JP2023503651A - Ｍｓｃ細胞の大規模な組み合わせられたｃａｒ形質導入及びｃｒｉｓｐｒ遺伝子編集 - Google Patents

Ｍｓｃ細胞の大規模な組み合わせられたｃａｒ形質導入及びｃｒｉｓｐｒ遺伝子編集 Download PDF

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Abstract

【課題】癌、感染症および／または免疫関連障害などの病状の処置をはじめとした任意の目的のために使用され得る方法、及び組成物を提供する。【解決手段】本開示の実施形態は、工学的間葉系幹／間葉系細胞（ＭＳＣ）を製造するための方法及び組成物を包含する。本開示は、ＣＲＩＳＰＲを使用するなどして、１つまたは複数の遺伝子の発現を破壊するように操作され、また、少なくとも１つの異種抗原受容体を発現するように操作されるＭＳＣ細胞を産生するための大規模プロセスに関する。特定の実施形態は、プロセスのための特定のパラメータを含む。【選択図】図１

Description

本出願は、２０１９年１１月２７日に出願された米国仮特許出願連続番号６２／９４１，６６３の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本開示は、一般に、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、及び医学の分野に関するものである。
細胞免疫療法は、癌の治療のために有用であり得る。しかしながら、単独で適用される場合のほとんどの免疫療法アプローチは、特に固形腫瘍などの悪性腫瘍の大部分に対して限られた価値しかない。この限られた成功の理由には、（１）免疫系による検出を減少させる腫瘍細胞表面上の腫瘍抗原の発現の減少、（２）ＰＤ１、ＮＫＧ２Ａ、及びＴＩＧＩＴなどの阻害性受容体のリガンドの発現、（３）免疫細胞の不活性化を誘導するＣＩＳＨなどの細胞チェックポイントのアップレギュレーション、及び（４）免疫反応を抑制し、腫瘍細胞の増殖と生存を促進するトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）やアデノシンなどの物質を放出する微小環境下の細胞（例えば、制御性Ｔ細胞や骨髄由来抑制細胞など）の誘導。したがって、これらの課題に対処する方法を含む、細胞免疫療法の改善された方法に対する満たされていない必要性が存在する。
本開示の実施形態は、養子細胞療法適用において使用されるときに、間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）の活性を高めるための方法及び組成物を包含する。特定の実施形態では、本開示は、生存性及び持続性が増強するように特異的に操作されているＭＳＣの生存性及び持続性を、そのように操作されていない対応するＭＳＣ細胞と比較して増強することに関する。特定の実施形態は、同じ又は類似する操作を欠くＭＳＣと比較して、アポトーシスのリスクを低下させるように特異的に操作されるＭＳＣに対するアポトーシスを低下させるための方法及び組成物を含む。本開示の方法は、ＭＳＣの拡大増殖を改善し、それを必要とする個体のための治療として使用しようとするそれらの有効性を増大させる特定のパラメーターを利用する。
本開示の特定の実施形態は、例えば、骨髄、臍帯組織、末梢血、脂肪組織、歯髄又はそれらの混合物に由来するものを含め、ＭＳＣのＣＡＲ形質導入とＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集との組み合わせのための新規の大規模アプローチ（ＧＭＰグレードを含む）を包含する。本開示は、１つ又は複数の異種抗原受容体を発現する、及びまた、ＭＳＣにおいて１つ又は複数の内因性遺伝子の破壊を有するように遺伝子編集されている操作されたＭＳＣを提供する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ形質導入ＭＳＣは、ＭＳＣにおける１つ又は複数の内因性遺伝子の発現の破壊を有するように操作され、他の実施形態では、ＭＳＣにおける１つ又は複数の内因性遺伝子の発現の破壊を有するＭＳＣは、１つ又は複数の異種抗原受容体を発現するように形質導入又は遺伝子移入される。特定の実施形態は、ＣＡＲ形質導入ＭＳＣを含む、初代ＭＳＣの遺伝子編集（大規模なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９介在性を含む）操作ストラテジーを提供する。
特定の実施形態では、本プロセスは、最大１×１０９個又はそれを超える細胞を操作するためを含む、本プロセスを大規模にすることを可能にする、特定のパラメーター（特定の条件及び／又は試薬を含む）を利用する。本開示は、１つ又は複数の異種抗原受容体を有するように、及びまた、ＭＳＣの内因性の１つ又は複数の遺伝子の発現を欠くか又は発現が低下するように細胞を改変することを可能にする。特定の場合において、所望される場合は、複数の遺伝子に対することを含め、ＣＲＩＳＰＲ及びガイドＲＮＡを使用して、１つ又は複数の内因性遺伝子をノックアウト又はノックダウンする。特定の実施形態では、ＭＳＣは、内因性遺伝子のノックアウト又はノックダウン以外、及び異種抗原受容体の発現以外の、１つ又は複数の様式で改変される。本プロセスはまた、一部の場合において、本プロセスの特定の工程に対する特定の時間の長さも包含する。
作製されたＭＳＣは、癌、感染性疾患及び／又は免疫関連障害などの医学的状態の治療を含む何らかの目的のために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは使用前に適切に保存される。操作されたＭＳＣのレシピエント個体は、細胞の供給源に関して自己又は同種であり得る。いくつかの場合において、適切な保存後、本開示の方法によって作製されるＭＳＣは、治療目的のために利用され、保存中、作製の後にさらに改変されてもよいし又はされなくてもよい。例えば、ＭＳＣは、それらの生存性を促進するために、細胞における１つ又は複数の内因性遺伝子の遺伝子編集を有するように操作され得、次にＭＳＣは保存されるが、使用前にこのＭＳＣは、個体の癌細胞上の抗原を標的とする受容体など、レシピエント個体の必要性に特異的な１つ又は複数の異種抗原受容体を発現するようにさらに改変され得る。他の場合では、ＭＳＣは、例えば、公知の癌抗原である抗原に対するものを含めて、１つ又は複数の異種抗原受容体を発現するように操作され得、ＭＳＣはその後保存されるが、使用前に、ＭＳＣが１つ又は複数の内因性遺伝子の発現を破壊するように遺伝子編集されるようにさらに改変され得る。この例では、異種抗原受容体は、周知の癌抗原、又は様々な癌細胞型上に存在する抗原を標的とするように設計されてもよいし又はされなくてもよい。
本方法に対する特定の場合において、ＣＲＩＳＰＲ工程は、２つ以上の送達工程を含むものとしてさらに定義される。そのような場合、第１の送達工程は、１つ又は複数の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを送達することを含み得、第２の送達工程は、第１の送達工程における１つ又は複数の遺伝子とは異なる１つ又は複数の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを送達することを含み得る。特定の例では、第１の送達工程と第２の送達工程との間の期間は、少なくとも約２日間であるか、又は第１の送達工程と第２の送達工程との間の期間は、約２～３日間である。特定の実施形態では、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ－関連組成物は、エレクトロポレーションによって何らかのＭＳＣに送達される。細胞がエレクトロポレーションされる場合、エレクトロポレーションは、約２００，０００～１×１０９個のＭＳＣなど、特定の量の細胞を使用し得る。エレクトロポレーションは、約２００，０００～２，０００，０００個の細胞を使用し得る。エレクトロポレーションは、約１，０００，０００～１ｘ１０９個のＭＳＣを使用し得る。
特定の実施形態では、異種抗原受容体は、１つ又は複数のキメラ抗原受容体、及び／又は１つ又は複数のＴ細胞受容体、及び／又は１つ又は複数の細胞死受容体（ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド）である。異種抗原受容体は、腫瘍関連抗原を含む癌抗原を標的とし得る。特定の場合において、異種抗原受容体は、ＣＤ１９、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ５、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ－１、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＬＬ－１、Ｕ５ ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＤ９９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原を標的とする。
特定の実施形態では、ＭＳＣにおける発現の破壊を有する遺伝子は、その破壊が、そのような破壊がない場合と比較して、ＭＳＣを治療により適したものにする何らかの遺伝子又は複数の遺伝子である。特定の実施形態では、本遺伝子は、阻害性遺伝子、例えばＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＴＤＡＧ８、ＣＤ５、ＣＤ７、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＬＡＧ３、ＴＣＲ、ベータ２－ミクログロブリン、ＨＬＡ、ＣＤ７３、ＣＤ３９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される阻害性遺伝子などである。
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、１つ又は複数の異種サイトカイン遺伝子、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータなど）、を発現するように操作される。
本明細書中の方法の何れかにおいて、機能アッセイ、細胞傷害性アッセイ及び／又はインビボ活性によって、遺伝子破壊の程度について分析されている細胞を含め、作製された細胞の何れかを分析し得る。特定の実施形態では、細胞は、フローサイトメトリー、マスサイトメトリ、ＲＮＡシーケンシング、ＰＣＲ又はそれらの組み合わせによって分析される。この方法に続いて、細胞の何れかが、凍結保存など、保存され得る。有効量の何れかの細胞を、それを必要とする個体、例えば、癌、感染性疾患及び／又は免疫関連障害を有する個体に送達し得る。
本開示の実施形態は、本明細書中に包含される何らかの方法によって作製されるＭＳＣの集団を含む。集団が薬学的に許容可能な担体中にある場合を含め、本開示の細胞の集団を含む組成物が企図される。
本開示の実施形態は、本開示の何らかの方法によって作製された治療有効量のＭＳＣを個体に投与する工程を含む、医学的状態について個体を処置する方法を含む。ＭＳＣは、個体に１回又は２回以上投与され得る。個体は、医学的状態に対する１つ又は複数のさらなる治療を、受けたことがあってもよいし、又は受けたことがなくてもよいか、又は受けているか、又は受けるであろう。
本開示の他の目的、特性及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明及び特定の例は、本開示の特定の実施形態を示しているが、単なる例示として与えられていることを理解されたい。
本開示のより完全な理解のために、ここで、添付の図面と組み合わせて解釈される次の記載を参照する。
異なる供給源からのヒト間葉系間質（ＭＳＣ）細胞のＣＡＲ形質導入及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９編集のためのプロトコールの一例の概略図。
ＭＳＣの形質導入効率。図２Ａ）骨髄（ＢＭ）由来ＭＳＣ（左のプロット）及び臍帯組織（ＣＴ）由来ＭＳＣ（右のプロット）が、形質導入されていないＭＳＣ（赤色プロット；左ピークに向かって）及びアイソタイプ（灰色プロット；左端ピーク）と比較して、ＢＭ ＭＳＣについては６６．５％の効率（青色のプロット）で、ＣＴ ＭＳＣについては９８．４％（青色プロット；右端のピーク）で、ＣＡＲ ＣＤ５を発現するレトロウイルスベクターにより形質導入されたことを示す代表的なヒストグラム。フローサイトメトリーを使用して、細胞表面でのＣＡＲ抗体の発現によって形質導入を検出した。図２Ｂ）ＢＭ ＭＳＣ（左のプロット）及びＣＴ ＭＳＣ（右のプロット）が、形質導入されていないＭＳＣ（赤色プロット；左ピーク）及びアイソタイプ（灰色プロット；左端ピーク）と比較して、ＢＭ ＭＳＣについては６３．９％の効率（青色のプロット）及び８７．９％の効率（青色プロット；右ピーク）で、ＣＡＲ ＣＤ３８を発現するレトロウイルスベクターにより形質導入されたことを示す代表的なヒストグラム。フローサイトメトリーを使用して、細胞表面での発現ＣＡＲ抗体によって形質導入を検出した。図２Ｃ）ＣＴ ＭＳＣが、非形質導入ＭＳＣ（赤色プロット；左ピーク）及びアイソタイプ（灰色プロット；また左ピーク）と比較して、８３．６％の効率（青色プロット；右ピーク）で、フコシルトランスフェラーゼ６（ＦＴ６）（タンパク質の特定の残基に糖を付加し、ＭＳＣの接着能を増大させ；これは、ＭＳＣ中の１つ又は複数のＣＡＲと組み合わせられ得る）を発現するレトロウイルスベクターにより形質導入されたことを示す代表的なヒストグラム。フローサイトメトリーを使用してそれらの細胞表面上のシアリル－ルイスＸ（ｓＬｅｘ）及びルイス（ＬｅＸ）残基（ＨＥＣＡ）の発現によって、形質導入を検出した。図２Ｄ）形質導入されていないＭＳＣ（赤色プロット；左ピーク）及びアイソタイプ（灰色プロット；左端ピーク）と比較して、ＦＴ６に対して４６．８％の効率及びＩＬ－２１に対して６７．９％の効率（青色プロット；右ピーク）で、ＣＴ ＭＳＣの継代５がＦＴ６（左のプロット）及びＩＬ－２１の膜結合バージョン（右のプロット）を同時発現するレトロウイルスベクターで形質導入されたことを示す代表的なヒストグラム。
臍帯組織（ＣＴ）ＭＳＣにおいて発現される免疫抑制遺伝子のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集の効率。図３Ａ）フローサイトメトリーによって実証された、Ｃａｓ９対象（赤色；右ピーク）と比較した、ＭＳＣ（青色；左ピーク）におけるエクソン２を標的とするＣＤ４７遺伝子編集のノックアウト（ＫＯ）効率を示す代表的なヒストグラム。図３Ｂ）Ｃａｓ９対照（赤色）と比較した、エクソン１に対する及びエクソン２に対するガイド、細胞及びＣＴ ＭＳＣにおける、単一ガイド（青色）としてのＰＤ－Ｌ２を使用したＭＳＣ（右パネル）におけるＣＤ４７遺伝子のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集のＫＯ効率を示すＤＮＡ電気泳動ゲル。図３Ｃ）フローサイトメトリーによって評価されたＣａｓ９対照（赤色；最も右のピーク）と比較した、ＣＴ ＭＳＣ（青色；最も左のピーク）における免疫抑制遺伝子ＰＤ－Ｌ１（左パネル）及びＰＤ－Ｌ２のＫＯ効率を示す代表的なヒストグラム。図３Ｄ）Ｃａｓ９のみ（Ｃａｓ９；最も右のピーク）を用いてエレクトロポレーションを行ったＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２の二重ＫＯ（最も左のピーク）を示す代表的なヒストグラムであり、これらは対照として使用された。
ＣＤ４０Ｌでの臍帯組織（ＣＴ）由来ＭＳＣの形質導入及び機能性。図４Ａ）ＣＴ ＭＳＣが、フローサイトメトリーによって評価された、形質導入されていないＭＳＣ（赤色プロット；殆ど左ピーク）と比較して、８７．１％の効率（青色プロット；ほぼ右ピーク）でＣＤ４０Ｌを発現するレトロウイルスベクターにより形質導入されたことを示す代表的なヒストグラム。図４Ｂ）培養中に継続的に維持されたＣＤ４０ＬでのＭＳＣ形質導入の一貫性を示す棒グラフ。図４Ｃ）ＣＴ ＭＳＣの阻害効果。フローサイトメトリーによって評価した場合の、形質導入されていないＭＳＣ又は異なる比率で形質導入されたＭＳＣの非存在下又は存在下でのＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって誘導された精製Ｔリンパ球の増殖。
免疫抑制遺伝子のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集を介して操作されたＭＳＣの増殖及び機能研究。図５Ａ）ノックアウト（Ｋ））ＭＳＣの累積集団倍加レベル（ｃＰＤ）。完全培地を使用してＭＳｃｓ Ｐ４（７５，０００）を２４ウェルプレートに播種し、培地を週に２回交換しながら７日間、拡大増殖させた。その後、ＴｒｙｐＬＥを使用してＭＳＣ単層を放出させ、細胞を完全培地で洗浄し、３００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、細胞を１ｍｌの完全培地中で再懸濁し、自動計数を使用してアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム染色（ＡＯ／ＰＩ）を使用して計数する。以下の式を適用することによって各継代後のｃＰＤを計算した：２ＰＤ＝回収した細胞数／播種細胞数；ｃＰＤ＝Σｎ２（ＰＤ１＋ＰＤ２＋：：：＋ＰＤｎ）、ＰＤはここでは集団倍加を指す。図５Ｂ）ＣＤ４＋細胞のサイトカイン分泌（ＩＦＮｇ、ＩＬ－２、ＴＮＦａ）を測定することによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した後、ＭＳＣ ＫＯ細胞及びＣａｓ９対照細胞の免疫抑制能をインビトロで試験した。ＫＯ及びＣａｓ９対照ＭＳＣを１：１（ＭＳＣ／ＣＤ ４）でＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。
Ｉ．（定義）
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又はそれ以上を意味することがある。本明細書において請求項（複数可）で使用されているように、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」と共に使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたはそれ以上を意味することがある。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも２つ目以上を意味する場合がある。さらに、用語「有する」、「含む」、「含む」、及び「包含する」は交換可能であり、当業者は、これらの用語がオープンエンドな用語であることを認識している。特定の実施形態において、本開示の態様は、例えば、本開示の１つ以上の配列から「本質的にからなる」または「構成される」場合がある。本発明のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／又は方法から構成されるか、又は本質的に構成されてもよい。本明細書に記載される任意の方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法又は組成物に関して実施され得ることが企図される。本願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質組成、手段、方法及びステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。本明細書で使用される場合、「又は」及び「及び／又は」という用語は、複数の成分を組み合わせて、又は互いに排他的に記述するために利用される。例えば、”ｘ、ｙ、及び／又はｚ”は、”ｘ”単独、”ｙ”単独、”ｚ”単独、”ｘ、ｙ、及びｚ”、”（ｘ及びｙ）又はｚ”、”ｘ又は（ｙ及びｚ）”、又は”ｘ又はｙ又はｚ”を指すことができる。ｘ、ｙ、またはｚは、実施形態から具体的に除外されてもよいことが特に企図される。
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、選択肢のみを指すように明示的に示されない限り、又は選択肢は相互に排他的であることを示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用される。もっとも、本開示は選択肢及び「及び／又は」のみに言及する定義を支持する。本明細書で使用される「別の」は、少なくとも第２の、またはそれ以上を意味することがある。用語「約」、「実質的に」及び「約」は、一般に、記載された値プラス又はマイナス５％を意味する。
本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加の実施形態」、又は「さらなる実施形態」又はそれらの組み合わせへの言及は、実施形態と関連して説明される特定の特徴、構造又は特性が本開示の少なくとも一実施形態に含まれることを意味している。したがって、本明細書中の様々な場所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ又は複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わされ得る。
「免疫障害」、「免疫関連障害」、又は「免疫介在性障害」は、免疫応答が疾患の発症又は進行に重要な役割を果たす障害を指す。免疫介在性障害には、自己免疫疾患、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、及び炎症性疾患及びアレルギー性疾患が含まれる。
本明細書で使用する「操作された」という用語は、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクターなどを含む、人の手によって生成される実体を指す。少なくともいくつかの場合において、操作された物は合成であり、天然には存在しない、または本開示において利用される方法で構成された要素から構成される。ＭＳＣに関して、細胞は、１つ以上の内因性遺伝子の発現が減少しているため、および／または１つ以上の異種遺伝子（合成抗原受容体および／またはサイトカインなど）を発現するため、操作され得る。この場合、操作はすべて人の手によって行われる。抗原受容体に関しては、抗原受容体は、自然界に見られない成分の融合タンパク質の形態でそのように構成されるように遺伝的に組み替えられた複数の成分からなるため、操作されているとみなされることがある。
本明細書で使用する「大規模」という用語は、１０１０、１０１１などの数のＭＳＣ細胞を含む、最大１０９以上のオーダーのものを指す。
疾患または状態の「治療」または処置は、疾患の徴候または症状を緩和する努力として、患者に１つまたは複数の薬剤を投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。治療の望ましい効果としては、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、寛解または予後の改善などが挙げられる。緩和は、疾患または状態の徴候または症状が現れる前に起こり得るだけでなく、それらの出現後にも起こり得る。したがって、「治療する」または「処置」は、疾患または望ましくない状態の「予防する」または「防止する」ことを含むことができる。さらに、「治療する」または「治療」は、徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、特に、患者にわずかな効果しか与えないプロトコルを含む。
本出願を通じて使用される「治療上の利益」又は「治療上有効な」という用語は、この状態の医学的治療に関して対象の幸福を促進又は増進するものを指す。これには、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の減少が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、癌の治療は、例えば、腫瘍の大きさの減少、腫瘍の浸潤性の減少、癌の成長速度の減少、または転移の防止を含んでもよい。癌の治療はまた、癌を有する被験者の生存を延長することを指す場合もある。
「対象」及び「患者」又は「個体」は、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物などのヒト又は非ヒトのいずれかを意味する。特定の実施形態では、対象はヒトである。
本明細書で使用されるように、「哺乳動物」は、本発明の方法のための適切な対象である。哺乳類は、ヒトを含む高等脊椎動物クラスＭａｍｍａｌｉａの任意のメンバーであってよく；生殖、体毛、及び若者を養うためのミルクを分泌する雌の乳腺によって特徴付けられる。さらに、哺乳類は、気候条件が変化しても体温を一定に保つことができることも特徴である。哺乳類の例としては、ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、ネズミ、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、チンパンジーが挙げられる。哺乳類は、「患者」または「被験者」または「個体」と称されることがある。
「医薬または薬学的に許容される」という語句は、適宜、ヒトなどの動物に投与したときに有害、アレルギー、または他の不快な反応を生じない分子および組成物を指す。抗体または追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者には既知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、調製物は、ＦＤＡ生物学的標準室が要求する無菌性、発熱性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきであることが理解されよう。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、任意のおよび全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、生理食塩水、非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンガーデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、注射用有機エステル、例えばエチルオレート）、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化剤、保存剤（例えば。抗菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、香料、色素、液体および栄養補充剤、当業者に知られているような材料およびその組み合わせが挙げられる。医薬組成物中の様々な成分のｐＨ及び正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。
本明細書で使用する場合、遺伝子の「破壊」は、破壊がない場合の遺伝子産物の発現レベルと比較して、細胞内の対象遺伝子によってコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現の排除又は減少を意味する。例示的な遺伝子産物には、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質産物が含まれる。ある場合の破壊は、一過性または可逆性であり、他の場合は永久的である。いくつかの場合における破壊は、切断された又は非機能的な産物が生成され得るという事実にもかかわらず、機能的又は全長のタンパク質又はｍＲＮＡのものである。本明細書のいくつかの実施形態では、発現とは対照的に、遺伝子活性または機能が破壊される。遺伝子破壊は、一般に、人工的な方法、すなわち、化合物、分子、複合体、又は組成物の添加又は導入によって、及び／又はＤＮＡレベルなど、遺伝子の又は遺伝子に関連する核酸の破壊によって、誘導される。遺伝子破壊のための例示的な方法には、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト、及び／又は遺伝子編集などの遺伝子破壊技術が含まれる。例としては、一般に一過性の発現低下をもたらすＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又はリボザイムなどのアンチセンス技術、並びに、例えば、切断及び／又は相同組換えの誘導によって、標的遺伝子の不活性化又は破壊をもたらす遺伝子編集技術などが挙げられる。例としては、挿入、変異、および欠失が挙げられる。破壊は、典型的には、遺伝子によってコードされる正常または「野生型」産物の発現の抑制および／または完全な欠如をもたらす。そのような遺伝子破壊の例示は、遺伝子全体の欠失を含む、遺伝子または遺伝子の一部の挿入、フレームシフトおよびミスセンス変異、欠失、ノックイン、およびノックアウトである。このような破壊は、コード領域、例えば、１つ以上のエクソンにおいて起こり得、その結果、停止コドンの挿入などにより、完全長生成物、機能的生成物、または任意の生成物を生成することができなくなる。このような破壊は、遺伝子の転写を妨げるように、プロモーターまたはエンハンサー、あるいは転写の活性化に影響を与える他の領域の破壊によっても起こり得る。遺伝子の破壊には、相同組換えによる標的遺伝子の不活性化など、ジーンターゲティングが含まれる。
