KR20220036287A - 고순도 및 고효율의 자연살해세포 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고순도 및 고효율의 자연살해세포(Natural Killer cells; NK cells) 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 NK세포의 증식 및 활성 증진용 조성물, 및 상기 증식 및 활성이 증진된 NK세포의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NK 세포의 제조기술은 고순도 및 고효율의 NK 세포를 수득할 수 있으며, 방사선 조사된 암세포를 지지세포로 이용하는 종래 기술에 의한 한계점을 극복할 수 있는바, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포는 높은 순도 및 우수한 암세포 살상능력을 바탕으로 암, 자가면역질환 등의 관련 질환의 치료 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 고순도 및 고효율의 자연살해세포(Natural Killer cells; NK cells) 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 NK 세포의 증식 및 활성 증진용 조성물, 및 상기 증식 및 활성이 증진된 NK 세포의 제조방법에 관한 것이다.
암환자에서 항암제를 이용한 치료 과정에는 환자의 면역세포가 감소해 면역기능이 저하되는 부작용이 있다. 따라서 체외에서 증식 및 활성화시킨 면역세포를 환자의 체내에 이식해 감소된 면역세포의 수와 기능을 활성화 시켜주는 치료 기술은 기존의 항암치료법과 병행 시 시너지 효과를 기대할 수 있고, 기존 항암 치료 후 잔존 암 및 미세잔존 암에 대한 제거 효과가 있기 때문에 암의 재발을 방지할 수 있다.
면역세포치료법에 이용되고 있는 자연살해세포(Natural Killer cells; NK cells)는 형태학적으로 세포질에 큰 과립을 가지는 세포로, 혈액 내 림프구의 약 5~15%를 차지한다. NK 세포는 T 세포나 B 세포처럼 림프구 전구세포(common lymphoid progenitor)로부터 분화되며, 종양세포나 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 역할을 수행하는 세포독성 림프구(cytotoxic lymphocyte)이다. 그러나 NK 세포는 기존 B세포, T세포 및 수지상세포(Dendritic cells; DC cells)와는 차별적으로 항원 제시와 같은 활성화 과정 없이 스스로 암세포를 인식할 수 있고, 그랜자임(granzyme) 및 퍼포린(perforin) 등의 효소를 이용해 직접적으로 암세포를 살상할 수 있다. 이러한 NK 세포의 분화와 활성에서의 결함은 유방암, 흑색종암, 폐암 등 다양한 암종과 관련되어 있음이 보고되어 있으며, NK 세포의 우수한 살상 능력은 고형암 및 감염성 질환의 치료 및 골수나 장기이식에 대한 거부반응 방지를 위한 새로운 면역세포치료법에 응용될 수 있다.
그러나 NK 세포는 상기와 같은 다양한 질환에 대한 치료제로써의 가능성에도 불구하고 체내에 존재하는 세포 수가 많지 않아 세포치료에 효과적으로 이용하기 위해서는 많은 수의 NK 세포를 확보하는 것이 무엇보다 중요하다. 그러나 NK 세포는 정상인에서의 세포 수도 적을뿐더러 특히 암환자에서는 NK 세포의 수, 분화 및 기능이 저하되어 있어 치료제로의 이용을 위한 충분한 세포 수의 확보가 어려우며, 시험관 내(in vitro)에서 대량 증식 및 배양이 용이하지 않다.
이러한 측면에서, NK 세포를 실제 유용한 수준으로 증폭 및 활성화시키기 위한 배양 기술에 대한 다양한 연구가 이루어져 왔다. 예컨대, 종래에 IL-2 또는 그 밖의 사이토카인 및 화합물(chemical)을 이용한 NK 세포 배양 기술은 초기 대비 NK 세포 수를 비약적으로 증가시키지 못한 것으로 보고되었고, 지지세포를 이용한 배양 기술로써 방사선 조사한 암세포, MICA, 4-1BBL, 및 IL-15를 발현하도록 형질전환된 K562 세포 등을 이용해 NK 세포의 증식을 효과적으로 향상시킨 결과들이 보고되었으나(Tissue Antigens, 76(6): p467-475, 2010), 이러한 기술은 모두 암세포를 이용한 것으로 상기 암세포가 세포치료제 제제에 혼합될 가능성 등 임상 적용에 있어서 중요한 안전성을 보장하기에 적합하지 않은 방법을 사용하였다는 점에서 한계를 가진다.
