CN105985985B

CN105985985B - Crispr技术编辑并用igf优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用

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Publication number: CN105985985B
Application number: CN201610297972.0A
Authority: CN
Inventors: 李杨欣; 沈振亚; 邵联波
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: SHANGHAI XINRUITE BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2016-05-06
Filing date: 2016-05-06
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2036-05-06
Also published as: CN105985985A

Abstract

本发明属于异体间充质干细胞应用领域，具体涉及CRISPR技术编辑并用IGF优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用，包括如下步骤：利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，然后通过贴壁培养获得间充质干细胞；设计间充质干细胞表面抗原B2M‑gRNA，炎症因子TNF‑α‑gRNA；构建重组的慢病毒颗粒并转染间充质干细胞；用IGF‑1优化间充质干细胞；利用改造和优化后的间充质干细胞来制备治疗心肌梗死的药物。本发明利用CRISPR/Cas9技术清除异体间充质干细胞表面导致免疫排斥的抗原以及引起炎症反应的炎症因子，并用IGF‑1提高间充质干细胞的抗凋亡能力、促进其归巢，为临床治疗心血管疾病的药物的制备提供一套新的技术方案，所制备的异体间充质干细胞移植后不会引起免疫排斥。

Description

CRISPR技术编辑并用IGF优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用

技术领域

本发明属于异体间充质干细胞应用领域，具体涉及CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心肌梗死中的应用。

背景技术

随着社会经济的发展，国民生活方式发生了深刻的变化，尤其是人口老龄化及城镇化进程的加速，中国心血管病危险因素呈明显上升趋势，导致了心血管病的发病人数持续增加，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)的死亡率亦呈上升趋势。急性心肌梗死是临床常见的急症之一，死亡率高，而且预后差，对人们的健康造成了严重危害。同时，AMI的发病率在世界范围内也是逐年上升。尽管近年来在介入治疗、心脏移植方面取得了可喜的进展，但是由于受到供体来源短缺、手术技能要求高等因素的限制，传统治疗方法在临床的应用也受到了限制。干细胞移植治疗是近年发展起来的一项新型临床前沿技术，其原理是通过移植或动员干细胞进入梗死心肌组织，增加梗死区心肌样细胞数量及毛细血管数量，逆转心脏重构，替代、修复或加强受损的组织或器官的生物学功能，改善心功能。

根据国内外临床导向，基于我们基础研究的结果和临床数据,及从临床安全性、可行性考虑，我们从诱导型干细胞、心肌干细胞、血液中祖细胞等不同类型细胞中，首先选择了间充质干细胞(MSCs)。间充质干细胞是近年来兴起并得到快速发展的移植细胞，而且干细胞移植是国内外临床治疗心肌梗死的发展趋势。和其它类型的细胞相比，MSCs具有许多优点：(1)易于分离培养，疗效好，无伦理道德问题；(2)具有向心肌细胞分化的潜能；(3)免疫排斥性相对较低，有异体移植的前景；(4)独特的归巢功能，可以静脉系统输注。急性心肌梗死发生后的前48小时主要是心肌细胞的坏死，并伴有炎性细胞的侵润，不适宜进行细胞移植。在第3-4天由于炎症因子还处于较高的水平也不适宜进行细胞移植。第7天时VEGF等生长分子的浓度达到峰值。2周后疤痕组织形成，细胞移植治疗难以生效。因此心梗后细胞移植的最佳时间是在第7-14天。但是考虑到心肌梗死一般发病都比较急，患者可能来不及准备自身的MSCs，而且心肌梗死大部分发生在老年人身上。研究显示随着年龄的增长，体内MSCs的数量随之减少，细胞活力也逐渐降低。因此，为了保证临床上能够及时有效的治疗心肌梗死，移植异体来源的间充质干细胞是理想的选择。尽管间充质干细胞的免疫排斥性相对较低，但是心肌梗死病灶部位的特殊微环境提高机体对移植后的间充质干细胞的敏感性，加重免疫排斥反应。为了进一步降低移植细胞和宿主之间的免疫排斥反应，提高细胞移植的治疗效果，本发明中利用CRISPR/Cas9这一精准的医学前沿技术对移植细胞进行编辑，清除异体MSCs细胞表面导致免疫排斥的抗原后，再进行异体移植治疗心肌梗死。