本明細書で使用する「異種」という用語は、レシピエントとは異なる細胞型又は異なる種に由来することを意味する。具体的には、合成である、及び／又はＭＳＣ細胞由来でない遺伝子又はタンパク質を指す。この用語はまた、合成的に誘導された遺伝子または遺伝子コンストラクトを指す。例えば、サイトカインは、サイトカインをコードする核酸配列を保有するベクターでＭＳＣ細胞に提供されることを含む、遺伝子組換えによるなど、合成的に由来したため、サイトカインがＭＳＣ細胞によって天然に産生される場合でも、ＭＳＣ細胞に関して異種と見なされることがある。
本明細書中で使用される場合、「間葉系幹細胞」又は「間葉系間質細胞」又は「ＭＳＣ」という用語は、様々な細胞型に分化し得る多能性間質細胞を指す。特定の実施形態では、ＭＳＣは１つ又は複数の特徴を有する。特定の実施形態では、ＭＳＣは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４及びＨＬＡ－Ｉのうちの１つ又は複数の発現を有し、及び／又は、（例えば、造血細胞に関して）、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲ及び／又はＣＤ１４などの系列マーカーの欠如又は発現低下がある。
本開示は、ＭＳＣの大規模な拡大増殖、ＣＡＲ形質導入、サイトカイン発現及び遺伝子編集のための新規アプローチに関する。このアプローチは、任意選択的にサイトカイン遺伝子を発現することに加えて、多数に拡大増殖させ、腫瘍抗原に対してそれらの特異性を再方向付けするように形質転換しようとする末梢血由来、臍帯血由来又は幹細胞由来のＭＳＣ（例として）の拡大増殖を可能にする。ＭＳＣの機能は、いくつかの例として、細胞疲弊及び腫瘍誘発性機能障害に関与する遺伝子を欠失させることによってさらに改善される。
特定の実施形態では、本開示は、細胞の改善された機能及び腫瘍微小環境に対する耐性に寄与するヒトＭＳＣにおける単一又は複数の遺伝子のＣＡＲ形質導入と欠失との組み合わせを包含する。特に、治療のためのＭＳＣの作製を可能にする大規模なＧＭＰグレードのプロトコールが開示される。本開示の実施形態は、患者自身のＭＳＣ又は養子移入されたＭＳＣの機能を促進する新規免疫療法アプローチを使用する患者ケアの改善を含む。
ＩＩ．プロセス
本開示の実施形態は、操作されたＭＳＣを、特に大規模に作製するプロセスに関する。特定の実施形態では、本プロセスは、特定のタイプの操作されたＭＳＣを作製するために１つの特定のパラメーター又は特定のパラメーターの組み合わせを利用し、このパラメーターは、試薬の特定の濃度、特定のタイプのＭＳＣ、１つ又は複数の工程に対する特定の持続時間、特定のタイプの細胞改変機構又はそれらの組み合わせを含む。最適な変数が本明細書中に記載されているが、依然として適切な量の操作されたＭＳＣを作製するプロセスの変形物もあり、これらも本明細書中に包含されることを当業者は認識するであろう。
このプロセスは、一般に、一連の工程に関し、特定の実施形態では、この一連の工程は、ＭＳＣの拡大増殖、１つ、２つ又はそれを超える態様でのＭＳＣの操作及び作製された操作されている細胞の拡大増殖と、それに続く任意選択的な分析工程及び／又は任意選択的な個体への投与工程を含む。特定の実施形態では、操作は、（１）操作された抗原受容体及び／又はサイトカイン（及び／又はフコシルトランスフェラーゼ６及び／又は膜結合ＩＬ－２１及び／又はＣＤ４０Ｌ）などの異種タンパク質を発現するように細胞を改変すること、及び（２）ＭＳＣにおける１つ又は複数の内因性遺伝子の発現の低下（ノックダウン）又は発現の排除（ノックアウト）を有するように細胞を改変することの両方を含む。一部の例では、（１）は（２）の前に行われ、他の場合では、（２）が（１）の前に行われる。発現が低下するか又は発現が排除されるように細胞を改変することは何らかの手段によって行われ得るが、特定の実施形態では、改変はＣＲＩＳＰＲによるものである。
このプロセスのための最初の工程は、最終的な改変のためのＭＳＣの数の増加を可能にするＭＳＣの拡大増殖であり得る。ＭＳＣは、例えば、新鮮な供給源から、又は保存物から、又は市販のものを入手し得る。ＭＳＣはあらゆる種類であり得るが、特定の実施形態では、ＭＳＣは、臍帯血組織、末梢血、骨髄、脂肪組織又はそれらの混合物に由来する。特定の場合において、ＭＳＣは、臍帯組織又は骨髄に由来する。特定の実施形態では、拡大増殖工程のためのＭＳＣの開始培養は、少なくとも５００万～１億個の細胞を含み、いくつかの場合では、１×１０９個の細胞が使用される。従って、特定の場合において、プロコトールを開始させるためのＭＳＣの数は、５００万、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、５０００万、５５００万、６０００万、６５００万、７０００万、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、１億個又はそれを超えるＭＳＣである。５００万～１億、５００万～９０００万、５００万～７５００万、５００万～５０００万、５００万～２５００万、５００万～１０００万、１０００万～１億、１０００万～９０００万、１０００万～７５００万、１０００万～６０００万、１０００万～５０００万、１０００万～２５００万、２５００万～１億、２５００万～９０００万、２５００万～７５００万、２５００万～５０００万、５０００万～１億、５０００万～９０００万、５０００万～７５００万、７５００万～１億、７５００万～９０００万又は９０００万～１億個及びその間で導き出すことが可能な何らかの範囲の細胞を含む細胞の範囲が、本プロセスの何れかの工程で利用され得る。
特定の実施形態では、培養における拡大増殖工程の開始前に、ＭＳＣは、混合細胞の集団とともに存在し得る特定の望ましくない細胞の枯渇に供される。枯渇工程は、望ましくない細胞をＭＳＣの集団から選別するための手段として、望ましくない細胞上の特定のマーカーの存在を利用し得る。これを行うための手段の一例として、細胞に対して、免疫磁気ビーズ（望ましくない細胞と会合するマーカーに対する抗体を有する）を使用して枯渇化を行い、それによってＭＳＣの濃縮集団を生成させ得る。
特定の実施形態では、拡大増殖工程が行われる培地は、サイトカインを欠き得る。拡大増殖工程は、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃を含め、約３５℃～３８℃などの特定の温度で行われ得る。拡大増殖工程は、３％～７％ＣＯ２などの特定の酸素レベルで行われ得；特定の実施形態では、拡大増殖工程は、３％、４％、５％、６％又は７％ＣＯ２で行われる。拡大増殖工程は、特定の日数など、特定の期間継続し得る。特定の実施形態では、拡大増殖工程は、２、３、４、５、６、７日間又はそれより長く継続するが、特定の場合には、拡大増殖工程は、２～７、３～７、２～６、３～６、４～７、４～６、４～５、５～６、５～７又は６～７日間継続する。特定の実施形態では、拡大増殖工程における培地は、拡大増殖中に交換されてもよいし又はされなくてもよいが、特定の実施形態では、培地交換される。培地は、以前と同じ培地組成に対して、又は異なる培地組成に交換されているように置き換えられ得る。特定の態様では、拡大増殖工程は、ガス透過性バイオリアクター、例えばＧ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ又はＧ－Ｒｅｘ １００（登録商標）などのバイオリアクター中で行われる。特定の態様では、バイオリアクターはガス透過性バイオリアクターである。特定の態様では、ガス透過性バイオリアクターは、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００Ｍ又はＧ－Ｒｅｘ １００（登録商標）である。いくつかの態様では、３、３．５、４、４．５又は５Ｌなどの３～５Ｌの培地など、特定の量の培地中で拡大増殖（刺激）工程が行われる。
ＭＳＣの拡大増殖の開始後の約第２日、３日、４日、５日、６日、７日又は８日に、拡大増殖させたＭＳＣに対して改変を行い得る。第１の改変は、１つ又は複数の異種抗原受容体を発現させるためのＭＳＣの形質導入又は遺伝子移入であり得るが、一部の場合には、第１の改変はＭＳＣの１つ又は複数の内因性遺伝子の発現を破壊することである。第１の改変が、１つ又は複数の異種抗原受容体を発現させるためのＭＳＣの形質導入又は遺伝子移入である場合、その後の改変はＭＳＣの１つ又は複数の内因性遺伝子の発現を破壊することである。第１の改変がＭＳＣの１つ又は複数の内因性遺伝子の発現を破壊することである場合、その後の改変は、１つ又は複数の異種抗原受容体を発現させるためのＭＳＣの形質導入又は遺伝子移入である。特定の実施形態では、ＭＳＣは、１つ又は複数の異種サイトカインを発現するように操作され、この工程はいつでも行われ得る。
特定の実施形態では、拡大増殖させたＭＳＣは、１つ又は複数の内因性遺伝子の発現の破壊のために細胞を遺伝子編集する前に、異種抗原受容体遺伝子を有するように細胞に対して形質導入又は遺伝子移入を行う。特定の実施形態では、１つ又は複数のキメラ抗原受容体、１つ又は複数のＴ細胞受容体又はそれらの組み合わせをコードする発現コンストラクトを含む特定のベクターを用いて細胞に対して形質導入又は遺伝子移入を行う。ベクターは、少なくともナノ粒子、プラスミド、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクターなどを含む何らかの種類であり得る。ＭＳＣは、ＭＳＣが複数の異種タンパク質、例えば異種抗原受容体、自殺遺伝子及び１つ又は複数のサイトカイン、例えばＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数の異種サイトカインを発現することを可能にするベクターで遺伝子移入又は形質導入され得る。複数の異種タンパク質に対する遺伝子は同じベクター上に存在し得るが、いくつかの場合では、それらは複数のベクター上に存在する。細胞が形質導入又は遺伝子移入されたら、それらが改変され、異種タンパク質の発現について試験され得、これは、遺伝子移入／形質導入の１、２、３日後又はそれより後に行われ得る。改変されたＭＳＣの集団からのアリコートを試験する場合、試験は、さらなる改変の前、例えばＭＳＣの遺伝子編集の前に行われてもよいし又は行われなくてもよい。
ＭＳＣの拡大増殖の開始後、約第３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日又は１２日以内に、改変されたＭＳＣに対して遺伝子編集の方法を行い得る。遺伝子編集工程は、遺伝子移入／形質導入工程後１、２、３日又はそれより長い日数以内に行われ得る。改変された（遺伝子移入又は形質導入）ＭＳＣの遺伝子編集は、何らかの適切な方法によって行われ得るが、特定の実施形態では、改変ＭＳＣの遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ法によって行われる。従って、特定の実施形態では、改変された細胞は、適切な量のＣａｓ９及びガイドＲＮＡに曝露される。ＭＳＣの複数の遺伝子を発現のために破壊しようとする場合、編集しようとする所望の遺伝子のそれぞれについて１つ又は複数の配列特異的ガイドＲＮＡを含むガイドＲＮＡ群が存在し得る。特定の実施形態では、ＭＳＣに対して、１日、２日、３日又はそれを超える時間で隔てられた２回の異なるエレクトロポレーション工程を行う。そのような場合、第１のエレクトロポレーション工程は、１つ又は複数の遺伝子を標的とすることを含み、第２又は後続のエレクトロポレーション工程は、第１のエレクトロポレーション工程とは異なる遺伝子である１つ又は複数の遺伝子を標的とすることを含む。いくつかの場合では、３、４、５回又はそれを超える回数のさらなるエレクトロポレーション工程を含め、２回のエレクトロポレーション工程を超える連続したエレクトロポレーション工程が存在する。複数のエレクトロポレーション工程が利用される何れかの場合で、次のエレクトロポレーションは、前のエレクトロポレーション工程から１、２、３、４日後又はそれより長い日数後のみなど、特定の期間の後にのみ行われ得る。
特定の実施形態では、ＭＳＣに対して最初に遺伝子編集工程を行い、続いて１つ又は複数の異種抗原受容体遺伝子を保有するための形質導入又は遺伝子移入工程を行う。
ＭＳＣの遺伝子編集及び形質転換／形質導入に続いて、ＭＳＣに対して、改変された遺伝子編集ＭＳＣの数を増加させるための第２の拡大増殖工程を行ってもよいし、又は行わなくてもよい。特定の実施形態では、本プロセスの第２の拡大増殖工程は、本プロセスの第１の拡大増殖工程と実質的に同一であり得るが、代替実施形態では、第２の拡大増殖工程は、第１の拡大増殖工程とは異なり、例えば、異なる培地、異なる外因的に添加された化合物、培養／拡大増殖のための異なる持続時間、いくつか例を挙げるとＧＲＥＸ又はＷＡＶＥなどの異なる拡大増殖フラスコ又はその組み合わせなどを有する。
第２の拡大増殖工程のための特定の期間の後、細胞は、利用、分析、保存などされ得る。特定の実施形態では、細胞は、機能性、細胞傷害性、インビボ活性などについて分析される。例えば、細胞は、（１）異種抗原受容体がその標的抗原に結合する能力；（２）発現のノックダウン又はノックアウトを確認するための編集された遺伝子の発現又はその欠如；又は（３）両方について分析され得る。特定の場合において、細胞は、例えば、質量分析及び／又はＲＮＡ配列決定に供される。細胞は、インビトロ及び／又はインビボで抗癌活性について分析され得る。
特定の実施形態では、作製されたＭＳＣは、例えば凍結保存を含め、保存される。例えば、ＭＳＣは、出発ＭＳＣが得られた個体による使用のために凍結保存され得るか、又はＭＳＣは、出発ＭＳＣが得られた個体とは異なる個体による使用のために凍結保存され得る。
ＩＩＩ．具体的な実施形態
ＭＳＣ生産のためのプロセスの具体的な実施形態は、以下の通りであり得る。
ＭＳＣ細胞の拡大増殖及び形質導入
骨髄（ＢＭ）及び臍帯組織（ＣＢｔ）からの間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）を、それらが８０％コンフルエンスに達するまで、５％血小板溶解物、１％Ｌ－グルタミン、２Ｕ／ｍｌヘパリン及び１％抗生物質（ペニシリン－ストレプトマイシン）を追加したアルファＭＥＭ培地を含有する完全培地中で拡大増殖させた。８０％コンフルエンスに達した後、ＴｒｙｐＬｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ １％を使用してＭＳＣを５分間トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、計数する。
ＭＳＣは、１つ又は複数のＣＡＲ、１つ又は複数の合成ＴＣＲ、１つ又は複数のサイトカイン遺伝子、ＣＤ４０リガンド、ホーミング受容体、細胞死受容体、例えばＴＲＡＩＬ若しくはＦＡＳリガンドなど、又はこれらの遺伝子の組み合わせを発現するように形質導入（レトロウイルス形質導入を含む）され得る。形質導入工程は、より少ない継代数（継代１～４の間）のＭＳＣを用いて行われ得る。１ウェルあたりＰＢＳで希釈した１％レトロネクチン１ｍｌを含有する非組織培養プレートを３７℃で５時間温置することによって、レトロネクチン形質導入プレートを準備する。次いで、レトロネクチンプレートを吸引し、抗生物質なしの完全培地をウェルに添加する。培地を含むプレートを１０分間温置する。次いで、培地をレトロウイルス上清と交換し、２０００ｇ及び３２℃で２時間遠心分離する。次に、レトロウイルス上清を新鮮なレトロウイルス上清と交換し、細胞を添加する。プレートを２０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で５０分間振盪し、次いで３７℃で５％ＣＯ２とともに静置する。２４時間後、上清を除去し、新しい新鮮な完全培地をプレートに添加する。１００ｍｍ皿あたり細胞１．５×１０５個の密度でレトロネクチン形質導入プレートにＭＳＣを播種する。２～３日後（形質導入後）、形質導入されたＭＳＣをトリプシン処理し、遠心分離し、完全培地上で拡大増殖させる。このとき、ＭＳＣの形質導入効率は、フローサイトメトリーを用いて評価すべきである。
ＭＳＣ細胞拡大増殖及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集
骨髄（ＢＭ）及び臍帯組織（ＣＢｔ）からの間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）を、それらが８０％コンフルエンスに達するまで、５％血小板溶解物、１％Ｌ－グルタミン、２Ｕ／ｍｌヘパリン及び１％抗生物質（ペニシリン－ストレプトマイシン）を追加したアルファＭＥＭ培地を含有する完全培地中で拡大増殖させた。８０％コンフルエンスに達した後、ＴｒｙｐＬｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ １％を使用してＭＳＣを５分間トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、計数する。
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集を使用したＭＳＣにおける遺伝子のノックアウトのために、より少ない継代数（１～４の間）のＭＳＣを使用する。ＴｒｙｐＬｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ１％を使用して５分間細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、計数する。特定の場合には、１回のエレクトロポレーション工程で最大２つ又は３つの遺伝子を同時に編集し得る。３つ以上の遺伝子を標的とする場合、最初のエレクトロポレーション工程後に２～３日間細胞を休ませ、次いで所望のｇＲＮＡを用いて２回目のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９＋エレクトロポレーションを行う。（Ｃｒｉｓｐｒ Ｃａｓ９アプリケーションの詳細については以下を参照されたい）。特定の実施形態では、同じＭＳＣ細胞において最大５個までの遺伝子をノックアウトし得、特定の場合には、これは同じ日の同じ反応ではなく、異なる反応及び日に行われる。
ＭＳＣ細胞拡大増殖、ＣＡＲ形質導入及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集
５％血小板溶解物、１％Ｌ－グルタミン、２Ｕ／ｍｌヘパリン及び１％抗生物質（ペニシリン－ストレプトマイシン）を追加したアルファＭＥＭ培地を含有する完全培地中で、８０％コンフルエンスに達するまで骨髄（ＢＭ）及び臍帯組織（ＣＢｔ）からの間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）を拡大増殖させた。８０％コンフルエンスに達した後、ＴｒｙｐＬｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ １％を使用してＭＳＣを５分間トリプシン処理し、ＰＢＳにより洗浄し、計数する。
ＭＳＣは、１つ又は複数のＣＡＲ、１つ又は複数の合成ＴＣＲ、１つ又は複数のサイトカイン遺伝子、ＣＤ４０リガンド、ホーミング受容体、細胞死受容体、例えばＴＲＡＩＬ若しくはＦＡＳリガンドなど、又はこれらの遺伝子の組み合わせを発現するように形質導入（レトロウイルス形質導入を含む）され得る。形質導入工程は、より少ない継代数（継代１～４の間）のＭＳＣを用いて行われ得る。１ウェルあたりＰＢＳで希釈した１％レトロネクチン１ｍｌを含有する非組織培養プレートを３７℃で５時間温置することによって、レトロネクチン形質導入プレートを準備する。次いで、レトロネクチンプレートを吸引し、抗生物質なしの完全培地をウェルに添加する。培地を含むプレートを１０分間温置する。次いで、培地をレトロウイルス上清と交換し、２０００ｇ及び３２℃で２時間遠心分離する。次に、レトロウイルス上清を新鮮なレトロウイルス上清と交換し、細胞を添加する。プレートを２０ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で５０分間振盪し、次いで、３７℃で５％ＣＯ２とともに静置する。２４時間後、上清を除去し、新しい新鮮な完全培地をプレートに添加する。１００ｍｍ皿あたり細胞１．５×１０５個の密度でレトロネクチン形質導入プレートにＭＳＣを播種する。２～３日後（形質導入後）、形質導入されたＭＳＣをトリプシン処理し、遠心分離し、完全培地中で拡大増殖させる。このとき、ＭＳＣの形質導入効率は、フローサイトメトリーを用いて評価すべきである。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ９遺伝子編集が必要とされる場合、ＣＡＲ形質導入工程の７２～９６時間後、ＴｒｙｐＬｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ １％を使用して５分間、ＭＳＣを再びトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、計数する。１回のエレクトロポレーション工程で、最大２つの遺伝子を同時に編集し得る。３つ以上の遺伝子を標的とする場合、最初のエレクトロポレーション工程後に細胞を２～３日間休ませ、次いで所望のｇＲＮＡを用いて２回目のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９＋エレクトロポレーションを行い得る。（Ｃｒｉｓｐｒ Ｃａｓ９アプリケーションの詳細については以下を参照されたい）。
最初にＣＲＩＳＲＰ遺伝子編集工程を行い、続いて２～３日後にＣＡＲ形質導入を行い得ることに留意されたい。
以下は、ＭＳＣに適用され得るＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集の１つの例を提供するが、可変要素の何れか１つ又は複数が変更され得る。
１．ｃｒＲＮＡプレ複合体形成及びエレクトロポレーション（Ｌｏｎｚａ ４Ｄ）（５００万～３０００万個のＭＳＣに対して）
工程１：ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を作製する
Figure 2023503651000002
 ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの出発濃度は２００μＭである。これらを等モル濃度で混合した後の最終濃度は１００μＭである。
ａ．ピペットで混合し、遠心分離する。
ｂ．サーモサイクラー中で９５℃にて５分間温置する。
ｃ．ベンチトップ上で室温まで冷ます。
工程２：ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖及びＣａｓ９ヌクレアーゼを組み合わせる
Figure 2023503651000003
Figure 2023503651000004
 ａ．ピペットで混合し、遠心分離する。
ｂ．混合物を室温で１５分間温置する。
工程３：工程３からのｃｒＲＮＡ＃１とｃｒＲＮＡ＃２とを組み合わせる。
Figure 2023503651000005
 工程４：エレクトロポレーションの実施
Figure 2023503651000006
 ａ．培地（優先的には抗生物質不含）を含む培養プレートを準備する。
ｂ．細胞５×１０６個を調製し（ＰＢＳで２回洗浄してＦＢＳを除去）、使用直前に１００μＬのＰ３初代細胞ヌクレオフェクター溶液中で再懸濁する。
ｃ．細胞懸濁液及びＲＮＰ（最終的なＣａｓ９濃度は４．６μＭであり、ｇＲＮＡ濃度は４μＭである）を混合し、ヌクルオキュベット（ｎｕｃｌｕｏｃｕｖｅｔｔｅ）に移し、蓋を所定の位置にして閉じる。
ｄ．エレクトロポレーションプログラムはＥＯ－１１５であり、次いで細胞を培養プレートに添加し、３７Ｃ０インキュベーター内で回復させる。
ｅ．５Ｅ＋１０６－Ｘ単位まで（Ｃａｔ：ＡＡＦ－１００２Ｘ）（最終製品から２０μｌで十分である。最終濃度については上記を参照されたい。）
ｆ．最大３０×１０６個のエレクトロポレーションを行うために、１ｍｌ ＬＶ Ｋｉｔ Ｌ Ｕｎｉｔ（カタログ番号：Ｖ４ＬＣ－２００２）を使用する。
ｇ．最大１００×１０６個又はそれを超える個数に対してエレクトロポレーションを行うために、１ｍｌ ＬＶ Ｋｉｔ Ｌ Ｕｎｉｔ（カタログ番号：ＡＡＦ－１００２Ｌ）を使用する。
ｈ．全細胞の数を５×１０６で除し、次いで工程３からのＲＮＰ複合体の最終量を乗じることによって、必要とされるＲＮＰ複合体の総量を計算する。
ｉ．例：細胞数が３０×１０６個である場合、３０×１０６／５×１０６＝６となり、６×２０μｌ＝１２０μｌを使用する。
ｉｉ．例：細胞数が１００×１０６である場合、１００×１０６／５×１０６＝２０となり、２０×２０μｌ＝４００μｌを使用する。
ＣＲＩＳＰＲ ＣＡＳ９：小規模プロトコール（出発細胞集団１５万～３００万個）
１．ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プレ複合体形成及びエレクトロポレーション（Ｎｅｏｎ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
ａ．近接領域にまたがる１つ又は２つのｓｇＲＮＡを設計し、各遺伝子に使用した。１．５μｇのｃａｓ９（ＰＮＡ Ｂｉｏ）及び５００ｎｇのｓｇＲＮＡ（全てのｓｇＲＮＡの合計）反応物を各遺伝子について作製し、氷上で２０分間温置した。
ｂ．２０分後、１５０，０００個のＭＳＣ細胞をＲ緩衝液中で再懸濁し（Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに含まれ、ＲＮＰ複合体及び細胞を含む総体積は１４μｌとなるはずである）、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して１０μｌのエレクトロポレーションチップでエレクトロポレーションを行った。
ｃ．エレクトロポレーション条件は、ＭＳＣの場合、１６００Ｖ、１０ｍｓ及び３パルスである。次いで、細胞を培地とともに培養プレートに添加し、３７℃のインキュベーター中で回復させる。
２．ｃｒＲＮＡプレ複合体形成及びエレクトロポレーション（Ｎｅｏｎ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）
工程１：ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を作製する
Figure 2023503651000007
 ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの出発濃度は２００μＭである。それらを等モル混合した最終濃度は、４４μＭである。
ｄ．ピペットで混合し、遠心分離する。
ｅ．サーモサイクラー中、９５Ｃで５分間温置する。
ｆ．ベンチトップ上で室温まで冷ます。
工程２：ｃａｓ９ヌクレアーゼ調製
Figure 2023503651000008
 工程３：ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖及びＣａｓ９ヌクレアーゼを組み合わせる。
Figure 2023503651000009
Figure 2023503651000010
