CN104726494B

CN104726494B - CRISPR-Cas9技术构建染色体易位干细胞及动物模型的方法

Info

Publication number: CN104726494B
Application number: CN201510075127.4A
Authority: CN
Inventors: 刘厚奇; 蒋俊锋; 应其龙; 王越; 张莉
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2035-02-12
Also published as: CN104726494A

Abstract

本发明涉及一种染色体易位干细胞模型及动物模型制备方法，主要通过CRISPR/Cas9技术诱导干细胞中特异位点染色体易位发生及细胞模型制备，以及进一步利用胚胎干细胞技术构建携带特异位点染色体易位的动物模型的方法。具体的，通过向干细胞中同时导入Cas9和针对两个目的染色体位点的gRNA，可以人工诱导特异位点的染色体易位，再经过筛选，可以得到携带该染色体易位的细胞模型。而携带该染色体易位的动物胚胎干细胞，还可以进一步通过嵌合体技术得到携带特异位点的染色体易位的动物模型。对于研究染色体易位，融合基因的功能，染色体相互作用的研究，以及药物的筛选评价，都有较大应用前景。

Description

CRISPR-Cas9技术构建染色体易位干细胞及动物模型的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及在干细胞中通过CRISPR-Cas9技术构建特异位点染色体易位，以及用干细胞构建特异位点染色体易位的动物模型的方法。

背景技术

染色体易位(Chromosome Translocation)，即染色体片段位置的改变，是最常见的染色体异常(参见文献:Braude,P.,Pickering,S.,Flinter,F.,and Ogilvie,C.M.(2002).Preimplantation genetic diagnosis.Nat Rev Genet 3,941-953)。其产生过程往往是不同染色体位点的DNA双链发生断裂(double-strand breaks，DSBs)，然后不同的染色体断端经由非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)机制修复，造成染色体片段位置的改变(参见文献:Roukos,V.,and Misteli,T.(2014).The biogenesis ofchromosome translocations.Nat Cell Biol 16,293-300.)。染色体易位可发生在不同的染色体之间，也可发生于同一染色体的不同位置，使得基因的位置发生改变，往往产生基因的突变和融合基因。

染色体易位事件可能发生在细胞减数分裂时期，使得生殖细胞携带易位染色体，进而传到后代个体的每个细胞，包括后代个体的生殖细胞，并可能进一步遗传下去。染色体易位事件也可能发生在细胞有丝分裂时期，使得个体的部分细胞携带易位染色体。

由于染色体易位发生的位置千差万别，因此对个体健康的影响也有很大的差异。很多携带平衡染色体易位的个体往往表现正常，但很多染色体易位也能导致疾病，比如不孕不育(参见文献:Fraccaro,M.,Maraschio,P.,Pasquali,F.,Tiepolo,L.,Zuffardi,O.,and Giarola,A.(1973).Male infertility and 13-14translocation.Lancet 1,488)，唐氏综合症(参见文献:Prasher,V.P.(1993).Presenile dementia associated withunbalanced Robertsonian translocation form of Down's syndrome.Lancet 342,686-687)，精神分裂症，以及多种肿瘤(参见文献:Bunting,S.F.,and Nussenzweig,A.(2013).End-joining,translocations and cancer.Nat Rev Cancer 13,443-454)。而且也由于染色体易位发生的位置千差万别，不断有新的染色体易位被发现，并伴有不同的临床症状(参见文献:Imataka,G.,Okuya,M.,Hirao,J.,and Arisaka,O.(2014).Terminal deletion6q syndrome with 11q partial trisomy mosaicism due to maternal balancedtranslocation.Genet Couns 25,63-67)。因此，对染色体易位的研究有重要的意义。然而，由于技术的限制，一直没有容易的方法建立染色体易位的细胞或者动物模型，用于染色体易位的研究以及药物的筛选等应用。

小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)是分离于小鼠胚胎囊胚期内细胞团的特殊干细胞，其明显的优势和独特的特点是可以分化为小鼠个体的一切细胞类型，并具有无限增殖并维持其多能性的能力。因此mESCs被广泛用于各种细胞模型的建立，也可以定向分化mESCs得到研究者感兴趣的细胞，比如某些难以分离，原代培养的细胞，尤其是要经过筛选得到基因修改或基因敲除的细胞，而该类型细胞又没有很好的分裂能力时，利用mESCs进行基因修改和筛选，再诱导其分化为该类型细胞就成了几乎唯一的选择。mESCs还被广泛用于各种基因敲除小鼠和基因修饰小鼠动物模型的建立(参见文献:Ben-David,U.,O.Kopper,and N.Benvenisty.(2012).Expanding the boundaries ofembryonic stem cells.Cell Stem Cell 10(6)，666-77)。如果我们能在胚胎干细胞中人工介导任意两染色体位点的染色体易位，那么上文中一直没有容易的方法建立染色体易位的细胞或者动物模型的问题就迎刃而解了。

CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)-CRISPR-associated endonuclease(Cas9))技术是近年出现的革命性的基因编辑技术。该技术可以快速，容易的实现对目标DNA序列在精确的位点进行编辑，包括突变，修改，插入等改变，使得生命的遗传密码可以按照人类的意愿改变。(参见文献:Hsu,P.D.,Lander,E.S.,and Zhang,F.(2014).Development and Applications of CRISPR-Cas9forGenome Engineering.Cell 157,1262-1278)。该技术主要是通过向细胞内导入引导核糖核酸(Single-guide RNA，gRNAs)和Cas9蛋白实现对目标DNA的切割。gRNA是一个经过特殊设计的向导RNA，可以识别并结合靶基因DNA序列；Cas9蛋白是一个酶，其带有一个核定位信号，以确保在哺乳动物细胞的核中表达；可以与gRNA以及其识别的DNA结合，将目的DNA序列切断，在设计的位置上精准的介导DNA序列的DSBs，再利用细胞DNA的损伤修复机制以及同源重组等机制，对DNA在断裂位点及附近进行突变，插入，替换等等修改，实现基因编辑的目的(参见文献:Mali,P.,Yang,L.,Esvelt,K.M.,Aach,J.,Guell,M.,DiCarlo,J.E.,Norville,J.E.,and Church,G.M.(2013).RNA-guided human genome engineering viaCas9.Science 339,823-826)。

中国专利申请CN201310625372.9，发明名称为“一种玉米基因组定点改造方法”，公开号为CN 103667338A，公开了一种玉米基因组定点改造方法，是使玉米组织中含有向导RNA和Cas9核酸酶，然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，目的基因上的双链靶标片段被剪切，再通过玉米细胞的自身DNA修复功能，最终实现玉米目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失。

中国专利申请CN 201410438927.3，发明名称为“白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法”，公开号为CN 104263754A，公开了一种白化病模型猪的重构卵的构建方法，是通过CRISPR/Cas9技术将gRNA和Cas9的表达载体转染微型猪胎儿成纤维细胞，筛选出酪氨酸酶基因敲除的阳性克隆细胞，再将阳性克隆细胞注入母猪的去核卵母细胞中，形成重构卵，获得TYR基因敲除猪具有典型白化特征。

目前国内外尚无有关CRISPR-Cas9技术用于在干细胞中人工介导染色体易位的相关文献报道，也无报道用CRISPR-Cas9技术获得携带人工介导染色体易位的干细胞进一步产生染色体易位动物模型的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在干细胞中通过CRISPR/Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，本发明的另一目的是利用胚胎干细胞技术和CRISPR/Cas9技术构建携带特异位点的染色体易位的动物模型的方法，本发明的第三目的是提供所述方法在构建特异位点染色体易位干细胞模型及动物模型中的应用。

申请人设想，既然CRISPR-Cas9技术可以介导特异DNA序列的DSBs，而染色体易位也是因为不同染色体位点的DSBs触发的，那么是否可以利用CRISPR-Cas9技术在干细胞(特别是胚胎干细胞)中对不同染色体位点进行位点特异的切割，从而按照人们的意愿，人工介导任意两染色体位点的染色体易位，从而得到各种类型的染色体易位细胞模型，以及用该携带染色体易位的动物的干细胞制作携带染色体易位的动物模型？

本发明首次在干细胞中用CRISPR-Cas9技术产生染色体易位，以及用这样的干细胞构建动物模型。

本发明的第一方面，提供一种在干细胞中通过CRISPR/Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，包括如下步骤：

A、确定想要诱导的染色体易位的两个染色体位点，标记为chr-site1、chr-site2；根据目标染色体位点(chr-site1、chr-site2)分别设计gRNA的识别序列，标记为gRNA-1、gRNA-2；

B、构建表达gRNA-1、gRNA-2的表达载体；

C、将步骤B得到的表达gRNA-1、gRNA-2的表达载体，以及含Cas9基因的表达载体共转染目标干细胞。

本发明的方法还进一步包括：

D、根据目标染色体位点(chr-site1、chr-site2)设计检测引物，其中一个引物位于chr-site1附近，标记为P1，另一个引物位于chr-site2附近，标记为P2，鉴定染色体易位是否成功；

E、克隆化携带目标染色体易位的干细胞系。

本发明所述的目标干细胞，具体为：跟据需要确定想要携带特异位点染色体易位的干细胞类型、种属，可以是胚胎干细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、肿瘤干细胞等等。如果需要获得携带某染色体易位的干细胞模型(细胞模型)，可以选择各种种属的干细胞，包括人的干细胞，如果还需要进一步获得携带染色体易位的动物模型，则可以选择动物的胚胎干细胞，诱导多能干细胞。选择好干细胞类型后，可通过商业途径，或根据文献报道方法自己分离培养获得该目标干细胞。

在本发明的一个优选实例中，本发明所述的目标干细胞为小鼠的胚胎干细胞(mESCs)，按照文献报道方法分离培养mESCs,其具体方法可以参考：Czechanski,A.,etal.,Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells frompermissive and nonpermissive strains.Nat Protoc,2014.9(3):p.559-74.