CRISPR/Cas9技术是2013年张峰等团队基于某些细菌内存在的一种抵御外来病毒、质粒等遗传元件入侵的特异性免疫保护机制，发明的一种新型的基因编辑技术。由于其成本低、制作简便、快捷、高效等优点，迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效技术。目前的研究显示CRISPR/Cas9技术已经在斑马鱼、大、小鼠、食蟹猴等不同的物种中成功的应用。尤其在临床应用方面有着很好的应用前景，美国哥伦比亚大学和爱荷华大学的科学家通过应用CRISPR/Cas9基因编辑技术诱导疾病患者多能干细胞分化的方式实现了眼疾色素性视网膜炎相关缺陷基因的修复。最近国内研究人员将病人的皮肤细胞诱导成iPS细胞(诱导多能干细胞)后，利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组来修复发生突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内，治疗人类的镰刀形贫血症。此外，像使用CRISPR/Cas9技术根除HIV病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果也已先后发表在Nature等著名杂志。但用CRISPR/Cas9技术清除间充质干细胞上免疫抗原，治疗心肌梗死，尚无相关报道。

目前用的自体MSCs移植治疗心肌梗死是近年来兴起并得到快速发展的一项技术，还存在以下缺陷：1)心肌梗死一般发病都比较急，患者可能来不及准备自身的MSCs，而且心肌梗死大部分发生在老年人身上。研究显示随着年龄的增长，体内MSCs的数量随之减少，细胞活力也逐渐降低，所以需要新的细胞移植技术，如本发明：无免疫排斥性的、抗凋亡、易归巢的异体MSCs；2)相对于本发明采用的CRISPR/Cas9技术，传统的siRNA技术具有转染效率相对较低，不能彻底的对靶基因进行敲除的缺陷。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明利用CRISPR/Cas9技术清除异体间充质干细胞表面导致免疫排斥的抗原以及引起炎症反应的炎症因子，并用IGF-1提高间充质干细胞的抗凋亡能力、促进其归巢，提供了一种CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心肌梗死中的应用。本发明克服了现有临床治疗心肌梗死手段的不足，为临床治疗心血管疾病提供一套全新的治疗方案。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的一个技术方案为：CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，通过贴壁培养获得异体间充质干细胞；

(2)分别设计转录间充质干细胞表面抗原B2M、炎症因子TNF-α引导RNA(gRNA)对应的DNA序列：

B2M-gRNA相应的DNA oligo序列为5’-AGTCACATGGTTCACACGGCAGG-3’；TNF-α-gRNA对应的DNA oligo序列为5’-TATCTCGACTTTGCCGAGTCTGG-3’

(3)将B2M-gRNA相应的DNA oligo序列磷酸化聚合在一起形成双链后导入到载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得B2M重组慢病毒颗粒；将TNF-α-gRNA相应的DNAoligo序列磷酸化聚合在一起形成双链后导入到载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得TNF-α重组慢病毒颗粒，使得B2M重组慢病毒颗粒和TNF-α重组慢病毒颗粒同时侵染异体间充质干细胞；筛选阳性细胞并扩增培养；

