CN105950656A - 一种快速获得基因敲除细胞株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速获得基因敲除细胞株的方法，首先根据敲除目标基因设计sgRNA靶点，根据设计的靶序列合成多对单链寡核苷酸，每对分别两两退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经酶切，连入pX335载体中，分别获得sgRNA表达质粒载体；然后，将sgRNA表达质粒载体两两组合与敲除目标基因的SSA载体，共同转染培养细胞即可获得基因敲除细胞株。采用本发明方法可以快速高效的获得稳定的基因敲除细胞株。

Description

一种快速获得基因敲除细胞株的方法
技术领域
本发明涉及一种快速获得基因敲除细胞株的方法，具体是通过CRISPR/Cas9基因敲除法筛选出基因敲除的细胞株。
背景技术
基因敲除(knockout)技术是20世纪80年代发展起来的。是指一种遗传工程基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。
目前为止基因敲除的方法分三种:1.锌指核酸酶(ZFNs)；2.转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)；3.CRISPR-Cas9。锌指核酸酶ZFNs在植物基因组定点改造上的可能前景，但由于ZFNs的合成组装技术难度大，一般实验室难以实施，而且ZFNs易于对基因组进行非特异性切割，或对靶点DNA切割效率低，一直限制其进入实际应用。相比于传统的锌指核酸酶(ZFNs)技术，TALENs具有独特的优势：设计更简单，特异性更高。但具有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司。而CRISPR-Cas9系统对特异位点的识别靠小的crRNA的引导，CRISPR区可以有一系列的crRNA组成，每个针对特异位点的crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于ZFN和TALEN载体，更加容易构建。
CRISPR-Cas92013年1月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9出现，它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。CRISPR(Clusteredregularly interspaced short palindromicrepeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由RNA介导的可遗传的获得性免疫系统，这种免疫系统为宿主细胞提供了对外源DNA(如噬菌体质粒)的免疫功能。
此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(short guideRNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。
操作步骤如下：第一步:据靶序列设计RNA序列；第二步:根据自身需要选择sgRNA表达载体构建，或sgRNA体外转录合成；第三步:选择CRISPR/Cas9载体；第四步：sgRNA活性检测；第五步：稳定表达Cas9蛋白细胞株筛选。
CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于它的两位前辈ZFN系统和TALEN系统，它有着一些无可比拟的优点。首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。其次，CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性，例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成。
发明内容
本发明目的是提供一种快速获得基因敲除细胞株的方法，可以快速获得高效的CRISPR/Cas9系统，进而通过转染实验结合96孔板筛选获得基因敲除细胞株。
为此，本发明采用的技术方案是，一种快速获得基因敲除细胞株的方法，首先根据敲除目标基因设计sgRNA靶点，根据设计的靶序列合成多对单链寡核苷酸，每对分别两两退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经酶切，连入pX335载体中，分别获得sgRNA表达质粒载体；然后，将sgRNA表达质粒载体两两组合与敲除目标基因的SSA载体，共同转染预先培养好的细胞，即可获得基因敲除细胞株。
所述敲除目标基因的SSA载体构建时，将目标片段与含有双荧光素酶报告基因的SSA-载体骨架连接获得SSA-目标基因载体。
获得基因敲除细胞株后，通过双荧光素酶报告基因进行敲除效率检测；选取敲除效率较高的质粒组合转染细胞，筛选细胞单克隆，测序，在靶基因特定区域发生序列突变的单克隆细胞即可判断为基因成功敲除的细胞。
以采用本发明方法获得绵羊DKK2基因敲除细胞株为例，具体步骤如下，