따라서 이러한 종래 문제점을 극복할 수 있으면서 충분한 암세포 살상능을 유지하는 NK 세포의 다량 확보를 위한, 고순도 및 고효율의 NK 세포를 수득할 수 있는 방법이 절실히 요구된다.
본 발명자들은 상기 종래 문제점을 극복하고 고순도 및 고효율의 NK 세포를 수득할 수 있는 최적화된 NK 세포의 제조기술을 확립하기 위해 예의 연구한 결과, 혈액 내 NK 세포를 활성화 및 증식을 목적으로 하는 배양을 구분하는 공정을 포함하며, 암세포 등의 지지세포의 이용 없이 CD 항체 및 사이토카인의 첨가만으로 증식 및 활성이 현저히 증진된 NK 세포의 제조방법을 개발하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 자연살해세포(NK 세포)의 증식 및 활성 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 증식 및 활성이 증진된 자연살해세포(NK 세포)의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인터루킨-2(Interleukin-2), 인터루킨-12(Interleukin-12) 및 항-CD16 항체를 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포(Natural killer cells)의 증식 및 활성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 조성물은 인터루킨-15(Interleukin-15), 인터루킨-18(Interleukin-18), 항-CD3 항체 및 항-CD56 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 자가혈청을 더 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계; (b) 항-CD3 항체, 항-CD16 항체 및 항-CD56 항체로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이 코팅된 배양 플라스크에 상기 단핵구 및 배양액을 넣은 후 5 내지 7일 동안 1차 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포를 회수하고 배양액과 함께 5 내지 7일 동안 2차 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포(Natural killer cells)의 제조방법으로서, 상기 배양액은 인터루킨-2(Interleukin-2), 인터루킨-12(Interleukin-12), 인터루킨-15(Interleukin-15) 및 인터루킨-18(Interleukin-18)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상, 및 자가혈청을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 자가혈청은 5 내지 15%로 첨가되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 자연살해세포(Natural killer cells)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명에 따른 NK 세포의 제조기술은 NK 세포의 증식 및 활성을 현저히 향상시켜 고순도 및 고효율의 NK 세포를 수득할 수 있으며, 암세포를 지지세포로 이용하는 종래 기술의 한계점을 극복할 수 있는바, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포는 높은 순도 및 우수한 암세포 살상능력을 바탕으로 암, 감염질환, 자가면역질환 등 다양한 관련 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 NK 세포 제조공정에서 1차 활성화 배양 및 2차 증식 배양 후 얻어진 배양물에 대하여 NK 세포가 차지하는 비율을 알아보기 위해 FACS 분석을 실시한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 NK 세포 제조공정에서 1차 활성화 배양 및 2차 증식 배양 후 얻어진 NK 세포의 암세포 살상률을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 NK 세포 제조공정에서 1차 활성화 배양 및 2차 증식 배양 과정에서 활성화된 NK 세포의 현미경 이미지 사진을 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 NK 세포 제조공정에서 1차 활성화 배양 및 2차 증식 배양 후 얻어진 NK 세포의 암세포 살상률을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 NK 세포 제조공정에서 1차 활성화 배양 및 2차 증식 배양 과정에서 활성화된 NK 세포의 현미경 이미지 사진을 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 상기 종래 NK 세포 제조기술의 한계점을 극복하고 고순도 및 고효율의 NK 세포를 수득할 수 있는 최적화된 NK 세포의 제조방법을 확립하기 위해 예의 연구한 결과, CD 항체 및 사이토카인의 첨가만으로 증식 및 활성이 증진된 NK 세포를 제조할 수 있는 방법을 개발하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 인터루킨-2(Interleukin-2), 인터루킨-12(Interleukin-12) 및 항-CD16 항체를 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포(Natural killer cells)의 증식 및 활성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “세포 증식”은 세포가 일련의 세포분열 단계를 거쳐 배양물 내 세포의 수가 증가하거나 또는 분화하는 것을 의미한다. 