프절내 투여를 고려할 수 있다. 제제 형태로서는 생리 식염수나 각종 링거액 등의 현탁액을 들 수 있다. 투여량은 투여 경로에 따라 상이하여 피하의 경우에는 0.1 ㎖ 내지 5 ㎖, 정맥내의 경우에는 300 ㎖ 정도까지 투여가 가능하다. Vα24+NKT 세포수 환산의 투여량은 통상적으로는 체표면적(m2) 당 105내지 1010개이다. 대상 질환으로서는 다발성 골수종, 림프종, 백혈병에서부터 유방암, 대장암, 폐암, 전립선암, 흑색종, 신장암, 간장암, 췌장암 등을 들 수 있다. 또한, CML, HIV 등의 바이러스성 질환에 대해서도 응용할 수 있다.
본 발명에 따르면, α-GlyCer을 이용하여 대량의 자가 Vα24+NKT 세포를 체외에서 생성할 수 있다. 그 세포수는 임상에서 사용하는 데 충분히 높으며, 또한 그 배양된 Vα24+NKT 세포는 MHC의 발현 유무에 상관없이 종양에 대하여 강한 살종양 활성을 나타낸다. 본 발명에서 G-PBSC는 PBMC에 비해 시험관 내에서의 α-GlyCer의 자극에 의해 매우 효과적으로 인간 Vα24+NKT 세포의 증폭을 나타낸다. 또한, G-PBSC는 건강한 사람에게서 유래되었어도, 또는 암 환자에게서 유래되었어도 동일한 정도로 증폭된다.
본 발명은 충분한 수의 Vα24+NKT 세포를 얻는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 세포를 이용하는 질환의 치료법인 세포 의료에 사용하기에 적합한 Vα24+NKT 세포 및 그 세포를 포함하는 세포 분획을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 말초혈로부터 얻어지는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)으로부터, α-GlyCer를 이용하여 충분한 수의 Vα24+NKT 세포를 얻는 방법을 발견하였다.
단핵 세포 분획에는 DC 및 T 세포, 단핵구, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 과립구 등이 포함되어 있다. 이 분획에 α-GlyCer를 작용시키면 DC의 CD1d 분자에α-GlyCer가 제시되며, 나아가 사이토카인의 분비에 의해 Vα24+NKT 세포, NK 세포 등의 증식이 일어난다. 이 단핵 세포 분획을 G-CSF에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 말초혈로부터 얻는 경우에는 보다 효율적으로 NKT 세포가 증식되며, 단핵 세포 분획의 면역 반응이 강력히 야기되는 것이 판명되었다. 또한, G-CSF에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 말초혈로부터 얻어지는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)으로부터 IL-2와 α-GlyCer의 존재하에서 배양시킴으로써 발생하는 NKT 세포의 증폭은, G-CSF에 의해 동원되지 않은 말초혈로부터 얻어지는 단핵 세포 분획 (PBMC)의 경우와 비교하여, 그 효과가 장기적으로 지속되는 것이 판명되었다.
본 발명은 상기 사실에 기초하여 이루어진 것으로, 이하의 증폭 방법 및 제조 방법 (이 방법에 의해 얻어지는 세포 및 세포 분획을 포함함) 및 암 치료제를 제공한다.
(1) G-CSF에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻을 수 있는 단핵 세포 분획(G-PBSC)을 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer의 존재하에서 배양하는 것을 포함하는, 인간 Vα24+NKT 세포의 증폭 방법.
(2) 상기 항목 (1)에 있어서, 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인이 IL-2를 포함하는 증폭 방법.
(3) G-CSF에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻을 수 있는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)을 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer의 존재하에서 배양하고, 배양된 세포로부터 인간 Vα24+NKT 세포를 단리하는 것을 포함하는, 인간 Vα24+NKT 세포의 제조 방법.
(4) 상기 항목 (3)에 있어서, 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인이 IL-2를 포함하는 제조 방법.
(5) G-CSF에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻을 수 있는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)을 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-GlyCer의 존재하에서 배양하는 것을 포함하는, 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획의 제조 방법.