(1)根据绵羊DKK2基因的第一外显子的编码区设计sgRNA靶点，正向靶标T1序列如SEQ ID No.1所示，反向靶标T2序列如SEQ ID No.2所示；
(2)根据步骤(1)设计的靶序列合成单链寡核苷酸T1-F、T1-R、T2-F、T2-R、T3-F、T3-R、T4-F、T4-R、T5-F、T5-R，序列分别如SEQ ID No.3-12所示；T1-F与T1-R，T2-F与T2-R，T3-F与T3-RT4-F与T4-R，T5-F与T5-R分别两两退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经酶切，连入pX335载体中，分别获得pX335-sgRNA-F1、pX335-sgRNA-R2、pX335-sgRNA-F3、pX335-sgRNA-F4、pX335-sgRNA-R5载体；
(3)SSA载体的构建
①引物设计
根据绵羊DKK2基因组序列设计引物并在引物5’端分别添加AscI和SalI酶切位点，获得两对引物SSAF1、SSAR1、SSAF2、SSAR2序列分别如SEQ IDNo.13-16所示；
②PCR及TA克隆
提取绵羊基因组DNA，以此为模板用步骤①的两对引物进行PCR扩增，分别获得450bp、530bp的片段，与T载体连接并测序，选取无突变的质粒用于后续酶切试验；
③用AscI和SalI酶切步骤②所得质粒及序列如SEQ ID No.19所示的SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN质粒，将回收的450bp或530bp的片段和SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN的载体骨架连接，获得SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体，序列如SEQ ID No.20所示；
(4)将上述获得的pX335-sgRNA-F1载体、pX335-sgRNA-R2载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体，作为一个实验组；将pX335-sgRNA-F3载体、pX335-sgRNA-R2载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体为一个实验组；pX335-sgRNA-F4载体、pX335-sgRNA-R5载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体为一个实验组；以pX335载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体组合作为阴性对照组，各组分别转染预先培养好的细胞，即可获得DKK2基因敲除细胞株。
最后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行敲除效率检测。选取敲除效率较高的一对质粒转染细胞，使用96孔板筛选细胞单克隆。将获得的细胞单克隆扩大培养，提取基因组DNA，PCR，克隆测序。在靶基因特定区域发生序列突变的单克隆细胞即可判断为DKK2基因成功敲除的细胞。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明方法适用范围广泛，采用本发明方法可以获得稳定的基因敲除细胞株。不仅仅是可以快速获得DKK2基因敲除细胞株，也可以适用于其它的基因敲除细胞株的获得。
(2)本发明方法通过设计多对引物，构建多组pX335-sgRNA载体，分布在目的基因的不同位置，根据序列特点采用载体两两配对组合方式，分别转染细胞，可快速筛选出效率高的一对。
(3)本发明采用SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN质粒，该质粒改造自MSTN质粒，带有AscI和SalI酶切位点，内部含有一个萤火虫荧光素酶表达基因和一个被目的基因隔断的不表达的海肾荧光素酶表达基因，对目的基因进行有效的切割之后，海肾荧光素酶表达基因发生重组使得海肾荧光素酶高效表达，通过表达量即可鉴定敲除的效率。可以直接在细胞体内进行敲除效率的验证。极大提高工作效率。
附图说明
图1为本发明实施例1设计sgRNA靶标设计图。
图2为本发明实施例1构建的sgRNA表达载体电泳图。
图3为本发明实施例1构建的sgRNA表达载体测序序列对比图。
图4为本发明实施例1采取敖汉细毛羊全血基因组DNA，PCR获得450bp、530bp片段电泳图。
图5为图4中的450bp片段测序结果。
图6为本发明实施例1SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体AscI和SalI酶切结果。
图7为将450bp片段进行切胶回收然后与通过AscI和SalI酶切并切胶回收的MSTN载体进行T4DNA连接酶连接并测序验证SSA载体构建情况，并且对链接完成的载体进行酶切。
图8为本发明实施例1敖汉细毛羊羊胎儿成纤维细胞原代培养3d和5d后的细胞形态。
图9为本发明实施例1敖汉细毛羊羊胎儿成纤维细胞传代培养后胰酶消化后细胞形态和传代后3～5d细胞形态。
图10为本发明实施例1敖汉细毛羊羊胎儿成纤维细胞转染前细胞形态。