当转染的目标干细胞为小鼠的胚胎干细胞(mESCs)，其转染前较优的培养方法为：在0.1％明胶包被的培养皿或培养板中，其培养基为mES培养基，并置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；所述的mES培养基为含有1％非必要氨基酸(Invitrogen),10％胎牛血清(HyClone),0.1mMβ-巯基乙醇(Invitrogen),2mM GlutaMax(Invitrogen),以及100单位/ml白血病抑制因子的GMEM培养基(Sigma,G5414)。

所述的步骤A中，所述的两个染色体位点chr-site1、chr-site2可以在不同的染色体上，这样可以诱导得到位点特异的染色体间易位，也可以在相同的染色体上，这样可以诱导得到位点特异的染色体内易位。

根据目标位置分别设计gRNA的识别序列，记为gRNA-1，gRNA-2。其所识别的染色体位点上满足(N)₁₉NGG的序列模式的，N为A、T、C或G，下标19表示N的个数；具体设计方法可参考以下网址：(http://www.addgene.org/static/cms/files/hCRISPR_gRNA_Synthesis.pdf)。

根据目标染色体易位设计检测引物，其中一个引物位于chr-site1附近，记为P1，另一个引物位于chr-site2附近，记为P2，设计引物所扩增的序列应跨越新形成的易位染色体的易位位点，其余参照一般引物设计原则。

在本发明的一个优选实例中，确定小鼠7号染色体上的GSK3a基因所在位点为chr-site1，小鼠5号染色体上的CDX2基因所在位点为chr-site2。

gRNA-1的设计识别位点为：GATTGGTAATGGCTCATT(SEQ ID NO：1)

gRNA-2的设计识别位点为：GTGAGCTACCTTCTGGACA(SEQ ID NO：2)

所设计的染色体易位检测引物其序列为：

P1:CAAATCGTGTTTCTGGGGGT(SEQ ID NO：3)

P2:CTGAGGAAATGCCCAGTAAA(SEQ ID NO：4)

所述的步骤B中，表达载体可以是DNA、质粒、病毒、RNA；所述的病毒可以是慢病毒、腺病毒等。

在本发明的一个优选实例中，将gRNA-1，构建到载体PLKO-bsd中；将gRNA-2，构建到载体PLKO-puro中具体步骤参见Addgene网站：(http://www.addgene.org/static/cms/files/hCRISPR_gRNA_Synthesis.pdf)，经测序正确后，两表达载体备用。

所述的步骤C中，含Cas9基因的表达载体可以购自商业公司，或者参考文献的方法制备得到：Cong,L.,et al.,Multiplex genome engineering using CRISPR/Cassystems.Science,2013.339(6121):p.819-23.

所述的步骤C中，将gRNA-1表达载体、gRNA-2表达载体，以及含Cas9基因的表达载体共转染目标干细胞，转染方法可参考文献Wang,H.,et al.,One-step generation ofmice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genomeengineering.Cell,2013.153(4):p.910-8.，继续培养3-5天。

在本发明的一个优选实例中，Cas9表达载体购自Addgene(Plasmid ID号：41815)，利用Lipofectamine2000试剂(美国Invitrogene公司),将Cas9表达载体，gRNA-1，gRNA-2表达载体共转染小鼠的胚胎干细胞(mESCs)。

所述的步骤D中，鉴定染色体易位是否成功，具体步骤如下：

c)PCR鉴定特异位点的染色体易位

消化转染后的细胞，取出部分细胞继续培养，剩下部分细胞用于基因组DNA抽提，并用P1、P2引物，通过PCR的方法检测是否已经存在设计的染色体易位。如果没有，继续摸索条件，如果检测到设计的染色体易位，则说明成功利用该方法诱导了染色体易位，转染后的细胞群体中，存在携带该染色体易位的细胞。

在本发明的一个优选实例中，转染4天后的mESCs经胰酶消化。一半细胞继续培养，另一半细胞用于基因组DNA抽提，具体为利用基因组DNA抽提试剂盒(Qiagen公司)，按照说明书步骤抽提，并用针对该优选实例的P1,P2引物，通过PCR和测序的方法检测到5号染色体与7号染色体在设计位点的染色体易位(图1)。

d)Chromosome Painting的方法鉴定特异位点的染色体易位

转染后的细胞，加入秋水仙碱处理2小时。按照Chromosome Painting试剂盒(美国Applied Spectral Imaging公司)步骤处理细胞，滴片，原位杂交，并用荧光显微镜镜检。

在本发明的一个优选实例中，针对小鼠5号染色体的Chromosome Painting探针试剂盒(红色荧光标记)以及针对小鼠7号染色体的Chromosome Painting探针试剂盒(绿色荧光标记)购自美国Applied Spectral Imaging公司。PCR鉴定后的mESCs加入秋水仙碱处理2小时。按照Chromosome Painting试剂盒说明书步骤处理细胞，滴片，原位杂交，并用荧光显微镜镜检。结果发现有的mESCs细胞的一条7号染色体的部分跟一条5号染色体的部分连接在了一起，证明在小鼠胚胎干细胞中确实发生了7号染色体与5号染色体的易位(图2)。

