BR112021010248A2

BR112021010248A2 - métodos para expansão ex vivo de células naturais killer e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112021010248A2
Application number: BR112021010248-5A
Authority: BR
Inventors: Elizabeth SHPALL; Katy REZVANI
Original assignee: Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2021-08-17
Also published as: AU2019386830A1; AR117220A1; MX2021006393A; KR20210096648A; TW202039833A; JP2022513665A; WO2020112493A1; CN113316455A; EP3886874A1; CO2021007657A2; CA3121210A1; US20220033778A1

Abstract

MÉTODOS PARA EXPANSÃO EX VIVO DE CÉLULAS NATURAIS KILLER E USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a métodos ex vivo para a expansão de células naturais killer derivadas do sangue do cordão umbilical e métodos para seu uso. Exemplos de modalidades incluem estimular células mononucleares do sangue do cordão umbilical na presença de células apresentadoras de antígeno (APCs) e IL-2 e reestimular as células com APCs para produzir células NK expandidas. Em modalidades específicas, o método não utiliza a correspondência de antígeno leucocitário humano (HLA).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO-

DOS PARA EXPANSÃO EX VIVO DE CÉLULAS NATURAIS KILLER E USO DOS MESMOS".

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente provisório US nº de série 62/773.132, depositado em 29 de novembro de 2018, aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência.

ANTECEDENTES

1. Campo

[0002] A presente invenção refere-se em geral aos campos da bio- logia celular, biologia molecular, imunologia e medicina. Mais particu- larmente, trata-se de métodos para a expansão de células naturais kil- ler (NK) e sua utilização.

2. Descrição da técnica relacionada

[0003] As células naturais killer (NK) emergem como uma fonte estimulante de imunoterapia celular para pacientes com diversas ma- lignidades hematológicas e tumores sólidos; no entanto, a maioria dos estudos que utilizam células NK transferidas adotivamente têm sido limitados pela necessidade de um antígeno leucocitário humano (HLA) - combinado ou doador haploidêntico; procedimentos de expansão demorados e complicados; persistência inadequada e fraca expansão in vivo das células infundidas; e atividade antitumoral decepcionante.

[0004] A fonte ideal de células para a geração de células NK não é bem compreendida. As células NK do sangue periférico (células PB- NK) do paciente (isto é, autólogas) ou de doadores alogênicos adultos são mais comumente usadas; entretanto, essa abordagem requer que um doador disposto, combinado a um mínimo de 3 de 6 moléculas HLA com o receptor, seja submetido a leucoferese. Outra desvanta- gem das células PB NK adultas é a proliferação e persistência in vivo sub-ótimas após a transferência adotiva. Assim, o sangue do cordão umbilical (CB) é uma fonte atraente de células hematopoiéticas para a geração de células NK, dado o grande inventário global de mais de um milhão de unidades de CB congeladas e prontas para uso nos bancos mundiais de CB.

[0005] Tem sido demonstrado que as células CB-NK têm proprie- dades inerentes que as tornam superiores às células NK expandidas do sangue periférico para terapia adoptiva, incluindo maior expressão de genes relacionados à ciclagem de células, divisão celular e replica- ção de DNA. O obstáculo ao uso generalizado do CB é a dificuldade em expandir as células NK funcionais de unidades de CB congeladas em doses clinicamente relevantes. Assim, há uma necessidade não atendida de métodos melhorados de expansão das células NK a partir do CB.

SUMÁRIO

[0006] Em uma modalidade, a presente revelação fornece um mé- todo ex vivo para a expansão de células naturais killer (NK) compre- endendo: estimular células mononucleares (CMNs) do sangue do cor- dão na presença de células apresentadoras de antígeno (APCs) e IL- 2; e re-estimular as células com APCs para produzir células NK ex- pandidas, em que, pelo menos em alguns casos, o método é realizado em um biorreator. A etapa estimulante pode direcionar os CMNs para as células NK. A etapa de re-estimulação pode ou não compreender a presença de IL-2. Em determinados aspectos, o método não compre- ende a remoção ou adição de quaisquer componentes de meios du- rante uma etapa estimulante. Em aspectos específicos, o método é realizado dentro de um determinado período de tempo, como em me- nos de 15 dias, por exemplo, em 14 dias.

[0007] Em determinadas modalidades, a presente revelação for- nece um método ex vivo para a expansão de células naturais killer (NK), compreendendo: (a) obter de uma população inicial de células mononucleares (CMNs) a partir do sangue do cordão umbilical; (b) es-

timular as CMNs na presença de células apresentadoras de antígenos (APCs) e IL-2; e (c) re-estimular as células com APCs para a produção de células NK expandidas, em que o método é realizado em um bior- reator e em conformidade com as boas práticas de fabricação (BPF). A estimulação da etapa (b) pode direcionar as CMNs para as células NK. A etapa (c) pode ou não compreender a presença de IL-2. Em deter- minados aspectos, o método não compreende a remoção ou adição de quaisquer componentes de meios durante uma etapa (b). Em aspectos específicos, o método é realizado em menos de 15 dias, como em 14 dias.

[0008] Em alguns aspectos, o método inclui ainda a depleção de células positivas para um ou mais marcadores específicos, como o CD3, por exemplo. Em determinados aspectos, a etapa de depleção é realizada entre as etapas (b) e (c). Em alguns aspectos, as células são removidas do biorreator para depleção de CD3 e colocadas no biorrea- tor para a etapa (c).

[0009] Em determinados aspectos, a obtenção da população inicial de CMNs a partir do sangue do cordão umbilical, compreende o des- congelamento do sangue do cordão umbilical na presença de dextra- no, albumina sérica humana (HSA), DNase e/ou cloreto de magnésio. Em aspectos específicos, a obtenção da população inicial de CMNs do sangue do cordão umbilical, compreende o descongelamento do san- gue do cordão na presença de dextrano e/ou DNase. Em aspectos es- pecíficos, o sangue do cordão umbilical é lavado na presença de dex- trano a 5-20%, como 10%. Em determinados aspectos, o sangue do cordão umbilical é suspenso na presença de cloreto de magnésio, co- mo em uma concentração de 100-300 mM, em especial de 200 mM. Em alguns aspectos, a obtenção compreende a realização da centrifu- gação do gradiente de densidade de ficoll para obtenção de células mononucleares (CMNs).

[0010] Em determinados aspectos, o biorreator é um biorreator permeável a gás. Em aspectos específicos, o biorreator permeável a gás é G-Rex100M ou G-Rex100. Em alguns aspectos, a estimulação da etapa (b) é realizada em 3-5 L de meio, como 3, 3,5, 4, 4,50u 5 L.

[0011] Em alguns aspectos, as APCs são APCs com radiação ga- ma. Em determinados aspectos, as APCs são modificadas para ex- pressar IL-21 ligada a membrana (mbIL-21). Em aspectos específicos, as APCs são modificadas para expressar IL-21, IL-15 e/ou IL-2. Em alguns aspectos, as CMNs e as APCs estão presentes em uma razão de 1:2. Em alguns aspectos, a IL-2 está a uma concentração de 50- 200 IU/mL, como 100 IU/mL. Em aspectos específicos, a I|L-2 é rea- bastecida a cada 2-3 dias.

[0012] Em aspectos particulares, a etapa (b) é realizada por 6 a 8 dias, como 7 dias. Em alguns aspectos, a etapa (c) é realizada por 6a 8 dias, como 7 dias. Em alguns aspectos, a etapa (c) não compreende a divisão das células. Em aspectos específicos, as células são alimen- tadas duas vezes com |L-2 durante a etapa (c) e, em casos especiífi- cos, não são adicionados nem removidos outros componentes do meio durante a etapa (c).

[0013] Em alguns aspectos, o método compreende o uso de 3,4, ou 6 biorreatores. Em aspectos específicos, o método compreende o uso de menos de 10 biorreatores.

[0014] Em aspectos específicos, as células NK são expandidas pelo menos 500 vezes, 800 vezes, 1000 vezes, 1200 vezes, 1500 ve- zes, 2000 vezes, 2500 vezes, 3000 vezes ou 500 vezes. Em aspectos específicos, a cultura das células NK no biorreator produz mais de 1000 células NK em comparação com a cultura estática de líquidos.

[0015] Em determinados aspectos, o método não compreende a correspondência de antígeno leucocitário humano (HLA). Em alguns aspectos, a população inicial de células NK não é obtida de um doador haploidêntico.

[0016] Em alguns aspectos, as células NK expandidas têm ativi- dade antitumoral aumentada como compreende as células NK expan- didas a partir do sangue periférico. Em determinados aspectos, as cé- lulas NK expandidas têm maior expressão de um ou mais genes do ciclo celular, um ou mais genes de divisão celular e/ou um ou mais ge- nes de replicação de DNA, em comparação com as células NK expan- didas a partir do sangue periférico. Em alguns aspectos, as células NK expandidas têm capacidade proliferativa elevada em comparação com as células NK expandidas a partir do sangue periférico. Em alguns as- pectos, as células NK expandidas não apresentam exaustão. Em de- terminados aspectos, a exaustão é detectada medindo a expressão de perforina, granzima, CD57, KLRG1 e/ou PD1. Em alguns aspectos, as células NK expandidas têm alta expressão de perforina e/ou granzima. Em determinados aspectos, as células NK expandidas têm pouca ou nenhuma expressão de CD57, KLRG1 e/ou PD1.

[0017] Em alguns aspectos, as células NK expandidas compreen- dem uma dose clinicamente relevante. Em determinados aspectos, o sangue do cordão umbilical é sangue do cordão umbilical congelado. Em aspectos específicos, o sangue do cordão umbilical congelado foi testado para detecção de uma ou mais doenças infecciosas, como he- patite A, hepatite B, hepatite C, Trypanosoma cruzi, VIH, Vírus T- linfotrópico humano, sífilis, vírus Zika, e assim por diante. Em alguns aspectos, o sangue do cordão umbilical é sangue do cordão agrupado a partir de 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 unidades individuais de sangue do cordão.

[0018] Em alguns aspectos, as células NK não são autólogas, co- mo em relação a um indivíduo receptor. Em determinados aspectos, as células NK não são alogênicas, como em relação a um indivíduo receptor.

[0019] Em alguns aspectos, as APCs são célula apresentadora de antígeno universais (uAPCs). Em determinados aspectos, as uAPCs são modificadas para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) inter- leucina-21 ligada à membrana (mblL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL). Em alguns aspectos, as uAPCs expressam CD48. Em determinados aspectos, as uAPCs expressam CS1. Em aspectos específicos, as uAPCs expressam CD48 ou CS1. Em alguns aspectos, as uAPCs não têm, essencialmente, expressão de moléculas endógenas de HLA classe |, Il e/ou CD1d. Em determinados aspectos, as uAPCs expres- sam ICAM-1 (CD54) e/ou LFA-3 (CD58). Em aspectos específicos, as uAPCs são ainda definidas como aAPCs derivadas de células de leu- cemia, como as células K562.

[0020] Em aspectos adicionais, o método compreende adicional- mente a criopreservação de células NK expandidas.

[0021] Além disso, é fornecida aqui uma composição farmacêutica compreendendo uma população de células NK das modalidades (por exemplo, (a) obter de uma população inicial de células mononucleares (CMNs) a partir do sangue do cordão umbilical; (b) estimular as CMNs na presença de células apresentadoras de antígenos (APCs) e |L-2; e (c) re-estimular as células com APCs para a produção de células NK expandidas, em que o método é realizado em um biorreator e em con- formidade com BPF) e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0022] Uma modalidade adicional fornece uma composição com- preendendo uma dose efetiva de células NK das modalidades (por exemplo, (a) obter de uma população inicial de células mononucleares (CMNs) a partir do sangue do cordão umbilical; (b) estimular as CMNs na presença de células apresentadoras de antígenos (APCs) e |L-2; e (c) re-estimular as células com APCs para a produção de células NK expandidas, em que o método é realizado em um biorreator e em con- formidade com BPF) para uso no tratamento de uma doença ou um distúrbio em um indivíduo.

[0023] Outra modalidade fornece o uso de uma composição com- preendendo uma quantidade efetiva de células NK produzidas pelas modalidades (por exemplo, (a) obter de uma população inicial de célu- las mononucleares (CMNs) a partir do sangue do cordão umbilical; (b) estimular as CMNs na presença de células apresentadoras de antíge- nos (APCs) e |L-2; e (c) re-estimular as células com APCs para a pro- dução de células NK expandidas, em que o método é realizado em um biorreator e em conformidade com BPF) para o tratamento de um dis- túrbio imune relacionado em um indivíduo.

[0024] Em ainda outra modalidade, é fornecido um método para tratar uma doença ou um distúrbio compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de células NK expandidas de acordo com as modalidades (por exemplo, (a) obter de uma população inicial de célu- las mononucleares (CMNs) a partir do sangue do cordão umbilical; (b) estimular as CMNs na presença de células apresentadoras de antíge- nos (APCs) e |L-2; e (c) re-estimular as células com APCs para a pro- dução de células NK expandidas, em que o método é realizado em um biorreator e em conformidade com a BPF) ao indivíduo.

[0025] Em aspectos adicionais, o método compreende ainda a administração de quimioterapia. Em alguns aspectos, a quimioterapia é administrada antes das células NK expandidas. Em aspectos especí- ficos, a quimioterapia é mieloablativa. Em outros aspectos, a quimiote- rapia não é mieloablativa. Em alguns aspectos, a quimioterapia é qui- mioterapia de linfodepleção. Em aspectos específicos, a quimioterapia de linfodepleção é quimioterapia de linfodepleção à base de fludarabi- na. Em aspectos específicos, a quimioterapia é a lenalidomida.

[0026] Em aspectos específicos, o método não compreende a cor- respondência de HLA. Em aspectos específicos, o indivíduo não de- senvolve doença de enxerto versus hospedeiro ou outra toxicidade.

[0027] Em alguns aspectos, a doença ou o distúrbio é um distúrbio imunerrelacionado. Em determinados aspectos, o distúrbio imunorrela- cionado é um distúrbio autoimune, uma doença de enxerto versus hospedeiro, uma rejeição de aloenxerto, ou uma condição inflamatória. Em alguns aspectos, a doença ou o distúrbio é um o câncer, como o mieloma múltiplo.

[0028] Em aspectos adicionais, o método compreende ainda a administração de, pelo menos, um segundo agente terapêutico. Em alguns aspectos, o pelo menos segundo agente terapêutico compre- ende quimioterapia, imunoterapia, cirurgia, radioterapia ou bioterapia. Em alguns aspectos, as células NK e/ou pelo menos um segundo agente terapêutico são administrados por via intravenosa, intraperito- neal, intratraqueal, intratumoral, intramuscular, endoscopicamente, in- tralesional, percutaneamente, subcutaneamente, regionalmente ou por injeção direta ou perfusão.

[0029] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção serão visíveis a partir da seguinte descrição detalhada. No entanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indicando modalidades preferidas da invenção, são dados apenas a título de ilustração, uma vez que diversas mudan- ças e modificações dentro do espírito e o escopo da invenção se tor- nará evidente aos versados na técnica a partir desta descrição deta- lhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0030] Os desenhos a seguir fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais alguns aspectos na presente revelação. Os métodos e composições da revelação po- dem ser melhor compreendidos por referência a um ou mais destes desenhos, em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.

[0031] Figuras 1A-1E: Maior expressão de genes envolvidos na proliferação celular (FIG. 1A), ativação celular (FIG. 1B), aderência ce- lular (FIG. 1C), ciclo celular (FIG. 1D), e replicação de DNA (FIG. 1E) no sangue do cordão (CB) umbilical versus as células NK do sangue periférico (PB).

[0032] Figura 2: células NK do CB têm uma capacidade proliferati- va superior à das células PB-NK.

[0033] Figura 3: As células NK do CB expandidas (células NK RE- CB) rapidamente ex vivo não apresentam evidências fenotípicas de exaustão.

[0034] Figura 4: células NK RE-CB induzem uma atividade antitu- moral robusta no modelo de camundongo imunodeficiente do mieloma múltiplo (MM), conforme mostrado pela imagem do BLI (painel direito) e pela sobrevivência (painel esquerdo).

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS

[0035] Em determinadas modalidades, a presente revelação for- nece métodos para a expansão ex vivo das células NK. Os presentes métodos fornecem um protocolo de expansão robusto e rápido para a fabricação de células NK altamente funcionais e em conformidade com as Boas Práticas de Fabricação (BPF) e de unidades CB, como unida- des de CB congeladas. Assim, os presentes métodos podem ser reali- zados sem um doador vivo. As células NK robustas também podem ser geradas a partir de células do sangue periférico frescas ou conge- ladas. O método pode compreender a expansão na presença de célu- las apresentadoras de antígeno (APCs), como células apresentadoras de antígeno universal (uAPCs) que podem ou não ter capacidades de expansão específicas de células NK. As células NK expandidas rapi- damente do CB ex vivo (células NK RE-CB) podem ser infundidas frescas ou criopreservadas usando condições otimizadas para que possam ser usadas posteriormente. Importante, o método prevê a ex- pansão em larga escala das células NK em doses clínicas.

[0036] A expansão das células NK pode ser realizada em um sis- tema fechado, como um biorreator. Os estudos atuais mostraram que as células CB-NK poderiam ser geradas com expansão mais consis- tente e robusta, como mais de 1.000 vezes, do que os sistemas estáti- cos de cultura de líquidos.

[0037] Em alguns aspectos, o presente procedimento em confor- midade com as BPF inclui o uso de condições específicas de cultura que foram otimizadas para a primeira semana e segunda semana de cultura de células NK. O aumento do volume dos meios e a redução da concentração de células nas culturas tiveram um efeito impressio- nante na magnitude da expansão, no tempo e na logística necessários para a realização das culturas e no custo do procedimento. Como mostrado na Tabela 2A, nos primeiros sete dias de cultura e na Tabela 2B para a segunda semana de cultura, uma expansão significativa- mente melhor é obtida com maior volume de meio e uma menor con- centração de células (G-Rex100M) em comparação com menos meios e maior concentração de células (G-Rex100). São necessários menos biorreatores para o procedimento otimizado e são necessárias menos células para gerar a mesma dose de célula NK ou uma dose mais ele- vada. Isto é mostrado no dia 7, por exemplo, onde quatro vezes menos células são necessárias para semear cada 100 M G-Rex para obter a mesma dose. No dia 0-7, não é necessária qualquer intervenção nas culturas, como, por exemplo, não alimentar as células como nos méto- dos anteriores. Com o procedimento otimizado nos dias 7-14, as célu- las não necessitam de separação e são alimentadas apenas duas ve- zes (embora em alternativas sejam alimentadas uma vez, três vezes, ou quatro ou mais vezes). Menos meios e citocinas são usados, bem como menos tempo de tecnólogos que economiza dinheiro e melhora a logística. Mais importante, é necessária uma intervenção mínima nas culturas nos dias 7-14 (por exemplo, apenas IL2 é adicionado duas vezes), o que não só poupa tempo tecnológico, como também reduz significativamente a possibilidade de contaminação microbiana. Isto contrasta com os atuais procedimentos de expansão das células NK atualmente em uso, onde as culturas são frequentemente divididas dia sim, dia não, com a alimentação, aumentando repetidamente o risco de contaminação microbiana. Conforme resumido na Tabela 2C, a abordagem otimizada reduz o tempo do tecnólogo em 29%.

[0038] Os presentes estudos mostraram que as células NK do CB expandida (NK RE-CB) rapidamente ex vivo podem ser infundidas com segurança, sem qualquer toxicidade ou risco de doença do enxerto contra hospedeiro, mesmo na ausência de qualquer combinação de HLA. Demonstrou-se também que a administração de quimioterapia, como mieloblativa, não mieloablativa ou de intensidade reduzida com ou sem quimioterapia de resgate ou de linfodepletação de células- tronco, antes da infusão de células NK RE-CB, promove o crescimento e a ativação in vivo das células CB-NK, associada à regressão tumoral em modelos animais de tumor, bem como em pacientes. Estas células são, portanto, um produto de imunoterapia verdadeiramente “pronto para uso”, permitindo a maior flexibilidade para pacientes que possam necessitar de terapia adicional antes da infusão.

[0039] Dessa forma, a presente revelação também fornece méto- dos para o tratamento de um câncer, como malignidades hematológi- cas e tumores sólidos. O tratamento pode compreender a administra- ção de células NK com quimioterapia, como mieloablativa, não mielo- ablativa ou intensidade reduzida com ou sem quimioterapia de resgate ou de linfodepletação de células-tronco. A quimioterapia pode ser ad- ministrada antes da infusão das células NK. As células NK podem ser administradas em combinação com terapias direcionadas aos recepto- res das células NK, como o CD16, para redirecionar as células para um alvo, aumentando assim a resposta contra diferentes tumores. As terapias direcionadas aos receptores de células NK, como o CD16, podem ser anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos ou anti- corpos triespecíficos. Em casos específicos, as células NK não são combinadas com quimioterapia e/ou outras imunoterapias. |. Definições

[0040] Conforme usado aqui, "essencialmente livre", em termos de um componente especificado, é usado aqui para significar que ne- nhum componente especificado foi formulado propositadamente em uma composição e/ou está presente somente como contaminante ou em quantidades vestigiais. A quantidade total do componente especifi- cado resultante de qualquer contaminação acidental de uma composi- ção é, por conseguinte, bastante inferior a 0,05%, de preferência infe- rior a 0,01%. Em casos específicos, existe uma composição na qual nenhuma quantidade do componente especificado pode ser detectada com métodos analíticos padrão.

[0041] Conforme usado aqui na especificação, "a/0" ou "uma/um" pode significar uma ou mais. Como usado aqui na(s) reivindica- ção(ões), quando usado em conjunto com o termo "compreendendo", as palavras "a/0" ou "uma/um" podem significar uma ou mais de uma.

[0042] O uso do termo "ou" nas reivindicações é usado para signi- ficar "e/ou", a menos que seja explicitamente indicado para referir-se a alternativas apenas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a revelação suporte uma definição que se refere apenas a al- ternativas e "e/ou". Conforme usado aqui "outro" pode significar, pelo menos, um segundo ou mais. Os termos "cerca de", "substancialmen- te" e "aproximadamente" significam, em geral, o valor indicado mais ou menos 5%.