 ａ．ピペットで混合し、遠心分離する。
ｂ．混合物を室温で１５分間温置する。
工程４：工程３からのｃｒＲＮＡ＃１とｃｒＲＮＡ＃２とを組み合わせる
Figure 2023503651000011
 工程５：エレクトロポレーションの実施
ウェルあたり２５０，０００個の細胞を調製し、使用直前に７．５μｌのＴ緩衝液中で再懸濁する。
エレクトロポレーション条件は、１６００Ｖ、１０ｍｓ及び３パルスである。次いで、細胞を培養プレートに添加し、３７℃のインキュベーター中で回復させる。
ＩＶ．異種抗原受容体
本開示のＭＳＣは、操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、キメラサイトカイン受容体、ケモカイン受容体、それらの組み合わせなどの１つ又は複数の異種抗原受容体を発現するように遺伝子操作され得る。異種抗原受容体は、人為的に合成により作製される。特定の実施形態では、ＭＳＣは、癌抗原に対する抗原特異性を有する１つ又は複数のＣＡＲ及び／又はＴＣＲを発現するように改変される。２つ又はそれを超える数の異なる抗原などに対する複数のＣＡＲ及び／又はＴＣＲをＭＳＣに添加し得る。いくつかの態様では、免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲを使用するなどして、特定の遺伝子座でのＣＡＲ又はＴＣＲのノックインによってＣＡＲ又はＴＣＲを発現するように操作される。
ＭＳＣは、ＣＲＩＳＰＲを使用して特に編集されるが、代替的な適切な改変方法は当技術分野で公知である。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌを参照されたい。例えば、細胞は、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００８及びＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９に記載されている形質導入技術を使用して、癌抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲを発現するように形質導入され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ又は複数の抗原受容体をコードする遺伝子操作を介して導入された１つ又は複数の核酸、及びそのような核酸の遺伝子操作された産物を含む。いくつかの実施形態では、核酸は異種であり、即ち、細胞又はその細胞から得られた試料には通常存在せず、例えば、例えば操作されている細胞及び／又はそのような細胞が由来する生物には通常見られない、別の生物又は細胞から得られたものなどである。いくつかの実施形態では、核酸は、天然には存在しない核酸（例えばキメラ）など、天然には存在しない。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、治療を必要とする個体の癌細胞などの癌細胞を含む細胞の表面で発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＴＣＲ様ＣＡＲであり、抗原は、ＴＣＲのように、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に関連して細胞表面で認識される細胞内タンパク質のペプチド抗原など、プロセシングされたペプチド抗原である。
ＣＡＲ及び組み換えＴＣＲを含む例示的な抗原受容体並びに受容体を操作し、細胞に導入する方法としては、例えば、国際公開第２０００１４２５７号パンフレット、同第２０１３１２６７２６号パンフレット、同第２０１２／１２９５１４号パンフレット、同第２０１４０３１６８７号パンフレット、同第２０１３／１６６３２１号パンフレット、同第２０１３／０７１１５４号パンフレット、同第２０１３／１２３０６１号パンフレット、米国特許出願公開第２００２１３１９６０号明細書、同第２０１３２８７７４８号明細書、同第２０１３０１４９３３７号明細書、米国特許第６，４５１，９９５号明細書、同第７，４４６，１９０号明細書、同第８，２５２，５９２号明細書、同第８，３３９，６４５号明細書、同第８，３９８，２８２号明細書、同第７，４４６，１７９号明細書、同第６，４１０，３１９号明細書、同第７，０７０，９９５号明細書、同第７，２６５，２０９号明細書、同第７，３５４，７６２号明細書、同第７，４４６，１９１号明細書、同第８，３２４，３５３号明細書及び同第８，４７９，１１８号明細書並びに欧州特許出願公開第２５３７４１６号明細書に記載されているもの、及び／又はＳａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｕｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２に記載のものが挙げられる。いくつかの態様では、遺伝子操作された抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されているようなＣＡＲ及び国際公開第２０１４０５５６６８Ａ１号に記載されているものを含む。
Ａ．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ａ）１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン及びｃ）１つ又は複数の抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインが２つ以上の抗原結合領域を含む場合、２つ以上の抗原は、いくつかの場合では同じ細胞又は同じタイプの細胞の表面上に発現される異なる抗原を含め、異なる抗原である。
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体は、活性化若しくは刺激ＣＡＲ、共刺激ＣＡＲ（国際公開第２０１４／０５５６６８号パンフレット参照）及び／又は阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１３参照）を含むＣＡＲを含む。ＣＡＲは一般に、いくつかの態様では、リンカー及び／又は膜貫通ドメインを介して、１つ又は複数の細胞内シグナル伝達成分に連結された細胞外抗原（又はリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は、典型的には、天然抗原受容体を通じたシグナル、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を通じたシグナル及び／又は共刺激受容体単独を通じたシグナルを模倣するか又は近似する。
本開示の特定の実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン及び１つ又は複数のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、免疫原性を低下させるためにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含む、抗原特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含む核酸の使用に関する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ又は複数の抗原間の共有空間を含むエピトープを認識し得る。特定の実施形態では、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域及び／又はその抗原結合断片を含み得る。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えばサイトカイン）に由来する。
ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を促進するために使用されるヒト遺伝子であり得ることが企図される。特定の実施形態では、本発明は、全長ＣＡＲ ｃＤＮＡ又はコード領域を含む。抗原結合領域又はドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の断片、例えば、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第７，１０９，３０４号明細書に記載されるものなどを含み得る。断片はまた、ヒト抗原特異的抗体の何れかの数の異なる抗原結合ドメインでもあり得る。より具体的な実施形態では、断片は、ヒト細胞における発現のためのヒトコドン使用に最適化される配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。
配置は、ダイアボディ又は多量体などの多量体性であり得る。多量体は、軽鎖及び重鎖の可変部分のダイアボディへの交差対合によって形成される可能性が最も高い。コンストラクトのヒンジ部分は、完全に欠失しているものから、第１のシステインが維持されるもの、セリン置換ではなくプロリンになるもの、第１のシステインまで切断されるものまで、複数の選択肢を有し得る。Ｆｃ部分は欠失させ得る。安定である、及び／又は二量体化するあらゆるタンパク質がこの目的を果たし得る。Ｆｃドメインの１つのみ、例えばヒト免疫グロブリン由来のＣＨ２又はＣＨ３ドメインの何れかを使用し得る。二量体化を改善するように改変されているヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域も使用し得る。免疫グロブリンのヒンジ部分のみも使用し得る。ＣＤ８αの一部も使用し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメイン及び改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体としては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）の１つ又は複数が挙げられるが限定されない。ＣＤ ３ζによって開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激受容体によって提供されるさらなるシグナルは、ＭＳＣの完全な活性化のために重要であり、インビボ持続性及び養子免疫療法の治療的成功を改善するのに役立ち得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、特定の抗原（又はマーカー若しくはリガンド）、例えば養子療法によって標的としようとする特定の細胞型で発現される抗原、例えば癌マーカー、及び／又は抑制する応答を誘導することを意図した抗原、例えば正常若しくは非疾患細胞型で発現される抗原など、に対する特異性とともに構築される。従って、ＣＡＲは、典型的には、その細胞外部分において、１つ又は複数の抗原結合断片、ドメイン若しくは部分、又は１つ又は複数の抗体可変ドメイン、及び／又は抗体分子などの１つ又は複数の抗原結合分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）に由来する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などの抗体分子の抗原結合部分（単数又は複数）を含む。
キメラ抗原受容体の特定の実施形態では、受容体の抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと呼ばれ得る）は、腫瘍関連抗原又は病原体特異的抗原結合ドメインを含む。抗原には、デクチン－１など、パターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原が含まれる。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面に発現されるものである限り、どのような種類であってもよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓなどが挙げられる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原が少量存在する場合、持続性を改善するためにサイトカインと同時発現され得る。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ－７、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１又はそれらの組み合わせなどの１つ又は複数のサイトカインと同時発現され得る。
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ供給源、ｃＤＮＡ供給源から得ることができるか、又は合成され得る（例えばＰＣＲを介して）か、又はそれらの組み合わせである。ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に応じて、イントロンがｍＲＮＡを安定化することが分かっているので、ｃＤＮＡ又はそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化するために内因性又は外因性の非コード領域を使用することがさらに有利であり得る。
キメラコンストラクトは、ネイキッドＤＮＡとして又は適切なベクター中で免疫細胞に導入され得ることが企図される。ネイキッドＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによって細胞に対して安定に遺伝子移入を行う方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号明細書を参照されたい。ネイキッドＤＮＡは、一般に、発現のために適切な配向でプラスミド発現ベクターに含有されるキメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。
いくつかの場合、キメラコンストラクトを免疫細胞に導入するために、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）を使用し得る。本開示の方法に従って使用するのに適したベクターは、免疫細胞において非複製性である。例えばＨＩＶ、ＳＶ ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ又はＢＰＶに基づくベクターなど、ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、細胞内で維持されるウイルスのコピー数は細胞の生存を維持するのに十分低い。
いくつかの態様において、抗原に特異的に結合する構成要素または抗原特異的認識構成要素は、１つ以上の膜貫通ドメインおよび細胞内のシグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態において、上記ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。１つの実施形態において、そのＣＡＲにおけるドメインの１つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合において、その膜貫通ドメインは、レセプター複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるためにそのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように、選択されるかまたはアミノ酸置換によって改変される。
膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、天然起源または合成起源に由来する。起源が天然である場合、そのドメインは、いくつかの態様において、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞レセプターのアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ分子に由来する（すなわち、それらの分子の膜貫通領域を少なくとも含む）膜貫通領域を含む。あるいは、膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態において、合成の膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、合成の膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが、合成の膜貫通ドメインの各末端に見られる。
ある特定の実施形態において、ＭＳＣ細胞などの免疫細胞を遺伝的に改変するための本明細書中に開示されるプラットフォーム技術としては、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３－ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３－ζまたは他の組み合わせ）を介してシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）長さが不定の細胞外ドメインであって抗原認識ドメインを細胞表面に接続する細胞外ドメインを有するＣＡＲ、およびいくつかの場合では、（ｉｖ）ＣＡＲ＋免疫細胞を頑強かつ数値的に拡大することができる、Ｋ５６２に由来する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）が挙げられる。
Ｂ．Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態において、遺伝的に操作された抗原レセプターには、組換えＴＣＲ、および／または天然に存在するＴ細胞からクローニングされたＴＣＲが含まれる。「Ｔ細胞レセプター」または「ＴＣＲ」とは、可変ａ鎖および可変β鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）または可変γ鎖および可変δ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても知られる）を含む分子であって、ＭＨＣレセプターに結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子のことを指す。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、αβ型である。
通常、αβ型およびγδ型として存在するＴＣＲは、一般に構造が似ているが、それらを発現しているＴ細胞は、解剖学的位置または機能が異なり得る。ＴＣＲは、細胞表面上にまたは可溶型として見られ得る。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見られ、通常、その表面上で、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または短い細胞質テイルも含み得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ，１９９７を参照のこと）。例えば、いくつかの態様において、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質テイルを有し得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関わるＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合される。別段述べられない限り、用語「ＴＣＲ」は、その機能的ＴＣＲフラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語は、αβ型またはγδ型のＴＣＲをはじめとしたインタクトなまたは完全長のＴＣＲも包含する。
したがって、本明細書中の目的では、ＴＣＲへの言及には、任意のＴＣＲまたは機能的フラグメント（例えば、ＭＨＣ分子において結合した特異的な抗原ペプチド、すなわち、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分）が含まれる。交換可能に使用され得る、ＴＣＲの「抗原結合部分」または抗原結合フラグメントとは、ＴＣＲの構造ドメインの一部しか含まないが、完全なＴＣＲが結合する抗原（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体）に結合する分子のことを指す。いくつかの場合において、抗原結合部分は、特異的なＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン（例えば、ＴＣＲの可変ａ鎖および可変β鎖）を含み、例えば一般に、各鎖が３つの相補性決定領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは、会合してループ、または免疫グロブリンに類似の相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成し、それにより、抗原認識がもたらされ、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性が決定され、ペプチド特異性が決定される。通常、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられる（例えば、Ｊｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１は、抗原ペプチドのＮ末端部と相互作用するとも示されているのに対して、ベータ鎖のＣＤＲ１は、そのペプチドのＣ末端部と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。いくつかの実施形態において、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外の部分（例えば、ａ鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメインである、Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、ＶａまたはＶｐ；通常、ＫａｂａｔナンバリングであるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，５ｔｈ ｅｄ．に基づくアミノ酸１～１１６）、および細胞膜に隣接した１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメインまたはＣａ、通常、Ｋａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２５９、β鎖定常ドメインまたはＣｐ、通常、Ｋａｂａｔに基づくアミノ酸１１７～２９５）を含み得る。例えば、いくつかの場合、それらの２本の鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外の部分は、２つの膜近位定常ドメイン、およびＣＤＲを含む２つの膜遠位可変ドメインを含む。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い接続配列を含み、それにより、それらの２本の鎖の間に連結が形成される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲが、定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含むように、そのＴＣＲは、α鎖およびβ鎖の各々に追加のシステイン残基を有してもよい。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、正に帯電している。いくつかの場合において、ＴＣＲ鎖は、細胞質テイルを含む。いくつかの場合において、その構造のおかげで、ＴＣＲはＣＤ３のような他の分子と会合することができる。例えば、膜貫通領域とともに定常ドメインを含むＴＣＲは、そのタンパク質を細胞膜に固定し得、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合し得る。
一般に、ＣＤ３は、哺乳動物においては３つの異なる鎖（γ、δおよびε）およびζ鎖を有し得る多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物では、この複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、およびホモ二量体のＣＤ３ζ鎖を含み得る。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これは、これらの鎖が、正に帯電したＴ細胞レセプター鎖と会合できるようにする特性である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖およびＣＤ３ε鎖の各細胞内テイルは、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られる保存された単一のモチーフを含むのに対して、各ＣＤ３ζ鎖は、３つ含む。一般に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に関わる。これらのアクセサリー分子は、負に帯電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲから細胞へのシグナルの伝播において役割を果たす。ＣＤ３鎖およびζ鎖は、ＴＣＲと一体となって、Ｔ細胞レセプター複合体として知られる複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、２本の鎖αおよびβ（または必要に応じてγおよびδ）のヘテロ二量体であり得るか、または一本鎖ＴＣＲ構築物であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ジスルフィド結合などによって連結された２本の別個の鎖（α鎖とβ鎖またはγ鎖とδ鎖）を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、標的抗原（例えば、癌抗原）に対するＴＣＲが特定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードする核酸は、公的に入手可能なＴＣＲ ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などによって、種々の起源から得ることができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、生物学的起源、例えば、細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な起源から得られる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、インビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態において、高親和性Ｔ細胞クローンが、患者から単離され得、ＴＣＲが単離され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの実施形態において、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、すなわちＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて産生されたクローンである。例えば、腫瘍抗原（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイを用いて、標的抗原に対するＴＣＲが単離される（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２００８およびＬｉ，２００５を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識によって合成的に作製され得る。
Ｃ．抗原