(4)用含有浓度为10～30ng/ml IGF-1分子的无血清人间充质干细胞(hMSC)培养基在低氧条件(O₂浓度2％-5％)下培养异体间充质干细胞48小时。

步骤(1)的具体过程为：

a.无菌条件下采集顺产或剖腹产胎儿的脐带血，肝素抗凝；

b.采集脐带血后立即分离，用PBS将脐带血按照1:1的体积比例进行稀释；

c.将稀释后的血液缓慢加到等体积的淋巴细胞分离液上，加时要缓慢，注意不要冲破液体之间的分层，1000r/min离心15min；

d.小心吸取中间界面的白膜层，PBS洗两遍后，用hMSC培养基悬浮细胞制成单细胞悬液,以5×10⁶/mL密度接种，置于37℃的CO₂培养箱中进行培养；

e.7天后换液去除未贴壁细胞，2周后待贴壁细胞融合率达到90％时进行传代。

在步骤(1)中，还包括对通过贴壁培养获得的异体间充质干细胞的鉴定步骤。

步骤(3)的具体过程为：

a.合成B2M-gRNA相应的双股DNA序列和TNF-α-gRNA相应的双股DNA序列；

b.以LentiCRISPR v2载体为框架，将B2M-gRNA相应的DNA序列导入到LentiCRISPRv2载体中构建v2-B2M重组慢病毒载体；

c.以100mm的培养皿为例(约6.5×10⁶细胞/皿)经鉴定正确的v2-B2M重组慢病毒载体分别和包装载体质粒pCMVΔR、pRSV-Rev、pMD2.VSVG按照10μg、6.5μg、3.5μg、2.5μg的量混合后，通过磷酸钙法转染293T细胞。

d.收集48h与72h的293T培养上清，离心后使用0.22μm滤膜过滤，将成功包装获得的B2M重组慢病毒颗粒保存于-80℃冰箱备用；

e.按照步骤b-d构建TNF-α的v2-TNF-α重组慢病毒载体并包装获得TNF-α慢病毒颗粒；

f.将经293T包装后的B2M、TNF-α慢病毒颗粒，同时侵染MSCs细胞；

g.筛选阳性细胞并扩增培养。

在步骤(4)后，还包括步骤(5)：对IGF-1处理后的MSC细胞，PBS洗涤3次，用胰蛋白酶消化细胞，悬液离心，用培养基洗涤一次后离心去除悬液中的细胞碎片，再次用培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度，放入冰箱待移植用。

本发明还提供CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞在制备治疗心肌梗死的药物中的应用。

所用的异体间充质干细胞无免疫排斥性、抗炎症、抗凋亡、易归巢。

所述心肌梗死为因缺血及炎症反应导致的心肌细胞的坏死。

异体间充质干细胞上的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α被消除，归巢因子CXCR4表达提高。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：心血管疾病严重影响了我国人民的身体健康和生活质量。尽管最新研究表明，自体间充质干细胞治疗能够在一定程度上缓解病情，但从治疗时间上看，病人自体干细胞不是最佳选择。但移植异体干细胞可能引起免疫排斥。本发明利用CRISPR/Cas9技术清除异体间充质干细胞表面导致免疫排斥的抗原以及引起炎症反应的炎症因子，并用IGF-1提高间充质干细胞的抗凋亡能力、促进其归巢。本发明克服了现有临床治疗心肌梗死手段的不足，为临床治疗心血管疾病的药物的制备提供一套新的技术方案，所制备的异体间充质干细胞移植后不会引起免疫排斥，同时也会为国家和个人治疗心血管疾病节省大量资金。

附图说明

图1为本发明的异体间充质干细胞的制备和应用示意图；

图2为人脐血间充质干细胞的鉴定结果图；

图3为B2M-gRNA的选择示意图；

图4为TNF-α-gRNA的选择示意图；

图5和图6为本发明的重组质粒构建及转染过程示意图；

图7为流式细胞术检测细胞表面CXCR4分子的表达示意图；

图8为CRISPR/Cas9技术编辑后的间充质干细胞的免疫排斥反应检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步地说明。