所述的步骤E中，克隆化携带目标染色体易位的干细胞系，具体步骤如下：

PCR鉴定存在携带设计染色体易位后，说明还在培养的另一半干细胞中也很可能存在携带设计染色体易位的干细胞。因此，将培养的另一半细胞消化为单细胞悬液，有限稀释法将80个细胞种于96孔板中，镜检标出每孔只有一个细胞的培养孔，继续培养，等细胞长满，消化单克隆细胞，一半细胞每孔细胞对应传至96孔板，另一半细胞标记好在培养孔中所在位置，提基因组DNA，用P1,P2做PCR鉴定。染色体易位阳性的孔所对应的细胞即为克隆化的携带目标染色体易位的干细胞系。其特征是每个细胞都携带目标染色体易位。如此，成功得到携带特异位点染色体易位的干细胞，为该染色体易位的研究，药物的筛选，以及染色体相互作用的研究等等用途提供该干细胞模型。

在本发明的一个优选实例中，检测到5号染色体与7号染色体在设计位点染色体易位的mESCs细胞经单克隆化后，得到三个细胞克隆，存在该染色体易位分别命名为mESCs-T(5:7)-1，mESCs-T(5:7)-2，mESCs-T(5:7)-3(图3)。

本发明的第二方面，提供了一种利用胚胎干细胞技术和CRISPR/Cas9技术构建携带特异位点的染色体易位的动物模型的方法，所述的构建方法包括如下步骤：

步骤一：确定携带特异位点的染色体易位的动物模型的动物类型，选定胚胎干细胞的种属类型；所述的胚胎干细胞应来源该动物类型；

步骤二：按照本发明的第一方面所提供的方法，建立携带特异位点的染色体易位的胚胎干细胞系，并标记；应包括本发明的第一方面所提供的方法之步骤A至E；

步骤三：将携带特异位点的染色体易位的胚胎干细胞注入所选动物发育囊胚期囊胚(例如所选动物为小鼠，E3.5天为囊胚期，就选择在E3.5天注射)，并移植到代孕动物的子宫，等待嵌合体动物出生，鉴定染色体易位。

该嵌合体动物中部分细胞来源于染色体易位的胚胎干细胞，因此该动物即可作为部分细胞携带特异位点的染色体易位的动物模型。

进一步地，本发明构建动物模型的方法还包括步骤四：携带特异位点的染色体易位的嵌合体动物与正常动物杂交，得到杂合子动物，即得到每个细胞都携带特异位点的染色体易位的动物模型。如有需要，还可以将杂合子自交，得到纯合的携带染色体易位的动物模型。

所述的步骤一中，动物类型可以是哺乳动物，如小鼠，大鼠，猪等，也可以是其他类型的动物。

所述的步骤二中，胚胎干细胞可以分离于动物胚胎组织的具有多能性的干细胞，也可以是其他类似胚胎干细胞的细胞，如诱导多能干细胞，上胚层干细胞，胚胎生殖嵴干细胞等。

在本发明的一个实施例中，所述步骤一，具体为：确定构建携带特异位点染色体易位小鼠模型，选定小鼠胚胎干细胞(mESCs)为后续实验的工具干细胞。

在本发明的一个实施例中，所述步骤二，具体为：

c)按照本发明的第一方面所提供的方法得到干细胞系mESCs-T(5:7)-1，携带小鼠7号染色体与5号染色体的易位。

d)培养mESCs-T(5:7)-1至60％，感染GFP-puro慢病毒，加嘌呤霉素筛选得到GFP稳定表达细胞，命名为mESCs-T(5:7)-1-GFP。

在本发明的一个实施例中，所述步骤三，具体为：

1.消化mESCs-T(5:7)-1-GFP细胞，用显微注射方法将该细胞注入E3.5天的小鼠囊胚中，并将胚胎移植到代孕小鼠子宫，待嵌合体胚胎发育到E13.5天，将代孕小鼠处死，取出胚胎，荧光显微镜下镜检。结果发现胚胎中出现GFP阳性的组织如图4。说明mESCs-T(5:7)-1-GFP细胞可以参与胚胎发育，产生嵌合体小鼠胚胎。

2.取出嵌合体胚胎部分组织，用于基因组DNA抽提，并用针对这一优选实例所设计的P1,P2引物，通过PCR和测序的方法检测到该嵌合体组织中存在5号染色体和7号染色体的易位如图5。说明成功构建部分细胞中携带特异位点染色体易位的小鼠嵌合体模型。熟悉本领域的技术人员知道，得到了染色体易位的嵌合体小鼠，再通过与正常小鼠杂交，可得到杂合子小鼠，即得到每个细胞都携带特异位点的染色体易位的小鼠模型。如有需要，还可以将杂合子自交，得到纯合的携带染色体易位的小鼠模型。