본 발명에서 “자연살해세포(NK 세포)의 증식”은 NK 세포가 세포분열 단계를 거쳐 배양물에서 NK 세포의 수가 증가하거나 미성숙 혈액세포에서 NK 세포로의 분화에 의해 세포 수가 증가하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “자연살해세포(NK 세포)의 활성 증진”은 미성숙 상태의 NK 세포가 성숙한 NK 세포로 되거나 비활성 상태의 NK 세포가 활성화 됨으로써 배양물 내 종양세포나 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 세포 살상능을 갖는 세포의 수가 증가하거나, 개별 NK 세포가 갖는 세포 살상 효율이 증진되는 것을 모두 포함한다.
본원발명에서 상기 증식 및 활성 증진의 원료가되는 NK 세포는 상업적으로 구입하거나, 인간 또는 동물로부터 채취할 수 있으며, 바람직하게는 NK 세포에 의한 치료를 필요로 하는 인간으로부터 공급된 것일 수 있다.
또한 상기 NK 세포는 생체 내 임의의 조직 공급원에서 분리될 수 있는데, 바람직하게는 생체로부터 채취된 혈액 중에 포함된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 전혈, 제대혈, 골수 또는 말초혈액일 수 있으며, 가장 바람직하게는 말초혈액으로부터 분리될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 인터루킨-15(Interleukin-15), 인터루킨-18(Interleukin-18), 항-CD3 항체 및 항-CD56 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 사이토카인은 인터루킨 종류로서, 인터루킨은 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질을 총칭하는 것이다. 본 발명에 있어서, 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15) 및 인터루킨-18(IL-18)로 이루어진 군에서 선택되는 것으로, 특히 IL-2 및 IL-12를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 IL-2, IL-12, IL-15 및 IL-18을 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항-CD 항체는 항-CD16 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD56 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것으로, 특히 항-CD16 항체를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 항-CD16 항체, 항-CD3 항체 및 항-CD56 항체를 모두 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 NK 세포의 증식 및 활성 증진용 조성물은 상기 인터루킨 및 항-CD 항체 이외에, NK 세포의 증식 및 활성 증진을 위해 자가혈청을 비롯하여 다른 필수 성분 또는 기타 담체, 또는 보조체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계; (b) 항-CD3 항체, 항-CD16 항체 및 항-CD56 항체로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이 코팅된 배양 플라스크에 상기 단핵구 및 배양액을 넣은 후 5 내지 7일 동안 1차 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양된 세포를 회수하고 배양액과 함께 5 내지 7일 동안 2차 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포(Natural killer cells)의 제조방법으로서, 상기 배양액은 인터루킨-2(Interleukin-2), 인터루킨-12(Interleukin-12), 인터루킨-15(Interleukin-15) 및 인터루킨-18(Interleukin-18)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상, 및 자가혈청을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 단계 (a)에서, 상기 말초혈액 단핵구(PBMC)는 포유동물, 바람직하게는 인간의 말초혈액으로부터 분리된 것으로, 주로 B 세포, T 세포, 자연살해세포와 같은 면역세포, 및 호염구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구 등을 포함한다. 상기 PBMC는 생체에서 채취된 말초혈액으로부터 통상의 방법에 의해 준비될 수 있다. 예컨대, 본 발명에서는 피콜(Ficoll)을 이용한 비중 원심분리법을 이용하여 말초혈액으로부터 분리하였다.