遺伝子操作された異種抗原受容体によって標的とされる抗原の中には、養子細胞療法を介して標的としようとする疾患、状態又は細胞型に関連して発現されるものがある。疾患及び状態の中には、血液癌、免疫系の癌、例えばリンパ腫、白血病及び／又は骨髄腫、例えばＢ、Ｔ及び骨髄性白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む癌及び腫瘍を含む、増殖性、新生物性及び悪性の疾患及び障害がある。いくつかの実施形態では、抗原は、正常又は非標的細胞若しくは組織と比較した場合、疾患又は状態の細胞、例えば腫瘍又は病原性細胞上で選択的に発現されるか又は過剰発現される。他の実施形態では、抗原は正常細胞上で発現され、及び／又は操作された細胞上で発現される。
本方法では、あらゆる適切な抗原を標的とし得る。抗原は、いくつかの場合、ある特定の癌細胞に関連し得るが、非癌性細胞には関連し得ない。例示的な抗原としては、感染因子由来の抗原性分子、自己抗原／自己の抗原、腫瘍／癌関連抗原及び腫瘍ネオアンチゲンが挙げられるが限定されない（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。特定の態様では、抗原としては、ＮＹ－ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｕｃ－１、Ｈｅｒ ２、ＣＡ－１２５、ＷＴ－１、Ｍａｇｅ－Ａ３、Ｍａｇｅ－Ａ４、Ｍａｇｅ－Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４及びＣＥＡが挙げられる。特定の態様では、２つ以上の抗原受容体に対する抗原としては、ＣＤ１９、ＥＢＮＡ、ＷＴ１、ＣＤ１２３、ＮＹ－ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＣＡ－１２５、ＷＴ１、Ｍａｇｅ－Ａ３、Ｍａｇｅ－Ａ４、Ｍａｇｅ－Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４及び／又はＣＥＡが挙げられるが限定されない。これらの抗原の配列は、当技術分野で公知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース：ＣＤ１９（受託番号ＮＧ＿００７２７５．１）、ＥＢＮＡ（受託番号ＮＧ＿００２３９２．２）、ＷＴ１（受託番号ＮＧ＿００９２７２．１）、ＣＤ１２３（受託番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＮＹ－ＥＳＯ（受託番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（受託番号ＮＧ＿００７７２６．３）、ＭＵＣ１（受託番号ＮＧ＿０２９３８３．１）、ＨＥＲ２（受託番号ＮＧ＿００７５０３．１）、ＣＡ－１２５（受託番号ＮＧ＿０５５２５７．１）、ＷＴ１（受託番号ＮＧ＿００９２７２．１）、Ｍａｇｅ－Ａ３（受託番号ＮＧ＿０１３２４４．１）、Ｍａｇｅ－Ａ４（受託番号ＮＧ＿０１３２４５．１）、Ｍａｇｅ－Ａ１０（受託番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４（受託番号ＮＣ＿０００００３．１２）及び／又はＣＥＡ（受託番号ＮＣ＿００００１９．１０）である。
腫瘍関連抗原は、例として、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、中皮腫、卵巣癌、肝臓癌、脳癌、骨癌、胃癌、脾臓癌、精巣癌、子宮頸癌、肛門癌、胆嚢癌、甲状腺癌又はメラノーマに由来し得る。例示的な腫瘍関連抗原又は腫瘍細胞由来抗原としては、ＭＡＧＥ １、３及びＭＡＧＥ ４（又は国際公開第９９／４０１８８号に開示されているものなどの他のＭＡＧＥ抗原）；ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ ＥＳＯ１としても知られている）；ＳＡＧＥ；及びＨＡＧＥ又はＧＡＧＥが挙げられる。腫瘍抗原のこれらの非限定的な例は、メラノーマ、肺癌腫、肉腫及び膀胱癌などの広範囲の腫瘍型で発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号明細書を参照されたい。前立腺癌腫瘍関連抗原としては、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファート、ＮＫＸ３．１及び前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）が挙げられる。
他の腫瘍関連抗原としては、Ｐｌｕ－１、ＨＡＳＨ－１、ＨａｓＨ－２、Ｃｒｉｐｔｏ及びＣｒｉｐｔｉｎが挙げられる。さらに、腫瘍抗原は、自己ペプチドホルモン、例えば、多くの癌の治療に有用な短い１０アミノ酸長のペプチドである全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）であり得る。
腫瘍抗原としては、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ発現などの腫瘍関連抗原発現を特徴とする癌に由来する腫瘍抗原が挙げられる。関心のある腫瘍関連抗原としては、系統特異的腫瘍抗原、例えば、メラノサイト－メラノーマ系統抗原ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ－７、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質が挙げられる。
例示的な腫瘍関連抗原としては、ＣＤ１９、ＥＢＮＡ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＡ－１２５、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、ＣＤ２０、ＣＤ７０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＤ５６、ＡＫＴ、Ｈｅｒ３、上皮性腫瘍抗原、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＲＯＲ１、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＣＤ５、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＬＬ－１、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＤ９９、ｐ５３、変異型ｐ５３、Ｒａｓ、変異型ｒａｓ、ｃ－Ｍｙｃ、細胞質セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、Ａ－Ｒａｆ、Ｂ－Ｒａｆ及びＣ－Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＲＴ－１、メラノーマ関連抗原、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ－６、－１０、ＧＡＧＥ－１、－２、－８、ＧＡＧＥ－３、－４、－５、－６、－７Ｂ、ＮＡ８８－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ｍｄａ－７、ｇｐ７５、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＡＲＴ－４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ－Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、－カテニン／ｍ、カスパーゼ－８／ｍ、ＣＤＫ－４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇ２５０、ＨＡＧＥ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、７０７－ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ－ａｂｌ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（特にＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、ＶＥＧＦＲ２、細胞質チロシンキナーゼ（例えばｓｒｃファミリー、ｓｙｋ－ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、転写のシグナル伝達因子及び活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳ及びＳＴＡＴＥ、低酸素誘導性因子（例えばＨＩＦ－１及びＨＩＦ－２）、核因子－カッパＢ（ＮＦ－Ｂ）、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えばＮｏｔｃｈ１～４）、ＮＹ ＥＳＯ１、ｃ－Ｍｅｔ、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナルに調節されるキナーゼ（ＥＲＫ）及びそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ－３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞癌腫－５Ｔ４、ＳＭ２２－アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）及びＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧｓＳ、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１及びＬＲＲＮ１が挙げられる。
抗原には、腫瘍細胞において変異した遺伝子由来の、または正常細胞と比べて腫瘍細胞において異なるレベルで転写される遺伝子由来の、エピトープ領域またはエピトープペプチド（例えば、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再配列、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型または野生型ｐ５３、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１、およびＮ－アセチルグルコサミン転移酵素－Ｖなどの異常に発現されるイントロン配列）；ミエローマおよびＢ細胞リンパ腫においてユニークなイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性再配列；オンコウイルスのプロセスに由来するエピトープ領域またはエピトープペプチドを含む腫瘍抗原（例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７）；エプスタイン・バーウイルスタンパク質ＬＭＰ２；腫瘍選択的に発現する変異していない腫瘍胎児性タンパク質（例えば、癌胎児抗原およびアルファ－フェトプロテイン）が含まれ得る。
他の実施形態において、抗原は、癌抗原（腫瘍抗原）ではなく、病原性微生物または日和見病原性微生物（本明細書中で感染症微生物とも呼ばれる）（例えば、ウイルス、真菌、寄生生物および細菌）から得られるかまたはそれらに由来する。ある特定の実施形態において、そのような微生物に由来する抗原には、完全長タンパク質が含まれる。
本明細書中に記載される方法において使用が企図される抗原を有する例証的な病原性生物としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルスおよびＪＣウイルス）、アデノウイルス、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属の種、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む連鎖球菌属の種が挙げられる。当業者が理解するように、本明細書中に記載されるような抗原として使用するためのこれらおよび他の病原性微生物に由来するタンパク質、ならびにそれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、刊行物ならびにＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの公的データベースにおいて特定され得る。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原には、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、またはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のうちのいずれかが含まれる。
単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）に由来する抗原としては、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。後期群の遺伝子は、ビリオン粒子を形成するタンパク質を主にコードする。そのようなタンパク質としては、ウイルスカプシドを形成する（ＵＬ）の５つのタンパク質：ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８ならびに主要カプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５およびＵＬ２７が挙げられ、これらの各々が、本明細書中に記載されるような抗原として使用され得る。本明細書中で抗原としての使用が企図される他の例証的なＨＳＶタンパク質としては、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タンパク質が挙げられる。ＨＳＶゲノムは、少なくとも７４個の遺伝子を含み、その各々が、抗原として使用され得る可能性があるタンパク質をコードする。
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原としては、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の前初期および初期に発現されるウイルス抗原、糖タンパク質ＩおよびＩＩＩ、カプシドタンパク質、コートタンパク質、低分子マトリックスタンパク質（ｌｏｗｅｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１および１Ｅ２（ＵＬ１２３およびＵＬ１２２）、ＵＬ１２８～ＵＬ１５０の遺伝子クラスターのタンパク質産物（Ｒｙｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００６）、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ、ならびにｐｐ１５０が挙げられる。当業者が理解するように、本明細書中に記載される抗原として使用するためのＣＭＶタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの公的データベースにおいて特定され得る（例えば、Ｂｅｎｎｅｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｏｅｗｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍａｒｓｃｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照のこと）。
ある特定の実施形態において使用が企図されるエプスタイン・バンウイルス（ＥＢＶ）に由来する抗原としては、ＥＢＶ溶解性タンパク質ｇｐ３５０およびｇｐ１１０、エプスタイン・バン核抗原（ＥＢＮＡ）－１、ＥＢＮＡ－２、ＥＢＮＡ－３Ａ、ＥＢＮＡ－３Ｂ、ＥＢＮＡ－３Ｃ、ＥＢＮＡ－リーダータンパク質（ＥＢＮＡ－ＬＰ）、ならびに潜伏感染膜タンパク質（ＬＭＰ）－１、ＬＭＰ－２ＡおよびＬＭＰ－２Ｂを含む、潜伏感染サイクル中に生成されるＥＢＶタンパク質が挙げられる（例えば、Ｌｏｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照のこと）。
本明細書中で使用が企図される呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する抗原には、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１個のタンパク質またはそれらの抗原性フラグメント：ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）ＳＨ、ＧおよびＦ（ウイルスコートタンパク質）、Ｍ２（第２のマトリックスタンパク質）、Ｍ２－１（伸長因子）、Ｍ２－２（転写制御）、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにリンタンパク質Ｐのうちのいずれかが含まれる。
使用が企図される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する抗原には、ＶＳＶゲノムによってコードされる主要な５つのタンパク質およびそれらの抗原性フラグメント：巨大タンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）およびマトリックスタンパク質（Ｍ）のうちのいずれか１つが含まれる（例えば、Ｒｉｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照のこと）。
ある特定の実施形態において使用が企図されるインフルエンザウイルスに由来する抗原としては、赤血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質Ｍ１およびＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１－Ｆ２、ならびにＰＢ２が挙げられる。
例示的なウイルス抗原としては、アデノウイルスのポリペプチド、アルファウイルスのポリペプチド、カリシウイルスのポリペプチド（例えば、カリシウイルスのカプシド抗原）、コロナウイルスのポリペプチド、ジステンパーウイルスのポリペプチド、エボラウイルスのポリペプチド、エンテロウイルスのポリペプチド、フラビウイルスのポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）のポリペプチド（Ｂ型肝炎のコアまたは表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１もしくはＥ２糖タンパク質、コアまたは非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスのポリペプチド（単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスのポリペプチド、白血病ウイルスのポリペプチド、マールブルグウイルスのポリペプチド、オルトミクソウイルスのポリペプチド、パピローマウイルスのポリペプチド、パラインフルエンザウイルスのポリペプチド（例えば、赤血球凝集素ポリペプチドおよびノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスのポリペプチド、パルボウイルスのポリペプチド、ペスチウイルスのポリペプチド、ピコルナウイルスのポリペプチド（例えば、ポリオウイルスのカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスのポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスのポリペプチド）、狂犬病ウイルスのポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルスの糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスのポリペプチド、レトロウイルスのポリペプチド、およびロタウイルスのポリペプチドも挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、抗原は、細菌抗原であり得る。ある特定の実施形態において、目的の細菌抗原は、分泌型ポリペプチドであり得る。他のある特定の実施形態において、細菌抗原には、細菌の細胞外面上に露出したポリペプチドの一部を有する抗原が含まれる。
使用が企図される、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌属の種に由来する抗原としては、ビルレンス制御因子、例えば、Ａｇｒシステム、ＳａｒおよびＳａｅ、Ａｒｌシステム、Ｓａｒホモログ（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺおよびＴｃａＲ）、ＳｒｒシステムならびにＴＲＡＰが挙げられる。抗原として役立ち得る他のブドウ球菌属のタンパク質としては、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡおよびＣｆｖＢが挙げられる（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８ Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄ．Ｊｏｄｉ Ｌｉｎｄｓａｙを参照のこと）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの２種（Ｎ３１５およびＭｕ５０）のゲノムが、配列決定済みであり、例えば、ＰＡＴＲＩＣ（ＰＡＴＲＩＣ：Ｔｈｅ ＶＢＩ ＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）において公的に入手可能である。当業者が理解するように、抗原として使用するためのブドウ球菌属のタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（登録商標）およびＴｒＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公的データベースにおいても特定され得る。
本明細書中に記載されるある特定の実施形態において使用が企図されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原としては、ニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔおよびピリンタンパク質（ＲｒｇＡ；ＲｒｇＢ；ＲｒｇＣ）が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原性タンパク質も、当該分野で公知であり、いくつかの実施形態において抗原として使用され得る（例えば、Ｚｙｓｋ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照のこと）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの毒性株の全ゲノム配列は、配列決定済みであり、当業者が理解するように、本明細書中で使用するためのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）などの他の公的データベースにおいても特定され得る。本開示に係る抗原として特に興味深いタンパク質としては、肺炎球菌の表面に露出すると予測される病原性因子およびタンパク質が挙げられる（例えば、Ｆｒｏｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０を参照のこと）。
抗原として使用され得る細菌抗原の例としては、アクチノマイセス属のポリペプチド、バチルス属のポリペプチド、バクテロイデス属のポリペプチド、ボルデテラ属のポリペプチド、バルトネラ属のポリペプチド、ボレリア属のポリペプチド（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＯｓｐＡ）、ブルセラ属のポリペプチド、カンピロバクター属のポリペプチド、キャプノサイトファーガ属のポリペプチド、クラミジア属のポリペプチド、コリネバクテリウム属のポリペプチド、コクシエラ属のポリペプチド、デルマトフィルス属のポリペプチド、エンテロコッカス属のポリペプチド、エーリキア属のポリペプチド、エシェリキア属のポリペプチド、フランシセラ属のポリペプチド、フソバクテリウム属のポリペプチド、ヘモバルトネラ属のポリペプチド、ヘモフィルス属のポリペプチド（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型外膜タンパク質）、ヘリコバクター属のポリペプチド、クレブシエラ属のポリペプチド、Ｌ型細菌のポリペプチド、レプトスピラ属のポリペプチド、リステリア属のポリペプチド、マイコバクテリウム属のポリペプチド、マイコプラズマ属のポリペプチド、ナイセリア属のポリペプチド、ネオリケッチア属のポリペプチド、ノカルジア属のポリペプチド、パスツレラ属のポリペプチド、ペプトコッカス属のポリペプチド、ペプトストレプトコッカス属のポリペプチド、肺炎球菌のポリペプチド（すなわち、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのポリペプチド）、プロテウス属のポリペプチド、シュードモナス属のポリペプチド、リケッチア属のポリペプチド、ロシャリメア属のポリペプチド、サルモネラ属のポリペプチド、シゲラ属のポリペプチド、ブドウ球菌属のポリペプチド、Ａ群連鎖球菌のポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＭタンパク質）、Ｂ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のポリペプチド、トレポネーマ属のポリペプチド、およびエルシニア属のポリペプチド（例えば、Ｙ ｐｅｓｔｉｓのＦ１およびＶ抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。
真菌抗原の例としては、アブシディア属のポリペプチド、アクレモニウム属のポリペプチド、アルテルナリア属のポリペプチド、アスペルギルス属のポリペプチド、バシジオボラス属のポリペプチド、ビポラーリス属のポリペプチド、ブラストミセス属のポリペプチド、カンジダ属のポリペプチド、コクシジオイデス属のポリペプチド、コニディオボラス属のポリペプチド、クリプトコッカス属のポリペプチド、カーバラリア属のポリペプチド、エピデルモフィトン属のポリペプチド、エクソフィアラ属のポリペプチド、ゲオトリクム属のポリペプチド、ヒストプラズマ属のポリペプチド、マヅレラ属のポリペプチド、マラセチア属のポリペプチド、ミクロスポルム属のポリペプチド、モニリエラ属のポリペプチド、モルチエレラ属のポリペプチド、ケカビ属のポリペプチド、ペシロマイセス属のポリペプチド、ペニシリウム属のポリペプチド、フィアレモニウム属（Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍ）のポリペプチド、フィアロフォラ属のポリペプチド、プロトテカ属のポリペプチド、シュードアレシェリア属のポリペプチド、シュードミクロドキウム属（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）のポリペプチド、フィチウム属のポリペプチド、リノスポリジウム属のポリペプチド、クモノスカビ属のポリペプチド、スコレコバシジウム属（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）のポリペプチド、スポロトリクス属のポリペプチド、ステンフィリウム属（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）のポリペプチド、白癬菌属のポリペプチド、トリコスポロン属のポリペプチドおよびキシロヒファ属（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