在免疫排斥反应中人类白细胞抗原I(human leukocyte antigen I，HLA-I)和HLA-II是引起免疫排斥的主要抗原，HLA-I抗原由两条多肽链组成，即具有多态性的重链和非多态性的轻链。B2M定位在人15号染色体的长臂上，在除红细胞外的所有有核细胞中表达，是HLA-I分子的轻链，其作用是调节HLA-I重链的形成。间充质干细胞表达中等量的HLA-I分子，不表达HLA-II分子。当间充质干细胞分化后，HLA-I类分子继续表达，但始终不表达HLA-II类分子。所以，本发明中我们利用CRISPR/Cas9技术清除间充质干细胞中B2M分子，进而清除其最可能导致免疫排斥的HLA-I类抗原的表达。由于B2M的非多态性，我们设计的B2MgRNA会对不同供源的人的脐带组织源的间充质干细胞都有效，而不用针对每个供体单独设计一个gRNA，在临床上易于推广。

人体中的促炎细胞因子主要有TNF-α和IL-6等，这些细胞因子作为重要的炎症介质，在机体炎症损伤的发生、发展的病理过程中具有重要作用。生理状态下，人体液中TNF-α和IL-6水平较低，但在病理状态下，TNF-α和IL-6分泌量增加以及引起的各种炎症因子的级联放大释放可导致炎症反应，引起组织细胞损伤。TNF-α的细胞来源广泛，包括各种免疫细胞、内皮细胞、成纤维细胞等，而且还有文献表明在某些病理环境下，MSC也可以分泌TNF-α。人TNF-α基因编码前体蛋白，经酶剪切去除信号肽生成分泌型TNF-α。分泌型TNF-α具有广泛的生物学活性，如：参与炎性反应和免疫应答、参与内毒素性休克等病理过程，关键是TNF-α可进一步诱导IL-6、IL-8等炎症因子的产生。因此，本专利中，我们在MSC植入病灶部位前将利用CRISPR/Cas9技术将TNF-α这个起主导作用的炎症分子清除。

除了考虑炎症反应对干细胞治疗心肌梗死产生的不良影响，间充质干细胞自身的凋亡和归巢也会影响干细胞移植的疗效，所以，本发明在利用CRISPR/Cas9技术清除脐带间充质干细胞的表面免疫抗原基础上，还要针对细胞的其他方面进行进一步的优化。我们发现生长因子IGF-1(insulin like-growth factor-1)具有抑制干细胞凋亡的作用，同时还可以通过提高细胞趋化因子CXCR4的表达来提高干细胞在心脏中的归巢的作用。因此，在移植前，我们用IGF-1处理CRISPR/Cas9编辑后的脐带间充质干细胞对其进行进一步的优化。

本发明用CRISPR/Cas9技术清除异体间充质干细胞表面导致免疫排斥的抗原及引起炎症反应的炎症因子，并用IGF-1进一步优化间充质干细胞，克服了现有的临床治疗心肌梗死手段的不足，为临床治疗心血管疾病提供一套全新的治疗方案。

根据图1，本发明的主要步骤为：

(1)利用密度梯度离心法分离获得异体的单个核细胞，然后通过贴壁培养获得间充质干细胞。

(2)利用“OPTIMISED”网站设计间充质干细胞表面抗原B2M-gRNA，炎症因子TNF-α-gRNA相应的DNA oligo序列。

(3)构建重组的慢病毒颗粒并转染间充质干细胞。

(4)用IGF-1优化间充质干细胞。

(5)利用改造和优化后的间充质干细胞来制备治疗心肌梗死的药物。

(6)免疫排斥反应的检测。

实施例1.人脐血间充质干细胞的分离：

1)无菌条件下采集顺产及剖腹产胎儿的脐带血，肝素抗凝。

2)标本采集后立即分离,用PBS将脐血按照1:1的比例进行稀释。

3)将稀释后的血液缓慢加到等体积的淋巴细胞分离液上，加时要缓慢，注意不要冲破液体之间的分层，1000r/min离心15min。

4)小心吸取中间界面的白膜层，PBS洗两遍后，用无血清人间充质干细胞(hMSC)培养基悬浮细胞制成单细胞悬液,以5×10⁶/mL密度接种，置于37℃、5％的CO₂培养箱中进行培养。