또한, 상기 말초혈액 단핵구는 치료를 필요로 하는 개체로부터 얻어지는 것, 즉 자가(autologous) 말초혈액 단핵구일 수 있다. 상기 말초혈액 단핵구가 자가 유래일 경우, 증식된 NK 세포 집단에서 일부 T 세포가 존재하더라도, 모든 세포가 환자 본인 유래이기 때문에 T 세포를 제거할 필요가 없다는 장점이 있다.
본 발명의 상기 단계 (b)는 말초혈액 단핵구 내 NK 세포를 활성화시키기 위한 배양 단계이다.
본 발명의 상기 단계 (b)에서, 상기 항-CD 항체를 배양플라스크에 코팅하는 방법은 DPBS와 상기 항-CD3 항체, 항-CD16 항체 및 항-CD56 항체를 혼합한 코팅액을 배양 플라스크에 넣고 고루 분산시킨 후 37℃에서 2시간 내지 6시간, 바람직하게는 4시간, 또는 냉장 조건에서 16시간 내지 24시간, 바람직하게는 18시간 동안 정치하고 이후 세척하여 코팅액을 제거하는 과정을 통해 수행될 수 있다.
상기 코팅된 배양 플라스크에 단계 (a)에서 분리한 단핵구 및 배양액을 넣은 후 5 내지 7일 동안 배양할 수 있고, 바람직하게는 6일 동안 배양할 수 있으나, 당업자가 원하는 NK 세포의 수득을 위해 상기 배양일 수 범위 내에서 적절히 설정할 수 있다. 접종 세포 수는 T75 플라스크를 기준으로 1 x 106 cells 이상의 세포를 접종하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 단계 (b)의 1차 배양 진행 결과, 세포 수의 증가, 최소 87.6% 이상의 높은 세포 생존율을 확인하였고, NK 세포의 비율이 평균 13.9%에서 47.1%로 증가하였으며 활성화 배양기간이 1일 늘어날 경우 NK 세포의 비율이 평균적으로 15% 증가함을 확인하였다.
본 발명의 상기 단계 (c)는 NK 세포의 수를 현저히 증가시키기 위한 증식 배양 단계이다.
본 발명의 상기 단계 (c)는, 상기 단계 (b)를 통해 배양된 세포들을 회수하고 단계 (b)에서와 동일한 조성의 배양액을 이용해 5 내지 7일 동안 배양함으로써 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 6일 동안 배양할 수 있으나, 당업자가 원하는 NK 세포의 수득을 위해 상기 배양일 수 범위 내에서 적절히 설정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 단계 (c)의 2차 배양 진행 결과, 수득된 약 3 x 109개 세포 중 NK 세포가 94.42%의 매우 높은 비율을 차지하며 93.2%의 높은 생존율을 보임을 확인하였고, 흉선종세포주인 K562 세포에 대하여 평균 70%의 암세포 살상률을 보임을 확인하였다.
상기 단계 (b) 및 단계 (c)에서, 배양 조건은 통상의 세포배양 조건 즉, 약 37℃, CO2 배양기에서 수행될 수 있다. 배양 용기는 본 발명에서 배양 플라스크, 보다 바람직하게 T75 플라스크를 이용하였으나, 상업적으로 이용 가능한 배양 디쉬, 플라스크, 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 배양백에서 당업자가 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서, NK 세포의 제조를 위해 배양액에 첨가되는 기본 배지로는 RPMI1640 배지, CellGro 배지, AIM-V 배지 및 XVIVO 20과 같은 해당 기술분야에서 통상적으로 이용되는 동물세포 배양용 배지를 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 RPMI1640 배지를 이용하였으나, 배지의 종류는 당업자가 적절히 선택하여 응용할 수 있다. 또한, 상기 배양용 배지에는 필요에 따라 상기 기재된 첨가물질들 이외에 NK 세포의 증식 및 배양에 필요한 기타 성분이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양액에 추가로 첨가되는 자가혈청은 5 내지 15%로 첨가되는 것일 수 있고, 바람직하게는 7 내지 12 v/v%, 더욱 바람직하게는 9 내지 11 v/v%, 가장 바람직하게는 10 v/v%로 첨가될 수 있다.