原生動物の寄生生物抗原の例としては、バベシア属のポリペプチド、バランチジウム属のポリペプチド、ベスノイチア属（Ｂｅｓｎｏｉｔｉａ）のポリペプチド、クリプトスポリジウム属のポリペプチド、エイメリア属のポリペプチド、エンセファリトゾーン属のポリペプチド、エントアメーバ属のポリペプチド、ジアルジア属のポリペプチド、ハモンディア属（Ｈａｍｍｏｎｄｉａ）のポリペプチド、ヘパトゾーン属のポリペプチド、イソスポラ属のポリペプチド、リーシュマニア属のポリペプチド、微胞子虫門のポリペプチド、ネオスポラ属のポリペプチド、ノゼマ属のポリペプチド、ペンタトリコモナス属のポリペプチド、プラスモディウム属のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。蠕虫寄生生物抗原の例としては、アカントケイロネマ属のポリペプチド、アエルロストロンギルウス属（Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）のポリペプチド、鉤虫属のポリペプチド、住血線虫属のポリペプチド、回虫属のポリペプチド、ブルギア属のポリペプチド、ブノストムム属のポリペプチド、キャピラリア属のポリペプチド、カベルチア属（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）のポリペプチド、クーペリア属のポリペプチド、クレノソマ属（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ）のポリペプチド、ディクチオカウルス属のポリペプチド、ジオクトフィーメ属のポリペプチド、ディペタロネマ属のポリペプチド、裂頭条虫属のポリペプチド、ジプリジウム属のポリペプチド、イヌ糸状虫属のポリペプチド、ドラクンクルス属のポリペプチド、エンテロビウス属のポリペプチド、フィラロイデス属（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ）のポリペプチド、ヘモンクス属のポリペプチド、ラゴキラスカリス属（Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓ）のポリペプチド、ロア糸状虫属（Ｌｏａ）のポリペプチド、マンソネラ属のポリペプチド、ムエレリウス属（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ）のポリペプチド、ナノフィエツス属（Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ）のポリペプチド、アメリカ鉤虫属のポリペプチド、ネマトジルス属のポリペプチド、腸結節虫属のポリペプチド、オンコセルカ属のポリペプチド、オピストルキス属のポリペプチド、オステルタギア属のポリペプチド、パラフィラリア属（Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ）のポリペプチド、肺吸虫属のポリペプチド、パラスカリス属（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）のポリペプチド、フィサロプテラ属のポリペプチド、プロトストロンギルス属（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）のポリペプチド、セタリア属のポリペプチド、スピロセルカ属（Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａ）のポリペプチド スピロメトラ属のポリペプチド、ステファノフィラリア属のポリペプチド、ストロンギロイデス属のポリペプチド、ストロンギルス属のポリペプチド、テラジア属のポリペプチド、トキサスカリス属のポリペプチド、トキソカラ属のポリペプチド、旋毛虫属のポリペプチド、毛様線虫属のポリペプチド、鞭虫属のポリペプチド、ウンシナリア属のポリペプチドおよびウケレリア属のポリペプチド（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲ポリペプチド（ＰｆＣＳＰ））、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原（ｌｉｖｅｒ ｓｔａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ ｃ末端）、ならびに搬出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ－１）、ニューモシスチス属のポリペプチド、サルコシスティス属のポリペプチド、住血吸虫属のポリペプチド、タイレリア属のポリペプチド、トキソプラズマ属のポリペプチド、ならびにトリパノソーマ属のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
外寄生生物抗原の例としては、ノミ；カタダニおよびヒメダニを含むマダニ；ハエ、例えば、小虫、蚊、スナバエ、ブユ、ウマバエ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ幼虫症の原因となるハエおよび刺して血を吸う小さな羽虫（ｂｉｔｉｎｇ ｇｎａｔｓ）；アリ；クモ、シラミ；ダニ；ならびに半翅類の昆虫、例えば、トコジラミおよびサシガメのポリペプチド（抗原ならびにアレルゲンを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｄ．自殺遺伝子
いくつかの場合において、本開示の任意の細胞が、異種サイトカイン、操作されたレセプターなど以外の１つ以上の作用物質を産生するように改変される。具体的な実施形態において、ＭＳＣ細胞などの細胞は、１つ以上の自殺遺伝子を有するように操作され、本明細書中で使用される用語「自殺遺伝子」は、プロドラッグが投与された際に、遺伝子産物が、宿主細胞を殺滅する化合物に変化する遺伝子と定義される。いくつかの場合において、ＭＳＣ細胞療法は、ＭＳＣ細胞療法を受けている個体および／またはＭＳＣ細胞療法を受けた個体が、１つ以上の有害事象の１つ以上の症状（例えば、サイトカイン放出症候群、神経毒性、アナフィラキシー／アレルギーおよび／またはオンターゲット／オフ腫瘍毒性（例として））を示したとき、または１つ以上の症状を有するリスクがあると考えられるとき（切迫した場合を含む）、任意の種類の１つ以上の自殺遺伝子の利用の対象となり得る。自殺遺伝子の使用は、治療のために計画されたプロトコルの一部であり得るか、またはそれを使用する必要性が認められたときにだけ使用され得る。いくつかの場合において、細胞療法は、もはや必要なくなったという理由で、自殺遺伝子またはその遺伝子産物を標的化する作用物質を使用することによって終結される。
自殺遺伝子の例としては、操作された非分泌性（膜結合型を含む）の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ変異ポリペプチド（その全体が参照により本明細書中に援用されるＰＣＴ／ＵＳ１９／６２００９を参照のこと）が挙げられ、それらのポリペプチドは、ＴＮＦ－アルファ変異体に結合する抗体の送達によって標的化され得る。使用され得る自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、単純ヘルペスウイルス－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）と、ガンシクロビル、アシクロビルまたはＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼとシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼと５－フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジル酸キナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）とＡＺＴ；およびデオキシシチジンキナーゼとシトシンアラビノシドである。プロドラッグである６－メチルプリンデオキシリボシドを毒性のプリンである６－メチルプリンに変換するいわゆる自殺遺伝子であるＥ．ｃｏｌｉのプリンヌクレオシドホスホリラーゼが使用され得る。他の自殺遺伝子としては、ＣＤ２０、ＣＤ５２、誘導性カスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロ還元酵素（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン－α，γ－リアーゼ（ＭＥＴ）およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が例として挙げられる。
Ｅ．送達方法
いくつかの実施形態では、抗原受容体及び／又はサイトカインを含む1つ又は複数の組成物が、核酸又はタンパク質などとしてＭＳＣに送達される。当業者であれば、本開示の抗原レセプターを発現させるために標準的な組換え手法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６（両方が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）によってベクターを構築する能力を充分に備えているだろう。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来するもの）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来するもの）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（その複製可能型、複製欠損型およびガットレス型（ｇｕｔｌｅｓｓ ｆｏｒｍｓ）を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、マラバウイルス（ｍａｒａｂａ ｖｉｒｕｓ）ベクターおよびＢ群アデノウイルスｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
具体的な実施形態において、ベクターは、ＰＣＴ／ＵＳ１９／６２０１４（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されているようなマルチシストロニックベクターである。そのような場合、単一のベクターが、ＣＡＲまたはＴＣＲ（その発現構築物は、ＣＡＲまたはＴＣＲの部分の相互交換を可能にするためにモジュール形式で構成され得る）、自殺遺伝子および１つ以上のサイトカインをコードし得る。
１．ウイルスベクター
抗原レセプターをコードするウイルスベクターが、本開示のある特定の態様において提供され得る。組換えウイルスベクターを作製する際、必須ではない遺伝子は、通常、異種（または非天然）タンパク質の遺伝子またはコード配列で置き換えられる。ウイルスベクターは、ウイルス配列を利用して、核酸および場合によってはタンパク質を細胞に導入する一種の発現構築物である。ある特定のウイルスが細胞に感染する能力またはレセプター媒介性のエンドサイトーシスを介して細胞に侵入する能力、および宿主細胞のゲノムにインテグレートし、ウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力によって、それらのウイルスが、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移行させるための魅力的な候補になった。本発明のある特定の態様の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を下記に記載する。
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を有する他の遺伝子も含む。レンチウイルスベクターは、当該分野で周知である（例えば、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照のこと）。
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボとエキソビボの両方において遺伝子導入および核酸配列発現のために使用され得る。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルス（ここで、好適な宿主細胞が、パッケージング機能を有する２つ以上のベクター、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔでトランスフェクトされる）は、参照により本明細書中に援用される米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。
ａ．調節エレメント
本開示において有用なベクターに含められる発現カセットは、特に、タンパク質コード配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、および転写終結／ポリアデニル化配列を（５’から３’の方向で）含む。タンパク質をコードする遺伝子の転写を真核細胞において制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝的エレメントから構成される。細胞機構は、各エレメントによって運ばれる調節情報を集め、統合することができ、それにより、異なる遺伝子が、多くの場合は複雑なパターンである異なるパターンの転写制御を展開することが可能になる。本開示の状況において使用されるプロモーターとしては、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび組織特異的プロモーターが挙げられる。
ｂ．プロモーター／エンハンサー
本明細書中に提供される発現構築物は、抗原レセプターの発現を駆動するプロモーターを含む。プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成のための開始部位の位置を特定するように機能する配列を含む。これの最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなど、一部のプロモーターでは、ＴＡＴＡボックスを欠き、開始部位自体と重なっている不連続なエレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。さらなるプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を制御する。通常、これらは、開始部位の３０１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むと示されている。コード配列をプロモーター「の支配下に」するためには、転写読み枠の転写開始部位の５’末端を、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’）に置く。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされるＲＮＡの発現を促進する。
プロモーターエレメント間の間隔は、変更がきくことが多く、エレメントが、反転されるかまたは互いに対して移動された場合でも、プロモーターの機能は保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が低下し始めるまで最大５０ｂｐ広げられ得る。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協同的にまたは独自に機能して転写を活性化し得るとみられる。プロモーターは、核酸配列の転写性の活性化に関わるシス作用性制御配列のことを指す「エンハンサー」と併せて使用されてもよいし、使用されなくてもよい。
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られることがあるような、ある核酸配列と天然に会合したプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、「内在性」プロモーターと呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、ある核酸配列の下流または上流に位置する、その配列と天然に会合したエンハンサーであり得る。あるいは、ある核酸配列とその天然の環境では天然には会合していないプロモーターのことを指す、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの支配下にコード核酸セグメントを置くことによって、一定の利点が得られる。また、組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーは、その天然の環境では核酸配列と天然には会合していないエンハンサーのことを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに他の任意のウイルスまたは原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在」しない、すなわち、種々の転写制御領域の種々のエレメントおよび／または発現を変化させる変異を含む、プロモーターまたはエンハンサーが含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡの構築において最もよく使用されるプロモーターとしては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ－）プロモーターシステムが挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、組換えクローニング、および／またはＰＣＲＴＭをはじめとした核酸増幅技術を用いて、ある配列が、本明細書中に開示される組成物に関連して作製され得る。さらに、核以外のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）内での配列の転写および／または発現を指示する調節配列も同様に使用できることが企図される。
当然、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要になる。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のために、プロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせを使用することを承知している（例えば、参照により本明細書中に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および／または導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示する、適切な条件下において有用なプロモーター（例えば、組換えタンパク質および／または組換えペプチドの大規模生成において有益なプロモーター）であり得る。そのプロモーターは、異種であっても、内在性であってもよい。
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／のワールドワイドウェブを介したＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ ＥＰＤＢに従って）も、発現を駆動するために使用され得る。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用が、別の実行可能な実施形態である。適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部としてまたはさらなる遺伝的発現構築物として提供される場合、真核細胞は、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質での転写を支持し得る。
プロモーターの非限定的な例としては、初期ウイルスプロモーターまたは後期ウイルスプロモーター（例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター）；真核細胞プロモーター（例えば、ベータアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；および連鎖状応答エレメントプロモーター（例えば、サイクリックＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）およびミニマルＴＡＴＡボックス近傍の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ））が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに記載されているヒト成長ホルモンミニマルプロモーター、アクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３～３４１）またはマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ４５００７）を使用することも可能である。ある特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ、デクチン－１、デクチン－２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ ＭＬＰ、ベータ－アクチン、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩプロモーターであるが、しかしながら、治療用の遺伝子の発現を駆動するために有用な他の任意のプロモーターも本開示の実施に適用できる。
ある特定の態様において、本開示の方法は、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増加させる核酸配列であって、シスで、かつその向きを問わず、比較的長い距離（標的プロモーターから最大数キロベース離れた距離）にわたって作用する能力を有する核酸配列にも関する。しかしながら、エンハンサーは、所与のプロモーターに対して近位でも機能し得るので、エンハンサーの機能は必ずしもそのような長い距離に限定されない。
ｃ．開始シグナルおよび連結発現
コード配列の効率的な翻訳のために、本開示に提供される発現構築物において、特異的な開始シグナルも使用され得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。外来性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）が提供される必要がある場合がある。当業者であれば、これを判断することおよび必要なシグナルを提供することが容易にできるだろう。インサート全体の翻訳を確保するためには、開始コドンが、所望のコード配列の読み枠と「インフレーム」でなければならないことは周知である。その外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のものまたは合成のものであり得る。適切な転写エンハンサーエレメントを含めることによって、発現効率が高められ得る。
ある特定の実施形態において、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子のメッセージ、すなわちポリシストロニックなメッセージを生成するために使用される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部の部位において翻訳を開始することができる。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント、ならびに哺乳動物のメッセージ由来のＩＲＥＳが、報告されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結できる。各々がＩＲＥＳによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができ、ポリシストロニックなメッセージを生成できる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームが、効率的な翻訳のためにリボソームに接近できるようになる。単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率的に発現して、単一のメッセージを転写することもできる。
さらに、本開示に提供される構築物内の遺伝子の連結発現または同時発現をもたらすために、ある特定の２Ａ配列エレメントが使用され得る。例えば、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを形成することによって遺伝子を同時発現するために、切断配列が使用され得る。例示的な切断配列は、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）または「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）である。
ｄ．複製開始点
宿主細胞においてベクターを増殖させるために、そのベクターは、１つ以上の複製開始部位（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）、例えば、複製が開始される特異的な核酸配列である、上に記載されたようなＥＢＶのｏｒｉＰまたはプログラミングにおける機能が似ているかもしくは高められた遺伝的に操作されたｏｒｉＰに対応する核酸配列を含み得る。あるいは、上に記載されたような染色体外で複製する他のウイルスの複製起点、または自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
ｅ．選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカー
いくつかの実施形態において、本開示の構築物を含む細胞は、マーカーを発現ベクターに含めることによって、インビトロまたはインビボにおいて特定され得る。そのようなマーカーは、発現ベクターを含む細胞を容易に特定できるようにする特定可能な変化を細胞にもたらす。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。ポジティブ選択マーカーは、そのマーカーが存在することによってその選択が可能になるマーカーであり、ネガティブ選択マーカーは、その存在が選択を妨げるマーカーである。ポジティブ選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーを含めることにより、形質転換体のクローニングおよび特定が助けられ、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対して耐性にする遺伝子が、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づいて形質転換体の判別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色解析を基礎とする、ＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーをはじめとした他のタイプのマーカーも企図される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの、ネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素が利用され得る。当業者であれば、免疫学的マーカーをおそらくはＦＡＣＳ解析と併せて使用する方法も承知しているだろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることが可能である限り、重要ではないと考えられている。選択マーカーおよびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
２．他の核酸送達方法
抗原レセプターをコードする核酸のウイルス送達に加えて、以下の方法が、所与の宿主細胞への組換え遺伝子送達のさらなる方法であるので、本開示において考慮される。