5)7天后换液去除未贴壁细胞，2周后待贴壁细胞融合率达到90％时进行传代。

实施例2.人脐血间充质干细胞的鉴定

1)取生长状态良好的第3代细胞，用0.25％的胰酶进行消化。将消化下来的细胞离心后，PBS重悬，然后计数。

2)将细胞浓度调整到1×10⁶/ml，向每个EP管中吸取100μl，即1×10⁵个细胞。向EP管中加入荧光素标记的CD90-FITC(美国eBioscience,Cat^#:11-0909 -41)、CD45-FITC(美国eBioscience,Cat^#:11-9459-41)、CD11b-PE(美国eBioscience,Cat^#:12-0113-41)。

3)避光孵育30min后，PBS洗两遍，流式细胞仪检测，检测结果如图2，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示流式细胞仪检测细胞数目。

实施例3 间充质干细胞编辑的靶分子B2M-gRNA、TNF-α-gRNA的设计

1)从ENSEMBL网站上，找到B2M基因的外显子，发现该基因共有14个转录本，但只有3个转录本可以编码蛋白质，分别是B2M-001，B2M-006，B2M-201。

2)对B2M-001，B2M-006，B2M-201三个转录本进行比对后，发现它们具有一个公共外显子--ENSE00002219576。ENSE00002219576的序列如下：

ENSE00002219576：

CCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGG

3)将该外显子输入“OPTIMISED”网站，可以得到14条候选的gRNA对应的DNA oligo序列，筛选选得分比较高的oligo序列AGTCACATGGTTCACACGGCAGG。(如图3)

4)利用相同的方法得到TNF-α的gRNA对应的oligo序列为TATCTCGACTTTGCCGAGTCTGG(如图4)。

TNF-α第四外显子序列：

CAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGA。

实施例3 利用CRISPR/Cas9技术对MSC进行编辑

1)根据“OPTIMISED”网站的分析结果合成B2M-gRNA相应的DNA oligo序列，磷酸化聚合在一起形成双链。设计的靶分子单链oligo序列(图6)为AGTCACATGGTTCACACGGCAGG；针对TNF-α靶分子单链oligo序列为TATCTCGACTTTGCC GAGTCTGG(图6中表述)

2)以V2载体为框架(见图5和图6)，将B2M-gRNA相应的DNA oligo序列导入到V2载体中构建重组质粒。导入的位置在U6与Cas9之间，在U6启动子后大约10bp的位置，BGHpA起到转录的稳定作用。

3)经鉴定正确的V2-B2M重组慢病毒载体分别和包装载体质粒按照相应的含量混合后，通过磷酸钙法转染293T细胞。

以100mm的培养皿为例(约6.5×10⁶细胞/皿)经鉴定正确的v2-B2M重组慢病毒载体分别和包装载体质粒pCMVΔR、pRSV-Rev、pMD2.VSVG按照10μg、6.5μg、3.5μg、2.5μg的量混合后，通过磷酸钙法转染293T细胞。

注意：先加入三种公共质粒，然后再加入目的质粒，然后加入无菌水，然后加浓度为2.5M的CaCl₂(要一滴一滴的滴加)，混匀，逐滴加入到500μl的2×HBS中，经过大约10min可以看到溶液由透明变为乳白色，有颗粒。将乳白色的溶液全部滴加到293T细胞中，十字混匀。37度培养。转染过程涉及到的原料及含量如表1。

表1质粒转染过程涉及到的原料及含量

4)收集48h与72h的293T培养上清，离心后使用0.22μm滤膜过滤，将成功包装获得的B2M重组慢病毒颗粒保存于-80℃冰箱备用。同时包装V2的空载质粒用作对照。