图11、图12为本发明实施例2双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行敲除基因效率检测结果。注：相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异极显著(p<0.05)，相同字母大小写之间表示差异显著(p<0.01)。基因检测结果相同处理组间比较，不同处理组间不进行比较。
图13-15为本发明本发明实施例3获得的DKK2基因敲除细胞株的突变位点。
具体实施方式
下面结合具体试验方法对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面以获得敖汉细毛羊成纤维细胞DKK2基因敲除细胞株为例，对本发明方法做进一步详细说明：
实施例1.获得DKK2基因敲除细胞株
(1)靶标设计
首先在NCBI GI:417531944的序列中提取绵羊DKK2基因第一外显子的编码区设计sgRNA靶点，正向靶序列是GCTCACAGTTCGGCAGCTCG(74-93)(SEQ ID No.1)、反相靶序列是GCTCTCCACCATCAGCACCG(56-75)(SEQ ID No.2)。两个靶序列呈“头对头”的排布方式，二者相距-2bp，即有2bp的重叠。分别命名为正向靶标T1、反向靶标T2。靶标设计如图1所示。
(2)sgRNA表达质粒对的构建
根据步骤(1)设计的靶序列送公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：
T1-F：CACCGCTCACAGTTCGGCAGCTCG(SEQ ID No.3)
T1-R：AAACCGAGCTGCCGAACTGTGAGC(SEQ ID No.4)
T2-F：CACCGCTCTCCACCATCAGCACCG(SEQ ID No.5)
T2-R：AAACCGGTGCTGATGGTGGAGAGC(SEQ ID No.6)
T3-F：CACCGCAACTCCATCAAGTCCTCTC(SEQ ID No.7)
T3-R：AAACGAGAGGACTTGATGGAGTTGC(SEQ ID No.8)
T4-F：CACCGTACCAAGGACTGGCTTTCGG(SEQ ID No.9)
T4-R：AAACCCGAAAGCCAGTCCTTGGTAC(SEQ ID No.10)
T5-F：CACCGCCGCAGATCGATTGGCGCCC(SEQ ID No.11)
T5-R：AAACGGGCGCCAATCGATCTGCGGC(SEQ ID No.12)
其中T1-F与T1-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段T1，经BbsⅠ酶切，连入pX335载体中，获得pX335-sgRNA-F1载体；T2-F与T2-R退火获得带粘性末端的双链DNA片段T2，经BbsⅠ酶切，连入pX335载体中，获得pX335-sgRNA-R2载体。T3-F与T3-R、T4-F与T4-R、T5-F与T5-R分别两两退火获得带粘性末端的双链DNA片段T3、T4、T5，经BbsⅠ酶切，连入pX335载体中，获得pX335-sgRNA-F3、pX335-sgRNA-F4、pX335-sgRNA-R5载体。质粒均送公司测序验证，测序引物bbsR的序列为：5'AAAGTCCCTATTGGCGTTAC 3'(SEQ ID No.17)。
构建结果：
T1、T2、T3、T4、T5的五个片段长度分别为24bp、24bp、25bp、25bp、25bp。将五个靶序列和通过BbsI酶切的px335质粒进行T4DNA连接酶连接转化感受态细胞后测序结果与原序列对比一致。构建的载体电泳结果如图2所示，测序序列对比结果如图3所示。
(3)SSA载体构建设计引物设计
选取绵羊DKK2基因组序列(NCBI GI:417531944)的一段(601bp，18259800-18260400)(SEQ ID No.18)，使用Primer-BLAST软件设计引物。引物设计如下：
在上述引物5’端分别添加AscI和SalI酶切位点，得：
SSAF1：GGCGCGCCAGACTGAGTTCACACGGTGC(SEQ ID No.13)
SSAR1：GTCGACCGGGTCCCTACCTCTTCTGG(SEQ ID No.14)
SSAF2：GGCGCGCCCTGAGTTCACACGGTGCTGG(SEQ ID No.15)
SSAR2：GTCGACGGAACCCCTCCCCAGCTAT(SEQ ID No.16)
上述引物送生物公司合成。
(4)PCR及TA克隆
采取敖汉细毛羊全血，提取基因组DNA，以此为模板进行PCR扩增，使用上述步骤(3)设计合成的引物对，分别获得450bp、530bp左右的片段(如图4所示)。将PCR扩增所得到的450bp片段与T载体通过T4DNA连接酶连接并转化感受态细胞，做菌液PCR鉴定连接结果并送往公司测序：菌液PCR结果与原基因PCR结果一致，证明链接转化感受态细胞成功，测序结果如图5所示。选取无突变的质粒用于后续酶切试验。
(5)SSA载体构建