本開示の免疫細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の導入は、本明細書中に記載されるようにまたは当業者に公知であるように、細胞を形質転換するための核酸送達に適した任意の方法を使用し得る。そのような方法としては、ＤＮＡの直接送達（例えば、エキソビボトランスフェクション、注射（マイクロインジェクションを含む））；エレクトロポレーション；リン酸カルシウム沈殿；ＤＥＡＥ－デキストランに続くポリエチレングリコールの使用；直接的な音波負荷；リポソーム媒介性のトランスフェクションおよびレセプター媒介性のトランスフェクション；微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；炭化ケイ素繊維を伴った撹拌；アグロバクテリウム媒介性の形質転換；乾燥／阻害媒介性のＤＮＡ取り込み、およびそのような方法の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの手法などの手法の適用により、オルガネラ、細胞、組織または生物が安定にまたは一過性に形質転換され得る。
Ｖ．遺伝子編集およびＣＲＩＳＰＲ
本開示のＭＳＣ細胞作製プロセスは、ＭＳＣ細胞における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の内在性遺伝子を除去するＭＳＣ細胞の遺伝子編集を含み得る。いくつかの場合において、その遺伝子編集は、１つ以上の異種抗原レセプターを発現しているＭＳＣ細胞において行われるのに対して、他の場合において、その遺伝子編集は、異種抗原レセプターを発現していないが、少なくともいくつかの場合において最終的に１つ以上の異種抗原レセプターを発現する、ＭＳＣ細胞において行われる。特定の実施形態において、遺伝子編集されたＭＳＣ細胞は、拡大されたＭＳＣ細胞である。
特定の場合において、上記ＭＳＣ細胞の１つ以上の内在性遺伝子は、発現が破壊されるなど、改変され、ここで、その発現は、部分的または完全に低下される。具体的な場合において、１つ以上の遺伝子が、本開示のプロセスを用いてノックダウンまたはノックアウトされる。具体的な場合において、複数の遺伝子が、本開示のプロセスと同じ工程においてノックダウンまたはノックアウトされる。ＭＳＣ細胞において編集される遺伝子は、任意の種類であってよいが、具体的な実施形態において、それらの遺伝子は、その遺伝子産物がＭＳＣ細胞の活性および／または増殖を阻害する遺伝子である。具体的な場合において、ＭＳＣ細胞において編集される遺伝子は、そのＭＳＣ細胞が腫瘍微小環境においてより効果的に働くのを可能にする。具体的な場合において、それらの遺伝子は、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＴＤＡＧ８、ＣＤ５、ＣＤ７、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＬＡＧ３、ＴＣＲ、ベータ２－ミクログロブリン、ＨＬＡ、ＣＤ７３およびＣＤ３９のうちの１つ以上である。具体的な実施形態では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子が、ＭＳＣ細胞においてノックアウトまたはノックダウンされる。
いくつかの実施形態において、遺伝子編集は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した変更など、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて行われる。例えば、その変更は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行われ得る。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子（Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含む）、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「直列反復配列」、およびｔｒａｃｒＲＮＡによってプロセシングされた部分的な直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも称される）、ならびに／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物の発現に関与するかまたはその活性を指示する転写物および他のエレメントのことを総称する。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡ、およびヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントが、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来し得、例えば、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来し得る。
いくつかの態様において、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと既定のｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物を含む）が、細胞に導入される。一般に、ｇＲＮＡの５’末端における標的部位が、相補的な塩基対形成によって、Ｃａｓヌクレアーゼをその標的部位、例えば、遺伝子に標的化する。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例えば、通常、ＮＧＧまたはＮＡＧ）のすぐ５’の位置に基づいて選択され得る。この点において、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列に対応するようにガイドＲＮＡの最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１または１０ヌクレオチドを改変することによって、所望の配列に標的化される。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。通常、「標的配列」とは、一般に、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされる配列のことを指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ない。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）に続いて、本明細書中で論じられるような破壊または変更を誘導し得る。他の実施形態では、「ニッカーゼ」とみなされるＣａｓ９バリアントが、標的部位において一本鎖にニックを入れるために使用される。例えば特異性を改善するために、対のニッカーゼを使用することができ、そのニッカーゼの各々は、配列を標的化する異なるｇＲＮＡの対によって導かれ、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入される。他の実施形態では、遺伝子発現に影響するように、触媒的に不活性なＣａｓ９が、転写抑制因子または転写活性化因子などの異種エフェクタードメインに融合される。
標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含み得る。標的配列は、細胞のオルガネラ内など、細胞の核または細胞質に位置し得る。一般に、標的配列を含む標的化される遺伝子座への組換えのために使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。いくつかの態様では、外来性の鋳型ポリヌクレオチドが、編集鋳型と称されることがある。いくつかの態様において、組換えは、相同組換えである。
通常、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化するガイド配列を含む）の形成によって、標的配列においてまたは標的配列の近くで（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０塩基対以内またはそれ以上以内において）一方または両方の鎖の切断が生じる。野生型ｔｒａｃｒ配列の全部もしくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０ヌクレオチド、約２６ヌクレオチド、約３２ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド、約４８ヌクレオチド、約５４ヌクレオチド、約６３ヌクレオチド、約６７ヌクレオチド、約８５ヌクレオチドもしくはそれ以上または約２０ヌクレオチド超、約２６ヌクレオチド超、約３２ヌクレオチド超、約４５ヌクレオチド超、約４８ヌクレオチド超、約５４ヌクレオチド超、約６３ヌクレオチド超、約６７ヌクレオチド超、約８５ヌクレオチド超もしくはそれ以上）を含み得るかまたはそれらからなり得るｔｒａｃｒ配列も、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列の全部または一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に参加する、ｔｒａｃｒメイト配列に対して十分な相補性（例えば、最適にアラインメントされたとき、ｔｒａｃｒメイト配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性）を有する。
ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントの発現によって、１つ以上の標的部位においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が指示されるように、そのＣＲＩＳＰＲシステムのそれらのエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターが細胞に導入され得る。また、構成要素がタンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達され得る。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列がそれぞれ、別個のベクター上の別個の調節エレメントに作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節エレメントから発現されるエレメントの２つ以上が、単一ベクターにおいて組み合わされ得、１つ以上のさらなるベクターが、第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を提供する。そのベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位（「クローニング部位」とも称される）を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の挿入部位が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流および／または下流に配置される。複数の異なるガイド配列が使用されるとき、細胞内の異なる複数の対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために単一の発現構築物が使用され得る。
ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された調節エレメントを含み得る。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログまたはそれらの改変バージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見られ得る。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のもの）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補鎖内などの標的配列の位置での一方または両方の鎖の切断を指示し得る。ベクターは、対応する野生型酵素と比べて変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし得、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、そのＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的化する２つのガイド配列と組み合わせて使用され得る。この組み合わせは、両方の鎖にニックを入れること、およびＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘導するために使用されることができる。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞における発現に向けてコドンが最適化される。真核細胞は、特定の生物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物）の細胞またはそれらの生物に由来する細胞であり得る。一般に、コドンの最適化とは、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、天然の配列の少なくとも１つのコドンをその宿主細胞の遺伝子においてより高頻度にまたは最も高頻度に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞において発現が高まるように核酸配列を改変するプロセスのことを指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用頻度の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、その翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。選択されるｔＲＮＡが細胞内で優勢であることは、通常、ペプチド合成において最も高頻度に使用されるコドンであることを反映する。したがって、コドン最適化に基づいて、遺伝子を所与の生物における最適な遺伝子発現に適応させることができる。
一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分およびその標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するのに十分な相補性をその標的配列に対して有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％もしくはそれ以上、または約５０％超、約６０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９７％超、約９９％超もしくはそれ以上である。
最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得る。そのアルゴリズムの非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて利用可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて利用可能）が挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および必要に応じて任意の２つのドメインの間にリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するかまたは他の細胞分子（マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン融合物および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含むがこれらに限定されない）に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号に記載されている。
ＶＩ．処置方法
いくつかの実施形態において、本開示の方法によって作製されたＭＳＣ細胞は、それを必要とする個体の処置方法に使用される。本開示の実施形態は、例として、癌、任意の種類の感染症および任意の免疫障害について、個体を処置する方法を含む。その個体は、最初の処置として、または別の処置の後に（および／または別の処置とともに）、本開示の処置方法を使用し得る。癌の実施形態において、免疫療法の方法は、癌のタイプおよび／またはステージに基づいて、癌を有する個体のニーズに合わせることができ、少なくともいくつかの場合では、免疫療法は、処置の期間中にその個体に対して改変され得る。
具体的な場合において、処置方法の例は、以下のとおりである：１）任意のタイプの血液悪性腫瘍を有する癌患者を処置するために、作製されたＭＳＣ細胞（エキソビボで拡大されたもの、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを発現するもの）を用いる養子細胞療法、（２）任意のタイプの固形癌を有する癌患者を処置するために、作製されたＭＳＣ細胞（エキソビボで拡大されたもの、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを発現するもの）を用いる養子細胞療法、（３）感染症および／または免疫障害を有する患者を処置するために、作製されたＭＳＣ細胞（エキソビボで拡大されたもの、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを発現するもの）を用いる養子細胞療法。
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の方法によって作製された有効量のＭＳＣ細胞を投与する工程を含む、免疫療法のための方法を提供する。１つの実施形態において、少なくとも特定の場合において、本明細書中の方法によって作製された、免疫応答を誘発するＭＳＣ細胞集団の１回以上の移入によって、内科疾患または内科障害が処置される。本開示のある特定の実施形態において、本開示の方法によって作製された、免疫応答を誘発する１つ以上のＭＳＣ細胞集団の送達によって、癌または感染症が処置される。個体の癌を処置するためまたは癌の進行を遅延させるための方法が本明細書中に提供され、その方法は、有効量の抗原特異的細胞療法をその個体に投与する工程を含む。本方法は、免疫障害、固形癌、血液癌および／またはウイルス感染症の処置に適用され得る。
本処置方法が有用な腫瘍には、任意の悪性細胞タイプ、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍に見られる細胞タイプが含まれる。例示的な固形腫瘍としては、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺および乳房からなる群より選択される器官の腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、ミエローマなどが挙げられる。本明細書中に提供される方法を用いて処置され得る癌のさらなる例としては、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（消化器癌および消化管間質癌を含む）、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々なタイプの頭頸部癌、および黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
癌は、具体的には以下の組織タイプの癌であり得るが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭状癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌・胆管癌の混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ内腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状・濾胞腺癌；非被包性硬化癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒子黒色腫；末端黒子型黒色腫；結節性黒色腫；巨大色素性母斑内悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；グリオーマ、悪性；上衣腫；アストロサイトーマ；原形質性アストロサイトーマ；細線維性アストロサイトーマ；星芽腫；膠芽腫；乏突起膠腫；希突起芽腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節神経芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小非切れ込み型細胞ＮＨＬ；巨大病変（ｂｕｌｋｙ ｄｉｓｅａｓｅ）ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病。
特定の実施形態は、リンパ腫または白血病などの血液悪性腫瘍の処置方法に関する。白血病は、血液または骨髄の癌であり、血液細胞（通常は白血球細胞（白血球））の異常な増殖（分裂増殖による生成）を特徴とする。白血病は、血液腫瘍と呼ばれる広範な疾患群の一部である。白血病は、多種多様な疾患を網羅する広義語である。白血病は、急性および慢性の形態に臨床的におよび病理学的に分けられる。
本開示のある特定の実施形態において、ＭＳＣ細胞は、それを必要とする個体（例えば、癌または感染症を有する個体）に送達される。次いで、それらの細胞は、その個体の免疫系を増強して、それぞれの癌細胞または病原性細胞を攻撃する。いくつかの場合では、その個体にＭＳＣ細胞が１回以上提供される。個体にＭＳＣ細胞が２回以上提供される場合、投与間の時間は、その個体において伝播するのに十分な時間であるべきであり、具体的な実施形態では、投与間の時間は、ｌ、２、３、４、５、６、７日間もしくはそれ以上である。
本開示のある特定の実施形態は、免疫媒介性障害を処置または予防するための方法を提供する。１つの実施形態において、被験体は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および自己免疫性睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック多発性皮膚炎（ｃｅｌｉａｃ ｓｐａｔｅ－ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症－線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型糖尿病または免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（例えば、微小変化群、巣状糸球体硬化症または膜性腎症）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎または疱疹状皮膚炎脈管炎）、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書中に開示される方法を用いて処置され得る自己免疫疾患のいくつかの例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎または乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。被験体は、喘息などのアレルギー性障害も有し得る。
さらに別の実施形態では、被験体は、移植される器官または幹細胞のレシピエントであり、拒絶反応を予防および／または処置するために免疫細胞が使用される。特定の実施形態において、被験体は、移植片対宿主病を有するか、または移植片対宿主病を発症するリスクがある。ＧＶＨＤは、血縁ドナーまたは非血縁ドナーからの幹細胞を使用するまたは含む任意の移植に関して起こり得る合併症である。ＧＶＨＤには、急性と慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植後の最初の３ヶ月以内に現れる。急性ＧＶＨＤの徴候としては、手および足における赤みがかった発疹が挙げられ、それは、剥皮または皮膚の水疱形成を伴って広がることがあり、より重篤になることがある。急性ＧＶＨＤは、胃および腸にも影響することがあり、その場合、筋痙攣、悪心および下痢が認められる。皮膚および目の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響していることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重症度に基づいて等級付けされる：ステージ／グレード１が軽度であり；ステージ／グレード４が重度である。慢性ＧＶＨＤは、移植の３ヶ月後またはそれ以降に発症する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの症状と似ているが、さらに、慢性ＧＶＨＤは、眼の粘液腺、口の唾液腺ならびに胃壁および腸を滑らかにする腺にも影響し得る。本明細書中に開示される任意の免疫細胞集団を使用することができる。移植される器官の例としては、臓器移植片、例えば、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺および／または心臓、あるいは細胞移植片、例えば、小島、肝細胞、筋芽細胞、骨髄または造血性幹細胞もしくは他の幹細胞が挙げられる。移植片は、複合性の移植片、例えば、顔面の組織であり得る。免疫細胞は、移植の前、移植と同時、または移植の後に、投与され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、移植の前に、例えば、移植の少なくとも１時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも１週間前、少なくとも２週間前、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前または少なくとも１ヶ月前に投与される。１つの非限定的な具体例では、治療有効量の免疫細胞の投与は、移植の３～５日前に行われる。
いくつかの実施形態において、被験体には、免疫細胞療法の前に骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法が施され得る。その骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法は、任意の好適な経路によって投与され得る任意の好適なそのような治療であり得る。その骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法は、特に、癌が転移性であり得る黒色腫である場合、例えば、シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与を含み得る。シクロホスファミドおよびフルダラビンの例示的な投与経路は、静脈内である。同様に、任意の好適な用量のシクロホスファミドおよびフルダラビンが投与され得る。特定の態様では、およそ６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドが２日間投与され、その後、およそ２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが５日間投与される。
ある特定の実施形態では、ＭＳＣ細胞の成長および活性化を促進する１つ以上の成長因子が、ＭＳＣ細胞と同時にまたはＭＳＣ細胞に続いて被験体に投与される。その成長因子は、ＭＳＣ細胞の成長および活性化を促進する任意の好適な成長因子であり得る。好適な免疫細胞成長因子の例としては、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８およびＩＬ－２１が挙げられ、これらは、単独でまたは様々な組み合わせで（例えば、ＩＬ－２とＩＬ－７、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－２とＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－１２とＩＬ－７、ＩＬ－１２とＩＬ－１５またはＩＬ－１２とＩＬ２）使用され得る。