5)按照上述步骤构建TNF-α的重组质粒并通过转染293T细胞并包装得到TNF-α慢病毒颗粒。将TNF-α相应的DNA oligo序列导入到V2载体中构建重组质粒。导入的位置在U6与Cas9之间，在U6启动子后大约10bp的位置，BGHpA起到转录的稳定作用。经鉴定正确的TNF-α重组慢病毒载体分别和包装载体质粒按照相应的含量混合后，通过磷酸钙法转染293T细胞。质粒转染过程涉及到的原料及含量如表1。

6)将经293T包装后的B2M、TNF-α慢病毒颗粒，侵染MSCs细胞。

7)筛选阳性细胞并扩增培养。

实施例4 IGF-1预处理MSC增强其抗凋亡能力并促进归巢因子CXCR4表达

1)IGF-1促进MSC的抗凋亡能力

i.用含有浓度为10ng/ml和30ng/ml的IGF-1分子的无血清人间充质干细胞培养基分别在低氧条件下(O₂浓度2％-5％)培养MSC细胞48小时后，制备细胞悬液。

ii.调整细胞悬液密度至1×10⁶/ml，吸取100μl悬液到新的EP管中，加入AnnexinV-FITC和PI各5μl，室温避光孵育15min后，加入400μl的PBS缓冲液，流式检测，检测结果为Annexin V-FITC表达量下降。表明IGF-1抑制凋亡。

2)IGF-1提高MSC的归巢因子CXCR4的表达

i.用含有浓度为10ng/ml的IGF-1分子的无血清人间充质干细胞培养基培养MSC细胞24小时。

ii.Trizol法提取细胞的总RNA后，用5μg的RNA逆转录出cDNA，然后RT-qPCR检测CXCR4基因的表达，检测结果如图7A，共培养12小时和24小时后，CXCR4 mRNA的表达量明显上调。

iii.用含10ng/ml的IGF-1分子的培养基分别培养MSC和预先用IGF-1中和抗体处理过的MSC 48小时后，流式细胞术检测细胞表面CXCR4分子的表达，检测结果如图7B，IGF-1处理后，CXCR4蛋白的表达量明显上调；加入IGF-1中和抗体，在用IGF-1处理后，CXCR4蛋白的表达量无明显上调。

实施例5 CRISPR/Cas9技术编辑及IGF-1优化后的间充质干细胞在心梗模型治疗中的应用

1)按照LAD法结扎后，选取生长良好，达到90％融合状态的第4代经过CRISPR/Cas9技术编辑，及IGF-1优化后的MSC细胞，PBS洗涤3次，0.25％胰蛋白酶消化细胞，悬液1000r/min离心5min，用培养基洗涤一次后1000r/min离心5min去除悬液中的细胞碎片，再次用培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度6×10⁷/ml，放入4℃冰箱待移植用。

2)心肌梗死模型建立成功后进行细胞移植，用50μl微量注射器抽取细胞悬液50μl，注射到梗死区域中心及周边，共计5个点，约3.0×10⁶细胞。撤针过程中按压注射孔以防细胞漏出。同时分别以未经CRISPR/Cas9技术编辑和未优化的MSC作为对照。

3)闭合胸腔，苏醒后分笼饲养。

4)分别在术后的1周和2周处死大鼠，取左心室组织进行心脏组织染色，发现相对于未优化的MSC，使用经过优化的MSC治疗后心梗面积减小，心肌成纤维化程度降低。

实施例6 CRISPR/Cas9技术编辑后的间充质干细胞的免疫排斥反应检测

1)移植细胞48h后，将大鼠用1％的异氟烷麻醉后，利用毛细吸管从眼球后静脉丛取血200μl。

2)待自然凝固后，3000r/min离心10min，用移液器小心吸取上层的血清，转移到新的EP管，-80℃保存待用。

3)利用ELISA试剂盒检测移植后48h血清中C反应蛋白(CRP)(美国eBioscience,Cat^#:88-7501)、IL-6(美国eBioscience，Cat^#:BMS625*)、TNF-α(美国eBioscience，Cat^#:88-7340-22)等炎症分子的表达水平。检测结果如图8所示，相对于对照组，经过优化的实验组炎症因子的表达量明显降低。