본 발명은 실시예를 통해 PBMC와 비교하여 상기 NK 세포의 제조방법을 통해 고순도 및 고효율의 NK 세포를 수득할 수 있음을 구체적으로 입증하였다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 자연살해세포(Natural killer cells)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 세포치료제를 제공한다.
상기 암은 고형암 및 혈액암을 포함한 모든 종류의 암을 포함할 수 있다. 고형암이란 혈액암과는 달리 장기에서 덩어리를 이루어 형성된 암을 의미하며, 대부분의 장기에서 발생하는 암이 이에 해당된다. 본 발명에 따른 NK 세포를 이용하여 치료가능한 암종에는 특별한 제한은 없으며, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 감염성 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
상기 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다.
이러한 감염성 질환의 비제한적인 예로 B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus; HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환 및 인플루엔자 등이 포함될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 고순도 및 고효율의 NK 세포 제조방법
본 발명자들은 고순도 및 고효율의 NK 세포를 제조하기 위해 하기와 같은 과정에 따라 실험을 진행하였다.
1) 자가혈액의 채취
인체로부터 혈액을 채혈한 후 Sodium Heparin Tube와 Plain tube에 담아 혈액 분리를 준비하였다.
2) 배양 플라스크 코팅
50ml tube에 DPBS 13ml과 CD3, CD16 및 CD56 혼합물 1ml을 혼합하여 코팅액을 제조하였다. 이어서 상기 코팅액 14ml을 T75 플라스크에 넣고 전체 면적에 고루 분산시켰다. 이후 37℃에서 4시간 또는 냉장 상태에서 18시간 동안 정치한 후, 코팅액을 제거하고 DPBS 10ml을 넣어 1회 세척하여 준비하였다.
3) 혈청 준비
혈액 중 Plain tube의 혈액을 4℃에서 2000rpm으로 30분 동안 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후 상층액을 회수하고 0.2um membrane filter를 이용하여 여과시킨 다음 냉장보관하여 배양에 사용하였다.
4) 면역세포 분리
Heparin tube의 혈액을 BSC로 옮기고 50ml tube로 옮겨 총량을 확인한 다음, 동량의 DPBS를 넣어 혼합하였다. 혈액과 동량의 피콜(Ficoll)을 50ml tube에 옮겨 담은 다음, Ficoll이 담겨 있는 tube에 DPBS와 혈액의 혼합물을 넣어 충분히 준비하였다. 다음으로, 준비된 tube를 2000rpm에서 20분 동안 4℃로 원심분리를 하였고, 원심분리 종료 후 버피 코트(Buffy coat) 층을 회수하여 새로운 50ml tube로 옮겨주었다. 회수한 버피 코트의 2배 부피의 DPBS를 첨가하고, 1200rpm으로 5분 동안 4℃로 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 세포를 잘 풀어준 뒤 2배 부피의 DPBS를 20ml 첨가하여 1200rpm에서 5분 동안 4℃로 원심분리하였다. 이후 상층액을 제거하고 세포를 풀어준 뒤 배양액을 첨가하여 재부유하고 세포 수를 측정하였다.
5) 면역세포의 활성화 배양
RPMI 배양액 50ml에 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18과 자가혈청을 첨가하였다. T75 플라스크에 준비된 배양액을 넣고, 1,000,000 cells 이상의 면역세포를 파종하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6일 동안 활성화배양 하였다.