(6) 상기 항목 (5)에 있어서, IL-2 및 α-GlyCer의 존재하에서의 배양으로 얻어진 세포를 종양 항원의 존재하에서 더 배양하는 것을 포함하는 제조 방법.
(7) 상기 항목 (5) 또는 (6)에 있어서, 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인이 IL-2를 포함하는 제조 방법.
(8) 상기 항목 (3) 또는 (4)에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포를 유효 성분으로 포함하는 암 치료제.
(9) 상기 항목 (5) 내지 (7) 중 어느 한 항목에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획을 유효 성분으로 포함하는 암 치료제.
또한, 본 발명은 상기 항목 (3) 또는 (4)에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포 또는 상기 항목 (5) 내지 (7) 중 어느 한 항목에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획을 유효량으로 암 치료의 필요가 있는 대상에 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 항목 (3) 또는 (4)에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포 또는 상기 항목 (5) 내지 (7) 중 어느 한 항목에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+NKT 세포를 포함하는 세포 분획의, 암 치료제의 제조에서의 용도를 제공한다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
<실시예 1> 인간 Vα24+NKT 세포의 증폭
(1) PBMC의 제조와 G-PBSC의 제조
건강한 사람으로부터 채취한 400 ㎖의 전혈로 제조된 버피 코트(조 PBMC)는 일본 적십자사로부터 공급되었다. 한편, 화학 요법 후, G-CSF를 100-250 ㎍/body/day의 용량으로 피하에 6 내지 10일간 투여한 환자 (표 1)로부터 최후의 G-CSF 투여 후 2 내지 24시간 이내에 코베 스펙트라 세포 분리기 (COBE SpectraTMCell Separator: LAKE WOOD, CO USA 80215)를 이용한 어페리시스를 실시함으로써, PBSC를 포함하는 세포 분획 (조 G-PBSC)을 채취하였다 (Hematopoietic Stem Cells: Biology and Therapeutic Applications. Levit DJ, Mertelsmann R(eds), Marcel Dekker, Inc., New York, 1995, 611-630).
이렇게 해서 얻어진 조 PBMC 및 조 G-PBSC로부터 림포-세팔 (Lympho-sepal) 밀도 구배 매체 (Immuno-Biological Laboratories Gunma, Japan)를 사용하여 각각의 단핵 세포 분획 (각각 PBMC, G-PBSC라고 함)을 제조하였다.
(2) 시험관 내의 Vα24+NKT 세포의 활성화와 증폭
(1)에서 얻어진 PBMC 및 G-PBSC는 100 U/㎖ IL-2와 100 ng/㎖의 α-GlyCer의 존재하에서 RPMI-1640에 2 mM L-글루타민, 1 ％ 피루브산, 2 ％ 중탄산, 100 U/㎖ 페니실린, 100 U/㎖ 스트렙토마이신 (GIBCO BRL)을 보충 첨가하여 배양하였다. 세포는 5 ％ C02가스, 37 ℃에서 수증기 포화하에서 배양하였다. 배양 세포의 수와 특징은 0일째(d0)와 12일째(d12)에 검토하였다. α-GlyCer로서는 기린 비어 가부시끼 가이샤에 의해 제조된 (2S,3S,4R)-1-O-(α-D-갈락토피라노실)-N-헥사코사노일-2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올 (이하, α-GalCer이라고 함)을 사용하였다.