CRP的结果：Control＝12.8±0.5μg/ml，编辑、优化MSC＝11.3±0.3μg/ml；

IL-6的结果：Control＝28.5±0.6pg/ml，编辑、优化MSC＝25.3±0.7pg/ml；

TNF-α的结果：Control＝39.6±0.4pg/ml，编辑、优化MSC＝30.3±0.5pg/ml。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同形式的替换，这些改进和等同替换得到的技术方案也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

B2M-gRNA对应DNA oligo序列为5’-AGTCACATGGTTCACACGGC AGG-3’； TNF-α-gRNA对应的DNA oligo序列为5’-TATCTCGACTT TGCCGAGTCTGG-3’

(3)将B2M-gRNA对应的DNA oligo序列磷酸化聚合在一起形成双链后导入到LentiCRISPR v2载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得B2M重组慢病毒颗粒；将TNF-α-gRNA对应的DNA oligo序列导入到LentiCRISPR v2载体中构建重组质粒并转染293T细胞以获得TNF-α重组慢病毒颗粒，将得到的B2M重组慢病毒颗粒和TNF-α重组慢病毒颗粒同时侵染异体间充质干细胞；筛选阳性细胞并扩增培养；

(4)用含有浓度为10~30ng/ml IGF-1分子的无血清人间充质干细胞（hMSC）培养基低氧条件下培养异体间充质干细胞48小时，低氧条件指O₂浓度2%-5%。

2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤（1）的具体过程为：

a．无菌条件下采集顺产或剖腹产胎儿的脐带血，肝素抗凝；

b．采集脐带血后立即分离，用PBS将脐带血按照1:1的体积比例进行稀释；

c．将稀释后的血液缓慢加到等体积的淋巴细胞分离液中，1000r/min离心15min；

d．小心吸取中间界面的白膜层，PBS洗两遍后，用hMSC培养基悬浮细胞制成单细胞悬液, 以5×10⁶/ mL密度接种，置于37 ℃的CO₂培养箱中进行培养；

e．7天后换液去除未贴壁细胞，2周后待贴壁细胞融合率达到90%时进行传代。

3.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，还包括对通过贴壁培养获得的异体间充质干细胞的鉴定步骤。

4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤（3）的具体过程为：

b.以LentiCRISPR v2载体为框架，将B2M-gRNA相应的DNA序列导入到LentiCRISPR v2载体中构建v2-B2M重组慢病毒载体；

c.经鉴定正确的v2-B2M重组慢病毒载体分别和包装载体质粒pCMVΔR、pRSV-Rev、pMD2.VSVG按照10μg、6.5μg、3.5μg、2.5μg的量混合后，通过磷酸钙法转染293T细胞；

f.将经293T包装后的B2M、TNF-α慢病毒颗粒，同时侵染MSCs细胞；

g.筛选阳性细胞并扩增培养。

5.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞的制备方法，其特征在于，在步骤（4）后，还包括步骤（5）：对IGF-1处理后的MSC细胞，PBS洗涤若干次，用胰蛋白酶消化细胞，悬液离心，用培养基洗涤一次后离心去除悬液中的细胞碎片，再次用培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度，放入冰箱待移植用。

6.权利要求1-5任意一项所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞在制备治疗心肌梗死的药物中的应用。

7.权利要求6所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞在制备治疗心肌梗死的药物中的应用，其特征在于，所用的异体间充质干细胞无免疫排斥性、抗炎症、抗凋亡、易归巢。

8.权利要求6所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞在制备治疗心肌梗死的药物中的应用，其特征在于，所述心肌梗死为因缺血及炎症反应导致的心肌细胞的坏死。

9.权利要求6所述的CRISPR/Cas9技术编辑并利用生长因子优化的异体间充质干细胞在制备治疗心肌梗死的药物中的应用，其特征在于，异体间充质干细胞上的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α被消除，归巢因子CXCR4表达提高。