治療有効量の作製されたＭＳＣ細胞が、非経口投与をはじめとしたいくつかの経路、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、腫瘍内、髄腔内、心室内、レザバー、関節内の注射または注入によって投与され得る。
養子細胞療法において使用するための作製されたＭＳＣ細胞の治療有効量は、処置される被験体において所望の効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害するために必要なＭＳＣ細胞の量、または自己免疫疾患もしくは同種免疫疾患を後退させるために必要なＭＳＣ細胞の量、または自己免疫疾患によって引き起こされる症状、例えば、疼痛および炎症を和らげることができる量であり得る。これは、炎症に伴う症状、例えば、疼痛、浮腫および体温上昇を和らげるために必要な量であり得る。これは、移植された器官の拒絶反応を減少させるまたは予防するために必要な量でもあり得る。
作製されたＭＳＣ細胞集団は、疾患状態を回復させるために、上記疾患と一致した処置レジメンで、例えば、１日から数日間にわたって１回または数回で、投与され得るか、または疾患の進行を阻害するためおよび疾患の再発を予防するために、長期間にわたる定期的な投与で投与され得る。製剤において用いられる正確な用量は、投与経路および疾患または障害の重篤度にも依存し、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。ＭＳＣ細胞の治療有効用量は、処置される被験体、苦痛の重症度およびタイプならびに投与様式に依存する。いくつかの実施形態において、ヒト被験体の処置において使用され得る用量は、少なくとも３．８×１０４、少なくとも３．８×１０５、少なくとも３．８×１０６、少なくとも３．８×１０７、少なくとも３．８×１０８、少なくとも３．８×１０９または少なくとも３．８×１０１０ＭＳＣ細胞／ｍ２で変動する。ある特定の実施形態において、ヒト被験体の処置において使用される用量は、約３．８×１０９～約３．８×１０１０ＭＳＣ細胞／ｍ２で変動する。さらなる実施形態において、ＭＳＣ細胞の治療有効量は、約５×１０６細胞／ｋｇ体重～約７．５×１０８細胞／ｋｇ体重、例えば、約２×１０７細胞～約５×１０８細胞／ｋｇ体重または約５×１０７細胞～約２×１０８細胞／ｋｇ体重で変動し得る。ＭＳＣ細胞の正確な量は、被験体の年齢、体重、性別および生理学的状態に基づいて当業者によってすぐに決定される。有効量は、インビトロモデルまたは動物モデルの試験系から導かれた用量反応曲線から外挿され得る。
上記ＭＳＣ細胞は、免疫媒介性障害を処置するための１つ以上の他の治療薬と併用して投与され得る。併用療法としては、１つ以上の抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、免疫枯渇剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシンまたはビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリンまたは糖質コルチコイド、例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、糖質コルチコイド（例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）または非ステロイド性抗炎症剤（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェンまたはナプロキセンナトリウム））、サイトカイン（例えば、インターロイキン－１０またはトランスフォーミング成長因子－ベータ）、ホルモン（例えば、エストロゲン）またはワクチンが挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、抗体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧまたはＢ細胞を認識する抗体）；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）；照射；またはケモカイン、インターロイキンもしくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ－２、抗ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）を含むがこれらに限定されない免疫抑制剤または免疫寛容誘発剤が投与され得る。そのようなさらなる医薬品は、所望の効果に応じて免疫細胞の投与前、投与中または投与後に投与され得る。上記細胞および作用物質のこの投与は、同じ経路または異なる経路による投与、および同じ部位または異なる部位における投与であり得る。
Ａ．薬学的組成物
本明細書中に包含されるプロセスによって作製されたＭＳＣ細胞および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物および製剤も本明細書中に提供される。
本明細書中に記載されるような薬学的組成物および製剤は、所望の程度の純度を有する活性成分（例えば、抗体またはポリペプチド）を１つ以上の自由選択の薬学的に許容され得るキャリア（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で調製され得る。薬学的に許容され得るキャリアは、一般に、使用される投与量および濃度においてレシピエントにとって無毒性であり、それらのキャリアとしては、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な本明細書中の薬学的に許容され得るキャリアとしては、間質薬物分散剤、例えば、中性で活性な可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）がさらに挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含むある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと併用される。
Ｂ．併用療法
ある特定の実施形態において、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つのさらなる治療と併用されるＭＳＣ細胞集団を含む。癌の実施形態の場合、そのさらなる治療は、放射線療法、手術（例えば、ランペクトミーおよび乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ治療、ウイルス治療、ＲＮＡ治療、免疫療法、骨髄移植、ナノ治療、モノクローナル抗体治療または前述の組み合わせであり得る。そのさらなる治療は、アジュバント療法またはネオアジュバント療法の形態であり得る。病原性の状態の場合、そのさらなる治療は、１つ以上の抗生物質、抗ウイルス薬などを含み得る。
いくつかの癌の実施形態において、さらなる治療は、小分子酵素阻害剤または抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生率および／または重症度を下げることを目的とする作用物質、例えば、抗悪心剤など）の投与である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、放射線療法である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、手術である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、放射線療法と手術の併用である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、ガンマ線照射である。いくつかの実施形態において、さらなる治療は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的化する治療、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤および／または化学予防剤である。さらなる治療は、当該分野で公知の化学療法剤の１つ以上であり得る。
本開示のＭＳＣ細胞療法は、免疫チェックポイント療法などのさらなる癌治療の前、最中、後または様々な組み合わせで投与され得る。それらの投与は、同時から数分、数日、数週間までの範囲の間隔で行われ得る。免疫細胞療法がさらなる治療薬とは別に患者に提供される実施形態では、それら２つの化合物が、なおも患者に対して有益な併用効果を発揮できるように、各送達時点の間にかなりの期間が経過しないことを保証するのが一般的である。そのような場合、抗体療法と抗癌療法とが、互いの約１２～２４または７２時間以内に、より詳細には、互いの約６～１２時間以内に患者に提供され得ることが企図される。いくつかの状況において、それぞれの投与間に数日（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過した場合、処置期間をかなり延長することが望ましいことがある。
様々な組み合わせが使用され得る。下記の例の場合、免疫細胞療法が、「Ａ」であり、抗癌療法が、「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ｂ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
本実施形態の任意の化合物または治療の患者への投与は、それらの作用物質に毒性がある場合はそれを考慮して、そのような化合物を投与するための一般的なプロトコルに従う。ゆえに、いくつかの実施形態では、併用療法に起因し得る毒性をモニタリングする工程が存在する。
１．化学療法
多種多様の化学療法剤が、本実施形態に従って使用され得る。用語「化学療法」とは、薬物を使用して癌を処置することを指す。「化学療法剤」は、癌の処置において投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの作用物質または薬物は、細胞内でのそれらの活性様式によって、例えば、それらが細胞周期に影響するか否かおよびどのステージにおいて細胞周期に影響するかによって、分類される。あるいは、作用物質は、ＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、または核酸合成に影響することによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。
化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）およびビゼレシン（ｂｉｚｅｌｅｓｉｎ）合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ－２１８９およびＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エレウセロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎ）；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）およびウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特に、カリケアマイシンガンマｌＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１））；ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（ジネマイシンＡを含む）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質であるエンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラルニシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモミシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラルニシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；抗代謝産物（例えば、メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリンおよびトリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）およびチオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン）；抗副腎（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、ミトタンおよびトリロスタン）；葉酸補給剤（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｓ））；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクォン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ－１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチノイン酸）；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル－タンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こす、広く使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞への放射性同位体の定方向送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波、陽子ビーム照射およびＵＶ照射などの他の形態のＤＮＡ損傷因子も企図される。これらの因子のすべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対して広範囲のダメージをもたらす可能性が最も高い。Ｘ線の線量の範囲は、長期間（３～４週間）にわたる５０～２００レントゲンという１日線量から、２０００～６０００レントゲンという単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量の範囲は、大きく異なり、同位体の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに腫瘍性細胞による取り込みに依存する。
３．免疫療法
当業者は、さらなる免疫療法が上記実施形態の方法と併用してまたは併せて使用され得ることを理解する。癌の処置の状況において、免疫治療薬は、通常、癌細胞を標的化し、破壊するために免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子を使用することに頼る。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））が、そのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体であり得る。その抗体は、単独で治療のエフェクターとして機能し得るか、または他の細胞をリクルートして、実際に細胞殺滅に影響し得る。その抗体はまた、薬物またはトキシン（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合体化され得、標的化剤として役立ち得る。あるいは、そのエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＭＳＣ細胞が含まれる。
抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）は、殺細胞薬に共有結合的に連結されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含み、併用療法において使用され得る。このアプローチは、抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を非常に強力な細胞傷害性薬物と組み合わせることにより、豊富なレベルの抗原を有する腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装した」ＭＡｂをもたらす。また、薬物の標的化送達は、正常組織への曝露を最小限に抑えることから、毒性を低減し、治療指数を改善する。例示的なＡＤＣ薬物としては、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）およびＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ－ＤＭ１）が挙げられる。
免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は、標的化の影響を受けやすい何らかのマーカー、すなわち、他の大部分の細胞上に存在しない何らかのマーカーを有さなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが、本実施形態の状況において標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニンレセプター、ｅｒｂ Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替の態様は、抗癌効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ、ガンマ－ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ－１、ＭＣＰ－１、ＩＬ－８などのケモカイン、およびＦＬＴ３リガンドなどの成長因子をはじめとした免疫刺激分子も存在する。
免疫療法の例としては、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ－１、ＧＭ－ＣＳＦならびにＴＮＦ；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２およびｐ５３；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５が挙げられる。１つ以上の抗癌療法が、本明細書中に記載される抗体療法とともに使用され得ることが企図される。
いくつかの実施形態において、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナルを強める（例えば、共刺激分子）かまたはシグナルを弱めるかのいずれかである。免疫チェックポイントの遮断によって標的化され得る阻害性免疫チェックポイントとしては、アデノシンＡ２Ａレセプター（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＤ１５２としても知られるＣＴＬＡ－４）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ－１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）、ならびにＴ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１軸および／またはＣＴＬＡ－４を標的化する。
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子、組換え型のリガンドまたはレセプターなどの薬物であり得るか、または特に、ヒト抗体などの抗体である。免疫チェックポイントタンパク質またはそのアナログの公知の阻害剤が、使用され得、特に、キメラ化型、ヒト化型またはヒト型の抗体が使用され得る。当業者が承知しているように、代替のおよび／または等価な名称が、本開示において述べられるある特定の抗体に対して使用され得る。そのような代替のおよび／または等価な名称は、本開示の文脈において相互交換可能である。例えば、ランブロリズマブが、代替のおよび等価な名称であるＭＫ－３４７５およびペンブロリズマブとしても知られていることは公知である。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１がそのリガンド結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤ－１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態において、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ－１および／またはＢ７－１である。別の実施形態において、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な態様において、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ－１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであり得る。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびＣＴ－０１１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外部分またはＰＤ－１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ－２２４である。ＭＤＸ－１１０６－０４、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＢＭＳ－９３６５５８およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られるニボルマブは、使用され得る抗ＰＤ－１抗体である。ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＳＣＨ－９００４７５としても知られるペンブロリズマブは、例示的な抗ＰＤ－１抗体である。ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても知られるＣＴ－０１１も、抗ＰＤ－１抗体である。Ｂ７－ＤＣＩｇとしても知られるＡＭＰ－２２４は、ＰＤＬ２－Ｆｃ融合可溶性レセプターである。
本明細書中に提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）である。ヒトＣＴＬＡ－４の完全ｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞の表面上に見られ、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合したとき「切」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上に発現される免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８に似ており、両分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれＢ７－１およびＢ７－２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達するのに対して、ＣＤ２８は、刺激シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞にも見られ、それらの細胞の機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞レセプターおよびＣＤ２８を介したＴ細胞の活性化により、Ｂ７分子に対する阻害性レセプターであるＣＴＬＡ－４が高発現される。
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）、それらの抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。
本方法における使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（またはそれ由来のＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン）は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。あるいは、当該分野で認められている抗ＣＴＬＡ－４抗体を使用することができる。例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られる）またはその抗原結合フラグメントおよびバリアントである。他の実施形態において、その抗体は、イピリムマブの重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＶＲおよび軽鎖ＶＲを含む。したがって、１つの実施形態において、その抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態において、その抗体は、ＣＴＬＡ－４上の、上述の抗体と同じエピトープへの結合について競合し、かつ／またはＣＴＬＡ－４上の、上述の抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、その抗体は、上述の抗体に対して少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％または９９％の可変領域同一性）を有する。
４．手術
癌を有する人のおよそ６０％が、予防的手術、診断的手術または進行度診断手術、根治的手術および緩和手術をはじめとした何らかのタイプの手術を受ける。根治的手術には、癌性組織の全部または一部を物理的に除去、切除および／または破壊する摘出術が含まれ、他の治療（例えば、本実施形態の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法）と併せて使用され得る。腫瘍摘出術とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。手術による処置には、腫瘍摘出術に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気手術および顕微鏡下手術（モース術）が含まれる。
癌性細胞、組織または腫瘍の一部または全部を切除する際、身体に空洞が形成され得る。処置は、さらなる抗癌療法によるその領域の灌流、直接注射または局所適用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１、２、３、４および５週間ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヶ月ごとに、反復され得る。これらの処置は、様々な投与量の処置でもあり得る。
５．他の作用物質
処置の治療効果を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて他の作用物質が使用され得ることが企図される。これらのさらなる作用物質としては、細胞表面レセプターおよびギャップ結合のアップレギュレーションに影響する作用物質、細胞分裂抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感度を高める作用物質、または他の生物学的作用物質が挙げられる。ギャップ結合数を増加させることによる細胞間のシグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を高め得る。他の実施形態では、処置の抗過剰増殖の有効性を改善するために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて細胞分裂抑制剤または分化剤が使用され得る。本実施形態の有効性を改善するために、細胞接着の阻害剤が企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感度を高める他の作用物質（例えば、抗体ｃ２２５）が、処置の有効性を改善するために本実施形態のある特定の態様と組み合わせて使用され得ることがさらに企図される。