本发明的第三方面，提供所述第一方面和第二方面所述方法所构建的特异位点染色体易位干细胞模型及动物模型在染色体易位的研究，融合基因的研究，染色体相互作用的研究，动物育种，以及药物的筛选、评价中的应用。

例如：可构建识别人21号染色体和14号染色体特异位点的gRNA，采用本方法第一方面，构建T(14:21)干细胞模型来研究唐氏综合症，构建识别人22号染色体和9号染色体特异位点的gRNA，构建T(9:22)干细胞模型来研究白血病，构建识别小鼠2号染色体和10号染色体的特异位点的gRNA，构建T(2:10)小鼠模型，或构建T(9:22)黑猩猩模型来研究白血病，以及其治疗药物的筛选和治疗效果的评价等。

附图说明

图1为在小鼠胚胎干细胞中成功诱导5号染色体与7号染色体易位的PCR及测序鉴定结果；其中A:利用针对5号染色体与7号染色体的引物P1,P2做PCR鉴定的结果。由于正常情况下P1,P2所能结合的DNA模板位于不同的染色体，因此在对照mESCs细胞中不能扩增出任何条带，只有发生5号染色体与7号染色体在设计位点易位，才能扩增出条带，图中可见当向mESCs中导入Cas9和两个gRNA后，可以可以扩增出条带，且条带大小同预期一致；B:将PCR产物回收测序后的结果，可见所测序列有一半与小鼠5号染色体上设计位置完全一致，一半与小鼠7号染色体上设计位置完全一致，说明染色体易位发生的位点精确位于设计位点。

图2为在小鼠胚胎干细胞中成功诱导5号染色体与7号染色体易位的ChromosomePainting鉴定结果；Chromosome Painting技术可以将整条染色体标上荧光；图中小鼠5号染色体被标上红色荧光，小鼠7号染色体被标上绿色荧光；其中A：对照组小鼠胚胎干细胞染色体Chromosome Painting结果。可见小鼠5号染色体和7号染色体独立分开存在；B：导入Cas9和两条设计gRNA后的小鼠胚胎干细胞染色体Chromosome Painting结果。可见一条小鼠5号染色体的大部分与7号染色体的大部分相连而成一条较大的易位染色体。

图3为经单克隆化后，从每个克隆中分别提取DNA并用P1,P2检测5号染色体与7号染色体易位的结果；图中标记“+”的组是单克隆化前的携带染色体易位的mESCs细胞组，作为阳性对照，可见三个mESCs克隆携带5号染色体与7号染色体易位；分别命名为mESCs-T(5:7)-1，mESCs-T(5:7)-2，mESCs-T(5:7)-3。

图4为携带5号染色体与7号染色体易位的嵌合体小鼠胚胎荧光镜检结果；嵌合体小鼠胚胎来源于在E3.5天时注射了mESCs细胞后的小鼠囊胚；该mESCs携带5号染色体与7号染色体易位，并稳定表达GFP；其中A：注射了mESCs细胞后的E13.5天的小鼠胚胎，小图中显示的是刚显微注射后E3.5天的小鼠囊胚；B：明视野下的注射过mESCs的小鼠E13.5天的小鼠胚胎组织；C:绿色荧光视野下的注射过mESCs的小鼠E13.5天的小鼠胚胎组织；图中可见一块组织显示GFP阳性；说明携带5号染色体与7号染色体易位的mESCs参与胚胎的发育，所见的胚胎为嵌合体胚胎；D：明视野及绿色荧光视野merge后的结果。

图5为嵌合体小鼠胚胎组织5号染色体与7号染色体易位的PCR及测序鉴定结果；其中A:利用针对5号染色体与7号染色体的引物P1,P2做PCR鉴定的结果；图中可见嵌合体小鼠胚胎组织中抽提的DNA可以扩增出条带，且条带大小同预期一致；B:将PCR产物回收测序后的结果，可见所测序列与携带染色体易位的mESCs中所测结果一致；说明嵌合体小鼠胚胎携带5号染色体与7号染色体易位，且易位发生在设计位点。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：小鼠胚胎干细胞(mESCs)的分离、培养与传代。

按照文献报道方法从分离小鼠胚胎干细胞，其具体方法可以参考：Czechanski,A.,et al.,Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells frompermissive and nonpermissive strains.Nat Protoc,2014.9(3):p.559-74.小鼠胚胎干细胞分离后，按如下方法培养：

在0.1％明胶包被的培养皿或培养板中，其培养基为mES培养基，并置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；所述的mES培养基为含有1％非必要氨基酸(Invitrogen),10％胎牛血清(HyClone),0.1mMβ-巯基乙醇(Invitrogen),2mM GlutaMax(Invitrogen),以及100单位/ml白血病抑制因子的GMEM培养基(Sigma,G5414)。