[0043] Um "distúrbio imune," "distúrbio imunerrelacionado," ou "distúrbio imunemediado" refere-se a um distúrbio em que a resposta imune desempenha um papel chave no desenvolvimento ou na pro-

gressão da doença. Os distúrbios imuno-mediadas incluem distúrbios auto-imunes, rejeição de aloenxerto, doença de enxerto versus hospe- deiro e condições inflamatórias e alérgicas.

[0044] "Tratamento" ou tratamento de uma doença ou condição refere-se à execução de um protocolo, que pode incluir a administra- ção de um ou mais fármacos a um paciente, em um esforço para alivi- ar sinais ou sintomas da doença. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem diminuir a taxa de progressão da doença, amenizar ou paliar o estado da doença, e remissão ou melhor prognóstico. O alívio pode ocorrer antes dos sinais ou sintomas da doença ou condição que apa- recem, bem como após a sua aparência. Assim, "tratar" ou "tratamen- to" pode incluir "prevenir" ou "prevenção" de doenças ou condições indesejáveis. Além disso, "tratar" ou "tratamento" não requer alívio completo dos sinais ou sintomas, não requer cura, e inclui especifica- mente protocolos que têm apenas um efeito marginal sobre o paciente.

[0045] O termo "benefício terapêutico" ou "terapeuticamente efi- caz", usado ao longo deste pedido, refere-se a qualquer coisa que promova ou melhore o bem-estar do indivíduo em relação ao trata- mento médico dessa condição. Isto inclui, mas não se limita a, uma redução da frequência ou gravidade dos sinais ou sintomas de uma doença. Por exemplo, o tratamento do câncer pode envolver, por exemplo, uma redução do tamanho de um tumor, uma redução da in- vasividade de um tumor, redução da taxa de crescimento do câncer ou a prevenção de metástases. O tratamento do câncer pode também se referir a prolongar a sobrevivência de um indivíduo com câncer.

[0046] "Indivíduo" e "paciente" referem-se a um ser humano ou não humano, como primatas, mamíferos e vertebrados. Em modalida- des específicas, o indivíduo é um ser humano.

[0047] As frases "farmaceuticamente ou farmacologicamente acei- tável" se referem a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou desagradável quando ad- ministradas a um animal ou ser humano, quando apropriado. A prepa- ração de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou um ingrediente ativo adicional será conhecida pelos versados na técnica conforme a presente revelação. Além disso, para a administra- ção de animais (por exemplo, humanos), será entendido que as prepa- rações devem satisfazer as normas de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza exigidas pelo FDA Office of Biological Stan- dards.

[0048] Tal como usado aqui, o "carreador farmaceuticamente acei- tável" inclui todos e quaisquer solventes aquosos (por exemplo, água, soluções alcoólicas/aquosas, soluções salinas, veículos parenteral, como cloreto de sódio, dextrose de Ringer, etc), solventes não aquo- sos (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal, e éste- res orgânicos injetáveis, como etiloleato), meios de dispersão, reves- timentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agen- tes antibacterianos ou antifúngicos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes), agentes isotônicos, agentes retardadores de absorção, sais, fármacos, estabilizadores de fármacos, géis, aglutinantes, excipi- entes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes, reabastecedores de fluidos e nutrien- tes, como materiais e combinações deles, como seria conhecido por um versado na técnica. O pH e a concentração exata dos vários com- ponentes em uma composição farmacêutica são ajustados de acordo com parâmetros conhecidos.

[0049] O termo “haplotipagem”, “combinação de HLA” ou “tipagem de tecidos” refere-se a um método usado para identificar o haplótipo ou tipos de tecido de um indivíduo, por exemplo, determinando qual locus (ou loci) de HLA é expressado nos linfócitos de um determinado indivíduo. Entretanto, em modalidades específicas, o método não compreende a correspondência de antígeno leucocitário humano (HLA). Os genes HLA estão localizados no complexo principal de his- tocompatibilidade (MHC), uma região no braço curto do cromossomo 6, e estão envolvidos na interação célula-célula, resposta imune, transplante de órgãos, desenvolvimento de câncer e susceptibilidade à doença. Há seis loci genéticos importantes no transplante, designados HLA-A, HLA-B, HLA-C, e HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ. Em cada lo- cus, pode haver qualquer um de vários alelos diferentes. Um método amplamente usado para a haplotipagem usa a reação em cadeia da polimerase (PCR) para comparar o DNA do indivíduo, com segmentos conhecidos dos genes que codificam antígenos MHC. A variabilidade dessas regiões dos genes determina o tipo de tecido ou haplótipo do indivíduo. Os métodos sorológicos também são usados para detectar antígenos sorologicamente definidos nas superfícies das células. Os determinantes HLA-A, -B e -C podem ser medidos por técnicas soroló- gicas conhecidas. Em resumo, os linfócitos do indivíduo (isolados de sangue periférico fresco) são incubados com anti-soros que reconhe- cem todos os antígenos HLA conhecidos. As células são espalhadas por uma bandeja com poços microscópicos contendo vários tipos de anti-soros. As células são incubadas durante 30 minutos, seguidas de uma incubação complementar adicional de 60 minutos. Se os linfócitos tiverem em suas superfícies antígenos reconhecidos pelos anticorpos no anti-soro, os linfócitos são lisados. Pode ser adicionado um corante para mostrar alterações na permeabilidade da membrana da célula e morte da célula. O padrão de células destruídas pela lise indica o grau de incompatibilidade histológica. Se, por exemplo, os linfócitos de uma pessoa a ser testada para HLA-A3 forem destruídos em um poço com anti-soros para HLA-A3, o teste é positivo para este grupo de antíge- nos.

[0050] O termo "células apresentadoras de antígeno (APCs)" refe-

re-se a uma classe de células capazes de apresentar um ou mais an- tígenos na forma de um complexo peptídeo-MHC reconhecível por cé- lulas efetoras específicas do sistema imune, induzindo assim uma res- posta imune celular eficaz contra o antígeno ou antígenos sendo apre- sentados. O termo "APC" abrange células inteiras intactas, como ma- crófagos, células B, células endoteliais, células T ativadas e células dendríticas, ou moléculas, de ocorrência natural ou sintéticas capazes de apresentar antígeno, como moléculas purificadas de MHC classe | complexadas para beta2-microglobulina.

[0051] O termo "funcionalmente fechado" refere-se a um sistema selado para garantir a esterilidade dos fluidos, quer através da sela- gem hermética de todo o sistema, quer através do fornecimento de filtros de barreira esterilizados em todas as ligações ao sistema de co- leta.

[0052] O termo "biorreator" refere-se a um sistema de cultura celu- lar em larga escala que fornece nutrientes às células e remove meta- bólitos, bem como fornece um ambiente físico-químico propício ao crescimento das células, em um sistema fechado estéril. Em aspectos específicos, os processos biológicos e/ou bioquímicos desenvolvem-se em condições ambientais e de funcionamento monitoradas e controla- das, por exemplo, pH, temperatura, pressão, fornecimento de nutrien- tes e remoção de resíduos. De acordo com a presente revelação, a classe básica de biorreatores adequados para uso com os métodos atuais incluem biorreatores de fibra oca. Il. Expansão da célula NK

[0053] Em determinados aspectos, a presente revelação refere-se à expansão das células NK do CB. As células NK podem ter vanta- gens únicas relacionadas à maior expressão de genes envolvidos na ciclagem celular, divisão celular e replicação de DNA (como mostrado nas FIGS. 1A4-1E). Assim, os métodos atuais fornecem um protocolo de expansão rápida, em conformidade com BPF, para a propagação de células NK derivadas do CB.

[0054] Em um protocolo exemplar, a unidade de sangue do cordão umbilical (por exemplo, 20% ou cheia) é descongelada e as células NK são obtidas isolando células mononucleares usando centrifugação do gradiente de densidade de ficoll. As lavagens podem ser realizadas após o descongelamento e após o isolamento de células mononuclea- res. As células são então incubadas com IL-2 (100 U/mL) e APCs, co- mo APCs com radiação gama (100 Gy) (por exemplo, aAPCs ou uA- PCs IL-21 ligadas à membrana do Clone 9 (mblIL-21). A razão célula NK para aAPC pode ser de 2:1 no biorreator, como o biorreator G-Rex. No Dia 2, a cultura celular é alimentada com IL-2 e a taxa de expansão é monitorada. No Dia 6 ou 7, as células CD3+ podem estar depleta- das, por exemplo, usando uma coluna Miltenyi XS e um separador Su- perMACSY, As células são então incubadas com IL-2 (100 U/mL) com alimentação de IL-2 e depois colhidas no Dia 14.

[0055] O descongelamento pode ser realizado em um recipiente estéril em banho de água a 37 “*C. Os meios podem incluir RPMI 1640 com L-glutamina, meio Clicks e soro humano AB (por exemplo, 10%). A lavagem pode ser realizada por centrifugação a 450xG durante 10 minutos. A solução de lavagem pode ser de 0,1 a 10 %, como 0,5 %, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%, HSA DPBS, dextrano DPBS a 10 %, DNase e cloreto de magnésio.

[0056] A separação mononuclear pode ser realizada por sobrepo- sição de uma parte uniforme das células CB lavadas em tubos para Ficoll-Paque. As células podem então ser centrifugadas e a camada superior contaminando o plasma e o plasma é removido. As células podem ser posteriormente centrifugadas, o sobrenadante removido e as células ressuspensas em meios.

[0057] Em aspectos específicos, o controle da qualidade é realiza-

do ao longo de todo o processo, através da realização da contagem de células, viabilidade, quimerismo, imunofenotipagem, esterilidade, PCR de micoplasmas, coloração de Gram, endotoxina, ensaio de crômio e análise de ensaio de citocinas.

[0058] As células NK podem ser expandidas na presença de célu- las alimentadoras modificadas, como APCs. As APCs podem expres- sar ligantes para ativar moléculas e citocinas coestimulatórias NK. Por exemplo, as APCs podem ser UAPCs que expressam CD48, CS1, IL- 21, 1L-2 e/ou IL15.

[0059] Em determinadas modalidades, as células NK são deriva- das do sangue do cordão umbilical por métodos bem conhecidos na técnica. Em modalidades específicas, as células imunes são isoladas do CB, como CB agrupado. Especificamente, o presente protocolo de expansão rápida pode envolver o isolamento e a expansão de células NK de uma unidade de CB congelada e descongelada ou de uma nova unidade de CB selecionada de um banco de CB clínico. O CB pode ser agrupado a partir de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 ou mais unidades. As cé- lulas NK podem ser autólogas ou alogênicas. As células NK isoladas podem ser haplótipo compatíveis para o indivíduo a ser administrado com a terapia celular. No entanto, em aspectos específicos, as células NK não são autólogas ou HLA-correspondidas. As células NK podem ser detectadas por marcadores de superfície específicos, como CD16, CD56 e CD8 em humanos.

[0060] Em determinados aspectos, a população inicial de células NK é obtida isolando células mononucleares usando centrifugação de gradiente de densidade ficoll. A cultura de células pode estar esgotada em quaisquer células que expressem células CD3, CD14 e/ou CD1I9 e pode ser caracterizada para determinar a percentagem de células CD56+/CD3- ou células NK.

[0061] As células podem ser expandidas na presença das presen-

tes APCs, como UAPCs. A expansão pode ser de cerca de 2-30 dias, como 3-20 dias, particularmente 12-16 dias, como 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 dias, especificamente cerca de 14 dias. As células NK e as APCS podem estar presentes em uma razão de cerca de 3:1-1:3, co- mo 2:1, 1:1, 1:2, especificamente cerca de 1:2. A cultura de expansão pode incluir ainda citocinas para promover a expansão, como IL-2, I1L-21 e/ou IL-18. As citocinas podem estar presentes em uma concentração de cerca de 10-500 U/mL, como 100-300 U/mL, particularmente cerca de 200 U/mL. As citocinas podem ser reabastecidas na cultura de expan- são, como a cada 2-3 dias. As APCs podem ser adicionadas à cultura pelo menos uma segunda vez, como após a transdução de CAR.

[0062] Após a expansão, as células NK podem ser infundidas ime- diatamente ou armazenadas, como, por exemplo, por criopreservação. Em determinados aspectos, as células NK podem ser propagadas por dias, semanas ou meses ex vivo como uma população em massa em cerca de 1,2, 3,4, 5 dias.

[0063] As células NK expandidas podem secretar citocinas do tipo |, como interferon-Y, fator de necrose tumoral-a e fator estimulante de colônias de granulócito e macrófago (GM-CSF), que ativam tanto as células imunes inatas como adaptativas, bem como outras citocinas e quimiocinas. A medição dessas citocinas pode ser usada para deter- minar o estado de ativação das células NK. Além disso, outros méto- dos conhecidos na técnica para determinação da ativação de células NK podem ser usados para a caracterização das células NK da pre- sente revelação. A. Biorreator

[0064] As células NK podem ser expandidas em um sistema funci- onalmente fechado, como um biorreator. A expansão pode ser realiza- da em um biorreator permeável a gás, como o dispositivo de cultura de células G-Rex. O biorreator pode suportar entre 1x10º e 3x10º células totais em um volume médio de 450 ml.

[0065] Os biorreatores podem ser agrupados de acordo com as categorias gerais, incluindo: biorreatores estáticos, biorreatores de frascos com agitação, biorreatores de parede rotativa, biorreatores de fibra oca e biorreatores de perfusão direta. Dentro dos biorreatores, as células podem ser livres ou imobilizadas, semeadas em andaimes po- rosos tridimensionais (hidrogel).

[0066] Os biorreatores de fibra oca podem ser usados para melho- rar a transferência de massa durante a cultura. Um biorreator de fibra oca é um sistema de cultura de células 3D baseado em fibras ocas, que são membranas capilares pequenas e semi-permeáveis dispostas em conjunto paralelo com uma faixa típica de corte de peso molecular (MWCO) de 10-30 kDa. Estas membranas de fibra oca são muitas ve- zes agrupadas e alojadas em invólucros tubulares de policarbonato para criar cartuchos biorreatores de fibra oca. Dentro dos cartuchos, que também estão equipados com portas de entrada e saída, existem dois compartimentos: o espaço intracapilar (IC) dentro das fibras ocas e o espaço extracapilar (EC) em redor das fibras ocas.

[0067] Assim, para a presente revelação, o biorreator pode ser um biorreator de fibra oca. Os biorreatores de fibra oca podem ter as célu- las impregnadas dentro do lúmen das fibras, com o meio perfundido o espaço extralumenal ou, alternativamente, podem fornecer perfusão gasosa e de meio através das fibras ocas, com as células crescendo dentro do espaço extralumenal.

[0068] As fibras ocas devem ser adequadas para a entrega de nu- trientes e a remoção de resíduos no biorreator. As fibras ocas podem ter qualquer forma, por exemplo, podem ser redondas e tubulares ou sob a forma de anéis concêntricos. As fibras ocas podem ser feitas de uma membrana reabsorvível ou não reabsorvível. Por exemplo, os componentes adequados das fibras ocas incluem polidioxanona, poli-

lactida, poliglactina, ácido poliglicólico, ácido polilático, ácido poliglicó- lico/carbonato de trimetileno, celulose, metilcelulose, polímeros celuló- sicos, éster de celulose, celulose regenerada, plurônica, colágeno, elastina e suas misturas.

[0069] O biorreator pode ser iniciado antes da semeadura das cé- lulas. O priming pode incluir a lavagem com um tampão, como o PBS. O priming também pode incluir o revestimento do biorreator com uma proteína de matriz extracelular, como fibronectina. O biorreator pode então ser lavado com meio, como o alfa MEM.

[0070] Em modalidades específicas, os métodos atuais usam um biorreator GRex. A base do frasco de GRex é uma membrana per- meável a gás em que as células residem. Assim, as células estão em um ambiente altamente oxigenado, permitindo que sejam cultivadas em altas densidades. O sistema é facilmente dimensionado e requer manipulações de cultura menos frequentes. Os frascos GRex são compatíveis com incubadoras de cultura de tecidos padrão e equipa- mento de laboratório móvel, reduzindo o equipamento especializado e o investimento de capital necessário para iniciar um programa de tera- pia de células adotiva (ACT).

[0071] As células podem ser semeadas no biorreator a uma densi- dade de cerca de 100 - 1.000 células/cm?, como cerca de 150 célu- las/cm?, cerca de 200 células/cm?, cerca de 250 células/cm?, cerca de 300 células/cm?, como cerca de 350 células/cm?, como cerca de 400 cé- lulas/cm2, como cerca de 450 células/cm?, como cerca de 500 célu- las/cm?, como cerca de 550 células/cm?, como cerca de 600 células/cm?, como cerca de 650 células/cm?, como cerca de 700 células/cm?, como cerca de 750 células/cm?, como cerca de 800 células/cm?, como cerca de 850 células/cm?, como cerca de 900 células/cm?, como cerca de 950 células/cm?, ou cerca de 1000 células/cm?. Em particular, as célu- las podem ser semeadas a uma densidade celular de cerca de 400-

500 células/cm?, como, por exemplo, cerca de 450 células/cm?.

[0072] O número total de células semeadas no biorreator pode ser de cerca de 1,0x10º a cerca de 1,0x10º células, como cerca de 1,0x106 a 5,0x108, 5,0x108 a 1,0x107, 10x107 a 5,0x107, 5,0x107 a 1,0x10º célu- las. Em aspectos específicos, o número total de células semeadas no biorreator é de cerca de 1,0x107 a cerca de 3,0x10”, como cerca de 2,0x107 células.

[0073] As células podem ser semeadas em qualquer meio de cul- tura de células adequado, muitos dos quais estão disponíveis comer- cialmente. Os meios exemplares incluem DMEM, RPMI, MEM, Media 199, HAMS e similares. Em uma modalidade, os meios são os meios alfa MEM, particularmente os meios alfa MEM suplementados com L- glutamina. Os meios podem ser complementados com um ou mais dos seguintes fatores: fatores de crescimento, citocinas, hormônios ou an- tibióticos B27, vitaminas e/ou de pequenas moléculas. Em particular, os meios podem ser livre de soro.

[0074] Em algumas modalidades, as células podem ser incubadas à temperatura ambiente. A incubadora pode ser umidificada e ter uma atmosfera de cerca de 5% CO? e cerca de 1% O2. Em algumas moda- lidades, a concentração de CO2 pode variar de cerca de 1-20%, 2- 10% ou 3-5%. Em algumas modalidades, a concentração de O2 pode variar de cerca de 1-20%, 2-10% ou 3-5%. B. Células apresentadoras de antígenos

[0075] As células apresentadoras de antígeno, que incluem macró- fagos, linfócitos B e células dendríticas, distinguem-se pela expressão de uma determinada molécula de MHC. As APCs internalizam o antí- geno e re-expressam uma parte desse antígeno, junto com a molécula MHC na membrana celular externa. O MHC é um grande complexo genético com múltiplos loci. Os loci de MHC codificam duas classes principais de moléculas de membrana de MHC, referidas como MHCs de classe | e classe Il. Os linfócitos T auxiliares reconhecem geralmen- te o antígeno associado às moléculas de MHC classe || e os linfócitos T citotóxicos reconhecem o antígeno associado às moléculas de MHC de classe |. Em seres humanos, o MHC é referido como o complexo HLA e em camundongos o complexo H-2.

[0076] Em alguns casos, as aAPCs são úteis na preparação de composições terapêuticas e produtos de terapia celular das modalida- des. Para obter orientação geral sobre a preparação e uso de sistemas de apresentação de antígenos, consultar, por exemplo, a patente US Nºs. 6.225.042, 6.355.479, 6.362.001 e 6.790.662; publicação de pedi- do de patente US nºs. 2009/0017000 e 2009/0004142; e publicação internacional nº. WO2007/103009.

[0077] Os sistemas aAPC podem incluir pelo menos uma molécula auxiliar exógena. Pode ser usado qualquer número e combinação adequados de moléculas auxiliares. A molécula auxiliar pode ser sele- cionada a partir de moléculas auxiliares, como moléculas coestimulató- rias e moléculas de adesão. Moléculas coestimulatórias exemplares incluem CD86, CD64 (FcyRI), ligante 41BB e IL-21. As moléculas de adesão podem incluir glicoproteínas de ligação a carboidratos, como selectinas, glicoproteínas de ligação transmembrana, como integrinas, proteínas dependentes de cálcio, como caderinas, e proteínas super- familiares de imunoglobulina transmembrana de passagem única (Ig), como moléculas de adesão intercelular (ICAMs), que promovem, por exemplo, contato célula-a-célula ou célula-matriz. Moléculas de ade- são exemplares incluem LFA-3 e ICAMs, como ICAM-1. As técnicas, os métodos e reagentes úteis para a seleção, clonagem, preparação e expressão de moléculas de assistência exemplares, incluindo molécu- las coestimulatórias e moléculas de adesão, são exemplificadas em, por exemplo, patente US Nos. 6.225.042, 6.355.479 e 6.362.001. C. Células apresentadoras de antígenos universais

[0078] Algumas modalidades da presente revelação dizem respei- to à produção e uso de células apresentadoras de antígeno universais (UAPCS). As UAPCs podem ser usadas para a expansão de células imunes, como células NK e células T. As UAPCs podem ser modifica- das para expressar a IL-21 (mbIL-21) e 41BFL (ligante CD137) ligadas a membrana.

[0079] As UAPCs podem ser modificadas para expressar a ligação de CD137 e/ou uma citocina ligada à membrana. A citocina ligada à membrana pode ser mIlL-21 ou mIL-15. Em modalidades específicas, as UAPCs são modificadas para expressar o ligante CD137 e mIL-21. As APCs podem ser derivadas de células cancerosas, como as células de leucemia. As APCs podem não expressar moléculas endógenas de HLA classe |, Il ou CD1d. Elas podem expressar ICAM-1 (CD54) e LFA-3 (CD58). Em particular, as APCs podem ser células K562, como as células K562 modificadas para expressar o ligante CD137 e mIL-21. As APCs podem ser irradiadas. A modificação pode ser por qualquer método conhecido na técnica, como transdução de retrovirais.