ＶＩＩ．製造品又はキット
製造品又はキットも提供され、免疫細胞を含むものも本明細書中で提供される。操作されたＭＳＣ及び／又はそれらを作製するための１つ又は複数の試薬を含む製造品又はキットが提供される。ｖは、何らかの供給源からのものであり得、本明細書中に包含される方法によって作製され得るか、又はキットは、そのような操作されたＭＳＣを作製するための試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは既に改変されており、それらがさらに改変され得るように、例えば遺伝子編集されるように、及び／又は１つ又は複数の異種抗原受容体を発現するようにキットにおいて提供され得る。特定の実施形態では、ＭＳＣは、１つ又は複数の異種抗原受容体を発現するように、及び／又は遺伝子編集されるように既に改変されており、それらがさらに改変され得るようにキット中で提供され得る。特定の実施形態では、ＭＳＣは遺伝子編集されるように既に改変されており、１つ又は複数の異種抗原受容体を発現するようにそれらがさらに改変され得るようにキットにおいて提供され得る。
特定の実施形態では、ＭＳＣを作製するための１つ又は複数の試薬、例えば、特定の遺伝子を標的とする試薬、１つ又は複数の異種抗原受容体を含む試薬（又は異種抗原受容体を作製するための１つ又は複数の試薬）、サイトカイントランスフェクション又は形質導入ベクター又は発現コンストラクト又はそれらの組み合わせがキットにおいて提供される。一般的な実施形態では、試薬は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む核酸、タンパク質、培地、緩衝液、塩、補助因子などを含み得る。特定の場合において、キットは、特定の所望の遺伝子を標的化するためのものを含め、１つ又は複数のＣＲＩＳＰＲ関連試薬を含む。
製造品又はキットは、免疫細胞を使用して、個体における癌を処置するため若しくは癌の進行を遅延させるため、又は癌を有する個体の免疫機能を促進するための説明書を含む添付文書をさらに含み得る。本明細書中に記載される抗原特異的免疫細胞の何れも、製造品又はキット中に含まれ得る。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。容器は、ガラス、プラスチック（ポリ塩化ビニル又はポリオレフィンなど）又は金属合金（ステンレス鋼又はハステロイなど）などの様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、処方物を保持し、容器上又は容器に結び付けられたラベルは使用法を示し得る。製造品又はキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用説明書付きの添付文書を含め、商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、製造品は、１つ又は複数の別の薬剤（例えば、化学療法剤及び抗新生物剤）をさらに含む。１つ又は複数の薬剤に対する適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するように発明者により発見された技術を表し、従ってその実施のための好ましい方式を構成すると考えられ得ることが当業者により理解されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更をなし得、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を依然として得ることができることを理解すべきである。
実施例１
ＭＳＣ細胞の組み合わせたＣＡＲ形質導入及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集
異なる供給源からのヒト間葉系間質（ＭＳＣ）細胞のＣＡＲ形質導入及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９編集のためのプロトコールの一例を図１で例示する。臍帯組織、骨髄、脂肪組織又は末梢血（例として）から単離されたＭＳＣを、５％ヒト血小板溶解物（ｈＰＬＴ）及び１％Ｌ－グルタミンが追加されたアルファＭＥＭ培地（完全培地）中で少なくとも継代２（Ｐ２）まで拡大増殖させ、次いでＣＡＲ及び／又は関心のある遺伝子を保有するレトロウイルスを用いて形質導入する。形質導入されたＭＳＣは、７日間又は約７日間拡大増殖させ得、次に、形質導入効率が検証され得る。続いて、４Ｄヌクレオフェクターなどにおいて、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を使用するＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９遺伝子編集技術によって遺伝子編集を行い得る。その後、ＭＳＣを完全培地中で７日間又は約７日間培養し得、一部の場合において、培地を１週間に約２回交換する。特定の実施形態では、ＭＳＣ単層をトリプシン処理し、ノックアウト（ＫＯ）効率を評価し得る。形質導入済みの細胞及びＫＯ細胞は、バイオリアクターシステムを７日間又は約７日間使用するなどして拡大増殖させ得る。作製された細胞は、それらの使用まで凍結保存されてもよいし、又は凍結保存されなくてもよい。
図２Ａ～２Ｄは、ＭＳＣの形質導入効率を示す。例えば、図２Ａにおいて、代表的なヒストグラムは、骨髄（ＢＭ）由来ＭＳＣ（左のプロット）及び臍帯組織（ＣＴ）由来ＭＳＣ（右のプロット）に対して、ＣＡＲ（ＣＡＲ ＣＤ５）の１つの例を発現するレトロウイルスベクターを用いて形質導入が行われたことを表す。形質導入効率（フローサイトメトリーを使用して、細胞表面でのＣＡＲ抗体の発現によって検出される場合）は、形質導入されていないＭＳＣ及びアイソタイプと比較して、ＢＭ ＭＳＣについては６６．５％の効率であり、ＣＴ ＭＳＣについては９８．４％の効率であった。図２Ｂは、ＢＭ ＭＳＣ（左のプロット）及びＣＴ ＭＳＣ（右のプロット）が、形質導入されていないＭＳＣ及びアイソタイプと比較した場合、ＢＭ ＭＳＣについては６３．９％の効率及び８７．９％の効率で、ＣＡＲ ＣＤ ３８を発現するレトロウイルスベクターにより形質導入されたことを示す代表的なヒストグラムを提供する。図２Ｃは、ＣＴ ＭＳＣが、非形質導入ＭＳＣ及びアイソタイプと比較して、８３．６％の効率で、フコシルトランスフェラーゼ６（ＦＴ６）を発現するレトロウイルスベクターにより形質導入されたことを示す代表的なヒストグラムを用いた分析を示す。この例において、フローサイトメトリーを使用して細胞表面上のシアリル－ルイスＸ（ｓＬｅｘ）及びルイス（ＬｅＸ）残基（ＨＥＣＡ）の発現によって、形質導入を検出した。図２Ｄ）は、形質導入されていないＭＳＣ及びアイソタイプと比較した場合、ＦＴ６に対して４６．８％の効率及びＩＬ－２１に対して６７．９％の効率で、継代５のＣＴ ＭＳＣがＦＴ６（左のプロット）及びＩＬ－２１の膜結合バージョン（右のプロット）を同時発現するレトロウイルスベクターで形質導入されたことを示す代表的なヒストグラムを提供する。
ＣＴ ＭＳＣにおいて発現される免疫抑制遺伝子のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集の効率を図３Ａ～３Ｄで示す。図３Ａは、Ｃａｓ９対照と比較した、ＭＳＣにおけるエクソン２を標的とするＣＤ４７遺伝子編集のＫＯ効率のフローサイトメトリー分析を示す。ＣＤ４７に対するガイドＲＮＡは、配列番号１（ＣＴＡＣＴＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧＴＡＡＡＧ）として提供される。図３Ｂは、エクソン１及びエクソン２に対するガイドを使用したＭＳＣにおけるＣＤ４７遺伝子のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集のＫＯ効率を実証するＤＮＡ電気泳動ゲルを示す。図３Ｃは、Ｃａｓ９対照（赤色）と比較した、ＣＴ ＭＳＣ（青色）における単一ガイドとしての免疫抑制遺伝子ＰＤ－Ｌ１（左パネル）又はＰＤ－Ｌ２（右パネル）のＫＯ効率のフローサイトメトリー分析を示す。図３Ｄは、対照としてのＣａｓ９単独（赤色）の使用と比較した、ＣＴ ＭＳＣ（青色）における免疫抑制遺伝子ＰＤ－Ｌ １及びＰＤ－Ｌ ２の同時編集のＫＯ効率のフローサイトメトリー分析を示す。
図４Ａ～４Ｃは、ＣＤ４０ＬでのＣＴ由来ＭＳＣの形質導入及び機能性を示す。特に、図４Ａは、ＣＴ ＭＳＣが、フローサイトメトリーによって評価される場合、形質導入されていないＭＳＣと比較して、８７．１％の効率でＣＤ４０Ｌを発現するレトロウイルスベクターにより形質導入されたことを示す代表的なヒストグラムを提供する。図４Ｂは、培養において継続的に維持されるＣＤ４０ＬでのＭＳＣ形質導入の一貫性を表す棒グラフを示す（ここで、Ｐ５、Ｐ６及びＰ７は、継代５、６及び７を指す）。ＣＴ ＭＳＣの免疫抑制効果は図４Ｃで示される。ＭＳＣの非存在下で観察されたＴ細胞の増殖（陽性対照）に対する、形質導入されていないＭＳＣ又は異なる比率で形質導入されたＭＳＣの存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによって誘導された精製Ｔリンパ球増殖の阻害は、フローサイトメトリーによって評価される場合、そこで示される。
免疫抑制遺伝子のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９遺伝子編集を介して操作されたＭＳＣの増殖及び機能研究を図５で提供する。図５Ａは、ノックアウト（ＫＯ））ＭＳＣの累積集団倍加レベル（ｃＰＤ）を示す。完全培地を使用して、継代４（Ｐ４）からのＭＳＣ（細胞７５，０００個）を２４ウェルプレートに播種し、培地を週に２回交換しながら７日間拡大増殖させた。その後、ＴｒｙｐＬＥを使用してＭＳＣ単層を放出させ、細胞を完全培地で洗浄し、３００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、細胞を１ｍｌの完全培地中で再懸濁し、自動計数を使用してアクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム染色（ＡＯ／ＰＩ）を使用して計数する。以下の式を適用することによって各継代後のｃＰＤを計算した：２ＰＤ＝回収した細胞数／播種細胞数；ｃＰＤ＝Σｎ２（ＰＤ １＋ＰＤ ２＋：：：＋ＰＤｎ）、ＰＤはここでは集団倍加を指す。ＣＤ４＋細胞のサイトカイン分泌（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦａ）を測定することによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞と同時培養した後のＭＳＣ ＫＯ細胞及びＣａｓ９対照細胞の免疫抑制能をインビトロで試験した。
本明細書中で開示され、特許請求される方法は全て、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製及び実行され得る。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の方法に、及び本方法の工程において又は本発明の工程の順序において変形物が適用され得ることは当業者にとって明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤を本明細書中に記載の薬剤に置き換え得るが、一方で同じ又は同様の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似の置換及び修正は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。

Claims (47)

  1. 操作された間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）を作製するインビトロの方法であって、
    拡大増殖させたＭＳＣを生成させるためにＭＳＣを拡大増殖させ、ＭＳＣにおける２つ以上の内因性遺伝子の発現を破壊するために、拡大増殖させられているＭＳＣの第１、第２、第３又は第４継代内で、有効量のＣａｓ９又はＣｐＦ１と、２つ以上の遺伝子のそれぞれに対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとをＭＳＣに送達する工程を含む、インビトロの方法。
  2. 前記送達工程が、２つのエレクトロポレーション工程としてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
  3. 第１の送達工程が、１つ又は複数の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを送達することを含み、第２の送達工程が、前記第１の送達工程における前記１つ又は複数の遺伝子とは異なる１つ又は複数の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを送達することを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 操作された間葉系幹細胞／間質細胞（ＭＳＣ）を作製するインビトロの方法であって、
    （ａ）拡大増殖させられたＭＳＣを生成させるためにＭＳＣを拡大増殖させ、前記ＭＳＣの第１継代、第２継代、第３継代又は第４継代内で拡大増殖させる工程、
    （ｂ１）及び（ｃ１）又は（ｂ２）及び（ｃ２）の１つ：
    （ｂ１）改変されたＭＳＣを作製するために、１つ又は複数の異種抗原受容体をコードするベクターで（ａ）のＭＳＣに対して形質導入又は遺伝子移入する工程；
    （ｃ１）第１の期間の後、前記ＭＳＣにおける１つ又は複数の内因性遺伝子の発現を破壊するために、前記改変されたＭＳＣに有効量のＣａｓ９又はＣｐＦ１及び１つ又は複数のガイドＲＮＡを送達し、それにより、遺伝子編集された改変ＭＳＣを作製する工程；
    又は
    （ｂ２）前記ＭＳＣにおける１つ又は複数の内因性遺伝子の発現を破壊するために、（ａ）のＭＳＣに有効量のＣａｓ９又はＣｐＦ１及び１つ又は複数のガイドＲＮＡを送達し、それにより遺伝子編集されたＭＳＣを作製する工程；
    （ｃ２）第１の期間の後、遺伝子編集された改変ＭＳＣを作製するために、１つ又は複数の異種抗原受容体をコードするベクターで前記遺伝子編集されたＭＳＣに対して形質導入するか又は遺伝子移入する工程
    を含む、インビトロの方法。
  5. 前記遺伝子編集された改変ＭＳＣが、（ｂ１）及び（ｃ１）の工程から作製される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記遺伝子編集された改変ＭＳＣが、（ｂ２）及び（ｃ２）の工程から作製される、請求項４に記載の方法。
  7. （ｃ１）及び（ｂ２）の工程がそれぞれ、２つ以上の送達工程としてさらに定義される、請求項４に記載の方法。
  8. 第１の送達工程が、１つ又は複数の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを送達することを含み、第２の送達工程が、前記第１の送達工程における前記１つ又は複数の遺伝子とは異なる１つ又は複数の遺伝子を標的とするガイドＲＮＡを送達することを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１の送達工程と前記第２の送達工程との間の期間が、少なくとも約２～３日である、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 前記第１の期間が約３日～８日である、請求項４～９の何れか１項に記載の方法。
  11. 送達工程がエレクトロポレーションによるものである、請求項１～１０の何れか１項に記載の方法。
  12. エレクトロポレーションが、約２００，０００個～１×１０９個のＭＳＣを使用する、請求項１１に記載の方法。
  13. エレクトロポレーションが、約２００，０００個～２，０００，０００個の細胞を使用する、請求項１１に記載の方法。
  14. エレクトロポレーションが、約１，０００，０００個～１×１０９個のＭＳＣを使用する、請求項１１に記載の方法。
  15. 前記エレクトロポレーション工程における前記ガイドＲＮＡの濃度が３、４又は５μＭである、請求項１～１４の何れか１項に記載の方法。
  16. 前記エレクトロポレーション工程におけるＣａｓ９ヌクレアーゼの濃度が４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９又は５μＭである、請求項１～１５の何れか１項に記載の方法。
  17. 前記ＭＳＣが、臍帯組織、骨髄、末梢血、脂肪組織、歯髄又はそれらの混合物に由来する、請求項１～１６の何れか１項に記載の方法。
  18. 前記異種抗原受容体がキメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体である、請求項４～１７の何れか１項に記載の方法。
  19. 前記異種抗原受容体が癌抗原を標的とする、請求項４～１８の何れか１項に記載の方法。
  20. 前記異種抗原受容体が、ＣＤ１９、ＥＢＮＡ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＣＡ－１２５、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４、ＣＤ２０、ＣＤ７０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＤ５６、ＡＫＴ、Ｈｅｒ３、上皮性腫瘍抗原、ＣＤ３１９（ＣＳ１）、ＲＯＲ１、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＣＤ５、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＬＬ－１、Ｕ５ｓｎＲＮＰ２００、ＣＤ２００、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＣＤ９９、ｐ５３、変異型ｐ５３、Ｒａｓ、変異型ｒａｓ、ｃ－Ｍｙｃ、細胞質セリン／スレオニンキナーゼ（例えば、Ａ－Ｒａｆ、Ｂ－Ｒａｆ及びＣ－Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＲＴ－１、メラノーマ関連抗原、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ－６、－１０、ＧＡＧＥ－１、－２、－８、ＧＡＧＥ－３、－４、－５、－６、－７Ｂ、ＮＡ８８－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ｍｄａ－７、ｇｐ７５、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＡＲＴ－４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ－Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、－カテニン／ｍ、カスパーゼ－８／ｍ、ＣＤＫ－４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇ２５０、ＨＡＧＥ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、７０７－ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ－ａｂｌ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（特にＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、ＶＥＧＦＲ２、細胞質チロシンキナーゼ（例えばｓｒｃファミリー、ｓｙｋ－ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、転写のシグナル伝達因子及び活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳ及びＳＴＡＴＥ、低酸素誘導性因子（例えばＨＩＦ－１及びＨＩＦ－２）、核因子－カッパＢ（ＮＦ－Ｂ）、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えばＮｏｔｃｈ１～４）、ＮＹ ＥＳＯ１、ｃ－Ｍｅｔ、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル調節されるキナーゼ（ＥＲＫ）及びそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ－３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞癌腫－５Ｔ４、ＳＭ２２－アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）及びＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリアン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ）、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＲＧｓＳ、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＦＡＰ、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原を標的とする、請求項１～１９の何れか１項に記載の方法。
  21. 前記ＭＳＣにおける発現の破壊を有する遺伝子が阻害性遺伝子である、請求項１～２０の何れか１項に記載の方法。
  22. 前記阻害性遺伝子が、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＦＯＸＯ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＡＤＯＲＡ２、ＮＲ３Ｃ１、ＰＤ１、ＰＤＬ－１、ＰＤＬ－２、ＣＤ４７、ＳＩＲＰＡ、ＳＨＩＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＲＰＳ６、４ＥＢＰ１、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＩＬ２１Ｒ、ＩＣＡＭ１、ＣＤ９５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ１０Ｒ、ＴＤＡＧ８、ＣＤ５、ＣＤ７、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＬＡＧ３、ＴＣＲ、ベータ２－ミクログロブリン、ＨＬＡ、ＣＤ７３、ＣＤ３９及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＭＳＣが、１つ又は複数の異種サイトカインにより形質導入又は遺伝子移入される、請求項１～２２の何れか１項に記載の方法。
  24. 前記細胞の何れかが分析される、請求項１～２３の何れか１項に記載の方法。
  25. 前記細胞が、機能アッセイ、細胞傷害性アッセイ及び／又はインビボ活性によって分析される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記細胞が、フローサイトメトリー、マスサイトメトリ、ＲＮＡシーケンシング又はそれらの組み合わせによって分析される、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 前記細胞の何れかが保存される、請求項１～２６の何れか１項に記載の方法。
  28. 前記細胞の何れかが冷凍保存される、請求項１～２７の何れか１項に記載の方法。
  29. 工程（ｃ１）又は（ｃ２）の後、１つ又は複数の機能アッセイによる分析の前及び／又は後に細胞を拡大増殖させる、請求項１～２８の何れか１項に記載の方法。
  30. 工程（ｃ１）又は（ｃ２）の後、保存の前及び／又は後に前記細胞を拡大増殖させる、請求項１～２９の何れか１項に記載の方法。
  31. 何らかの拡大増殖工程が、血小板溶解物、Ｌ－グルタミン及び／又はヘパリンを含む培地中で前記細胞を拡大増殖させる、請求項１～３０の何れか１項に記載の方法。
  32. 有効量の前記細胞が、それを必要とする個体に送達される、請求項１～３１の何れか１項に記載の方法。
  33. 前記個体が、癌、感染性疾患又は免疫関連障害を有する、請求項３２に記載の方法。
  34. 請求項１～３３の何れか１項に記載の方法によって作製されたＭＳＣの集団。
  35. 請求項３４に記載の集団を含む組成物。
  36. 前記集団が薬学的に許容可能な担体中に含まれる、請求項３５に記載の組成物。
  37. 医学的状態に対して個体を処置する方法であって、請求項１～３３の何れか１項に記載の方法によって作製された治療有効量のＭＳＣを前記個体に投与する工程を含む、方法。
  38. 前記医学的状態が癌である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記癌が血液系の悪性腫瘍又は固形腫瘍を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記医学的状態が感染性疾患及び／又は免疫関連障害である、請求項３７に記載の方法。
  41. 前記ＭＳＣが前記個体に１回又は複数回投与される、請求項３７～４０の何れか１項に記載の方法。
  42. 前記ＭＳＣが前記個体に複数回投与される場合、投与間の期間が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４時間を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ＭＳＣが前記個体に複数回投与される場合、投与間の期間が１、２、３、４、５、６又は７日間である、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記ＭＳＣが前記個体に複数回投与される場合、投与間の期間が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月を含む、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記個体に、前記医学的状態に対する有効量の１つ又は複数のさらなる治療が投与される、請求項３７～４４の何れか１項に記載の方法。
  46. 前記さらなる治療が、前記ＭＳＣの投与前、投与中及び／又は投与後に前記個体に投与される、請求項４５に記載の方法。
  47. 請求項１～３３の何れか１項に記載の方法によって作製されたＭＳＣ及び／又は前記ＭＳＣを作製するための１つ又は複数の試薬を含む、キット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN105985985B (zh) * 2016-05-06 2019-12-31 苏州大学 Crispr技术编辑并用igf优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用
CA3060443A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immune cells expressing engineered antigen receptors
JP2021522798A (ja) * 2018-05-03 2021-09-02 ボード オブ リージェンツ, ザ ユニバーシティ オブ テキサス システムBoard Of Regents, The University Of Texas System 免疫チェックポイント遮断によりキメラ抗原受容体を発現するように操作されたナチュラルキラー細胞
CN109082442B (zh) * 2018-07-17 2019-09-20 杭州观梓健康科技有限公司 一种可解除免疫抑制并增强肿瘤靶向性杀伤的间充质干细胞的制备方法

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