培养的mESCs克隆与克隆间将要融合时，需要传代，一般2-3天传代一次，其具体的方法为：

1.去除培养基，并用PBS(不含钙镁)细一遍；

2.加入胰酶EDTA(Gibco)覆盖细胞克隆。37℃消化5分钟。

3.加入含血清的mES培养基，轻柔吹打是细胞与细胞间充分解离。

4.将细胞悬液转入离心管，1300转离心3分钟；

5.弃上清，用mES培养基重悬细胞，并细胞计数；

6.将接种于明胶包被的细胞培养皿中，接种密度根据实验需求，置于细胞培养箱培养。

实施例2：设计并构建针对小鼠7号染色体与5号染色体的gRNA表达载体。

本实施例以在胚胎干细胞中构建小鼠7号染色体与5号染色体易位为目标。

设计的7号染色体易位位点位于GSK3a基因所在位点上，具体为：chr7:25235652-25235624，其位点序列为：25235652-GATTGGTAATGGCTCATTCGG-25235632，其gRNA的设计识别位点为：GATTGGTAATGGCTCATT(SEQ ID NO：1)

设计的5号染色体易位位点位于CDX2基因所在位点上，具体为：chr5：

147306976-147306947，其位点序列为：147306976-GTGAGCTACCTTCTGGACAAGG-147306955，其gRNA的设计识别位点为：GTGAGCTACCTTCTGGACA(SEQ ID NO：2)

设计完成后，委托DNA合成公司，分别按序列5合成针对7号染色体的gRNA-1的表达DNA序列，按序列6合成针对5号染色体的gRNA-2的表达DNA序列，序列包括上游的U6启动子元件，识别序列，向导RNA骨架序列，以及转录终止信号序列元件。所述的方法参见Addgene网站：(http://www.addgene.org/static/cms/files/hCRISPR_gRNA_Synthesis.pdf)。包括完整gRNA表达元件的DNA合成好后，然后按照常规分子克隆实验步骤将gRNA-1，构建到载体PLKO-bsd中，将gRNA-2，构建到载体PLKO-puro中。测序正确后，两表达载体备用。

实施例3：通过CRISPR/Cas9技术在小鼠胚胎干细胞中诱导7号染色体与5号染色体特异位点易位。

一、细胞培养及转染

小鼠胚胎干细胞(mESCs)分两组，一组实验组，另一组为对照组，培养于mES培养基中，置于37℃，5％二氧化碳培养箱静置培养。当两组细胞密度达到约50％，利用Lipofectamine2000试剂(美国Invitrogene公司)，按照转染试剂说明书的步骤和试剂比例，分别转染。其中实验组转染gRNA-1，gRNA-2表达载体，和Cas9表达载体(购自AddgenePlasmid ID号：41815)，对照组只转染Cas9表达载体。

二、染色体特异位点易位鉴定

(1)PCR鉴定特异位点的染色体易位

根据设计的gRNA识别位点，如果成功诱导7号染色体与5号染色体在设计的位点发生染色体易位，那么7号染色体的chr7:25235632位点以前的序列就和5号染色体的chr5：147306976之后的序列就连在了一起。因此，我们分别在chr7:25235632位点以前的1000bp范围内设计一条引物P1，在chr5：147306976之后的1000bp范围内设计一条引物P2，经Primer premier 5.0软件分析后，确定P1，P2的序列如下：

P1:CAAATCGTGTTTCTGGGGGT(SEQ ID NO：3)

P2:CTGAGGAAATGCCCAGTAAA(SEQ ID NO：4)

转染4天后，胰酶消化两组mESCs细胞。每组细胞一半继续培养，另一半细胞用于基因组DNA抽提。DNA抽提采用美国Qiagen公司的基因组DNA抽提试剂盒，按照说明书步骤实施。

然后分别以两组细胞基因组DNA为模板，P1,P2为引物，进行PCR反应，按如下反应体系加样：

经过预实验后，最终确定以下条件：

PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图1A所示，可见对照mESCs细胞的DNA不能扩增出任何条带，而实验组扩增出条带，且条带大小同预期一致。由于两天引物分别位于不同的染色体上，只有发生5号染色体与7号染色体在设计位点易位，才能扩增出条带，因此结果说明按照本发明的方法在小鼠胚胎干细胞中成功诱导了特异位点的染色体易位。

此外，在本实施例中，实验组中PCR所扩增出的条带进一步切胶回收后送测序公司测序，测序引物为P2，其测序结果显示如图1B，可见所测序列有一半与小鼠5号染色体上设计位置完全一致，且位于5号染色体的chr5：147306976之后，一半与小鼠7号染色体上设计位置完全一致，且位于7号染色体的chr7:25235632位点以前，说明染色体易位发生的位点精确位于设计位点。