使用AscI和SalI酶切上述步骤(4)所得质粒及SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN质粒，将回收的450bp或530bp左右的片段及SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN的载体骨架(6.5kb)连接，获得SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体。
AscI和SalI酶切TA克隆载体结果如图6所示。将450bp片段进行切胶回收然后与通过AscI和SalI酶切并切胶回收的MSTN载体进行T4DNA连接酶连接并测序验证SSA载体构建情况，并且对链接完成的载体进行酶切，结果如图7所示。
(6)成纤维细胞的培养
原代培养从试验羊场将怀孕40天的母羊取子宫立刻带回实验室进行细胞分离(实验前照射紫外30min)。用灭过菌的眼科剪、眼科镊子将胎儿外的组织清理掉，用含有双抗的PBS将胎儿清洗几遍，并转移到新的培养皿中。取新的眼科剪、眼科镊子，剥离胎儿，去除头、尾巴、四肢、内脏及躯干部皮肤，仅保留躯干部皮下组织放入干净培养皿中，用含双抗的PBS清洗几遍，直至漂液洗清亮透明为止，移至5mL离心管中，用眼科剪将其剪成0.5～1.0mm3大小的组织块加入37.0℃预热的0.25％胰蛋白酶混匀后放入新的培养皿中并于CO2培养箱(37.5℃，5.0％CO2)培养8min，加入3～5mL的工作液(DMEM/HIGH GLUCOSE80％+20FBS+1％双抗)终止消化，用10mL注射器吸、吹打，并平分到2个100mm的培养皿中，加入10mL工作液(DMEM/HIGH GLUCOSE80％+20FBS+1％双抗)置于CO2培养箱中进行培养，第二天换液时先用DPBS冲洗掉组织块和死细胞，再加入新鲜的培养液(DMEM/HIGH GLUCOSE80％+20FBS+1％双抗)继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，待细胞长满皿底90％左右开始传代。
传代培养观察培养皿中细胞生长状况，待细胞增殖至铺满瓶壁的80％～90％，吸除瓶内的旧培养液，用预热的DPBS洗涤1～2次，再向培养瓶内加入0.1％的胰蛋白酶1.0mL左右，37.0℃消化4～5min后把培养瓶放置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入3倍体积的DMEM终止消化，用吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要按顺序进行，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。接种到1.5ml离心管中1000r差速离心5分钟，去上清加入新培养基按l：3传代至新的培养瓶中，置于二氧化碳恒温培养箱中培养待细胞达90％汇合后，按照上述传代方法将F2代细胞接种到24孔板上培养24h。
细胞原代培养形态观察：每天用电子倒置显微镜观察培养的敖汉细毛羊羊胎儿成纤维细胞的生长情况，并进行拍照，记录细胞原代培养和传代培养的生长状况及特点。组织经胰蛋白酶处理后24h可观察到组织块附近有梭形、不规则三棱形的成纤维细胞游离生长，除此细胞外还有椭圆形或圆形的上皮样细胞生长，没有组织块的区域细胞密度极低。培养至第5d，培养皿皿底长满细胞，即可进行传代培养。如图8所示，左为原代培养3d的细胞形态；右为原代培养5d后的细胞形态。
细胞传代培养形态观察：当细胞密度达到90％左右时进行传代，采用胰酶消化法和差速离心法可将成纤维细胞和上皮样细胞及其他细胞分离开来，经3～4代培养的细胞仅剩成纤维细胞，经传代后细胞增殖加快，细胞形态没有发生明显的变化。如图9所示，左为胰酶消化后细胞形态；右为传代后3～5d细胞形态。转染前细胞形态如图10所示。
(7)转染
将pX335-sgRNA-F1载体和pX335-sgRNA-R2载体各取0.25ug，SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体取0.5ug，三种质粒共计1ug为实验组2，加入到150ul基础培养基(DMEM)中进行稀释，加入3ul脂质体混合孵育15min后逐滴加入上述步骤(6)的已接种培养细胞的24孔板，每孔加50ul，加三孔以作为平行实验。同样将pX335-sgRNA-F3载体、pX335-sgRNA-R2载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体为实验组3；pX335-sgRNA-F4载体、pX335-sgRNA-R5载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体为实验组4；以pX335载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体组合作为阴性对照组1，各组同实验组2处理方法相同，分别转染培养细胞。即获得敖汉细毛羊成纤维细胞DKK2基因敲除细胞株。
实施例2.双荧光素酶报告基因检测DKK2基因敲除效率
(1)稀释CellLysis Buffer(CLB)：用无菌水将5*Cell Lysis Buffer进行5倍稀释，配制成1倍CLB使用。CLB-20℃保存，使用前需新鲜配制。