[0080] As citocinas exercem controles muito potentes sobre clas- ses inteiras de células imunes (incluindo células NK), afetando o desti- no, a atividade e a eficácia das células. O poder da estimulação das citocinas para ativar as células NK confirma que suas funções efetoras "naturais" são altamente suscetíveis à intervenção ambiental e que o priming pode regular os comportamentos das células NK in vivo.

[0081] Para tratar da questão da aquisição de quantidades clini- camente relevantes de células NK, os métodos atuais usam a interleu- cina (IL-21) como direcionamento para a expansão de células NK na atual tecnologia de plataforma UAPC. Em humanos, a estimulação das células NK com IL-10 e IL-21 induz a expressão de NKG2D de forma STAT3-dependente. Enquanto os receptores das citocinas comparti- lham componentes semelhantes de sinalização celular em muitas célu-

las imunes, a sinalização específica das células NK depende do recep- tor de IL-21 STAT3 nexus para proliferação.

[0082] A sinalização das citocinas é crucial para a manutenção da sobrevida e proliferação dos linfócitos. A administração in vivo da IL-2 é o único método aprovado pelo FDA para a expansão das células NK. A IL-15, outro potente ativador de células NK, está sendo submetida a um ensaio clínico de fase | como uma possível alternativa à IL-2, mas espera-se que tenha toxicidade significativa após a administração sis- têmica. Além das toxicidades significativas, essas citocinas também induzem a proliferação de células T, limitando a persistência das célu- las NK. Apesar de compartilhar o mesmo receptor para transdução de sinal, os receptores IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e 11-21 têm efeitos dis- tintos e específicos em diversas células.

1. 11-21 ligada à membrana

[0083] Em determinadas modalidades, para energizar especifica- mente as células NK, a IL-21 pode ser usada para produzir as presen- tes UAPCs. O receptor IL-21 (IL21R), uma estreita relação com a ca- deia beta do receptor da IL-2 capaz de transdução de sinais através da sua dimerização com a cadeia gama comum do receptor da citocina (gama(c), é modulado positivamente em células NK humanas ativadas (células prontas para serem acionadas). Enquanto a IL-21, citocina tipo |, pode modular as funções das células T, B e NK, encontramos apenas células NK humanas com expansão significativa através da ativação da via de sinalização do receptor IL21 (1000 vezes ao longo de 21 dias). Por outro lado, a I1L21 desempenha um papel importante na contração de células T CD8+ve 1.

[0084] A sinalização de IL21R é alimentada principalmente pelo STAT3, um ativador de proliferação de células altamente potente. O nexus IL21R-STAT3 é impulsionado pela ligação de DNA STAT3 indu- zida por |L-21 a elementos GAS e cis induzíveis, conforme verificado pela imunoprecipitação e Western blotting com anti-fosfotirosina anti- corpo 2. A base molecular da proliferação mediada por I1L21 pode ser especificamente traçada para a tirosina 510 (Y510) no IL21R, que me- dia a fosforilação induzida por IL-21 do STAT1 e do STAT33. Este me- canismo é ressaltado pelas respostas de I1L-21 diminuída em camun- dongos com inativação dupla Stat1/Stat3.

[0085] A sinalização de IL21R é importante para a citotoxicidade NK. A deficiência de IL21R humana está ligada à citólise prejudicada de célu- las alvo K562 marcadas com 51Cr, enquanto a citotoxicidade celular de- pendente do anticorpo não está afetada 4. O defeito letal monogênico não embrionário (mutação perda-de-função em IL21R) apresenta um excelente delineamento de oportunidades, sendo útil na modelagem, aprimoramento e modelagem de respostas citolíticas NK inatas.

[0086] A sinalização de I|L-21 molda seletivamente os subconjun- tos de células NK, embora as populações de células CD56dim e CDB56bright tenham números semelhantes de superfície IL21R. A in- dução IL-21 da fosforilação STAT1 e STAT3 é maior nas células NK CDB56bright vs CD56dim. Em contraste, a I1L-21 não tem efeito na ati- vação do STATS, uma via de ativação da IL-2 que também aciona a expansão da célula T. Além da ativação do STAT3, a sinalização da 11-21 também envolve as vias MAPK e PI3SK e induz a expressão de genes inatos de resposta imune, incluindo IFN-gama, T-bet, IL- 12Rbeta2 e I1L-18R em células NK, iniciando-os para matar células tu- morais.

[0087] Para uma utilização eficiente da |L-21, a expressão da mblL-21 pode ser usada para concentrar e localizar a interação trans com a IL21R em células NK. A proximidade da membrana do mblL21 garante disponibilidade pronta onde ela seja necessária, assim, pode sustentar a proliferação ótima de células sem grandes quantidades e concentrações da IL-21 fornecidas exogenamente. As co-culturas com

K562-mb15-41BFL irradiadas induziram uma expansão mediana de 21,6 vezes das células NK CD56+CD3 do sangue periférico. Essa ex- pansão é maior quando comparada à estimulação com apenas citoci- nas solúveis da família Yc compartilhada, incluindo IL-2, IL-12, IL-15, I1L-21 isoladamente ou em combinações. Por comparação, as presen- tes UAPCS pode expandir as células NK em pelo menos 1000 vezes (3 vezes) durante 14-21 dias. A expressão de mbIlL21 em UAPCs tam- bém pode evitar a necessidade de citocinas exógenas de grau clínico.

2. 4-1BBL (ligante 4-1BB, ligante CD137, CD137L, TNFSF9)

[0088] Além da noção de priming de citocinas da função das célu- las NK, interações físicas diretas com a ativação de moléculas nas cé- lulas NK resultam em respostas proliferativas celulares melhoradas. O CD137 (4-1BB) é um membro da família de genes do receptor de ne- crose tumoral (TNF-R), que media a proliferação de células, diferenci- ação e morte programada de células (apoptose). O receptor murino foi primeiramente caracterizado seguido pelo homólogo humano, que compartilha uma identidade de 60% no nível do aminoácido, com con- servação significativa no domínio citoplasmático/de sinalização. O CD137 é principalmente expressado em células T e células NK ativa- das, com níveis variáveis detectáveis em timócitos, células mieloides e células endoteliais em locais de inflamações. A sinalização fisiológica de CD137 é mediada através de 1) NF-KkB que promove a sobrevivên- cia através da ativação Bcl-XL e 2) via PISK/ERK1/2 que especifica- mente leva a progressão do ciclo das células.

[0089] Nas células NK ativadas, o CD137 é uma molécula coesti- mulatória induzível por citocinas, que, por sua vez, dirige as respostas antitumorais nas células NK, aumentando a proliferação celular e a secreção de IFN-Y. Estudos que usam camundongos com genes ina- tivados CD137L-/- elucidaram a importância da sinalização CD137/CD137L no desenvolvimento de células imunes antitumorais.

Os camundongos com genes inativados CD137-/- tiveram uma fre- quência 4 vezes maior de metástases tumorais em comparação com camundongos de controle.

[0090] O ligante CD137 (ligante CD137L, 4-1BB), um membro da glicoproteína de 34 kDa da superfamília TNF, é detectado principal- mente em células apresentadoras de antígenos ativadas (APC), inclu- indo células B, macrófagos e células dendríticas, bem como é expres- sado transitoriamente a baixos níveis em células T ativadas. O CD137L humano é apenas 36% homólogo em comparação com a con- traparte10. Em linhagem com a eficácia antitumoral de anticorpos agonistas CD137, a ligação de CD137L tem sido demonstrada em provocar as atividades CTL e antitumoral.

[0091] Dessa forma, as presentes UAPCS podem ser modificadas para expressar o ligante 4-1BB, o contra-receptor fisiológico para CD137, para obter estímulos ótimos.

3. SLAM/CD48

[0092] Além do condicionamento das citocinas e da coestimulação de 4-1BFL, as interações físicas diretas entre as células NK e as célu- las-alvo também influenciam as respostas celulares, ou seja, a morte das células-alvo. A molécula de ativação da sinalização linfocítica (SLAM, anteriormente também conhecida como superfamília CD2) de receptores homólogos de imunoglobulina, que são amplamente ex- pressados e desempenham papéis críticos no sistema imune, é espe- cialmente importante em termos de interações intercelulares.

[0093] Assim, as UAPCs da presente revelação podem expressar um ou mais antígenos da família SLAM. Os membros da família SLAM incluem CD2, CD48, CD58 (LFA-3), CD244 (2B4), CD229 (Ly9), CD319 (CS1 (CD2 subconjunto 1); CRACC (células citotóxicas de ati- vação do receptor tipo CD2)) e CD352 (NTB-A (antígeno NK-T-B)). Em aspectos específicos, as UAPCs expressam CD48 e/ou CS1. As célu-

las NK expressam pelo menos três membros da família SLAM (SLMF). São eles os antígenos das células 2B4, NK, T e B (NTB-A) e células citotóxicas ativadoras de receptores tipo CD2 (CRACC), que reconhe- cem os seus respectivos ligantes CD48, NTB-A e CRACC nas células alvo e, possivelmente, em outras células NK. Enquanto SLAMF1, 3, 5, 6, 7, 8, e 9 são receptores homofílicos (auto-ligante), SLMF2 e SLMF4 são contra-receptores (heterofílicos) um ao outro. A ampla faixa (três ordens de magnitude) em afinidades homofílicas conhecidas (constan- te de dissociação, Kd, de < 1 uM a 200 UM) aponta para uma base mecanicista para os mecanismos de sinalização de sobreposição, mas distintos, para as glicoproteínas SLAM. Tabela 1: Afinidades de ligação dos membros da família SLAM. SLAMF | CD Nome Aliases Interação Receptor do | Afinidade contador 1 150 |SLAM | SLAMF1,CD150, | homofílico 200 CDw150 2 48 CD48 | BCM1, BLAST, heterofílico | CD2 (roedo- | >500 BLAST1, MEM- res) 102 E ae Es PE 3 229 LY9 hly9, antígeno dos | homofílico mlinfócitos 9 4 244 |2B4 NAIL, NKR2B4, heterofílico | CD48 Nmrk 352 |NTB-A | KALI, KALIL, homofílico 2 Ly108, NTBA, SF2000 CD2F10, CD84H1, | homofílico SF2001, CD2F-10, CD84-H1

[0094] Em modalidades particulares, as UAPCs atuais são modifi- cadas para expressar CD48 para reforçar a interação célula-a-célula para melhorar as respostas celulares NK. O CD48 é uma proteína an- corada ao glicosilfosfatidilinositol (GPI-AP) encontrada na superfície das células NK, células T, monócitos e basófilos, e participa nas vias de adesão e ativação nestas células. Apesar de sua falta de domínio intracelular, a estimulação de CD48 induz rearranjo de fatores de sina- lização em enxertos lipídicos, atividade da Leck-quinase e fosforilação da tirosina. Como uma molécula de adesão e coestimulatória, o CD48 induz inúmeros efeitos em linfócitos B e T, células NK, mastócitos e eosinófilos. Nas células NK humanas, o CD48 é o contra-receptor para 2B426, um importante ativador das células NK. Pensa-se que a intera- ção heterofílica compete pela interação de CD244 com MHC-l. A inte- ração 2B4/CD48 induz, assim, sinais de ativação nas células NK hu- manas, enquanto nas células NK murinas envia sinais inibitórios.

[0095] Embora as interações de 2B4-CD48 entre células da mes- ma população, ou seja, interações da célula NK-célula NK ou intera- ções da célula T-célula T, levem a uma ativação melhorada, expres- sando CD48 em APCs, como a linhagem celular mieloide K562, que normalmente é desprovida de CD48, as UAPCs podem ligar a potente via de sinalização 2B4 nas células NK em trans.

4. SLAM/CS1

[0096] Em algumas modalidades, as presentes UAPCs são modifi- cadas para expressar CS1, outro membro da família SLAM, como uma molécula coestimulatória para ligar os poderes de morte das células NK. Ao contrário do CD48 que se contra liga ao 2B4, as interações CS1 são homofílicas e podem ser caracterizadas no contexto das inte- rações cis vs trans. As células K562 que normalmente estão livres de CS1 podem ser modificadas para expressar CS1. Ill. Receptores de antígeno geneticamente modificados

[0097] As células NK da presente revelação podem ser genetica- mente modificadas para expressar receptores de antígeno como TCRs e/ou CAR modificados. Por exemplo, as células NK são modificadas para expressar um TCR com especificidade antigênica para um antí- geno do câncer. Múltiplos CARs e/ou TOCRs, como antígenos diferen- tes, podem ser adicionados às células NK.

[0098] Métodos adequados de modificação são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook e Ausubel, supra. Por exemplo, as células podem ser transduzidas para expressar um TCR com espe- cificidade antigênica para um antígeno cancerígeno usando técnicas de transdução descritas em Heemskerk et al., 2008 e Johnson et al,

2009.

[0099] A eletroporação do RNA codificante para as cadeias de comprimento total de TOR a e B (ou Y e 5) pode ser usada como al- ternativa para superar problemas a longo prazo com a auto-reatividade causada pelo emparelhamento de cadeias de TCR transduzidas retro- viralmente e endógenas. Mesmo que tal emparelhamento alternativo ocorra na estratégia de transfecção transiente, as células T auto- reativas possivelmente geradas perderão essa auto-reatividade após algum tempo, porque a cadeia de TCR a e 8 introduzida é expressada apenas transientemente. Quando a expressão introduzida da cadeia de TCR a e 8 é diminuída, apenas as células T autólogas normais são deixadas. Isso não ocorre quando cadeias de TOR de comprimento total são introduzidas por transdução de retrovirais estáveis, que nun- ca perderão as cadeias de TCR introduzidas, causando uma auto- reatividade constante no paciente.

[00100] Em algumas modalidades, as células compreendem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos através da engenharia genética que codificam um ou mais receptores de antígenos e produtos geneti- camente modificados desses ácidos nucleicos. Em algumas modalida- des, os ácidos nucleicos são heterólogos, ou seja, normalmente não presentes em uma célula ou amostra obtida a partir da célula, como uma obtida a partir de outro organismo ou célula, que, por exemplo, não é normalmente encontrado na célula que está sendo modificada e/ou em um organismo a partir do qual essa célula é derivada. Em al- gumas modalidades, os ácidos nucleicos não estão ocorrendo natu- ralmente, como um ácido nucleico não encontrado na natureza (por exemplo, quimérico).

[00101] Em algumas modalidades, o CAR contém um domínio ex- tracelular de reconhecimento de antígenos que se liga especificamente a um antígeno. Em algumas modalidades, o antígeno é uma proteína expressada na superfície das células. Em algumas modalidades, o CAR é um CAR semelhante a TCR e o antígeno é um antígeno peptí- dico processado, como um antígeno peptídico de uma proteína intra- celular, que, como um TCR, é reconhecido na superfície da célula no contexto de uma molécula de complexo principal de histocompatibili- dade (MHC).

[00102] Receptores de antígeno exemplares, incluindo CARs e TCRs recombinantes, bem como métodos de engenharia e introdução dos receptores em células, incluem os descritos, por exemplo, nos números de publicação de pedidos de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO?2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, números de aplicação de patente US US2002131960, US2013287748, US20130149337, patentes US nºs: 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592,

8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209,

7.354.762, 7.446.191, 8.324.353 e 8.479.118, e o número de pedido de patente europeia EP2537416, e/ou os descritos por Sadelain et al., 2013; Davila et al., 2013; Turtle et al., 2012; Wu et al., 2012. Em al- guns aspectos, os receptores de antígeno geneticamente modificados incluem um CAR conforme descrito na patente US nº: 7.446.190, e as descritas na publicação do pedido de patente internacional Nº:

WO/2014055668 Al. A. Receptores de antígeno quimérico

[00103] Em algumas modalidades, o CAR compreende: a) um do- mínio de sinalização intracelular, b) um domínio transmembranar e c) um domínio extracelular compreendendo uma região de ligação ao an- tígeno.

[00104] Em algumas modalidades, os receptores de antígeno modi- ficados incluem CARs, incluindo CARs ativadores ou estimuladores, CARs coestimulatórios (ver WO2014/055668) e/ou CARs inibitórios (ICARs, ver Fedorov et al., 2013). Os CARs geralmente incluem um domínio de ligação do antígeno extracelular (ou ligante) ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, em alguns aspectos via ligantes e/ou domínio(s) transmembrana(s). Estas moléculas normal- mente imitam ou aproximam um sinal através de um receptor de antí- geno natural, um sinal através de um receptor desse tipo em combina- ção com um receptor coestimulatório e/ou um sinal através de um re- ceptor coestimulatório apenas.

[00105] Determinadas modalidades da presente revelação referem- se ao uso de ácidos nucleicos, incluindo ácidos nucleicos que codifi- cam um polipeptídeo CAR antígeno específico, incluindo um CAR que foi humanizado para reduzir a imunogenicidade (hCAR), compreen- dendo um domínio de sinalização intracelular, um domínio transmem- branar, e um domínio extracelular compreendendo um ou mais moti- vos de sinalização. Em determinadas modalidades, o CAR pode reco- nhecer um epitopo compreendendo o espaço compartilhado entre um ou mais antígenos. Em determinadas modalidades, a região de ligação pode compreender regiões determinantes complementares de um an- ticorpo monoclonal, regiões variáveis de um anticorpo monoclonal e/ou seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em Uma modalidade adicio- nal, essa especificidade é derivada de um peptídeo (por exemplo, cito-

cina) que se liga a um receptor.

[00106] É contemplado que os ácidos nucleicos CAR humano po- dem ser genes humanos usados para melhorar a imunoterapia celular para pacientes humanos. Em uma modalidade específica, a invenção inclui um cDNA de CAR de comprimento total ou uma região de codifi- cação. As regiões ou domínio de ligação ao antígeno podem incluir um fragmento das cadeias VH e VL de um fragmento variável de cadeia única (scFV) derivado de um anticorpo monoclonal humano específico, como os descritos na patente US 7.109.304, incorporada aqui por refe- rência. O fragmento também pode ser qualquer número de diferentes domínios de ligação ao antígeno de um anticorpo específico do antí- geno humano. Em uma modalidade mais específica, o fragmento é um scFV específico do antígeno codificado por uma sequência que é oti- mizada para o uso de códon humano para expressão em células hu- manas.

[00107] O arranjo poderia ser multimérico, como um diabody ou multímeros. Os multímeros são formados muito provavelmente pelo emparelhamento cruzado da porção variável das cadeias leves e pe- sadas em um diabody. A parte da dobradiça da construção pode ter múltiplas alternativas de ser totalmente deletada, de manter a primeira cisteína, de uma prolina em vez de uma substituição de serina, de ser truncada até a primeira cisteína. A porção Fc pode ser deletada. Qual- quer proteína que seja estável e/ou dimerize pode servir este propósi- to. Pode-se usar apenas um dos domínios Fc, por exemplo, o domínio CH2 ou CH3 da imunoglobulina humana. Pode-se também usar a do- bradiça, a região CH2 e CH3 de uma imunoglobulina humana que foi modificada para melhorar a dimerização. Também poderia usar ape- nas a porção da dobradiça de uma imunoglobulina. Também poderia usar porções de CD8alfa.

[00108] Em algumas modalidades, o ácido nucleico do CAR com-

preende uma sequência que codifica outros receptores coestimulató- rios, como um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular CD28 modificado. Outros receptores coestimulatórios in- cluem, mas não se limitam a, um ou mais dos CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, DAP12 e 4-1BB (CD137). Além de um sinal primário iniciado pelo CD3 6, um sinal adicional fornecido por um receptor coes- timulatório humano inserido em um CAR humano é importante para a ativação total das células NK e pode ajudar a melhorar a persistência in vivo e o sucesso terapêutico da imunoterapia adotiva.

[00109] Em algumas modalidades, o CAR é construído com uma especificidade para um determinado antígeno (ou marcador ou ligan- te), como um antígeno expressado em um determinado tipo de célula a ser alvo de terapia adoptiva, por exemplo, um marcador de câncer, e/ou um antígeno destinado a induzir uma resposta de atenuação, co- mo um antígeno expressado em um tipo de célula normal ou não do- ente. Assim, o CAR normalmente inclui em sua porção extracelular, uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno, como um ou mais fra- gmentos de ligação ao antígeno, domínio ou porção, ou um ou mais domínios variáveis do anticorpo, e/ou moléculas do anticorpo. Em al- gumas modalidades, o CAR inclui uma porção de ligação ao antígeno ou partes de uma molécula de anticorpo, como um fragmento de anti- corpo de cadeia única (scFV) derivado das cadeias pesadas variáveis (VH) e leves variáveis (VL) de um anticorpo monoclonal (mAb).

[00110] Em determinadas modalidades do receptor do antígeno quimérico, a porção específica do antígeno do receptor (que pode ser referida como um domínio extracelular compreendendo uma região de ligação ao antígeno) compreende um antígeno associado ao tumor ou por um domínio de ligação ao antígeno específico do agente patogêni- co. Os antígenos incluem antígenos de carboidratos reconhecidos pe- los receptores de reconhecimento de padrões, como dectina-1. Um antígeno associado ao tumor pode ser de qualquer tipo desde que seja expressado na superfície celular das células tumorais. As modalidades exemplares dos antígenos associados ao tumor incluem ligantes CD19, CD20, antígeno carcinoembrionário, alfafetoproteína, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-MET, AKT, Her2, Her3, antígeno tumoral epi- telial, antígeno associado ao melanoma, p53 modificado, ras modifica- do e assim por diante. Em determinadas modalidades, o CAR pode ser coexpressado com uma citocina para melhorar a persistência quando há uma pequena quantidade de antígeno associado ao tumor. Por exemplo, o CAR pode ser coexpressado com IL-15.

[00111] A sequência do quadro de leitura aberto que codifica o re- ceptor quimérico pode ser obtida a partir de uma fonte de DNA genô- mico, de uma fonte de cDNA ou pode ser sintetizada (por exemplo, através de PCR), ou suas combinações. Dependendo do tamanho do DNA genômico e do número de íntrons, pode ser desejável usar o CDNA ou uma combinação dele, pois é possível que íntrons estabili- zem o mMRNA. Além disso, pode ser mais vantajoso usar regiões en- dógenas ou exógenas não codificadoras para estabilizar o MRNA.