배양 세포의 유세포 분석은 FACScan 세포분석기 (Becton Dickinson, Sunyvale, CA)를 이용하여 이하와 같이 행하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 결합 항Vα24 항체(C15), 피코에리트린(PE) 결합 항Vβ11 항체(C21), PE 결합 항CD3 항체, PE 결합 항CD56 항체, PE 결합 CD83 항체 및 PE 결합 CD8 항체는 이뮤노테크 (Immunotech: Marseilelles Cedex, France)에서 구입하였다. FITC 결합 PE 결합 항CD161 항체, PE 결합 항IL-2Rβ, PE 결합 항HLA-DR 항체 및 PE 결합 항CD4 항체는 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson)에서 구입하였다. PE 결합 항CD86 항체는 파밍젠 (Pharmingen: SanDiego, CA)으로부터 구입하였다. PE 결합 항CD57 항체는 SIGMA (Saint Loius, Missouri)로부터 구입하여 이소타입의 대조군으로 사용하였다. 배양 세포는 수확하여 10 ％ 소태아 혈청(FCS)-RPMI1640 배지에 1×105/㎖의 농도로 현탁하였다. 고속 냉각 마이크로 원심기 MRX-150 (TOMY SEIKO Co., Ltd, Tokyo, Japan)을 사용하여 2000 rpm으로 3분간 원심한 후, 세포를 상기 항체를 1 ㎕ 포함하는 50 ㎕의 PBS에 재현탁하고, 4 ℃에서 30분간 배양하였다. 세포는 PBS로 2회 세정하고, 다시 PBS로 현탁하여 4 ℃에서 분석시까지 보존하였다. 데이타는 FSC, SSC, Vα24 또는 CD4를 나타내는 FL-1, 및 Vβ11, CD8, CD3을 나타내는 FL-2로 표시하였다.
0일째와 12일째 사이의 Vα24+NKT 세포의 변화를 도 1에 나타내었다. IL-2와 α-GalCer에서의 처리에 의해 PBMC 유래의 Vα24+NKT 세포가 증식되었다. 5명의 다른 공여자로부터의 PBMC의 일련의 데이타를 표 2에 나타내었다. 0일째에서는 Vα24+NKT 세포가 전체 세포수의 0.03 내지 0.14 ％였다. 12일째의 Vα24+NKT 세포는 1.4배에서 6.1배로 증가하였다. 한편, G-PBSC 유래의 Vα24+NKT 세포는 12일째에 32배에서 1414배까지 증가하였다 (도 1, 표 3). 이 증폭은 PBMC에서 관찰된 것과 비교하여 적어도 10배 높았다 (도 2). 도 3은 12일째의 G-PBSC의 Vα24+NKT 세포의 표현형을 나타낸다. 이 세포의 98 ％는 TCRVβ11을 발현하고, 73.33 ％는 CD4 또는 CD8을 발현한다. 한편, Vα24+NKT 세포의 5 ％ 이하의 세포는 CD57, CD83, IL-2Rβ, HLA-DR를 각각 발현하였다 (도 3). 또한, PBMC로부터 파생된 Vα24+NKT 세포의 수는 12일째 후에 서서히 감소하였지만, G-PBSC로부터 파생된 Vα24+NKT 세포는 30일 배양에서도 증폭이 지속되었다 (도 5).
또한, 건강한 사람으로부터의 G-PBSC를 사용해도, 암 환자로부터의 G-PBSC와 동일한 정도로 증폭되는 것이 확인되었다.
상기의 결과로부터 명확한 바와 같이, G-PBSC를 사용함으로써 단시간의 배양으로 적어도 108의 Vα24+NKT 세포의 생산이 가능하였다.
<실시예 2> 인간 Vα24+NKT 세포의 인간 종양 세포에 대한 세포 상해 활성의 평가
배양 12일째에 배양 세포로부터 FACS 밴티지 세포 분류계 (FACS Vantagecell sorting system)에 의해 인간 Vα24+NKT 세포를 정제하고, 종양 세포에 대한 세포 상해 활성과 사이토카인 생산능에 대하여 평가하였다.
α-GalCer에 의해 활성화된 Vα24+NKT 세포의 세포 상해 활성은, Molt-4T 림프종 및 K562 백혈병의 종양 세포주 (ATCC, Pockville, MD)를 사용하여 3회 연속으로 실험하였다. 표적 세포는 1×106세포당 100 μCi 크롬산 나트륨 (NEN Life Science Products, Inc., Boston MA02118)으로 1시간 표지화하였다. 정제된 Vα24+NKT 세포와 Vα24-NKT 세포는 이펙터 세포로서 사용하여, 96웰의 둥근 바닥 플레이트에 소정의 이펙터(E)/표적(T)비로 각각의51Cr 표지된 표적 세포 상에 뿌렸다. 표적 세포가 용해되어 얻어진 방사 활성은 37 ℃에서 6시간 CO2배양기에서 배양한 후, γ 카운터로 계측하였다. 특이적 용해 반응의 비율(％)은, {(샘플 cpm - 백그라운드 cpm)/(최대 cpm - 백그라운드 cpm)} ×100으로 계산하였다. 백그라운드의 값은 표적 세포 단독에서의 상청액으로부터 계산되었다. 최대치는 표적 세포에 1 M HCl를 첨가함으로써 얻어졌다. 데이타는 3회 연속 실험의 평균치와 표준 편차를 나타내었다 (도 4).