6) 면역세포의 증식 배양
상기 5~7일 동안의 활성화 배양 후, 배양물을 모두 50ml tube에 회수하고 1200rpm, 5min, 4℃에서 원심분리하였다. 이어서 상층액을 제거하고 세포를 풀어준 뒤 배양액을 첨가하여 재부유하고 세포 수를 측정하였다. 세포를 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18이 첨가된 RPMI 배양액 총량이 200ml가 되도록 부유하여 1000ml 폴리비닐 배양액에 파종하였다. 이때 자가혈청은 4% 첨가하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6일간 배양하였다.
7) 면역세포의 배지 추가
3~5일 경과 후 배양액이 노란색으로 변하고 콜로니가 형성되면 세포수 및 생존율을 측정하고 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18이 첨가된 RPMI 배양액에 총량이 1000ml가 되도록 배양액을 첨가하였다.
8) 면역세포의 회수 및 충전
배양액을 250ml tube 4개로 옮긴 후, 1200rpm, 10분, 4℃에서 상층액을 버리고 원심분리하였다. 이후 상층액을 버리고 세포를 잘 풀어준 뒤 100ml Nomal saline에 현작하여 세포수 및 생존율을 측정하였다.
실시예 2. 활성화 배양 결과 분석-세포 수/생존율/NK 세포 비율
본 발명자들은 상기 실시예 1의 과정에 따라 증식 및 활성이 증진된 NK 세포를 제조하였다. 이를 위해, 먼저, 4명의 공여자로부터 혈액을 채취하고 상기 혈액 내 PBMC의 특성을 분석하였으며, 그 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
| 혈액량 | 세포수 | 생존율 | NK 비율 | ||
| N200515-01TS | 188 | 1.43 x 108 | 92.5 | 17.0 | |
| N200515-02TS | 184 | 1.62 x 108 | 93.9 | 10.8 | |
| N200612-01TS | 112 | 9.4 x 107 | 89.3 | 1.6 | |
| N200612-02TS | 101 | 1.04 x 108 | 92.7 | 16.9 | |
| 평균 | 146 | 1.04 x 108 | 92.1 | 13.9 | |
다음으로, 상기 각 공여자의 혈액 내 PBMC를 2 x 10^7/50ml의 접종 세포수 및 4 x 10^5 /ml의 접종 세포밀도로 상기 실시예 1에 기재한 방법에 따라 활성화배양을 실시하였으며, 배양 후 세포수, 생존율 및 NK 세포가 차지하는 비율을 분석하였다.
먼저 세포수 분석 결과, 하기 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이 배양 6일차에 평균 10.0x10^7 세포를 회수하였고, 최소 8.23x10^7 세포를 획득할 수 있었다.
| 6일 | |
| N200515-01TS | 8.23E+07 |
| N200515-02TS | 1.11E+08 |
| N200612-01TS | 1.03E+08 |
| N200612-02TS | 1.05E+08 |
| 평균 | 1.00E+08 |
| 표준편차 | 1.25E+07 |
다음으로, 세포의 생존율을 측정한 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 6일차에 평균 세포생존율이 88.85%였으며, 최소 87.6% 이상의 생존율을 나타내었다.
| 6일 | |
| N200515-01TS | 89.9 |
| N200515-02TS | 88.7 |
| N200612-01TS | 89.2 |
| N200612-02TS | 87.6 |
| 평균 | 88.85 |
| 표준편차 | 0.9 |
마지막으로, NK 세포가 차지하는 비율을 분석한 결과, 배양 6일차에 NK 세포가 47.1% 비율로 존재하는 것으로 나타났으며, 활성화 배양기간이 1일 추가될 경우 NK 세포의 비율이 평균 15% 증가하는 것을 알 수 있었다. 보다 자세한 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
| 6일 | |
| N200515-01TS | 67.9 |
| N200515-02TS | 68.1 |
| N200612-01TS | 20.9 |
| N200612-02TS | 31.5 |
| 평균 | 47.1 |
| 표준편차 | 24.5 |
실시예 3. 증식배양 결과 분석-세포 수/생존율/NK 세포 비율/암세포 살상률
상기 실시예 2의 방법에 따라 활성화 배양을 수행한 후 6일 동안 증식배양을 진행하였으며, 세포수, 세포 생존율, NK 세포의 비율 및 암세포 살상률을 측정하였다.