[00112] É contemplado que a construção quimérica possa ser intro- duzida em células imunes como DNA não conjungado (naked) ou em um vetor adequado. Os métodos de transferir células de forma estável por eletroporação usando DNA nu são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a patente US nº 6.410.319. O DNA nu refere-se geralmente ao DNA que codifica um receptor quimérico contido em um vetor de expressão de plasmídeo, na orientação adequada para a expressão.

[00113] Alternativamente, um vetor viral (por exemplo, um vetor re- troviral, um vetor adenoviral, um vetor viral adeno associado ou um vetor lentiviral) pode ser usado para introduzir a construção quimérica em células imunes. Vetores adequados para uso de acordo com o mé- todo da presente revelação não são replicantes nas células imunes.

Sabe-se que um grande número de vetores que se baseiam em vírus, onde o número de cópia do vírus mantido na célula é baixo o suficiente para manter a viabilidade da célula, como, por exemplo, vetores base- ados em HIV, SV40, EBV, HSV ou BPV.

[00114] Em alguns aspectos, a ligação específica do antígeno, ou componente de reconhecimento, está ligada a um ou mais domínios de sinalização transmembrana e intracelular. Em algumas modalida- des, o CAR inclui um domínio transmembranar fundido ao domínio ex- tracelular do CAR. Em uma modalidade, o domínio transmembranar que naturalmente é associado com um dos domínios no CAR é usado. Em alguns casos, o domínio transmembrana é selecionado ou modifi- cado pela substituição de aminoácidos para evitar a ligação desses domínios aos domínios transmembranares das mesmas ou diferentes proteínas de membrana de superfície para minimizar as interações com outros membros do complexo receptor.

[00115] O domínio transmembranar em algumas modalidades é re- sultante de uma fonte natural ou de origem sintética. Onde a fonte é natural, o domínio em alguns aspectos é derivado de qualquer proteí- na ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembrana- res incluem as derivadas da (ou seja, compreendem pelo menos a(s) região(ões) transmembrana(s) da) cadeia alfa, beta ou zeta do recep- tor de células T, moléculas CD28, CD3 zeta, CD3 épsilon, CD3 gama, CD3 delta, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D e DAP. Alternativamente, o domínio transmem- branar em algumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio transmembranar sintético compreende predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembranar sintético.

[00116] Em determinadas modalidades, as tecnologias de platafor- ma reveladas aqui para modificar geneticamente as células imunes, como as células NK, compreendem (i) a transferência de genes não virais usando um dispositivo de eletroporação (por exemplo, um nucle- ofector), (ii) CARs que sinalizam através de endodomínios (por exem- plo, CD28/CD3-6, CD137/CD3-6, ou outras combinações), (iii) CARs com comprimentos variáveis de domínios extracelulares que conectam o domínio de reconhecimento do antígeno à superfície celular e, em alguns casos, (iv) células apresentadoras de antígeno artificial (aAPC) derivadas de K562 para poder expandir robustamente e numericamen- te as células imunes de CAR+ (Singh et al., 2008; Singh et al., 2011). B. Receptor de células T (TCR)

[00117] Em algumas modalidades, os receptores de antígenos ge- neticamente modificados incluem TCRs recombinantes e/ou TCRs clonados de células T que ocorrem naturalmente. Um "receptor de cé- lulas T" ou "TCR" refere-se a uma molécula que contém uma variável de cadeia a e B (também conhecida como TCRa e TCRB, respectiva- mente) ou uma variável de cadeias Y e à (também conhecida como TCRY e TCR6ô, respectivamente) e isso é capaz de se ligar especifi- camente a um peptídeo antígeno ligado a um receptor MHC. Em al- gumas modalidades, o TCR é a forma af.

[00118] Normalmente, os TCRs que existem em formas af e yô são geralmente estruturalmente semelhantes, mas as células T que os ex- pressam podem ter localizações ou funções anatômicas distintas. Um TCR pode ser encontrado na superfície de uma célula ou na forma so- lúvel. Geralmente, um TCR é encontrado na superfície das células T (ou linfócitos T), onde geralmente é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados a moléculas de complexo principal de histocom- patibilidade (MHC). Em algumas modalidades, um TCR também pode conter um domínio constante, um domínio transmembranar e/ou uma pequena cauda citoplasmática (ver, por exemplo, Janeway et al, 1997). Por exemplo, em alguns aspectos, cada cadeia do TOR pode possuir um domínio variável de imunoglobulina N-terminal, um domínio constante de imunoglobulina, uma região transmembrana e uma pe- quena cauda citoplasmática na extremidade C-terminal Em algumas modalidades, um TCR está associado a proteínas invariantes do com- plexo CD3 envolvidas na mediação da transdução de sinal. Salvo indi- cação em contrário, o termo "TCR" deve ser entendido para abranger os fragmentos funcionais de TOR dos mesmos. O termo abrange tam- bém TCRs intactos ou de comprimento total, incluindo TORs na forma ab ou yô.

[00119] Assim, para o propósito aqui, a referência a um TCR inclui qualquer TCR ou fragmento funcional, como uma porção de ligação ao antígeno de um TCR que se liga a um peptídeo antigênico específico ligado em uma molécula MHC, ou seja, complexo peptídeo-MHC. Uma "porção de ligação ao antígeno" ou um fragmento de ligação ao antí- geno" de um TCR, que pode ser usado de forma intercambiável, refe- re-se a uma molécula que contém uma parte dos domínios estruturais de um TCR, mas que liga o antígeno (por exemplo complexo peptídeo- MHC) ao qual o TOR completo se liga. Em alguns casos, uma porção de ligação ao antígeno contém os domínios variáveis de um TCR, co- mo a cadeia variável a e a cadeia variável É de um TCR, suficiente pa- ra formar um local de ligação para ligação a um complexo específico peptídeo-MHC, como, geralmente, onde cada cadeia contém três regi- ões de determinação da complementaridade.

[00120] Em algumas modalidades, os domínios variáveis das ca- deias TOR associam-se para formar loops, ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) análogas às imunoglobulinas, que con- ferem o reconhecimento do antígeno e determinam a especificidade do peptídeo, formando o local de ligação da molécula TCR e determinam a especificidade do peptídeo. Tipicamente, como imunoglobulinas, as CDRs são separadas por regiões de estrutura (FRs) (ver, por exemplo, Jores et al., 1990; Chothia et al., 1988; Lefranc et al., 2003). Em algu- mas modalidades, a CDR3 é o principal CDR responsável pelo reco- nhecimento do antígeno processado, embora a CDR1 da cadeia alfa também tenha demonstrado interagir com a parte N-terminal do peptí- deo antigênico, enquanto a CDR1 da cadeia beta interage com a parte C-terminal do peptídeo. Pensa-se que a CDR2 reconhece a molécula MHC. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia B pode conter ainda uma região de hipervariabilidade (HV4).

[00121] Em algumas modalidades, as cadeias de TOR contêm um domínio constante. Por exemplo, tipo imunoglobulinas, a porção extra- celular das cadeias de TCR (por exemplo, cadeia a, cadeia B) pode conter dois domínios de imunoglobulina, um domínio variável (por exemplo, Va ou Vp; tipicamente aminoácidos 1 a 116 baseados na numeração de Kabat, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5º ed.) no terminal N, e um domínio constante (por exemplo, um domínio constante de cadeia a ou Ca, tipicamente aminoácidos 117 a 259 baseados em Kabat, domínio constante de cadeia B ou Cp, tipicamente aminoácidos 117 a 295 ba- seados em Kabat) adjacente à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TOR formada pelas duas ca- deias contém dois domínios constantes de membrana-proximais e dois domínios variáveis de membrana-distais contendo CDRs. O domínio constante do domínio de TCR contém sequências de conexão curtas em que um resíduo de cisteína forma uma ligação de dissulfeto, fa- zendo uma ligação entre as duas cadeias. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo adicional de cisteína em cada uma das cadeias a e B, de modo que o TCR contenha duas ligações de dissul-

feto nos domínios constantes.

[00122] Em algumas modalidades, as cadeias de TOR podem con- ter um domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é positivamente carregado. Em alguns casos, as ca- deias de TOR contêm uma cauda citoplasmática. Em alguns casos, a estrutura permite que o TCR se associe a outras moléculas como o CD3. Por exemplo, um TCR contendo domínios constantes com uma região transmembranar pode ancorar a proteína na membrana da cé- lula e associar-se a subunidades invariantes do aparelho de sinaliza- ção ou complexo de CD3

[00123] Geralmente, a CD3 é um complexo multiproteico que pode possuir três cadeias distintas (y, ô e €) em mamíferos e a cadeia €. Por exemplo, em mamíferos, o complexo pode conter uma cadeia CD3, uma cadeia CD35, duas cadeias CD3e e um homodímero de cadeias CD3 C. As cadeias CD3Y, CD3ôe CD3: são proteínas de superfície de células altamente relacionadas da superfamília de imunoglobulinas que contém um único domínio de imunoglobulina. As regiões trans- membranares das cadeias CD3Y, CD3õe CD3: são negativamente carregadas, o que é uma característica que permite que essas cadeias se associem às cadeias de receptores de células T positivamente car- regadas. As caudas intracelulares das cadeias CD3Y, CD35e CD3: contêm um único motivo conservado conhecido como motivo de ativa- ção do imunoreceptor baseado em tirosina ou ITAM, enquanto cada cadeia CD376 tem três. Em geral, os ITAMs estão envolvidos na capa- cidade de sinalização do complexo TCR. Estas moléculas acessórias têm regiões transmembranares com carga negativa e desempenham um papel na propagação do sinal do TCR para a célula. As cadeias CD3- e 6, junto com o TCR, formam o que é conhecido como comple- xo receptor de células T.

[00124] Em algumas modalidades, o TOR pode ser um heterodíme-

ro de duas cadeias a e B (ou opcionalmente y e 5) ou pode ser uma construção de TCR de cadeia única. Em algumas modalidades, o TOR é um heterodímero que contém duas cadeias separadas (cadeias a e B ou cadeias y e 5) que estão ligadas, como por ligação de dissulfetos ou ligações de dissulfetos. Em algumas modalidades, um TCR para um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno do câncer) é identificado e introduzido nas células. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o TOR pode ser obtido a partir de uma variedade de fon- tes, como através da amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR) de sequências de DNA de TCR disponíveis publicamente. Em algumas modalidades, o TCR é obtido a partir de uma fonte biológica, por exemplo, de células como uma célula T (por exemplo, célula T ci- totóxica), hibridomas de células T ou outra fonte disponível publica- mente. Em algumas modalidades, as células T podem ser obtidas a partir de células isoladas in vivo. Em algumas modalidades, um clone de células T de alta afinidade pode ser isolado de um paciente e o TCR isolado. Em algumas modalidades, as células T podem ser um hibridoma de células T cultivadas ou um clone. Em algumas modalida- des, o clone TCR para um antígeno alvo foi gerado em camundongos transgênicos modificados com genes do sistema imune humano (por exemplo, o sistema de antígeno de leucócitos humanos ou HLA). Ver, por exemplo, antígenos tumorais (ver, por exemplo, Parkhurst et al., 2009 e Cohen et al., 2005). Em algumas modalidades, a exibição do fago é usada para isolar os TCRs contra um antígeno alvo (ver, por exemplo, Varela-Rohena et al., 2008 e Li, 2005). Em algumas modali- dades, a porção de TCR ou de ligação ao antígeno pode ser gerada sinteticamente a partir do conhecimento da sequência de TCR.

C. Antígenos

[00125] Entre os antígenos direcionados pelos receptores de antí- genos geneticamente modificados estão aqueles expressados no con-

texto de uma doença, condição ou tipo de célula a ser direcionada através da terapia de células adotivas. Entre as doenças e condições estão as doenças e os distúrbios proliferativos, neoplásicos e malig- nos, incluindo cânceres e tumores, incluindo cânceres hematológicos, cânceres do sistema imune, como linfomas, leucemias e/ou mielomas, como B, T e leucemias mieloides, linfomas e mielomas múltiplos. Em algumas modalidades, o antígeno é seletivamente expressado ou so- brexpressado em células da doença ou da condição, por exemplo, o tumor ou as células patogênicas, em comparação com células ou teci- dos normais ou não direcionados. Em outras modalidades, o antígeno é expressado em células normais e/ou é expressado nas células modi- ficadas.

[00126] Qualquer antígeno adequado pode ser usado no presente método. Antígenos exemplares incluem, mas não se limitam a, moléculas antigênicas de agentes infecciosos, autoantígenos, antígenos associados ao tumor/câncer e neoplasias tumorais (Linnemann et al., 2015). Em as- pectos específicos, os antígenos incluem NY-ESO, EGFRvill, Muc-1, Her2, CA-125, WT-1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4 e CEA. Em aspectos específicos, os antígenos dos dois ou mais recepto- res de antígenos incluem, entre outros, CD19, EBNA, WT1, CD123, NY- ESO, EGFRvIII, MUC1, Her2, CA-125, WT1, Mage-A3, Mage-A4, Mage- A10, TRAIL/DR4 e/ou CEA. As sequências para estes antígenos são co- nhecidas na técnica, por exemplo (todos são número de acesso do Gen- Bank6&), CD19 (No. de acesso NG 007275.1), EBNA (No. de acesso NG 002392.2), WT1 (No. de acesso NG 009272.1), CD123 (No. de acesso NC 000023.11), NY-ESO (No. de acesso NC 000023.11), EG- FRVvIII (No. de acesso NG 007726.3), MUC1 (No. de acesso NG

029383.1), HER2 (No. de acesso. NG 007503.1), CA-125 (No. de aces- so NG 055257.1), WT1 (No. de acesso NG 009272.1), Mage-A3 (No. de acesso NG 013244.1), Mage-A4 (No. de acesso NG 013245.1), Mage-

A1O (No. de acesso NC 000023.11), TRAIL/DR4 (No. de acesso NC 000003.12), e/ou CEA (No. de acesso. NC 000019.10).

[00127] Os antígenos associados ao tumor podem ser derivados de cânceres da próstata, mama, colorretal, pulmão, pancreático, renal, mesotelioma, ovário ou melanoma. Antígenos associados ao tumor exemplificadores ou antígenos derivados de células tumorais incluem MAGE 1, 3, e MAGE 4 (ou outros antígenos MAGE como aqueles re- velados na publicação Internacional de Patentes No. WO99/40188); PRAME; BAGE; RAGE, Lage (também conhecido como NY ESO 1); SAGE; e HAGE ou GAGE. Estes exemplos não limitantes de antíge- nos tumorais são expressados em uma vasta gama de tipos de tumo- res, como melanoma, carcinoma do pulmão, sarcoma e carcinoma da bexiga. Ver, por exemplo, a patente US nº 6.544.518. Os antígenos associados ao tumor do câncer da próstata incluem, por exemplo, o antígeno da membrana específico da próstata (PSMA), o antígeno es- pecífico da próstata (PSA), os fosfatos de ácido prostático, o NKX3.1 e o antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata (STEAP).

[00128] Outros antígenos associados ao tumor incluem Plu-1, HASH-1, HasH-2, Cripto e Criptina. Além disso, um antígeno tumoral pode ser um hormônio de auto peptídeo, como o hormônio liberador de gonadotrofina (GNRH) de comprimento total, um peptídeo curto de aminoácidos de comprimento, útil no tratamento de muitos cânce- res.

[00129] Os antígenos tumorais incluem antígenos tumorais deriva- dos de cânceres que são caracterizados pela expressão de antígenos associados ao tumor, como a expressão de HER-2/neu. Os antígenos associados ao tumor de interesse incluem antígenos tumorais especí- ficos da linhagem, como os antígenos da linhagem melanócito- melanoma MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, tirosinase e proteí- na relacionada à tirosinase. Os antígenos ilustrativos associados ao tumor incluem, mas não se limitam a, antígenos tumorais derivados de ou que compreendam qualquer uma ou mais de p53, Ras, c-Myc, seri- na citoplasmática/quinases de treonina (por exemplo, A-Raf, B-Raf e C-Raf, quinases dependentes de ciclina) MAGE-A1, MAGE-A?2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, Tirosinase, TRP-1, TRP-2, ART- 4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC?, fosfoinosi- tídeo 3-quinases (PI3Ks), receptores TRK, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, Antígeno tumoral de Wilms (WT1), AFP, - catenina/m, Caspase-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAAO205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, Miosina/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, Anexina Il, CDC27/m, TPI/mbcer- abl, BCR-ABL, fator regulador de interferon 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, PmMI/RAR, transdutor de sinal de cálcio associado a tumor 1 (TACSTD1) TACSTD?, receptor de tirosina quinase (p.ex., receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (in particular, EGFRvII!), receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), re- ceptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR)), tirosina quinase citoplasmática (p.ex., família src, família syk-ZAP70), quinase ligada à integrina (ILK), transdutores de sinal e ativadores de transcri- ção STAT3, STATS e STATE, fator induzível por hipóxia (p.ex., HIF-1 e HIF-2), Fator Nuclear-Kappa B (NF-B), receptores Notch (p.ex., Notch1-4), c-Met, alvos mamíferos da rapamicina (nNTOR), WNT, qui- nases extracelulares reguladas por sinal (ERKs), e suas subunidades regulatórias, PMSA, PR-3, MDM2, Mesotelina, carcinoma de células renais-5T4, SM22-alfa, anidrases carbônicas | (CAI) e IX (CAIX) (tam- bém conhecida como G250), STEAD, TEL/AML1, GD2, proteinase3, hTERT, pontos de interrupção de translocação de sarcoma, EphA2, ML-IAP, EDpCAM, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAXS,

ALK, receptor de andrógeno, ciclina B1, ácido polissiálico, MYCN, RhoC, GD3, fucosil GM1, mesotélio, PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BO- RIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, proteína de esperma 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, legumaína, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, antígeno relacionado com fos 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1, LRRNI1 e idiotipo.

[00130] Os antígenos podem incluir regiões epitópicas ou peptídeos epitópicos derivados de genes mutados em células tumorais ou de ge- nes transcritos a diferentes níveis em células tumorais em comparação com células normais, como a enzima telomerase, survivina, mesoteli- na, ras mutada, rearranjo bcr/abl, Her2/neu, p53 mutado ou do tipo selvagem, citocromo P450 1B1, e sequências de íntron anormalmente expressas, como N-acetilglucosaminiltransferase-V; rearranjos clonais de genes de imunoglobulina que geram idiótipos únicos em mieloma e linfomas de células B; antígenos tumorais que incluem regiões epitópi- cas ou peptídeos epitópicos derivados de processos oncovirais, como proteínas do vírus do papiloma humano E6 e E7; proteína do vírus Epstein bar LMP2; proteínas oncofetais não mutadas com expressão seletiva tumoral, como antígeno carcinoembrionário e alfa-fetopro- teína.

[00131] Em outras modalidades, um antígeno é obtido ou derivado de um microrganismo patogênico ou de um microrganismo patogênico oportunista (também chamado aqui de microrganismo de doença in- fecciosa), como um vírus, fungo, parasita e bactéria. Em determinadas modalidades, os antígenos derivados desse microrganismo incluem proteínas de comprimento total.

[00132] Os organismos patogênicos ilustrativos cujos antígenos são contemplados para uso no método descrito incluem vírus da imunode- ficiência humana (HIV), vírus do herpes simples (HSV), vírus respirató-

rio sincicial (VRS), citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), influenza A, B, E C, vírus da estomatite vesiculosa (VSV), vírus da es- tomatite vesiculosa (VSV), poliomavírus (por exemplo, vírus BK e vírus JC), adenovírus, espécies de Staphylococcus incluindo Staphylococ- cus aureus resistente à meticilina (MRSA) e espécies de Streptococ- cus, incluindo Streptococcus pneumoniae. Como seria entendido pelo versado na técnica, as proteínas derivadas desses e de outros micror- ganismos patogênicos para uso como antígeno, conforme descrito aqui, e as sequências de nucleotídeos que codificam as proteínas po- dem ser identificadas em publicações e em bancos de dados públicos como GENBANKGO, SWISS-PROTO e TREMBLO.

[00133] Os antígenos derivados do vírus da imunodeficiência hu- mana (HIV) incluem qualquer uma das proteínas estruturais do vírion do HIV (por exemplo, gp120, gp41, p17, p24), protease, transcriptase reversa ou proteínas do HIV codificadas por tat, rev, nef, vif, vpr e vpu.

[00134] Os antígenos derivados do vírus do herpes simples (por exemplo, HSV1 e HSV2) incluem, mas não se limitam a, proteínas ex- pressadas a partir de genes HSV tardios. O grupo tardio de genes co- difica predominantemente proteínas que formam a partícula vírion. Es- sas proteínas incluem as cinco proteínas de (UL) que formam o capsí- deo viral: UL6, UL18, UL35, UL38 e a proteína principal do capsídeo UL19, UL45 e UL27, cada uma das quais pode ser usada como um antígeno, conforme descrito aqui. Outras proteínas ilustrativas do HSV contempladas para uso como antígenos aqui incluem as proteínas ICP27 (H1, H2), glicoproteína B (gB) e glicoproteína D (gD). O genoma do HSV compreende pelo menos 74 genes, cada um codificando uma proteína que poderia potencialmente ser usada como um antígeno.

[00135] Os antígenos derivados do citomegalovírus (CMV) incluem proteínas estruturais do CMV, antígenos virais expressados durante as fases inicial e inicial imediatas da replicação do vírus, glicoproteínas | e

Ill, proteína do capsídeo, proteína de revestimento, proteína de matriz inferior pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 e 162 (UL123 e UL122), produtos proteicos do agrupamento de genes de UL128-UL150 (Ryk- man, et al., 2006), glicoproteína B de envelope (gB), gH, gN e pp150. Como seria entendido pelo versado na técnica, as proteínas CMV para uso como antígenos descritos aqui podem ser identificadas em bancos de dados públicos como GENBANKO, SWISS-PROTO e TREMBLO (ver por exemplo, Bennekov et al., 2004; Loewendorf et al., 2010; Marschall et al., 2009).