(2)配制Luciferase Assay Reagent：将Luciferase Dilution Buffer和50*Lucifcrase Assay Reagent室温融化，用Luciferase Dilution Buffer将50*Lucifcrase Assay Reagent进行50倍稀释，稀释好的Lucifcrase Assay Reagent分装后-20℃保存，避免反复冻融。测定前取出室温融化使用。
(3)配制Stop Reagent：将Stop Buffer室温融化后，按照每个样品100ul体系，根据样品数量50倍稀释Stop Reagent50*。Stop Reagent需使用前新鲜配制，不可长期保存或反复冻融。Stop Buffer融化后，会有白色沉淀出现，将其平衡至室温后充分混匀，白色沉淀会消失。
(4)细胞裂解：
①细胞洗涤：吸除细胞培养基，用足量的PBS轻轻洗涤细胞两次，尽量去除洗涤液。
②加入配置好的细胞裂解液(CLB)：按照如下用量加入CLB，用移液器轻轻吹打几次，促进细胞充分裂解，室温放置5-10分钟后检测，如果直接将细胞培养板放置在振荡器上比较温和的裂解，可适当延长裂解时间至20分钟。
96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板
50ul 80ul 150ul 250ul 500ul
本实验采用的是24孔板，因此加入裂解液的量为150ul每孔。
(5)萤火虫荧光素酶活性测定：
取100ul Luciferase Assay Reagent加入测定管底部，加入20ul待测样品，轻轻混匀后，放入一起进行检测，也可以取50ul Luciferase Assay Reagent加入10ul待测样品进行检测，但每个样品的检测体系需要一致，本项目里采用的是100ul的体系。
(6)海肾荧光素酶活性测定：
取100ul稀释好的Stop Reagent加入步骤5的测定管中，轻轻混匀后，放入一起进行检测，Stop Reagent能够立即终止萤火虫荧光素酶发光，并且同时启动海肾荧光素酶发光反应，加入体系同步骤(5)相同。
试验样品为对照组1(px335)、实验组2(T1-T2)、实验组3(T2-T3)、实验组4(T4-T5)、每组三个重复最后求平均值做比较。
将转染18-72小时的细胞通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行敲除基因效率检测，检测结果如图11和图12所示。
通过数据对比得到T1-T2和T2-T3的敲除效率比值为17.17751和17.5629差异不显著(P>0.05)，相比较阴性对照组2.34654差异极显著(P<0.01)，与T4-T5的值16.63465差异显著(P<0.05)。选取比值稍高于组1的组2用于后续基因敲除试验(图11)。
本发明所用双荧光素酶报告基因检测是针对MSTN这一独特的质粒内部含有一个萤火虫荧光素酶表达基因和一个被本发明的目的基因隔断的不表达的海肾荧光素酶表达基因，当对MSTN中目的基因进行有效的切割之后，海肾荧光素酶表达基因发生重组使得海肾荧光素酶高效表达，从而通过表达量来鉴定敲除的效率，因此在双荧光素酶报告基因检测结果中，萤火虫荧光素酶在每个MSTN载体中都表达，当萤火虫荧光素酶表达，说明质粒转染细胞成功，并且在结果中萤火虫荧光素酶表达量差异不显著说明质粒转染量相差不多，如果海肾荧光素酶表达量越高，那么海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的比值就越高，证明目的片段的敲除效率越高，此处优点在于通过海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的比值来消除转染过程中转染量多少的差异所带来的误差。通过数据对比得到T1-T2和T2-T3的敲除效率比值为17.17751和17.5629差异不显著，相比较阴性对照组2.34654差异极显著，与T4-T5的值16.63465差异显著，实验组2的敲除效率最高(图11)。
实施例3.绵羊DKK2基因敲除细胞株的筛选
选取第二组质粒对(pX335-sgRNA-F3、pX335-sgRNA-R2和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2)转染绵羊胎儿成纤维细胞，使用96孔板筛选细胞单克隆。将获得的成纤维细胞单克隆扩大培养，提取基因组DNA，PCR，克隆测序。在靶基因特定区域发生序列突变的单克隆细胞即可判断为DKK2基因成功敲除的细胞。
具体过程如下，
(1)使用Amaxa核转仪及配套的核转试剂盒进行转染。首先使用0.05％胰蛋白酶消化贴壁细胞，用胎牛血清终止消化，磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，添加转染试剂，使用程序T-016转染细胞。