먼저, 세포수 분석 결과 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 증식배양 6일차에는 약 30억개의 세포가 얻어졌으며, 각 공여자별로 활성화 배양 6일 및 증식배양 7일을 실시한 결과 하기와 같은 결과가 나타났다.
| 13일(6일+7일) | |
| N200515-01TS | 3.66E+09 |
| N200515-02TS | 2.34E+09 |
| N200612-01TS | 2.62E+09 |
| N200612-02TS | 3.16E+09 |
| 평균 | 2.95E+09 |
| 표준편차 | 5.86E+08 |
다음으로, 세포 생존율을 분석한 결과는 하기 표 6에 나타낸 바와 같으며, 배양 6일차에는 93.2%의 생존율을 나타냈다.
| 13일(6일+7일) | |
| N200515-01TS | 94.5 |
| N200515-02TS | 95.2 |
| N200612-01TS | 90.8 |
| N200612-02TS | 92.4 |
| 평균 | 93.2 |
| 표준편차 | 2.0 |
다음으로, FACS를 통해 NK 세포가 차지하는 비율을 측정하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 CD56을 발현하는 NK 세포는 전체에서 94.42%를 차지하였으며, CD3(T세포)는 2.10%, CD19(B세포)는 1.84%, CD14(단핵구)는 0.79%를 나타내었다.
마지막으로 상기 배양된 NK 세포의 암세포에 대한 살상률을 분석하고자 하였다. 이를 위해, 6일 동안의 활성화 배양 및 7일 동안의 증식배양한 NK 세포를 이용하였으며, K562 흉선종세포주에 각 다른 공여자에서 제조된 세포(sample 1, 2, 3)들을 처리하였다. 그 결과 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 NK 세포가 평균적으로 70%의 암세포 살상률을 나타내는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 3에는 배양과정 중의 활성화된 NK 세포를 보여주는 현미경 사진을 나타내었다.
상기 실시예를 통해 본 발명에 따른 NK 세포 제조공정은 NK 세포가 차지하는 상대적 비율을 5~15%에서 94.42%까지 비약적으로 증가시키며, 암세포에 대한 살상능을 약 70%까지 증가시킴을 확인하였는바, 고순도 및 고활성의 NK 세포치료제의 제조가 가능함을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (7)
- 인터루킨-2(Interleukin-2), 인터루킨-12(Interleukin-12) 및 항-CD16 항체를 유효성분으로 포함하는, 자연살해세포(Natural killer cells)의 증식 및 활성 증진용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 인터루킨-15(Interleukin-15), 인터루킨-18(Interleukin-18), 항-CD3 항체 및 항-CD56 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 자가혈청을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- (a) 인간을 포함한 포유동물의 말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 단계;
(b) 항-CD3 항체, 항-CD16 항체 및 항-CD56 항체로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이 코팅된 배양 플라스크에 상기 단핵구 및 배양액을 넣은 후 5 내지 7일 동안 1차 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양된 세포를 회수하고 배양액과 함께 5 내지 7일 동안 2차 배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포(Natural killer cells)의 제조방법으로서,
상기 배양액은 인터루킨-2(Interleukin-2), 인터루킨-12(Interleukin-12), 인터루킨-15(Interleukin-15) 및 인터루킨-18(Interleukin-18)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상, 및 자가혈청을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 자가혈청은 5 내지 15%로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제4항의 방법에 의해 제조된, 자연살해세포(Natural killer cells).
- 제6항의 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 세포치료제.
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