[00136] Os antígenos derivados do vírus Epstein-Barr (EBV) que são contemplados para uso em determinadas modalidades incluem proteínas líticas EBV gp350 e gp110, proteínas EBV produzidas duran- te a infecção latente do ciclo, incluindo o antígeno nuclear de Epstein- Barr (EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3SB, EBNA-3C, proteína lí- der EBNA (EBNA-LP), e proteínas latentes de membrana (LMP)-1, LMP-2A e LMP-2B (ver, p.ex., Lockey et al., 2008).

[00137] Os antígenos derivados do vírus respiratório sincicial (VRS) que são contemplados para uso aqui incluem qualquer uma das onze proteínas codificadas pelo genoma do VSR, ou fragmentos antigênicos do mesmo: NS1, NS2, N (proteína nucleocapsídeo), M (proteína de matriz) SH, G e F (proteínas de revestimento viral), M2 (segunda pro- teína de matriz), M2-1 (fator de alongamento), M2-2 (regulação de transcrição), RNA polimerase e fosfoproteína P.

[00138] Os antígenos derivados do vírus da estomatite vesicular (VSV) que são contemplados para uso incluem qualquer uma das cin- co proteínas principais codificadas pelo genoma do VSV e seus frag- mentos antigênicos: proteína grande (L), glicoproteína (G), nucleopro- teína (N), fosfoproteína (P) e proteína matriz (M) (ver, por exemplo, Rieder et al., 1999).

[00139] Os antígenos derivados de um vírus influenza que são con-

templados para uso em determinadas modalidades incluem hemaglu- tinina (HA), neuraminidase (NA), nucleoproteína (NP), proteínas de matriz M1 e M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 e PB2.

[00140] —Antígenos virais exemplares também incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos de adenovírus, polipeptídeos de alfavírus, po- lipeptídeos de calicivírus (por exemplo, um antígeno de capsídeo de calicivírus), polipeptídeos de coronavírus, polipeptídeos do vírus da cinomose, polipeptídeos do vírus ebola, polipeptídeos de enterovírus, polipeptídeos do flavivírus, polipeptídeos do vírus da hepatite (AE) (um núcleo da hepatite B ou antígeno de superfície, um vírus da hepatite C E1 ou glicoproteínas do vírus E2, ou proteínas não estruturais), poli- peptídeos do herpesvírus (incluindo uma glicoproteína do vírus do her- pes simples ou vírus varicela zóster), polipeptídeos do vírus da perito- nite infecciosa, polipeptídeos do vírus da leucemia, polipeptídeos do vírus Marburg, polipeptídeos do ortomixovírus, polipeptídeos do vírus do papiloma, polipeptídeos do vírus da parainfluenza (por exemplo, polipeptídeos do vírus da hemaglutinina e da neuraminidase), polipep- tídeos do paramixovírus, polipeptídeos de parvovírus, polipeptídeos de pestivírus, polipeptídeos de vírus picorna (por exemplo, um polipeptí- deo do capsídeo de poliovírus), polipeptídeos de vírus pox (por exem- plo, um polipeptídeo do vírus vaccinia), polipeptídeos do vírus da raiva (por exemplo, uma glicoproteína G do vírus da raiva), polipeptídeos de reovírus, polipeptídeos de retrovírus e polipeptídeos de rotavírus.

[00141] Em determinadas modalidades, o antígeno pode ser antí- genos bacterianos. Em determinadas modalidades, um antígeno bac- teriano de interesse pode ser um polipeptídeo secretado. Em determi- nadas modalidades, antígenos bacterianos incluem antígenos que têm uma porção ou porções do polipeptídeo exposto na superfície celular externa das bactérias.

[00142] Os antígenos derivados de espécies de Staphylococcus incluindo Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) que são contemplados para uso incluem reguladores de virulência, como o sistema Agr, Sar e Sae, o sistema Arl, homólogos Sar (Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ e TcaR), o sistema Srr e TRAP. Outras proteínas de Staphylococcus que podem servir como antígenos incluem proteínas Clp, HtrA, MsrR, aconitase, CcpA, SvrA, Msa, CÍvA e CfvB (ver, por exemplo, Staphylococcus: Molecular Gene- tics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay). Os genomas de duas espécies de Staphylococcus aureus (N315 e Mu50) foram se- quenciados e estão publicamente disponíveis, por exemplo, em PA- TRIC (PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder et al., 2007). Como seria entendido pelo versado na técnica, as proteínas de Staphylococcus para uso como antígenos também po- dem ser identificadas em outros bancos de dados públicos como Gen- BankO, Swiss-Prot6 e TTEMBLO.

[00143] Os antígenos derivados do Streptococcus pneumoniae que são contemplados para uso em determinadas modalidades descritas aqui incluem pneumolisina, PspA, proteína A de ligação à colina (CbpA), NanA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht e proteínas pilinas (RrgA; RrgB; RrgC). As proteínas antigênicas do Streptococcus pneu- moniae também são conhecidas na técnica e podem ser usadas como antígeno em algumas modalidades (ver, por exemplo, Zysk et al. 2000). A sequência completa do genoma de uma cepa virulenta do Streptococcus pneumoniae foi sequenciada e, como seria entendido pela pessoa qualificada, as proteínas de S. pneumoniae a serem usa- das aqui também podem ser identificadas em outros bancos de dados públicos como GENBANKO, SWISS-PROTO e TREMBLO. As proteí- nas de interesse particular para antígenos de acordo com a presente revelação incluem fatores de virulência e proteínas previstas para se- rem expostas à superfície dos pneumococos (ver, por exemplo, Frolet et al., 2010).

[00144] “Exemplos de antígenos bacterianos que podem ser usados como antígenos incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos de Acti- nomyces, polipeptídeos de Bacillus, polipeptídeos de Bacteroides, po- lipeptídeos de Bordetella, polipeptídeos de Bartonella, polipeptídeos de Borrelia (p.ex., B. burgdorferi OspA), polipeptídeos de Brucella, poli- peptídeos de Campylobacter, polipeptídeos de Capnocytophaga, poli- peptídeos de Chlamydia, polipeptídeos de Corynebacterium, polipeptí- deos de Coxiella, polipeptídeos de Dermatophilus, polipeptídeos de Enterococcus, polipeptídeos de Ehrlichia, polipeptídeos de Escheri- chia, polipeptídeos de Francisella, polipeptídeos de Fusobacterium, polipeptídeos de Haemobartonella, polipeptídeos de Haemophilus (p.ex., proteína da membrana externa da H. influenzae tipo b), polipep- tídeos de Helicobacter, polipeptídeos de Klebsiella, polipeptídeos de bactérias de forma L, polipeptídeos de Leptospira, polipeptídeos de Listeria, polipeptídeos de Mycobacteria, polipeptídeos de Mycoplasma, polipeptídeos de Neisseria, polipeptídeos de Neorickettsia, polipeptí- deos de Nocardia, polipeptídeos de Pasteurella, polipeptídeos de Pep- tococcus, polipeptídeos de Peptostreptococcus, polipeptídeos de Pneumococcus (ou seja, polipeptídeos de S. pneumoniae) (ver descri- ção aqui), polipeptídeos de Proteus, polipeptídeos de Pseudomonas, polipeptídeos de Rickettsia, polipeptídeos de Rochalimaea, polipeptí- deos de Salmonella, polipeptídeos de Shigella, polipeptídeos de Sta- phylococcus, polipeptídeos de streptococcus do grupo A (p.ex., proteí- nas M de S. pyogenes), polipeptídeos de streptococcus do grupoB (S. agalactiae), polipeptídeos de Treponema, e polipeptídeos de Yersinia (p.ex., antígenos de Y pestis F1 e V).

[00145] Exemplos de antígenos fúngicos incluem, mas não se limi- tam a, Absidia polypeptides, Acremonium polypeptides, Alternaria polypeptides, Aspergillus polypeptides, Basidiobolus polypeptides, Bi-

polaris polypeptides, Blastomyces polypeptides, Candida polypeptides, Coccidioides polypeptides, Conidiobolus polypeptides, Cryptococcus polypeptides, Curvalaria polypeptides, Epidermophyton polypeptides, Exophiala polypeptides, Geotrichum polypeptides, Histoplasma poly- peptides, Madurella polypeptides, Malassezia polypeptides, Microspo- rum polypeptides, Moniliella polypeptides, Mortierella polypeptides, Mucor polypeptides, Paecilomyces polypeptides, Penicillium polypepti- des, Phialemonium polypeptides, Phialophora polypeptides, Prototheca polypeptides, Pseudallescheria polypeptides, Pseudomicrodochium polypeptides, Pythium polypeptides, Rhinosporidium polypeptides, Rhizopus polypeptides, Scolecobasidium polypeptides, Sporothrix polypeptides, Stemphylium polypeptides, Trichophyton polypeptides, Trichosporon polypeptides e Xylohypha polypeptides.

[00146] Exemplos de antígenos de protozoários parasitas incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos de Babesia, polipeptídeos de Ba- lantídio, polipeptídeos de Besnoitia, polipeptídeos de Cryptosporidium, polipeptídeos de Eimeria, polipeptídeos de Encephalitozoon, polipeptí- deos de Entamoeba, polipeptídeos de Giardia, polipeptídeos de Ham- mondia, polipeptídeos de Hepatozoon, polipeptídeos de Isospora, poli- peptídeos de Leishmania, polipeptídeos de Microsporidia, polipeptí- deos de Neospora, polipeptídeos de Nosema, polipeptídeos de Penta- trichomonas, polipeptídeos de Plasmodium. Exemplos de antígenos de helmintos parasitas incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos de Acanthocheilonema, polipeptídeos de Aelurostrongylus, polipeptídeos de Ancylostoma, polipeptídeos de Angiostrongylus, polipeptídeos de Ascaris, polipeptídeos de Brugia, polipeptídeos de Bunostomum, poli- peptídeos de Capillaria, polipeptídeos de Chabertia, polipeptídeos de Cooperia, polipeptídeos de Crenosoma, polipeptídeos de Dictyocaulus, polipeptídeos de Dioctophyme, polipeptídeos de Dipetalonema, poli- peptídeos de Diphyllobothrium, polipeptídeos de Diplydium, polipeptí-

deos de Dirofilaria, polipeptídeos de Dracunculus, polipeptídeos de En- terobius, polipeptídeos de Filaroides, polipeptídeos de Haemonchus, polipeptídeos de Lagochilascaris, polipeptídeos de Loa, polipeptídeos de Mansonella, polipeptídeos de Muellerius, polipeptídeos de Na- nophyetus, polipeptídeos de Necator, polipeptídeos de Nematodirus, polipeptídeos de Oesophagostomum, polipeptídeos de Onchocerca, polipeptídeos de Opisthorchis, polipeptídeos de Ostertagia, polipeptí- deos de Parafilaria, polipeptídeos de Paragonimus, polipeptídeos de Parascaris, polipeptídeos de Physaloptera, polipeptídeos de Protos- trongylus, polipeptídeos de Setaria, polipeptídeos de Spirocerca, poli- peptídeos de Spirometra, polipeptídeos de Stephanofilaria, polipeptí- deos de Strongyloides, polipeptídeos de Strongylus, polipeptídeos de Thelazia, polipeptídeos de Toxascaris, polipeptídeos de Toxocara, po- lipeptídeos de Trichinella, polipeptídeos de Trichostrongylus, polipeptí- deos de Trichuris, polipeptídeos de Uncinaria e polipeptídeos de Wu- chereria. (Por exemplo, P.falciparum circunsporozoite (PÍCSP)), prote- ína 2 da superfície de Sporozoite (PÍSSP2), térmico carboxil do antí- geno do estado hepático 1 (PÍLSA1 c-term) e proteína 1 exportada (PfEXp-1), polipeptídeos de Pneumocistis, polipeptídeos de Sarcocys- tis, polipeptídeos de Schistosoma, polipeptídeos de Theileria, polipep- tídeos de Toxoplasma e polipeptídeos de Trypanosoma.

[00147] “Exemplos de antígenos ectoparasitas incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos (incluindo antígenos e alérgenos) de pulgas; carrapatos, incluindo carrapatos de carcaças duras e de carcaças ma- cias; moscas, como mosquitos, flebotomíneos, borrachudos, mutuca, moscas-dos-chifres, moscas de veado, moscas tsé-tsé, moscas de estábulo, moscas causadoras de miíase e muruim; formigas; aranhas, piolhos; ácaros; e hemípteras, como percevejos e barbeiros.

D. Genes suicidas

[00148] O CAR das células imunes da presente revelação pode in- cluir um ou mais genes suicidas. O termo "gene suicida", como usado aqui, é definido como um gene que, após a administração de um pro- fármaco, afeta a transição de um produto genético para um composto que mata a sua célula hospedeira. Exemplos de combinações de ge- nes suicidas/profármacos dependentes que podem ser usados são o vírus da herpes simples-timidina quinase (HSV-tk) e ganciclovir, aci- clovir ou FIAU; oxidoredutase e cicloheximida; citosina deaminase e 5- fluorocitosina; timidina quinase timidilato quinase (Tdk::Tmk) e desoxi- citidina quinase; e citosina arabinose.

[00149] A fosforilase nucleosídeo da purina de E. coli, um chamado gene suicida que converte o pró-fármaco 6-metilpurina desoxirribose em purina 6-metilpurina tóxica. Outros exemplos de genes suicidas usados com a terapia pró-fármaco são o gene da citosina deaminase de E. coli e o gene da timidina quinase de HSV.

[00150] Genes suicidas exemplares incluem CD20, CD52, EGFRv3, rimiducid ou caspase 9 induzível. Em uma modalidade, pode ser usa- da uma versão truncada da variante Ill do EGFR (EGFRv3) como um antígeno suicida que pode ter sofrido ablação pelo cetuximabe. Outros genes suicidas conhecidos na técnica que podem ser usados na pre- sente revelação incluem purina nucleosídeo fosforilase (PNP), enzi- mas do citocromo p450 (CYP), carboxipeptidases (CP), carboxileste- rase (CE), nitoredutase (NTR), guanina ribosiltransferase (XGRTP), enzimas glicoidase, Metionina-a,y-liase (MET) e timidina fosforilase (TP). E. Métodos de aplicação

[00151] Um versado na técnica seria bem equipado para construir um vetor através de técnicas recombinantes padrão (ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001 e Ausubel et al., 1996, ambos incorporados aqui por referência) para a expressão dos receptores de antígeno da pre- sente revelação. Os vetores incluem, mas não se limitam a, plasmí- deos, cosmídeos, vírus (bacteriófago, vírus animais e vírus vegetais) e cromossomos artificiais (por exemplo, YACSs), como vetores retrovirais (por exemplo, derivados de vetores do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV, etc), vetores lentivirais (por exemplo, derivados do HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV etc, vetores adenovirais (Ad), incluindo replicação competente, replicação deficien- te e formas não intestinais, vetores virais adeno associados (AAV), ve- tores do vírus símio 40 (SV-40), vetores do vírus do papiloma bovino, vetores do vírus Epstein-Barr, vetores do vírus herpes, vetores do ví- rus vaccinia, vetores do vírus do sarcoma murino de Harvey, vetores do vírus do tumor mamário murino, vetores do parvoivírus, vetores do vírus da poliomielite, vetores do vírus da estomatite vesiculosa, vetores do vírus maraba e vetores do adenovírus enadenotucirev do grupo B. a. Vetores virais

[00152] Os vetores virais que codificam um receptor de antígeno podem ser fornecidos em determinados aspectos da presente revela- ção. Na geração de vetores virais recombinantes, genes não essenci- ais são tipicamente substituídos por um gene ou sequência de codifi- cação para uma proteína heteróloga (ou não nativa). Um vetor viral é uma espécie de construção de expressão que utiliza sequências virais para introduzir ácido nucleico e possivelmente proteínas em uma célu- la. A capacidade de determinados vírus infectarem células ou entrarem em células através da endocitose mediada por receptores, e de se in- tegrarem em genomas de células hospedeiras e expressarem genes virais de forma estável e eficiente, tornaram-nos candidatos atraentes para a transferência de ácidos nucleicos estranhos para células (por exemplo, células de mamíferos). Exemplos não limitantes de vetores de vírus que podem ser usados para fornecer um ácido nucleico de determinados aspectos da presente invenção são descritos abaixo.

[00153] Os lentivírus são retrovírus complexos, que, além dos ge- nes comuns retrovirais gag, pol e env, contêm outros genes com fun- ção regulatória ou estrutural. Os vetores lantivirais são bem conheci- dos na técnica (ver, por exemplo, as patentes US 6.013.516 e

5.994.136).

[00154] Os vetores lentivirais recombinantes são capazes de infec- tar células não divisórias e podem ser usados para a transferência de genes in vivo e ex vivo e para a expressão de sequências de ácidos nucleicos. Por exemplo, o lentivírus recombinante capaz de infectar uma célula não divisória - em que uma célula hospedeira adequada é transfectada com dois ou mais vetores que transportam as funções de empacotamento, nomeadamente gag, pol e env, bem como rev e tat - é descrito na patente US 5.994.136, incorporada aqui por referência. b. Elementos reguladores

[00155] Os cassetes de expressão incluídas nos vetores úteis na presente revelação contêm (em uma direção de 5' a 3') um promotor transcricional eucariótico ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação de proteínas, sinais de junção, incluindo sequências intervenientes, e uma sequência de terminação/poliadenilação trans- cricional. Os promotores e potenciadores que controlam a transcrição de genes codificantes de proteínas em células eucarióticas são com- postos por múltiplos elementos genéticos. A maquinaria celular é ca- paz de reunir e integrar a informação regulamentar transmitida por ca- da elemento, permitindo que diferentes genes evoluam padrões distin- tos, muitas vezes complexos, de regulação transcricional. Um promo- tor usado no contexto da presente revelação inclui promotores consti- tutivos, induzíveis e específicos do tecido. i) Promotor/potencializadores

[00156] As construções de expressão fornecidas aqui compreen-

dem um promotor para impulsionar a expressão do receptor de antí- genos. Um promotor é geralmente composto por uma sequência que funciona para posicionar o local de início para a síntese de RNA. O exemplo mais conhecido disto é a caixa TATA, mas em alguns promo- tores que não têm uma caixa TATA, como, por exemplo, o promotor do gene de desoxinucleotidil transferase terminal de mamífero e o promo- tor dos genes tardios SV40, um elemento discreto sobreposto ao sítio inicial ajuda a fixar o local de início. Os elementos promotores adicio- nais regulam a frequência da iniciação transcricional. Normalmente, estes estão localizados na região a 30110 pb a montante do local de partida, embora um número de promotores tenha sido demonstrado para conter elementos funcionais a jusante do local de partida tam- bém. Para apresentar uma sequência de codificação "sob o controle de” um promotor, um posiciona a extremidade 5' do local de iniciação da transcrição da estrutura de leitura transcricional "a jusante" do (ou seja, 3' do) promotor escolhido. O promotor "a montante" estimula a transcrição do DNA e promove a expressão do RNA codificado.

[00157] O espaçamento entre os elementos promotores é frequen- temente flexível, de modo que a função do promotor seja preservada quando os elementos são invertidos ou movidos em relação uns aos outros. No promotor tk, o espaçamento entre os elementos promotores pode ser aumentado para 50 bp antes da atividade começar a decli- nar. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independente para ativar a transcrição. Um promotor pode ou não ser usado em conjunto com um "potencializador", que se refere a uma sequência reguladora de ação cis envolvida na ativação transcricional de uma sequência de ácidos nucleicos.

[00158] Um promotor poderá ser um naturalmente associado com uma sequência de ácido nucleico, como pode ser obtido através do isolamento das sequências 5' não codificantes localizadas a montante do segmento de codificação e/ou éxon. Tal promotor pode ser referido como “endógeno”. Da mesma forma, um potencializador pode ser um naturalmente associado a uma sequência de ácidos nucleicos, locali- zada a jusante ou a montante dessa sequência. Alternativamente, de- terminadas vantagens serão obtidas ao posicionar um segmento de codificação de ácidos nucleicos sob o controle de um promotor recom- binante ou heterólogo, que se refere a um promotor que não é nor- malmente associado com a sequência de ácido nucleico em seu ambi- ente natural. Um potencializador recombinante ou heterólogo refere-se também a um potenciador normalmente não associado a uma sequên- cia de ácidos nucleicos no seu ambiente natural. Tais promotores ou potenciadores podem incluir promotores ou potenciadores de outros genes, e promotores ou potenciadores isolados de qualquer outro ví- rus, ou células procarióticas ou eucarióticas, e promotores ou potenci- adores que não "ocorrem naturalmente", ou seja, contendo elementos diferentes de diferentes regiões reguladoras transcricionais, e/ou mu- tações que alteram a expressão. Por exemplo, os promotores mais usados na construção de DNA recombinante incluem os sistemas de promotores de lactamase (penicilinase), lactose e triptofano (trp). Além de produzir sequências de ácidos nucleicos de promotores e potencia- dores de forma sintética, as sequências podem ser produzidas usando clonagem recombinante e/ou tecnologia de amplificação de ácidos nu- cléicos, incluindo PORTY, em conjunto com as composições descritas aqui. Além disso, é contemplado que as sequências de controle que direcionam a transcrição e/ou expressão de sequências dentro de or- ganelas não nucleares, como mitocôndrias, cloroplastos e similares, também podem ser empregadas.

[00159] Naturalmente, será importante empregar um promotor e/ou potenciador que efetivamente direciona a expressão do segmento de

DNA na organela, tipo de célula, tecido, órgão ou organismo escolhido para expressão. O versado na técnica da biologia molecular geralmen- te conhece o uso de promotores, potenciadores e combinações de ti- pos de células para expressão de proteínas, (ver, por exemplo, Sam- brook et al. 1989, aqui incorporado por referência). Os promotores empregados podem ser constitutivos, específicos para tecidos, induzí- veis e/ou úteis nas condições apropriadas para direcionar a expressão de alto nível do segmento de DNA introduzido, como é vantajoso na produção em larga escala de proteínas recombinantes e/ou peptídeos. O promotor pode ser heterólogo ou endógeno.

[00160] Além disso, qualquer combinação de promotor/potenciador (como, por exemplo, o banco de dados de promotor eucariótico EPDB, através do site epd.isb-sib.ch/) também pode ser usada para direcionar a expressão. O uso de um sistema de expressão citoplasmática T3, T7 ou SP6 é outra possível modalidade. As células eucarióticas podem suportar a transcrição citoplasmática de determinados promotores bac- terianos se for fornecida a polimerase bacteriana adequada, quer co- mo parte do complexo de administração, quer como uma construção adicional de expressão genética.