(2)Chromosome Painting的方法鉴定特异位点的染色体易位

针对小鼠5号染色体的Chromosome Painting探针试剂盒(红色荧光标记)以及针对小鼠7号染色体的Chromosome Painting探针试剂盒(绿色荧光标记)购自美国AppliedSpectral Imaging公司。两组细胞经PCR鉴定后，将部分mESCs细胞传入新的培养板，两组细胞都加入秋水仙碱(0.05ug/ml)处理2小时。按照Chromosome Painting试剂盒说明书步骤处理细胞，滴片，原位杂交，并用荧光显微镜镜检。结果发现对照组中小鼠5号染色体和7号染色体独立分开存在。实验组中可见有细胞的一条7号染色体的部分跟一条5号染色体的部分连接在了一起，证明在小鼠胚胎干细胞中确实发生了7号染色体与5号染色体的易位(图2)。

实施例4：克隆化携带7号染色体与5号染色体特异位点易位的小鼠胚胎干细胞。

经PCR和chromosome painting技术鉴定后，确定mESCs中存在携带7号染色体与5号染色体特异位点易位的细胞，但到此并没有得到每个细胞都携带该染色体易位的细胞系，因此需要进一步挑选出其中有染色体易位的细胞并建系。步骤如下：

1.将实验组mESCs细胞消化为单细胞悬液；

2.有限稀释法将80个细胞种于96孔板中，镜检标出每孔只有一个细胞的培养孔，继续培养；

3.等细胞长满，消化单克隆细胞，将细胞并分为两部分，一部分细胞按其所在培养孔位置对应传至96孔板，另一部分细胞标记好在培养孔中所在位置，抽提基因组DNA；

4.用P1,P2做PCR鉴定。结果得到三个细胞克隆，存在该染色体易位分别命名为mESCs-T(5:7)-1，mESCs-T(5:7)-2，mESCs-T(5:7)-3(图3)。染色体易位阳性的孔所对应的细胞即为克隆化的携带7号染色体与5号染色体特异位点易位的小鼠胚胎干细胞。该细胞即可用于该染色体易位研究的细胞模型，或用于相关疾病研究工具，药物开发与评价，染色体相互作用的研究等等。由于mESCs具有向个体所有细胞分化的能力，还可以将该细胞诱导到感兴趣的细胞类型，用于后续研究或其他应用。

实施例5：利用小鼠胚胎干细胞mESCs-T(5:7)-1构建携带7号染色体与5号染色体特异位点易位的小鼠模型

一、建立携带7号染色体与5号染色体特异位点易位的嵌合体小鼠

由于小鼠胚胎干细胞(mESCs)可以分化为小鼠个体的一切细胞类型，并具有无限增殖并维持其多能性的能力，因此被广泛用于各种基因敲除小鼠和基因修饰小鼠动物模型的建立，其具体步骤可以参见发明专利“Mitofilin基因敲除小鼠模型的制备方法及用途”其公开号为CN 102199572A。

因此，在获得mESCs-T(5:7)-1后，可以利用该胚胎干细胞制备携带7号染色体与5号染色体特异位点易位的小鼠模型。实施方法如下：

1.培养mESCs-T(5:7)-1至60％，感染GFP-puro慢病毒；

2.加嘌呤霉素筛选得到GFP稳定表达细胞，命名mESCs-T(5:7)-1-GFP；

3.用胰酶消化mESCs-T(5:7)-1-GFP细胞，得到mESCs-T(5:7)-1-GFP单细胞悬液；

4.用显微注射方法将该细胞注入E3.5天的小鼠囊胚中；

5.并将胚胎移植到代孕小鼠子宫；待嵌合体胚胎发育到E13.5天，将代孕小鼠处死，取出胚胎，荧光显微镜下镜检。

结果发现胚胎中出现GFP阳性的组织如图4。说明mESCs-T(5:7)-1-GFP细胞可以参与胚胎发育，产生嵌合体小鼠胚胎。

二、鉴定嵌合体小鼠胚胎携带7号染色体与5号染色体特异位点易位

采用类似鉴定细胞中7号染色体与5号染色体特异位点易位的方法，首先取出嵌合体胚胎部分组织，然后用基因组DNA抽提试剂盒(Qiagen公司)，按照说明书步骤抽提基因组DNA，并用引物P1,P2，通过PCR和测序的方法检测染色体易位，其中对照组为未经显微注射的囊胚发育来的小鼠胚胎。结果如图5，嵌合体小鼠胚胎组织中抽提的DNA可以扩增出条带，测序结果显示所测序列与携带染色体易位的mESCs中所测结果一致。说明嵌合体小鼠胚胎携带5号染色体与7号染色体易位，且易位发生在设计位点。