배양 세포의 78 ％ 이상은 비변이의 Vα24+/Vβ11+TCR을 발현하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이 이들 세포는 K562나 Molt-4의 암 세포에 대하여 강력한 세포 상해 활성을 나타내었다.
CD14+세포를 단핵구 분획으로부터 자기 비드에 의한 분리에 의해 수득하였다. 단핵구 유래 DC를 얻기 위해 이들 세포는 2 mM L-글루타민, 1 ％ 피루브산, 2 ％ 중탄산염, 100 U/㎖ 페니실린, 100 U/㎖ 스트렙토마이신 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)과 10 ％ FCS (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.)를 보충한 RPMI-1640 배지에서 50 ng/㎖의 재조합 인간 (rh)GM-CSF, 1000 U/㎖ rhIL-4 및 50 U/㎖ rhTNFα (SIGMA, St Louis, MO)의 존재하에서 배양하였다. 세포는 5 ％ C02가스, 37 ℃에서 수증기 포화하에서 배양하였다. 분류된 Vα24+NKT 세포는 동일한 공여자로부터 얻어진 단핵구 유래의 DC와 24시간 공배양하였다. 배양 상청액 중의 IFN-γ와 IL-4는 ELISA법 (DIACLONE, BESANCON, FRANCE)에 의해 측정하였다.
자기 단핵구 유래 DC 세포의 존재하에서의 Vα24+NKT 세포의 사이토카인의 분비는 ELISA법으로 48시간 후에 측정되었다. Vα24+NKT 세포의 IFN-γ의 분비는 확인되었지만, IL-4의 분비는 확인되지 않았다.
본 발명에 따르면, 단시간의 배양으로 다량의 Vα24+NKT 세포의 생산이 가능해진다. 또한, Vα24+NKT 세포가 증폭된 세포 분획을 얻을 수 있게 되며, 이 분획 전체를 사용함으로써 종래의 세포 의료에서는 기대하지 못했던 보다 광범위한 면역 반응이 야기되는 세포 의료가 기대된다.
Claims (9)
- 과립구 콜로니 자극 인자에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻을 수 있는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)을 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-글리코실세라마이드 (α-GlyCer)의 존재하에서 배양하는 것을 포함하는, 인간 Vα24+내츄럴 킬러 T 세포의 증폭 방법.
- 제1항에 있어서, 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인이 인터루킨 2를 포함하는 증폭 방법.
- 과립구 콜로니 자극 인자에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻을 수 있는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)을 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-글리코실세라마이드의 존재하에서 배양하고, 배양된 세포로부터 인간 Vα24+내츄럴 킬러 T 세포를 단리하는 것을 포함하는, 인간 Vα24+내츄럴 킬러 T 세포의 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인이 인터루킨 2를 포함하는 제조 방법.
- 과립구 콜로니 자극 인자에 의해 조혈 줄기세포가 동원된 인간 말초혈로부터 얻을 수 있는 단핵 세포 분획 (G-PBSC)을 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-글리코실세라마이드의 존재하에서 배양하는 것을 포함하는, 인간 Vα24+내츄럴 킬러 T 세포를 포함하는 세포 분획의 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인 및 α-글리코실세라마이드의 존재하에서의 배양으로 얻어진 세포를 종양 항원의 존재하에서 더 배양하는 것을 포함하는 제조 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 림프구의 증식 및(또는) 활성화 작용을 갖는 사이토카인이 인터루킨 2를 포함하는 제조 방법.
- 제3항 또는 제4항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+내츄럴 킬러 T 세포를 유효 성분으로 포함하는 암 치료제.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 Vα24+내츄럴 킬러 T 세포를 포함하는 세포 분획을 유효 성분으로 포함하는 암 치료제.
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