[00161] Exemplos não limitantes de promotores incluem promotores virais precoces ou tardios, como promotores SV40 precoces ou tardi- os, promotores imediatos precoces do citomegalovírus (CMV), promo- tores precoces do vírus do sarcoma de Rous (RSV); promotores de células eucarióticas, como, por exemplo, promotor de beta actina, promotor GADPH, promotor de metalotioneina; e promotores de ele- mentos de resposta concatenados, como promotores de elementos de resposta AMP cíclicos (cre), promotor de elemento de resposta de so- ro (sre), promotor de éster de forbol (TPA) e promotores de elementos de resposta (tre) perto de uma caixa TATA mínima. Também é possí- vel usar sequências de promotores de hormônio do crescimento hu-

mano (por exemplo, o promotor mínimo do hormônio do crescimento humano descrito em Genbank, no. De acesso X05244, nucleotídeo 283-341) ou um promotor do tumor mamário do camundongo (disponí- vel a partir da ATCC, Cat No. ATCC 45007). Em determinadas modali- dades, o promotor é CMV IE, dectina-1, dectina-2, CD11c humano, F4/80, SM22, VRS, SV40, Ad MLP, beta-actina, promotor MHC classe | ou MHC classe Il, porém qualquer outro promotor que seja útil para direcionar a expressão do gene terapêutico é aplicável à prática da presente revelação.

[00162] Em determinados aspectos, os métodos da revelação tam- bém se referem a sequências de potenciadores, ou seja, sequências de ácidos nucleicos que aumentam a atividade de um promotor e que têm potencial para agir no cis, e independentemente da sua orienta- ção, mesmo em distâncias relativamente longas (até vários quilobases longe do promotor alvo). No entanto, a função de potenciador não está necessariamente restrita a distâncias tão longas, pois também podem funcionar próximo de um determinado promotor. ii) Sinais de iniciação e expressão associada

[00163] Um sinal de iniciação específico também pode ser usado nas construções de expressão fornecidas na presente revelação para uma tradução eficiente de sequências de codificação. Estes sinais in- cluem o códon de iniciação ATG ou sequências adjacentes. Podem ser necessários sinais de controle translacional exógenos, incluindo o códon de iniciação ATG. Um versado na técnica seria prontamente capaz de determinar isso e fornecer os sinais necessários. Sabe-se que o códon de iniciação deve estar "dentro do quadro" com o quadro de leitura da sequência de codificação pretendida para garantir a tra- dução de todo o elemento de inserção. Os sinais de controle translaci- onal exógeno e os códons de iniciação podem ser naturais ou sintéti- cos. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos apropriados do potencializador de transcrição.

[00164] Em determinadas modalidades, o uso de elementos do sítio de entrada interno no ribossomo (IRES) é usado para criar mensagens multigene, ou policistrônico. Os elementos IRES são capazes de igno- rar o modelo de digitalização do ribossomo de tradução dependente de Cap metilado de 5' e começar a tradução em locais internos. Foram descritos elementos IRES de dois membros da família picornavirus (pólio e encefalomiocardite), bem como um IRES de uma mensagem de mamíferos. Os elementos IRES podem ser ligados a quadro de lei- tura aberto heterólogo. Podem ser transcritos vários quadros de leitura abertos em conjunto, cada um separado por um IRES, criando mensa- gens policistrônicas. Em virtude do elemento IRES, cada quadro de leitura aberto é acessível a ribossomos para uma tradução eficiente. Vários genes podem ser expressados de forma eficiente usando um único promotor/potenciador para transcrever uma única mensagem.

[00165] Além disso, determinados elementos da sequência 2A po- dem ser usados para criar uma coexpressão ou ligação de genes nas construções fornecidas na presente revelação. Por exemplo, as se- quências de clivagem poderiam ser usadas para coexpressar genes ligando quadros de leitura abertos para formar um único cístron. Uma sequência de clivagem exemplar é a F2A (vírus da febre aftosa 2A) ou uma sequência "semelhante a 2A" (por exemplo, vírus Thosea asigna 2A; T2A). ii) Origens da replicação

[00166] Afim de propagar um vetor em uma célula hospedeira, ele pode conter uma ou mais origens de sítios de replicação (frequente- mente designados por "ori"), por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos correspondente ao oriP da EBV, como descrito acima, ou um oriP geneticamente modificado com uma função semelhante ou eleva- da na programação, que é uma sequência específica de ácidos nuclei-

cos na qual a replicação é iniciada. Alternativamente, pode ser usada uma origem de replicação de outro vírus replicador extra-cromossô- mico, conforme descrito acima, ou uma sequência replicante de forma autônoma (ARS). Cc. Marcadores de seleção e de triagem

[00167] Em algumas modalidades, as células contendo uma cons- trução da presente revelação podem ser identificadas in vitro ou in vi- vo, incluindo um marcador no vetor de expressão. Esses marcadores confeririam uma alteração identificável à célula, permitindo uma fácil identificação das células contendo o vetor de expressão. Geralmente, um marcador de seleção é aquele que confere uma propriedade que permite a seleção. Um marcador de seleção positivo é aquele em que a presença do marcador permite sua seleção, enquanto um marcador de seleção negativo é aquele em que sua presença impede sua sele- ção. Um exemplo de um marcador de seleção positivo é um marcador de resistência a fármacos.

[00168] Geralmente, a inclusão de um marcador de seleção de fár- macos auxilia na clonagem e identificação de transformantes, por exemplo, genes que conferem resistência à neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol são marcadores de sele- ção úteis. Além de marcadores que conferem um fenótipo que permite a discriminação de transformantes com base na implementação de condições, outros tipos de marcadores, incluindo marcadores de tria- gem, como GFP, cuja base é a análise colorimétrica, também são con- templados. Alternativamente, as enzimas triáveis como marcadores de seleção negativos, como vírus da herpes simples timidina quinase (tk) ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT) podem ser usados. Um profis- sional versado na técnica também saberia como empregar marcadores imunológicos, possivelmente em conjunto com a análise FACS. O marcador usado não é considerado importante, desde que seja capaz de ser expressado em simultâneo com o ácido nucleico que codifica um produto genético. Outros exemplos de seleção e marcadores triá- veis são bem conhecidos por um profissional versado na técnica.

[00169] d.Outros métodos de aplicação de ácido nucleico

[00170] Além da administração viral dos ácidos nucleicos que codi- ficam o receptor do antígeno, a seguir são métodos adicionais de ad- ministração do gene recombinante a uma determinada célula hospe- deira, sendo assim considerados na presente revelação.

[00171] A introdução de um ácido nucleico, como o DNA ou RNA, nas células imunes da presente revelação pode usar quaisquer méto- dos adequados para a administração de ácidos nucleicos para a trans- formação de uma célula, tal como descrito aqui ou como seria conhe- cido por um versado na técnica. Tais métodos incluem, entre outros, a aplicação direta de DNA, como por transfecção ex vivo, por injeção, incluindo a microinjeção); por eletroporação; por precipitação de fosfa- to de cálcio; por uso de DEAE-dextrano seguido de polietilenoglicol; por carregamento sônico direto; por transfecção mediada por liposso- mo e transfecção mediada por receptor; por bombardeamento de mi- croprojétil; por agitação com fibras de carboneto de silício; por trans- formação mediada por Agrobacterium; pela absorção de DNA mediada por dessecação/inibição e qualquer combinação desses métodos. Através da aplicação de técnicas como estas, a(s) organela(s), a(s) célula(s), o(s) tecido(s) ou o(s) organismo(s) podem ser transformados de forma estável ou transitória. IV. Métodos de tratamento

[00172] Os presentes métodos podem facilitar a geração de um grande número de células NK altamente funcionais do sangue do cor- dão umbilical ou do sangue periférico para imunoterapia de células NK. Os presentes métodos também podem ser usados para melhorar a funcionalidade da terapia com células CAR-NK. Assim, são forneci-

dos métodos para o tratamento de doenças pela infusão adotiva de células NK isoladamente ou em combinação com anticorpos monoclo- nais, biespecíficos e triespecíficos que ligam o CD16 ou outros recep- tores nas células NK e redirecionam as células para um alvo, aumen- tando assim a resposta contra diferentes tumores.

[00173] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece métodos de imunoterapia, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz das células NK da presente revelação. Em uma mo- dalidade, uma doença ou distúrbio médico é tratado pela transferência de uma população de células NK que provoca uma resposta imune. Em determinadas modalidades da presente revelação, o câncer ou a infecção é tratado através da transferência de uma população de célu- las NK que provoca uma resposta imunológica. São fornecidos aqui métodos para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indiví- duo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma terapia celular NK. Os métodos atuais podem ser aplicados para o tratamento de distúrbios imunes, cânceres sólidos, cânceres hematológicos e infecções virais.

[00174] Os tumores para os quais os presentes métodos de trata- mento são úteis incluem qualquer tipo de célula maligna, como os en- contrados em um tumor sólido ou em um tumor hematológico. Tumo- res sólidos exemplares podem incluir, mas não se limitam a, um tumor de um órgão selecionado do grupo que consiste em pâncreas, cólon, ceco, estômago, cérebro, cabeça, pescoço, ovário, rim, laringe, sar- coma, pulmão, bexiga, melanoma, próstata e mama. Os tumores he- matológicos exemplares incluem tumores de medula óssea, maligni- dades das células T ou B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas e similares. Outros exemplos de cânceres que podem ser tratados usando os métodos fornecidos aqui incluem, mas não se limitam a, câncer do pulmão (incluindo câncer do pulmão de células pequenas,

câncer do pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pul- mão e carcinoma escamoso do pulmão), câncer do peritôneo, câncer gástrico ou do estômago (incluindo câncer gastrointestinal e câncer do estroma gastrointestinal), câncer pancreático, câncer de colo do útero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de ma- ma, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou ute- rino, carcinoma da glândula salivar, câncer do rim ou renal, câncer de próstata, câncer da vulval, câncer de tiroide, vários tipos de câncer de cabeça e pescoço e melanoma.

[00175] O câncer pode ser especificamente do seguinte tipo histo- lógico, embora não se limite a estes: neoplasia, maligna; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de células gigantes e fusiformes; carcinoma de células pequenas; carcinoma papilar; carcinoma de célu- las escamosas; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carci- noma pilomatrix; carcinoma de células de transição; carcinoma papilar de células de transição; adenocarcinoma; gastrinoma maligno; colan- giocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular com- binado e colangiocarcinoma; adenocarcinoma trabecular; carcinoma adenoide cístico; adenocarcinoma do pólipo adenomatoso; adenocar- cinoma, polipose coli familiar; carcinoma sólido; tumor carcinoide ma- ligno; adenocarcinoma bronquíolo-alveolar; adenocarcinoma de célu- las papilares; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarci- noma oxifílico; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocar- cinoma papilar e folicular; carcinoma esclerosante não encapsulante; carcinoma cortical adrenal; carcinoma endometroide; carcinoma de apêndice da pele; adenocarcinoma apócrino; adenocarcinoma sebá- ceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermóide; cista- denocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma se- roso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucino-

so; carcinoma de células em anel de sinete; carcinoma do ducto infil- trante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatório; doença de paget mamária; carcinoma de células acinares; carcinoma adenosquamoso; adenocarcinoma com metaplasia escamosa; timo- mas malignos; tumor de estroma ovárico maligno; tecoma maligno; tumor de células granulosa maligno; androblassoma maligno; carcino- ma de células sertoli; tumor de células de leydig maligno; tumor de cé- lulas lipídicas maligno; paraganglioma extra mamário maligno; feocro- mocitoma; glomangiossarcoma; melanoma maligno; melanoma ame- lanótico; melanoma expansivo superficial; melanoma lentigo maligno; melanomas lentiginosos acrais; melanomas nodulares; melanoma ma- ligno em nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul maligno; sarcoma; fibrossarcoma; histiocitoma fibroso ma- ligno; mixossarcoma; lipossarcoma; leiomiossarcoma; rabdomiossar- coma; rabdomiossarcoma embrionário; rabdomiossarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor misto, maligno; tumor misto mulleriano; ne- froblastoma; hepatoblastoma; carcinossarcoma; mesênquimoma ma- ligno; tumor de brenner, maligno; tumor filodes maligno; sarcoma sino- vial; mesotelioma maligno; disgerminoma; carcinoma embrionário; te- ratoma maligno; struma ovarii, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma maligno; hemangiossarcoma; hemangioendotelioma maligno; sarcoma de kaposi; hemangiopericitoma maligno; linfangiossarcoma; osteos- sarcoma; osteossarcoma justacortical; condrossarcoma; condroblas- toma maligno; condrossarcoma mesenquimal; tumor de células gigan- tes do osso; sarcoma de Ewing; tumor odontogênico maligno; odonto- sarcoma ameloblástico; ameloblastoma maligno; fibrossarcoma ame- loblástico; pinealoma maligno; cordoma; glioma maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplasmático; astrocitoma fibrilar; astro- blastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neu- roectodérmico primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma;

neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogênico olfatório; meningi- oma maligno; neurofibrossarcoma; neurilemoma maligno; tumor de células granulares maligno; linfoma maligno; doença de Hodgkin; hod- gkins; paragranuloma; linfoma maligno, pequeno linfocítico; linfoma maligno de células grandes, difuso; linfoma maligno folicular; micose fungóide; outros linfomas não Hodgkin especificados; linfoma de célu- las B; linfoma não Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfociíti- co pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; LNH linfoblástico de alto grau; NHL de células pequenas não clivadas de alto grau; do- ença volumosa NHL; linfoma de células do manto; linfoma relacionado à AIDS; macroglobulinemia de Waldenstrom; histiocitose maligna; mi- eloma múltiplo; sarcoma de mastócitos; doença imunoproliferativa do intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfossarcoma; leucemia mieloide; leucemia basofílica; leucemia eosinofílica; leucemia monocítica; leucemia de mastócitos; leucemia megacarioblástica; sar- coma mieloide; leucemia de células pilosas; leucemia linfocítica crôni- ca (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML); e leucemia mieloblástica crônica.

[00176] As modalidades específicas se referem a métodos de tra- tamento da leucemia. A leucemia é um câncer do sangue ou da medu- la óssea e é caracterizada por uma proliferação anormal (produção por multiplicação) de células sanguíneas, geralmente células sanguíneas brancas (leucócitos). Faz parte do grupo amplo de doenças chamadas neoplasias hematológicas. A leucemia é um termo amplo que abrange um espectro de doenças. A leucemia é clinicamente e patologicamente dividida em suas formas aguda e crônica.

[00177] Em determinadas modalidades da presente revelação, as células NK são entregues a um indivíduo que necessita dela, como um indivíduo que tenha câncer ou uma infecção. As células, então, melho- ram o sistema imune do indivíduo para atacar o respectivo câncer ou as células patogênicas. Em alguns casos, o indivíduo é fornecido com uma ou mais doses das células imunes. Nos casos em que o indivíduo é fornecido com duas ou mais doses das células imunes, a duração entre as administrações deve ser suficiente para permitir tempo para propagação no indivíduo e, em modalidades específicas, a duração entre as doses é de 1, 2, 3, 4,5,6,7, ou mais dias.

[00178] Determinadas modalidades da presente revelação forne- cem métodos para tratar ou prevenir um distúrbio imuno-mediado. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença autoimune. Exemplos não limitantes de doenças autoimunes incluem: alopecia areata, es- pondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica, doença de Addison autoimune, doenças autoimunes da glândula adrenal, anemia hemolí- tica autoimune, hepatite autoimune, ooforite autoimune e orquite, trombocitopenia autoimune de Addison, doença autoimune da glândula adrenal, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, ooforite autoimune e orquite, trombocitopenia autoimune, doença de Behcet, penfigóide bolhosa, cardiomiopatia, dermatite em onda celíaca, sín- drome de disfunção imunológica de fadiga crônica (CFIDS), polineuro- patia desmielinizante inflamatória crônica, síndrome de Churg-Strauss, penfigóide cicatricial, síndrome de CREST, doença de aglutinina fria, doença de Crohn, lúpus discoide, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, glomerulonefrite, doença de Graves, Guillain- Barré, tireoidite de Hashimoto, fibrose pulmonar idiopática, púrpura trombocitopenia idiopática (ITP), neuropatia IgA, artrite juvenil, líquen plano, lúpus eritematoso, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, diabetes mellitus tipo 1 ou imunomedia- da, miastenia gravis, síndrome nefrótica (como doença de alteração mínima, glomeruloesclerose focal ou nefropatia mebranosa), pênfigo vulgar, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, policondrite, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiosite e dermatomiosite, agamadglobulinemia primária, cirrose biliar primária, psoríase, artrite psoriásica, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, artrite reuma- tóide, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjogren, síndrome do homem rígido, lúpus eritematoso sistêmico, lúpus eritematoso, colite ulcerativa, uveite, vasculites (como poliarterite nodosa, arterite takaya- su, arterite temporal / arterite de células gigantes, ou dermatite vasculi- te herpetiforme), vitiligo e granulomatose de Wegener. Assim, alguns exemplos de uma doença autoimune que pode ser tratada pelos mé- todos revelados aqui incluem, mas não se limitam a, esclerose múlti- pla, artrite reumatoide, lúpus sistêmico eritematoso, diabetes mellitus tipo |, doença de Crohn; colite ulcerativa, miastenia gravis, glomerulo- nefrite, espondilite anquilosante, vasculite ou psoríase. O indivíduo também pode ter uma doença alérgica, como asma.

[00179] Em ainda outra modalidade, o indivíduo é o receptor de um órgão transplantado ou células-tronco e as células NK são usadas pa- ra prevenir e/ou tratar a rejeição. O transplante pode ser um transplan- te composto, como tecidos da face. As células NK podem ser adminis- tradas antes do transplante, concomitantemente ao transplante, ou após o transplante. Em algumas modalidades, as células NK são ad- ministradas antes do transplante, como pelo menos 1 hora, pelo me- nos 12 horas, pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, pelo menos 3 semanas, pelo me- nos 4 semanas, ou pelo menos 1 mês antes do transplante. Em um exemplo específico, não limitante, a administração da quantidade tera- pêutica eficaz de células NK ocorre 3-5 dias antes do transplante.

[00180] Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser administra- do com a quimioterapia linfodepletante não mieloablativa antes da te-

rapia com células NK. A quimioterapia linfodepletante não mieloablati- va pode ser qualquer terapia adequada, que pode ser administrada por qualquer via adequada. A quimioterapia linfodepletante não mieloabla- tiva pode incluir, por exemplo, a administração de ciclofosfamida e flu- darabina, particularmente se o câncer for melanoma, que pode ser me- tastático. Uma via exemplar de administração de ciclofosfamida e flu- darabina é intravenosa. Da mesma forma, qualquer dose adequada de ciclofosfamida e fludarabina pode ser administrada. Em especial, cerca de 60 mg/kg de ciclofosfamida é administrada durante dois dias, após os quais cerca de 25 mg/m? de fludarabina é administrada durante cin- co dias.

[00181] Em determinadas modalidades, um fator de crescimento que promove o crescimento e a ativação das células NK é administra- do ao indivíduo concomitantemente com as células NK ou posterior- mente às células NK. O fator de crescimento da célula imune pode ser qualquer fator de crescimento adequado que promova o crescimento e a ativação das células NK. Exemplos de fatores adequados de cresci- mento de células imunes incluem interleucina (IL)-2, IL-7, IL-15 e IL- 12, que podem ser usados isoladamente ou em várias combinações, como IL-2 e IL-7, IL-2 e IL-15, IL-7 e IL-15, IL-2, I1L-7 e I1L-15, IL-12 e IL-7, I1L-12 e IL-15, ou IL-12 e IL2.

[00182] As quantidades terapêuticas eficazes de células NK podem ser administradas por diversas vias, incluindo administração parente- ral, por exemplo, injeção intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal ou intra-articular, ou infusão.

[00183] A quantidade terapeuticamente eficaz de células NK para o uso na terapia adotiva da célula é essa quantidade que alcança um efeito desejado em um indivíduo que está sendo tratado. Por exemplo, esta pode ser a quantidade de células NK necessárias para inibir o avanço, ou para causar regressão de uma doença autoimune ou alo-

imune, ou que é capaz de aliviar os sintomas causados por uma doen- ça autoimune, como dor e inflamação. Pode ser a quantidade neces- sária para aliviar os sintomas associados à inflamação, como dor, edema e temperatura elevada. Também pode ser a quantidade neces- sária para diminuir ou impedir a rejeição de um órgão transplantado.

[00184] A população de células NK pode ser administrada em regi- mes de tratamento consistentes com a doença, por exemplo, uma úni- ca ou algumas doses durante um a vários dias para melhorar um esta- do de doença ou doses periódicas durante um longo período de tempo para inibir a progressão da doença e prevenir a recorrência da doença. A dose precisa para ser usada em formulações também dependerá também da via de administração, e da gravidade da doença ou do dis- túrbio, e deverá ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente. A quantidade terapeuticamente eficaz de células NK será dependente do indivíduo que está sendo tra- tado, da gravidade e do tipo da aflição e da forma de administração. Em algumas modalidades, as doses que poderiam ser usadas no tra- tamento de indivíduos humanos variam de pelo menos 3,8 x 10º, pelo menos 3,8 x 10º, pelo menos 3,8 x 10º, pelo menos 3,8 x 107, pelo menos 3,8 x 10º, pelo menos 3,8 x 10º, ou pelo menos 3,8 x 10º célu- las NK/m2. Em uma determinada modalidade, a dose usada no trata- mento de indivíduos humanos varia de cerca de 3,8 x 10º a cerca de 3,8 x 10º células NK/m?. Em modalidades adicionais, uma quantidade terapeuticamente eficaz de células NK pode variar de cerca de 5 x 106 células por kg do peso corporal a cerca de 7,5 x 108 células por kg do peso corporal, como cerca de 2 x 107 células a cerca de 5 x 10º célu- las por kg do peso corporal, ou cerca de 5 x 107 células a cerca de 2 x 108º células por kg do peso corporal. A quantidade exata de células NK é prontamente determinada por um profissional versado na técnica ba- seada na idade, peso, sexo e condição fisiológica do indivíduo. Doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas dos sistemas de teste in vitro ou do modelo animal.