由此，通过本发明提供的方法，成功构建部分细胞中携带特异位点染色体易位的小鼠嵌合体模型。

熟悉本领域的技术人员知道，得到了染色体易位的嵌合体小鼠，再通过与正常小鼠杂交，可得到杂合子小鼠，即得到每个细胞都携带特异位点的染色体易位的小鼠模型。如有需要，还可以将杂合子自交，得到纯合的携带染色体易位的小鼠模型。由于染色体易位在人类有两种存在情况，可以存在于部分细胞，也可存在于个体的每个细胞,因此，无论是携带特异位点染色体易位的小鼠嵌合体模型，还是进一步可以得到的每个细胞都携带特异位点的染色体易位的小鼠模型都将有很大的应用前景，包括用于研究染色体易位，研究融合基因的功能，研究染色体相互作用，以及用于药物的筛选评价等都有较大应用前景。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种在小鼠的胚胎干细胞中通过CRISPR-Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A、确定小鼠7号染色体上的GSK3a基因所在位点为chr-site1，小鼠5号染色体上的CDX2基因所在位点为chr-site2；根据目标染色体位点chr-site1、chr-site2分别设计gRNA的识别序列，标记为gRNA-1、gRNA-2；

gRNA-1的设计识别位点为：GATTGGTAATGGCTCATT(SEQ ID NO：1)

gRNA-2的设计识别位点为：GTGAGCTACCTTCTGGACA(SEQ ID NO：2)

B、构建表达gRNA-1、gRNA-2的表达载体；

2.根据权利要求1所述的一种在小鼠的胚胎干细胞中通过CRISPR-Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，其特征在于，该方法在步骤C之后还包括：

D、根据目标染色体位点chr-site1、chr-site2设计检测引物，其中一个引物位于chr-site1附近，标记为P1，另一个引物位于chr-site2附近，标记为P2，鉴定染色体易位是否成功；

P1:CAAATCGTGTTTCTGGGGGT(SEQ ID NO：3)

P2:CTGAGGAAATGCCCAGTAAA(SEQ ID NO：4)

E、克隆化携带目标染色体易位的干细胞系。

3.根据权利要求1所述的一种在小鼠的胚胎干细胞中通过CRISPR-Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，其特征在于，转染小鼠的胚胎干细胞前，用以下方法培养：在0.1％明胶包被的培养皿或培养板中，其培养基为mES培养基，并置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养；所述的mES培养基为含有1％非必要氨基酸,10％胎牛血清,0.1mMβ-巯基乙醇,2mM GlutaMax,以及100单位/ml白血病抑制因子的GMEM培养基。

4.根据权利要求1或2所述的一种在小鼠的胚胎干细胞中通过CRISPR-Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，其特征在于，步骤B中，表达载体为DNA、质粒、病毒，或RNA。

5.根据权利要求1或2所述的一种在小鼠的胚胎干细胞中通过CRISPR-Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，其特征在于，步骤B中，将gRNA-1构建到载体PLKO-bsd中；将gRNA-2构建到载体PLKO-puro中。

6.根据权利要求2所述的一种在小鼠的胚胎干细胞中通过CRISPR-Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，其特征在于，步骤D中，鉴定染色体易位是否成功的方法如下：

a)PCR鉴定特异位点的染色体易位

消化转染后的细胞，取出部分细胞继续培养，剩下部分细胞用于基因组DNA抽提，并用P1、P2引物，通过PCR的方法检测是否已经存在设计的染色体易位；

b)Chromosome Painting的方法鉴定特异位点的染色体易位

转染后的细胞，加入秋水仙碱处理2小时，按照Chromosome Painting试剂盒步骤处理细胞，滴片，原位杂交，并用荧光显微镜镜检。

7.根据权利要求2所述的一种在小鼠的胚胎干细胞中通过CRISPR-Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，其特征在于，步骤E中，克隆化携带目标染色体易位的干细胞系的步骤如下：

PCR鉴定存在携带设计染色体易位后，将培养的另一半细胞消化为单细胞悬液，有限稀释法将80个细胞种于96孔板中，镜检标出每孔只有一个细胞的培养孔，继续培养，等细胞长满，消化单克隆细胞，一半细胞每孔细胞对应传至96孔板，另一半细胞标记好在培养孔中所在位置，提基因组DNA，用P1,P2做PCR鉴定；染色体易位阳性的孔所对应的细胞即为克隆化的携带目标染色体易位的干细胞系。

8.一种利用胚胎干细胞技术和CRISPR-Cas9技术构建携带特异位点的染色体易位的动物模型的方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：

步骤一：确定构建携带特异位点染色体易位小鼠模型，所述的胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞；

步骤二：按照如权利要求1至7任一项所述的一种在小鼠的胚胎干细胞中通过CRISPR-Cas9技术诱导特异位点的染色体易位的方法，建立携带特异位点的染色体易位的胚胎干细胞系，并标记；

步骤三：将携带特异位点的染色体易位的胚胎干细胞注入所选动物发育囊胚期囊胚，并移植到代孕动物的子宫，等待嵌合体动物出生，鉴定染色体易位。

9.根据权利要求8所述的一种利用胚胎干细胞技术和CRISPR-Cas9技术构建携带特异位点的染色体易位的动物模型的方法，其特征在于，所述的构建动物模型的方法还包括步骤四：携带特异位点的染色体易位的嵌合体动物与正常动物杂交，得到杂合子动物，即得到每个细胞都携带特异位点的染色体易位的动物模型；或者将杂合子自交，得到纯合的携带染色体易位的动物模型。