[00185] As células NK podem ser administradas em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos para o tratamento do dis- túrbio imunomediado. As terapias combinadas podem incluir, mas não se limitam a, um ou mais agentes antimicrobianos (por exemplo, anti- bióticos, agentes antivirais e agentes antifúngicos), agentes antitumo- res (por exemplo, fluorouracil, metotrexato, paclitaxel, fludarabina, eto- posido, doxorrubicina ou vincristina), agentes de depleção imunológica (por exemplo, fludarabina, etoposide, doxorubicina ou vincristina), agentes imunomopressores (por exemplo, azatioprina ou glicocorticoi- des, como dexametasona ou prednisona), agentes anti-inflamatórios (por exemplo, glicocorticoides, como hidrocortisona, dexametasona ou prednisona, ou agentes anti-inflamatórios não esteroides, como ácido acetilsalicílico, ibuprofeno ou naproxeno sódico), citocinas (por exem- plo, interleucina-10 ou fator de crescimento transformante beta), hor- mônios (por exemplo, estrogênio) ou uma vacina. Além disso, agentes imunossupressores ou tolerogênicos, incluindo, mas não se limitando a, inibidores de calcineurina (por exemplo, ciclosporina e tacrolimus); inibidores de MTOR (por exemplo, rapamicina); micofenolato mofetil, anticorpos (por exemplo, reconhecendo CD3, CD4, CD40, CD154, CDA45, IVIG ou células B); agentes quimioterápicos (por exemplo, me- totrexato, treossulfano, bussulfano) irradiação ou quimiocinas, interleu- cinas ou seus inibidores (por exemplo, BAFF, IL-2, anti-IL-2R, IL-A4, ini- bidores da JAK quinase) podem ser administrados. Esses agentes farmacêuticos adicionais podem ser administrados antes, durante ou após a administração das células NK, dependendo do efeito desejado. Essa administração das células e do agente pode ser feita pela mes- ma via ou por vias diferentes e no mesmo local ou em um local dife- rente.

B. Composições farmacêuticas

[00186] Também são fornecidas aqui composições e formulações farmacêuticas compreendendo células NK e um carreador farmaceuti- camente aceitável.

[00187] As composições farmacêuticas e as formulações descritas aqui podem ser preparadas misturando os ingredientes ativos (como um anticorpo ou um polipeptídeo) com o grau de pureza desejado com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Re- mington's Pharmaceutical Sciences 22º edição, 2012), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos farmaceutica- mente aceitáveis são atóxicos para destinatários nas doses e concen- trações utilizadas, e incluem, mas não estão limitados a, tampões co- mo fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo o ácido ascórbico e a metionina; conservantes (como, por exemplo, clo- reto de amônio octadecildimetilbenzil, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio; fenol, butil ou álcool benzílico; parabenos alquil como metil ou propilparabeno; catecol, resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (inferior a 10 resí- duos); proteínas, como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos como gli- cina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarí- deos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo a glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, maniitol, trealose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal como o só- dio; complexos de metais (p.ex. Complexos protéicos de Zn); e/ou tenso- ativo não iônicos como o polietileno glicol (PEG). Veículos farmaceutica- mente exemplares aceitáveis aqui incluem ainda agentes de dispersão de fármacos intersticiais, como glicoproteínas de hialuronidase ativas neutras solúveis (SHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuroni- dase PH-20 solúveis humanas, como rHuPH20 (HYLENEXGO, Baxter

International, Inc.). Determinadas sSHASEGPs exemplares e métodos de utilização, incluindo rHuPH20, estão descritas nas publicações de patente US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma SsHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases co- mo condroitinases. C. Terapias de combinação

[00188] Em determinadas modalidades, as composições e os mé- todos das presentes modalidades envolvem uma população de células NK em combinação com pelo menos uma terapia adicional. A terapia adicional pode ser uma radioterapia, cirurgia (p.ex., tumorectomia e mastectomia), quimioterapia, terapia gênica, terapia do DNA, terapia viral, terapia do RNA, imunoterapia, transplante da medula óssea, na- noterapia, terapia com anticorpos monoclonais, ou uma combinação dos anteriores. A terapia adicional pode estar na forma de terapia ad- juvante ou neoadjuvante.

[00189] Em algumas modalidades, a terapia adicional é a adminis- tração de um inibidor enzimático de pequena molécula ou de um agen- te anti-metastático. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a administração de agentes limitantes de efeito colateral (por exemplo, agentes destinados a diminuir a ocorrência e/ou gravidade dos efeitos colaterais do tratamento, como agentes anti-náusea, etc). Em algumas modalidades, a terapia adicional é radiação. Em algumas modalidades, a terapia adicional é cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é uma combinação da radioterapia e da cirurgia. Em algumas modalida- des, a terapia adicional é radiação gama. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a terapia que foca a via de PBK/AKT/mTOR, o ini- bidor de HSP90, o inibidor da tubulina, o inibidor da apoptose, e/ou o agente quimiopreventivo. A terapia adicional pode ser um ou mais dos agentes quimioterapêuticos conhecidos na técnica.

[00190] Uma terapia celular NK pode ser administrada antes, duran-

te, após, ou em várias combinações relativas a uma terapia adicional do câncer, como a terapia do checkpoint imune. As administrações podem estar em intervalos que variam de simultaneamente a minutos a dias a semanas. Em modalidades em que a terapia da célula imune é fornecida a um paciente separadamente de um agente terapêutico adicional, seria geralmente garantido que um período significativo de tempo não expiraria entre o momento de cada aplicação, de tal forma que os dois compostos ainda seriam capazes de exercer um efeito combinado vantajoso sobre o paciente. Em tais casos, está contem- plado que um pode fornecer um paciente com a terapia do anticorpo e a terapia anticâncer dentro de cerca de 12 a 24 ou 72 hde cadaume, mais particularmente, dentro de cerca de 6-12 h de cada um. Em al- gumas situações, pode ser desejável prolongar significativamente o período de tratamento quando vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) se pro- longarem por várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre as respec- tivas administrações.

[00191] Podem ser usadas várias combinações. Para o exemplo abaixo uma terapia de célula NK é "A" e uma terapia do anticâncer é "B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

[00192] A administração de qualquer composto ou terapia das pre- sentes modalidades a um paciente seguirá protocolos gerais para a administração desses compostos, levando em conta a toxicidade, se houver, dos agentes. Portanto, em algumas modalidades há uma etapa de monitoramento da toxicidade que é atribuível à terapia combinada.

1. Quimioterapia

[00193] Uma grande variedade de agentes quimioterápicos pode ser usada de acordo com as presentes modalidades. O termo "quimio- terapia" refere-se ao uso de fármacos para tratar o câncer. Um "agente quimioterápico" é usado para conotar um composto ou composição que é administrado no tratamento do câncer. Esses agentes ou fárma- cos são categorizados por seu modo de atividade dentro de uma célu- la, por exemplo, se e em que estágio eles afetam o ciclo da célula. Al- ternativamente, um agente pode ser caracterizado com base na sua capacidade de reticular o DNA, de intercalar no DNA ou de induzir aberrações cromossômicas e mitóticas, afetando a síntese de ácidos nucleicos.

[00194] “Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes al- quilantes, como tiotepa e ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila, como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas, como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietile- notiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sin- tético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmici- na (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleutero- bina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramusti- na, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de meclioretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida e mostarda de uracila; nitrosureias, como carmustina, clorozotocina, fo- temustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, como os antibióticos enedina (por exemplo, calicheamicina, especialmente cali- cheamicina gammall e calicheamicina omegal1); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antiobióticos enedina relacionados a cromoproteína, aclacinomisinas, actinomicina, autrarni-

cina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubi- cina, 6-diazo-5-ox0-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino- doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorubicina, idarrubicina, marcelomi- cina, mitomicinas, como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalarnici- na, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zZinostatina e zorrubicina; anti-metabólitos, como metotrexato e 5- fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, como denopterina, pte- ropterina e trimetrexato; análogos de purina, como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina e tioguanina; análogos de pirimidina, como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuri- dina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; andrógenos, como calus- terona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e tes- tolactona; anti-adrenais, como mitotano e trilostano; reforçador de áci- do fólico, como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio;, uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinóides, como maitansina e ansamitoci- nas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidra- zida; procarbazina; complexo PSK -polissacarídeo; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-tri- clorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomusti- na; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; taxóides, por exemplo, paclitaxel e docetaxel gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; complexos de coordena-

ção de platina, como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vino- relbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopteri- na; xeloda; ibandronato; irinotecano (por exemplo, CPT-11); inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, como ácido retinóico; capecitabina; carboplatina, procarbazina, plico- micina, gemcitabina, navelbina, inibidores de farnesil-proteína tansfe- rase, transplatina e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente acei- táveis de qualquer um dos acima.

2. Radioterapia

[00195] Outros fatores que causam danos ao DNA e têm sido usa- dos extensivamente incluem o que é comumente conhecido como rai- os Y, raios X e/ou a entrega direcionada de radioisótopos às células tumorais. Outras formas de fatores prejudiciais ao DNA também são contempladas, como micro-ondas, irradiação do feixe de próton (Pa- tentes US 5.760.395 e 4.870.287) e irradiação UV. É muito provável que todos estes fatores afetem uma vasta gama de danos no DNA, nos precursores do DNA, na replicação e reparação do DNA, bem co- mo na montagem e manutenção dos cromossomas. As faixas de do- sagem para raios X variam de doses diárias de 50 a 200 roentgens por períodos prolongados (3 a 4 semanas), até doses únicas de 2000 a 6000 roentgens. As faixas de dosagem para radioisótopos variam mui- to e dependem da meia-vida do isótopo, da intensidade e do tipo de radiação emitida e da absorção pelas células neoplásicas.

3. Imunoterapia

[00196] O versado na técnica compreenderá que as imunoterapias podem ser usadas em combinação ou em conjunto com os métodos das modalidades. No contexto do tratamento oncológico, os imunote- rapêuticos geralmente dependem do uso de células e moléculas imuni- tárias efetoras para alvejar e destruir células cancerosas. O rituximabe

(RITUXANO) é um exemplo deste tipo. O efetor imune pode ser, por exemplo, um anticorpo específico para algum marcador na superfície de uma célula tumoral. O anticorpo, por si só, pode servir como efetor da terapia ou pode recrutar outras células para efetivamente afetar a morte das células. O anticorpo também pode ser conjugado a um fár- maco ou uma toxina (quimioterápicos, radionuclídeos, cadeia A de ri- cina, toxina da cólera, toxina da coqueluche, etc) e servir como agente de direcionamento. Alternativamente, o efetor pode ser um linfócito que transporta uma molécula de superfície que interage, direta ou indi- retamente, com um alvo de células tumorais. Várias células efetoras incluem células T citotóxicas e células NK.

[00197] Os conjugados de anticorpos-fármacos surgiram como uma abordagem inovadora para o desenvolvimento da terapêutica do cân- cer. O câncer é uma das principais causas de morte no mundo. Os conjugados de anticorpos-fármacos (ADCs) incluem anticorpos mono- clonais (MAbs) que estão covalentemente ligados a fármacos que ma- tam células. Esta abordagem combina a elevada especificidade dos MAbs em relação aos seus antígenos alvo com substâncias citotóxicas altamente potentes, resultando em MAbs "armados" que fornecem a carga útil (fármaco) às células tumorais com níveis enriquecidos do antígeno. A administração direcionada do fármaco também minimiza sua exposição em tecidos normais, resultando na diminuição da toxici- dade e melhora do índice terapêutico. A aprovação de dois fármacos ADC, ADCETRISO (brentuximabe vedotina) em 2011 e KADCYLAO (trastuzumabe entansina ou T-DM1) em 2013 pela FDA validou a abordagem. Existem atualmente mais de 30 candidatos a fármacos ADC em várias fases de ensaios clínicos para tratamento oncológico (Leal et al., 2014). À medida que a engenharia de anticorpos e a otimi- zação da carga útil do ligante estão se tornando cada vez mais ama- durecidas, a descoberta e o desenvolvimento de novos ADCs são ca-

da vez mais dependentes da identificação e validação de novos alvos que são adequados a essa abordagem e à geração de MAbs alvo. Dois critérios para alvos ADC são níveis de expressão elevados/regu- ladas positivas em células tumorais e uma internalização robusta.

[00198] Em um aspecto da imunoterapia, a célula tumoral deve ter algum marcador que seja passível de direcionamento, ou seja, não está presente na maioria das outras células. Existem muitos marcado- res tumorais e qualquer um destes pode ser adequado para direcio- namento no contexto das presentes modalidades. Os marcadores tu- morais comuns incluem CD20, antígeno carcinoembrionário, tirosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antígeno de Sialyl Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de laminina, erb B e pg. 155. Um aspecto alternativo da imunoterapia é combinar os efeitos anticâncer com efeitos estimula- tórios imunológicos. Moléculas de estímulo imune também existem in- cluindo: citocinas, como IL-2, IL-4, I1L-12, GM-CSF, gama-IFN, quimio- cinas, como MIP-1, MCP-1, IL-8 e fatores de crescimento, como o li- gante FLT3.

[00199] “Exemplos de imunoterapias atualmente sob investigação ou em uso são adjuvantes imunológicos, por exemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitroclorobenzeno e compostos aro- máticos (patentes US 5.801.005 e 5.739.169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); terapia de citocinas, por exemplo, interferons a, B e Y, IL-1, GM-CSF e TNF (Bukowski et al., 1998; Da- vidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); terapia gênica, p.ex., TNF, IL-1, IL-2 e p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; Pa- tentes US 5.830.880 e 5.846.945); e anticorpos monoclonais, por exemplo, anti-CD20, anti-ganglioside GM2, e anti-p185 (Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; U.S. Patent 5,824,311). Está contempla- do que uma ou mais terapias anticâncer pode ser usada com as tera- pias de anticorpos descritas aqui.

[00200] Em algumas modalidades, a imunoterapia pode ser um ini- bidor do checkpoint imune. Os checkpoints imunes aumentam um sinal (p.ex., moléculas coestimulatórias) ou diminuem um sinal. Checkpoints imunes inibidores que podem ser direcionados pelo bloqueio do che- ckpoint imune na invenção incluem o receptor de adenosina A2A (A2AR), B7-H3 (também conhecido como CD276), o atenuador de lin- fócitos B e T (BTLA), proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4, também conhecida como CD152), indoleamina 2,3-dioxige- nase (IDO), imunoglobulina da célula killer (KIR), gene de ativação de linfócitos 3 (LAG3), morte programada 1 (PD-1), domínio de imunoglo- bulina de células T e domínio de mucina 3 (TIM-3) e supressor de |g de domínio V da ativação de células T (VISTA). Em particular, os inibi- dores do ponto de verificação imune têm como alvo o eixo PD-1 e/ou CTLA-A4.

[00201] Os inibidores do ponto de verificação imune podem ser fármacos como moléculas pequenas, formas recombinantes de recep- tores ou ligantes ou, em particular, anticorpos, como anticorpos huma- nos (p.ex., publicação de patente internacional WO2015016718; Par- doll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252:64-2012; estando todos aqui incorpo- rados por referência. Podem ser usados inibidores conhecidos das proteínas do ponto de verificação imune ou seus análogos, em particu- lar formas de anticorpos quimerizados, humanizados ou humanos. Como o versado na técnica sabe, nomes alternativos e/ou equivalen- tes podem ser usados para determinados anticorpos mencionados na presente revelação. Esses nomes alternativas e/ou equivalentes são intercambiáveis no contexto da presente revelação. Por exemplo, sa- be-se que o lambrovizumabe também é conhecido sob os nomes al- ternativos e equivalentes MK-3475 e pembrozumabe.

[00202] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD- 1 é uma molécula que inibe a ligação da PD-1 aos seus parceiros de ligação do ligante. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação do ligante da PD-1 são PDL1 e/ou PDL2. Em outra modalidade, um antagonista de ligação PDL1 é uma molécula que inibe a ligação do PDL1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação do PDL1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra modalidade, o antagonista de ligação do PDL2 é uma molécula que inibe a ligação do PDL?2 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, um par- ceiro de ligação do PDL2 é PD-1. O antagonista pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo. Os anticorpos exemplares estão descritos nas patentes US Nos. US8735553, US8354509 e US8008499, todos aqui incorporados por referência. Outros antagonistas do eixo PD-1 para uso nos métodos fornecidos aqui são conhecidos na técni- ca, como descrito no pedido de patente US No. US20140294898, US2014022021 e US20110008369, todos aqui incorporados por refe- rência.

[00203] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD- 1 é um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico). Em algumas moda- lidades, o anticorpo anti-PD-1 é selecionado do grupo consistindo em nivolumabe, pembrolizumabe e CT-011. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação da PD-1 é uma imunoadesina (por exemplo, uma imunoadesina que compreende uma porção de ligação extracelular ou PD-1 do PDL1 ou PDL2 fundida a uma região constante (por exem- plo, uma região Fc de uma sequência de imunoglobulina). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação de PD-1 é AMP-224. Nivolumabe, também conhecido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS- 936558 e OPDIVOO, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WOZ2006/121168. Pembrozumabe, também conhecido como MK-3475, Merck 3475, lambrozumabe, KEYTRUDAG e SCH-900475, é um anti-

corpo anti-PD-1 descrito em WO2009/114335. CT-011, também co- nhecido como hBAT ou hBAT-1, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WOZ2009/101611. AMP-224, também conhecido como B7-DClg, é um receptor solúvel de fusão PDL2-Fc descrito em WO2010/027827 e WO?2011/066342.

[00204] Outro ponto de verificação imune que pode ser direcionado nos métodos fornecidos aqui é a proteína 4 associada aos linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), também conhecida como CD152. A sequência completa de cDNA do CTLA-4 humano tem o número de acesso Gen- bank L15006. O CTLA-4 encontra-se na superfície das células T e age como um "interruptor de desligado" quando ligado ao CD80 ou CD86 na superfície das células que apresentam o antígeno. O CTLA4 é um membro da superfamília de imunoglobulinas que é expressado na su- perfície das células T auxiliares e transmite um sinal inibitório para as células T. O CTLA4 é semelhante à proteína coestimulatória de células T, CD28, e ambas as moléculas se ligam ao CD80 e CD86, também chamados B7-1 e B7-2, respectivamente, nas células apresentadoras de antígenos. O CTLAA4 transmite um sinal inibitório para as células T, enquanto o CD28 transmite um sinal estimulante. O CTLA4 intracelular também é encontrado em células T reguladoras e pode ser importante para sua função. A ativação de células T através do receptor de célu- las T e CD28 leva a uma expressão aumentada de CTLA-4, um recep- tor inibitório para moléculas B7.

[00205] Em algumas modalidades, o inibidor do ponto de verifica- ção imune é um anticorpo anti-CTLA-4 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico), um fragmento de ligação do antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo.

[00206] Os anticorpos anti-humanos-CTLA-4 (ou domínios VH e/ou VL derivados deles) adequados para uso nos presentes métodos podem ser gerados usando métodos bem conhecidos na técnica. Alternativa- mente, podem ser usados anticorpos anti-CTLA-4 reconhecidos pela técnica. Por exemplo, os anticorpos anti-CTLA-4 revelados em: US

8.119.129, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504 (CP675,206, também conhecido como tremelimumabe; anteriormente ticilimumabe), patente US No. 6.207.156; Hurwitz et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Resumo nº 2505 (anticorpo CP-675206); e Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304 pode ser usado nos métodos revelados aqui. Os ensinamentos de cada uma das publicações mencionadas anteriormente estão incorporados aqui por referência. Também podem ser usados anticorpos que concorrem com qualquer um destes anti- corpos reconhecidos pela técnica para ligação ao CTLA-4. Por exem- plo, um anticorpo CTLA-4 humanizado é descrito no pedido de patente Internacional No. WO2001014424, WOZ2000037504 e patente US No. US8017114; todos aqui incorporados por referência.

[00207] Um anticorpo anti-cCTLA-4 exemplificador é o ipilimumabe (também conhecido como 10D1, MDX-010, MDX-101 e YervoyO) ou fragmentos de ligação do antígeno e suas variantes (ver, por exemplo, WO 01/14424). Em outras modalidades, o anticorpo compreende as CDRs de cadeia pesada e leve ou VRS de ipilimumabe. Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VH de ipilimumabe e os domínios CDR1, CDR2 e CDR3 da região VL de ipilimumabe. Em outra modalidade, o anticorpo concorre para a ligação com e/ou liga-se ao mesmo epitopo da CTLA- 4 que os anticorpos acima mencionados. Em outra modalidade, o anti- corpo tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos de região variável com os anticorpos mencionados acima (por exemplo, pelo menos cerca de 90%, 95% ou 99% de identidade de região variável com ipilimumabe).

[00208] Outras moléculas para modulação da CTLA-4 incluem |i- gantes e receptores CTLA-4, como descritos nas patentes US Nos. US5844905, USS5885796 e nos pedidos de patente Internacional WO1995001994 e WO1998042752; todos incorporados aqui por refe- rência, e imunoadesinas, como descrito na patente US8329867, incor- porada aqui por referência.

4. Cirurgia

[00209] Aproximadamente 60% das pessoas com câncer serão submetidas a cirurgia de algum tipo, que inclui cirurgia preventiva, di- agnóstica ou estadiamento, curativa e paliativa. A cirurgia curativa in- clui a ressecção na qual todo ou parte do tecido canceroso é fisica- mente removido, excisado e/ou destruído e pode ser usado em conjun- to com outras terapias, como o tratamento das presentes modalidades, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia gênica, imunote- rapia e/ou terapias alternativas. A ressecção tumoral refere-se à remo- ção física de pelo menos parte de um tumor. Além da ressecção tumo- ral, o tratamento cirúrgico inclui cirurgia a laser, criocirurgia, eletroci- rurgia e cirurgia microcontrolada (cirurgia de Mohs).

[00210] Após a excisão de parte ou de todas as células cancerosas, tecidos ou tumores, pode formar-se uma cavidade no corpo. O trata- mento pode ser realizado através da perfusão, injeção direta ou apli- cação local da área com uma terapia anticâncer adicional. Esse trata- mento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, Ou a cada 1,2, 3,4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Estes tratamentos podem ser de doses variadas também.

5. Outros agentes

[00211] É contemplado que outros agentes podem ser usados em combinação com determinados aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Esses agentes adicionais incluem agentes que afetam a regulação positiva de recep- tores de superfície celular e junções GAP, agentes citostáticos e de diferenciação, inibidores da adesão celular, agentes que aumentam a sensibilidade das células hiperproliferativas aos indutores apoptóticos ou outros agentes biológicos. O aumento da sinalização intercelular pela elevação do número de junções GAP aumentaria os efeitos anti- hiperproliferativos na população de células hiperproliferativas vizinhas. Em outras modalidades, os agentes citostáticos ou de diferenciação podem ser usados em combinação com determinados aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia anti-hiperproliferativa dos tratamentos. Os inibidores da adesão celular são contemplados para melhorar a eficácia das presentes modalidades. Exemplos de ini- bidores de adesão celular são inibidores da cinase de adesão focal (FAKs) e Lovastatina. Além disso, é contemplado que outros agentes que aumentam a sensibilidade de uma célula hiperproliferativa à apop- tose, como o anticorpo c225, poderiam ser usados em combinação com determinados aspectos das presentes modalidades para melhorar a eficácia do tratamento.

V. Artigos de fabricação ou kits

[00212] Um artigo de fabricação ou um kit é fornecido compreen- dendo células NK. O artigo de fabricação ou o kit podem adicionalmen- te incluir uma bula que compreendendo instruções para usar as célu- las NK para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo ou realçar a função imune de um indivíduo que tenha o câncer. Qual- quer uma das células NK específicas do antígeno descritas aqui pode ser incluída no artigo de fabricação ou kits. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, sacos e seringas. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais, como vidro, plástico (como cloreto de polivinila ou poliolefina) ou liga metálica (co- mo aço inoxidável ou hastelloy). Em algumas modalidades, o recipien-

te contém a formulação e o rótulo no, ou associado a ele, pode indicar as direções de uso. Os kits ou artigos de fabricação podem incluir ain- da outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para o uso. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação inclui ainda um ou mais de outro agente (por exemplo, um agente quimioterápico e um agente antineoplásico). Recipientes adequados para um ou mais agentes incluem, por exemplo, garrafas, frascos, sacos e seringas. VI. Exemplos

[00213] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar mo- dalidades preferidas da invenção. Deve ser apreciado por os versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelos inventores que funcionam bem na prática da invenção, e, assim, podem ser considerados modos preferenciais para a sua prática. No entanto, os versados na técnica deveriam, à luz da atual divulgação, entender que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado semelhante sem que se desvie do espírito e escopo da invenção. Exemplo 1 - Expansão de células NK

[00214] As células NK têm sido estudadas como potenciais efetores antitumorais, mas algumas barreiras limitam sua exploração terapêuti- ca, principalmente relacionada a seus pequenos números, exigindo expansão ex vivo para imunoterapia adotiva. As células NK do sangue periférico (células PB-NK) do paciente ou de doadores alogênicos adultos são mais comumente usadas; entretanto, essa abordagem re- quer que um doador disposto, combinado a um mínimo de 3 de 6 mo- léculas HLA com o receptor, seja submetido a leucoferese. Outra des- vantagem das células PB NK adultas é a proliferação e persistência in vivo sub-ótimas após a transferência adotiva.

[00215] Os presentes estudos mostraram que as células NK gera- das pelo CB podem ter vantagens únicas relacionadas à maior ex- pressão de genes envolvidos na proliferação celular, ativação celular, adesão celular, ciclo celular e replicação de DNA (FIGS. 1A-1E). As- sim, foi desenvolvido um protocolo de expansão rápida, em conformi- dade com BPF, para a propagação de células NK derivadas do CB usando células de alimentação modificadas, como células de alimen- tação que expressam ligantes 4-1 BB, I1L21 ou IL-15, e ligantes para ativar moléculas coestimulatórias NK, como CD48 ou CSI.

[00216] As células NK foram isoladas e expandidas de uma unidade de CB congelada e descongelada ou de uma unidade fresca de CB selecionada de um banco de CB clínico. Um aspecto único da presen- te estratégia é que não há nenhum requisito para a correspondência de HLA entre o doador e o receptor, permitindo um produto de terapia celular verdadeiramente "pronto para uso". Sempre que possível, a unidade CB é selecionada com base na não correspondência do ligan- te KIR com o receptor.

[00217] Como mostrado na FIG. 2, em um período de cultura de 2 semanas, foi alcançada uma expansão mediana de 803 vezes (faixa 346 a 5547), que é significativamente maior do que a expansão obtida com a célula NK PB (mediana 380, faixa 99-1515; P = 0,036), apon- tando para as propriedades proliferativas inerentes das células NK-CB. As células NK RE-CB apresentam um fenótipo funcional (FIG. 3) sem evidência de exaustão, como demonstrado pela alta expressão da per- forina e granzima e falta de expressão de CD57, KLRGI e PDL.

[00218] As células NKRE-CB eram altamente citotóxicas contra as linhagens celulares tumorais in vitro e induziram atividade antitumoral robusta em camundongos imunodeficientes após a irradiação FIG. 4. Além disso, foram administrados produtos de célula NK RE-CB (cor-

respondentes a 1-5 de 6 alelos HLA) a mais de 60 pacientes com cân- ceres hematológicos após quimioterapia de alta dose com resgate au- tólogo de células estaminais, quimioterapia mieloablativa, não mieloa- blativa ou de intensidade reduzida com um transplante de células es- taminais alogênicas e após quimioterapia linfodepletante à base de fludarabina, não tendo apresentado doença de enxerto versus hospe- deiro ou outra toxicidade.

[00219] Os presentes métodos foram otimizados para melhorar o tempo e a logística necessários para a realização das culturas e dimi- nuir o custo do procedimento. A otimização consistia em aumentar o volume dos meios e, consequentemente, reduzir a concentração de células. Como mostrado na Tabela 2A, nos primeiros sete dias de cul- tura e na Tabela 2B para a segunda semana de cultura, uma expan- são significativamente melhor foi obtida com maior volume de meio e uma menor concentração de células (G-Rex100M) em comparação com menos meios e maior concentração de células (G-Rex100). Fo- ram necessários menos biorreatores para o procedimento otimizado e foram necessárias menos células para gerar a mesma dose de célula NK ou uma dose mais elevada. Isto é mostrado no dia 7, onde quatro vezes menos células foram necessárias para semear cada 100 M G- Rex para obter a mesma dose. No dia 0-7, não foi necessária qualquer intervenção nas culturas (em comparação com a alimentação pelo menos duas vezes com o procedimento anterior).

[00220] Com o procedimento otimizado nos dias 7-14, as células não necessitam de separação e foram alimentadas apenas duas ve- zes. Menos meios e citocinas foram usados, e menos tempo para os tecnólogos, economizando dinheiro e melhorando a logística. Além disso, foi necessária uma intervenção mínima nas culturas nos dias 7- 14 (apenas IL2 é adicionada duas vezes), o que não só poupa tempo tecnológico, como também reduz significativamente a possibilidade de contaminação microbiana.

Isto contrastou com a maioria dos atuais procedimentos de expansão das células NK atualmente em uso, onde as culturas são frequentemente divididas dia sim, dia não, com a ali- mentação, aumentando repetidamente o risco de contaminação micro- biana.

Conforme resumido na Tabela 2C, a abordagem otimizada re- duziu o tempo do tecnólogo em 29%.

Tabela 2A.

DIA 0 até 7 (CB-NK) G-Rex 100 G-Rex 100M TNC plaquea- Reagentes & suprimentos necessários para . Reagentes & suprimentos usados do/G-Rex Dia | TNC Dia 7 | Expansão Expansão obter o mesmo TNC que G-Rex 100 0 (x 10e6) (x 10e6) da dobra | f G-Rex | Meio | Soro | IL-2(x1000 da dobra É G-Rex Meio (L) Soro | IL-2 (x 1000 eio 100 (L) (mL) unidades) 100 M (mL) unidades) Tabela 2B.

poupado (4)

[00221] Além da logística de cultura otimizada, custo e redução do risco de contaminação microbiana, a abordagem do presente método tem várias outras características novas e importantes. Como mostrado na FIG. 2, em um período de cultura de 2 semanas, foi alcançada uma expansão mediana de 803 vezes (faixa 346-5547), que foi significati- vamente maior do que a das células NK PB (mediana 380, faixa 99- 1515; P = 0,036), apontando para as propriedades proliferativas ine- rentes das células NK-CB. As células NK RE-CB apresentaram um fenótipo funcional FIG. 3, sem evidência de “exaustão, como mostrado pela alta expressão da perforina e granzima e falta de expressão de CD57, KLRGI e PD1. As células NK RE-CB eram altamente citotóxicas contra as linhagens celulares tumorais in vitro e induziram atividade antitumoral robusta em camundongos imunodeficientes após a irradia- ção (FIG. 4). Além disso, foram administrados produtos de célula NK RE-CB expandidos rapidamente (correspondentes a 1-5 de 6 alelos HLA) a mais de 80 pacientes com cânceres hematológicos após qui- mioterapia de alta dose com resgate autólogo de células estaminais, quimioterapia mieloablativa, não mieloablativa ou de intensidade redu- zida com um transplante de células estaminais alogênicas e após qui- mioterapia linfodepletante à base de fludarabina, sem doença de en- xerto versus hospedeiro ou outra toxicidade. Mais especificamente, 60 pacientes com mieloma múltiplo receberam com segurança células NK-CB em conjunto com quimioterapia (melfalano e lenalidomida) e transplante autólogo. Conforme mostrado na Tabela 3, 42 pacientes com mieloma múltiplo (MM) e pacientes MM de alto risco que recebe- ram células NK CB (incluídos no protocolo 2011-0379) tiveram respos-

ta parcial alta > muito boa (VGPR) e resposta completa (CR) maiores que 153 MM e pacientes com HRMM que receberam padrão de aten- dimento (SOC) com melfalano e autotransplante.

[00222] Tabela 3. Taxas de resposta de pacientes com mieloma múltiplo e mieloma múltiplo de alto risco Resposta Pacientes MM Pacientes HRMM (2011-0379 vs. SOC) (2011-0379 vs. SOC) 2 VGPR (%) 69 vs. 54 (p=0,07) 80 vs. 42 (p=0,01) sCRICR (%) 29 vs. 15 (p=0,04) 20 vs. 5 (p=0,07)

[00223] O anticorpo mononclonal elotuzamabe estimula as células NK, bem como as direciona a células de mieloma múltiplo, da seguinte forma: * elotuzumabe melhora a citotoxicidade celular dependente de anticorpos da célula NK (ADCC) via ligação de CD16 e por ligação direta de SLMF7 em células NK * as células NK expandidas ex vivo apresentam maior cito- toxicidade mediada por elotuzumabe que as células não expandidas * adição de elotuzumabe à lenalidomida, aumenta ainda ADCC NK-CB contra as linhagens celulares de mieloma resistentes a células NK SLAMF7hi

[00224] Com base nestes dados, o elotuzamabe foi adicionado a uma preparação de quimioterapia (melfalano e lenolidamida) e 15 pa- cientes adicionais com HRMM foram tratados com células NK do CB. Conforme mostrado na Tabela 4, em comparação aos pacientes que não receberam células NK, =2VGPR e as taxas de CR foram maiores para esses pacientes de alto risco recebendo células NK e ainda maio- res para aqueles que receberam células NK mais elotuzamabe. A taxa de resposta negativa mínima da doença residual (DRM) no Dia 100 na biópsia de medula foi também superior nos dois grupos que receberam células NK. Até o momento, todos os 15 pacientes estão vivos e ape- nas um tem evidência de mieloma progressivo em um ano após o transplante; este foi um dos poucos pacientes que foi MRD positivo na medula óssea no Dia 100. Catorze dos 15 pacientes permanecem sem progressão. Claramente, a terapia baseada em NK do CB da revela- ção é potente para pacientes com mieloma múltiplo de alto risco. Tabela 4. Taxas de resposta dos pacientes que receberam células NK com ou sem elotuzamabe Pacientes HRMM SOC ASCT Fase 1/2 Fase 2 Exp. Di1oo (n = 66) sem Elo (n = 15) com Elo (n=15) 2 VGPR (%) 42 80 EX) sCRICR (%) 5 20” 737 MRD negativo (%) 26 53 73 * valor p= 0,011; ** valor p = 0,0092

[00225] Em outro estudo (2015-0751) 14 pacientes com linfoma não Hodgkin refratário/recidivado receberam células NK de CB expandidas sem levar em consideração a correspondência de HLA com o pacien- te. Todos esses pacientes receberam as células NK do CB com segu- rança, sem toxicidade infusional ou outra toxicidade e sem GVHD. Mais da metade desses pacientes refratários (57%) obteve remissão completa e permanecem sem progressão ao ano seguinte a este tra- tamento. Esses resultados ressaltam o fato de que essas células NK do CB podem ser usadas como produtos prontos para uso sem a ne- cessidade de tipagem de HLA demorada e dispendiosa do paciente ou das unidades CB. Em um terceiro estudo (2012-0819), 19 pacientes receberam as células NK do CB em conjunto com um alotransplante. Esses pacientes toleraram muito bem esses produtos celulares e pa- recem ter menos recidiva da leucemia do que os pacientes tratados de forma semelhante, mas sem células NK do CB. Estes dados demons-

tram a segurança e eficácia das células NK do CB expandidas em vá- rios ambientes clínicos diferentes.

[00226] Assim, os presentes métodos podem ser usados para ex- pandir as células NK do sangue do cordão umbilical para obter uma dose clínica em conformidade com BPF.

[00227] ***

[00228] Todos os métodos revelados e reivindicados aqui podem ser feitos e executados sem experimentação indevida conforme a pre- sente revelação. Embora as composições e os métodos dessa inven- ção tenham sido descritos em termos de modalidades preferidas, fica- rá evidente para os versados na técnica que as variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem que se afaste do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será evidente que determinados agentes, tanto quimicamente como fisiologicamente relacionados, po- dem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, enquanto os mes- mos resultados ou resultados semelhantes seriam obtidos. Todas es- sas modificações e substituições semelhantes evidentes aos versados na técnica são consideradas dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método ex vivo para a expansão de células naturais killer (NK), compreendendo: (a) obter de uma população inicial de células mononu- cleares (CMNs) a partir do sangue do cordão umbilical; (b) estimular as CMNs na presença de células apre- sentadoras de antígenos (APCs) e |L-2; e (c) re-estimular as células com APCs para a produção de células NK expandidas, caracterizado pelo fato de que o método é realizado em um biorreator e em conformidade com as boas práticas de fabricação (GMP).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda células de depleção positivas para CDB3.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a depleção é realizada entre as etapas (b) e (c).

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as células são removidas do biorreator.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a obtenção da população inicial de CMNs a partir do sangue do cordão umbilical compreende o descongelamento do san- gue do cordão umbilical na presença de dextrano, albumina sérica humana (HSA), DNase e/ou cloreto de magnésio.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a obtenção da população inicial de CMNs do sangue do cordão umbilical compreende o descongelamento do sangue do cordão umbilical na presença de dextrano e DNase.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sangue do cordão umbilical é lavado na presença de dextrano a 10%.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 7, caracteri- zado pelo fato de que o sangue do cordão umbilical é suspenso na presença de cloreto de magnésio.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o cloreto de magnésio está em uma concentração de 200 mM.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a obtenção compreende a execução da centrifugação do gradiente de densidade de ficoll para obtenção de células mononucleares (CMNs).

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que não compreende a remo- ção ou adição de quaisquer componentes de meios durante a etapa (b).

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o biorreator é um biorrea- tor de gás permeável.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracteriza- do pelo fato de que o biorreator de gás permeável é G-Rex100M.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteriza- do pelo fato de que o estímulo da etapa (b) é realizado em 3-5 L de meio.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que as APCs são gama irradi- adas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que as APCs são modificadas para expressar |L-21 ligado à membrana (mblL-21).

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que APCs são modificadas pa-

ra expressar IL-21, IL-15, IL-7, IL-18, e/ou IL-2.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que as CMNs e as APCs são cultivadas em uma razão de 1:2.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a IL-2 está em uma con- centração de 50-200 IU/mL.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que a IL-2 está presente em uma concentração de 100 IU/mL.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a IL-2 é reabastecida a ca- da 2 a 3 dias.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada por 6 a8dias.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que a etapa (b) é realizada por 7 dias.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) não compreen- de a separação das células.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que as células são alimentadas duas vezes com |IL-2.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 25, caracterizado pelo fato de que compreende o uso de 3,4, ou 6 biorreatores.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracteriza- do pelo fato de que compreende o uso de menos de 10 biorreatores.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que as células NK são expan-

didas pelo menos 500 vezes, 800 vezes, 1000 vezes, 3000 vezes ou 5000 vezes.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a cultura das células NK no biorreator produz mais de 1000 vezes células NK em comparação com a cultura estática de líquidos.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 29, caracterizado pelo fato de que não compreende a corres- pondência do antígeno leucocitário humano (HLA).

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza- do pelo fato de que a população inicial de células NK não é obtida de um doador haploidêntico.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 31, caracterizado pelo fato de que é realizado em menos de dias.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracteriza- do pelo fato de que é realizado em 14 dias.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 33, caracterizado pelo fato de que as células NK expandidas têm atividade antitumor aumentada como compreende as células NK expandidas a partir do sangue periférico.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracteriza- do pelo fato de que as células NK expandidas têm maior expressão de genes de ciclo de células, divisão de células e/ou replicação de DNA em comparação com as células NK expandidas a partir do sangue pe- riférico.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 34, caracterizado pelo fato de que as células NK expandidas têm capacidade proliferativa elevada em comparação com as células NK expandidas a partir do sangue periférico.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 36, caracterizado pelo fato de que as células NK expandidas não exibem exaustão.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo fato de que a exaustão é detectada medindo a expressão de perforina, granzima, CD57, KLRG1 e PD1.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracteriza- do pelo fato de que as células NK expandidas têm alta expressão de perforina e granzima.

40. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracteriza- do pelo fato de que as células NK expandidas têm pouca ou nenhuma expressão de CD57, KLRG1 e PD1.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 40, caracterizado pelo fato de que as células NK expandidas compreendem uma dose clinicamente relevante.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o sangue do cordão umbi- lical é sangue do cordão umbilical congelado.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que o sangue do cordão umbilical congelado foi testa- do para doença infecciosa.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 43, caracterizado pelo fato de que o sangue do cordão umbi- lical é sangue do cordão umbilical agrupado.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que o sangue do cordão umbilical é agrupado a partir de 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 unidades individuais de sangue de cordão umbili- cal.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 45, caracterizado pelo fato de que as células NK não são au-

tólogas.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 46, caracterizado pelo fato de que as células NK não são alo- gênicas.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 47, caracterizado pelo fato de que as APCs são células apre- sentadoras de antígeno universais (uAPC's).

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que as uAPCs são modificadas para expressar (1) CD48 e/ou CS1 (CD319), (2) interleucina-21 ligada à membrana (mbIL-21) e (3) ligante 41BB (41BBL).

50. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que as uAPCs expressam o CD48.

51. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que as uAPCs expressam o CS1.

52. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteri- zado pelo fato de que as uAPCs expressam o CD48 e CS1.

53. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que as uAPCs não têm, essencialmente, expressão de moléculas endógenas de HLA classe |, |l ou CD1d.

54. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que as uAPCs expressam ICAM-1 (CD54) e LFA-3 (CD58).

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 54, caracterizado pelo fato de que as uAPCs são definidas ainda como aAPCs derivadas de células da leucemia.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que as aAPCs derivadas de células da leucemia são definidas ainda como células K562.

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 1 a 56, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a crio- preservação das células NK expandidas.

58. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células NK produzidas, como de- finidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 57, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

59. Composição caracterizada pelo fato de que compreen- de uma quantidade eficaz de células NK produzidas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 57, para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo.

60. Uso de uma composição compreendendo uma quanti- dade eficaz de células NK produzidas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento de um distúrbio imunorrelacionado em um indivíduo.

61. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio ca- racterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade efetiva de células NK expandidas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 57, ao indivíduo.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda a quimioterapia.

63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracteriza- do pelo fato de que a quimioterapia é administrada antes das células NK expandidas.

64. Método, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, carac- terizado pelo fato de que a quimioterapia é mieloablativa.

65. Método, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, carac- terizado pelo fato de que a quimioterapia é não mieloablativa.

66. Método, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, carac- terizado pelo fato de que a quimioterapia é quimioterapia de linfode- pleção.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracteriza- do pelo fato de que a quimioterapia de linfodepleção é a quimioterapia de linfodepleção à base de fludarabina.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 62 a 67, caracterizado pelo fato de que a quimioterapia é lenali- domida.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 62 a 68, caracterizado pelo fato de que não compreende a reali- zação da correspondência HLA.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 62 a 69, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio é um distúrbio imunorrelacionado.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracteriza- do pelo fato de que o distúrbio imunorrelacionado é um distúrbio au- toimune, uma doença de enxerto versus hospedeiro, uma rejeição de aloenxerto, ou uma condição inflamatória.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 61 a 69, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio é um câncer.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é o mieloma múltiplo.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 61 a 73, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não desenvol- ve doença de enxerto versus hospedeiro ou outra toxicidade.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 61 a 74, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a ad- ministração de uma dose efetiva de pelo menos um segundo agente terapêutico.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteriza- do pelo fato de que pelo menos o segundo agente terapêutico com-

preende quimioterapia, imunoterapia, cirurgia, radioterapia ou biotera- pia.

77. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteriza- do pelo fato de que as células NK e/ou pelo menos um segundo agen- te terapêutico são administrados intravenosamente, intraperitoneal- mente, intratraquealmente, intratumoralmente, intramuscularmente, endoscopicamente, intralesionalmente, percutaneamente, subcutane- amente, regionalmente ou por injeção direta ou perfusão.

78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 75 a 77, caracterizado pelo fato de que o segundo agente tera- pêutico compreende o elotuzumabe.