(2)将步骤(1)得到的重组细胞32-33℃培养48小时，然后收集细胞。具体步骤是：首先使用0.05％胰蛋白酶消化贴壁细胞，用胎牛血清终止消化，磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，对细胞进行计数，然后将细胞稀释到10个/ml的浓度，在96孔板的每孔中添加100微升细胞稀释液，置于二氧化碳培养箱中培养(37℃)。10-14天之后，将96孔板中存在汇合细胞的单克隆转移到24孔板中继续培养3-5天，然后使用0.05％胰蛋白酶消化贴壁细胞，用胎牛血清终止消化，取三分之一的细胞提取基因组DN，剩余三分之二的细胞冻存备用。一共获得单克隆32个，分别命名为1至32号克隆。
(3)提取步骤(2)收集的细胞的基因组DNA并作为模板，用PCRF与PCRR组成的引物对进行PCR扩增(SSAF1:GGCGCGCCAGACTGAGTTCACACGGTGC(SEQ ID NO.13)；SSAR1:GTCGACCGGGTCCCTACCTCTTCTGG(SEQ ID NO.14))，回收450bp左右的PCR扩增产物。
所述提取步骤(2)收集细胞基因组DNA的具体步骤是：使用TIANGEN公司DNA提取试剂盒提取DNA。将步骤(2)的细胞悬液中添加20微升蛋白酶K溶液，混匀。加入200微升缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。加入200微升无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上述溶液加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500微升缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入700微升缓冲液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500微升缓冲液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200微升洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，得到连接产物。具体的连接步骤是：在微量离心管中配置下列DNA溶液：pMD18-T载体1微升，PCR产物4微升。加入5微升SolutionⅠ。16℃反应30分钟。
(5)取5微升连接产物加入50微升DH5α感受态细胞中，冰上放置30分钟。42℃加热90秒，再在冰上放置1分钟。加入500微升SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。涂布于氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上进行培养，随机挑取10个克隆并进行测序，计算突变的克隆占总体克隆数的比例，从而判断出各个克隆DKK2基因是否被敲除以及双等位基因敲除的个数。结果发现在32个单克隆细胞中有3个在预期切割位点附近出现突变，其中一个克隆(23号克隆)为DKK2单等位基因敲除(如图13)，另外两个克隆(6号克隆、17号克隆)为双等位基因敲除(图14、图15)。实验结果表明，可以通过本发明方法可以快速获得基因敲除细胞株。

Claims (4)

1.一种快速获得基因敲除细胞株的方法，其特征是，首先根据敲除目标基因设计sgRNA靶点，根据设计的靶序列合成多对单链寡核苷酸，每对分别两两退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经酶切，连入pX335载体中，分别获得sgRNA表达质粒载体；然后，将sgRNA表达质粒载体两两组合与敲除目标基因的SSA载体，共同转染预先培养好的细胞，即可获得基因敲除细胞株。
2.如权利要求1所述的快速获得基因敲除细胞株的方法，其特征是，所述敲除目标基因的SSA载体构建是，将目标片段与含有双荧光素酶报告基因的SSA-载体骨架连接获得SSA-目标基因载体。
3.如权利要求2所述的快速获得基因敲除细胞株的方法，其特征是，获得基因敲除细胞株后，通过双荧光素酶报告基因进行敲除效率检测；选取敲除效率较高的质粒组合转染细胞，筛选细胞单克隆，测序，在靶基因特定区域发生序列突变的单克隆细胞即可判断为基因成功敲除的细胞。
4.用权利要求1-3任一所述方法获得绵羊DKK2基因敲除细胞株的方法，其特征是，步骤如下，
(1)根据绵羊DKK2基因的第一外显子的编码区设计sgRNA靶点，正向靶标T1序列如SEQ ID No.1所示，反向靶标T2序列如SEQ ID No.2所示；
(2)根据步骤(1)设计的靶序列合成单链寡核苷酸T1-F、T1-R、T2-F、T2-R、T3-F、T3-R、T4-F、T4-R、T5-F、T5-R，序列分别如SEQ ID No.3-12所示；T1-F与T1-R，T2-F与T2-R，T3-F与T3-RT4-F与T4-R，T5-F与T5-R分别两两退火获得带粘性末端的双链DNA片段，经酶切，连入pX335载体中，分别获得pX335-sgRNA-F1、pX335-sgRNA-R2、pX335-sgRNA-F3、pX335-sgRNA-F4、pX335-sgRNA-R5载体；
(3)SSA载体的构建
①引物设计
根据绵羊DKK2基因组序列设计引物并在引物5’端分别添加AscI和SalI酶切位点，获得两对引物SSAF1、SSAR1、SSAF2、SSAR2序列分别如SEQ IDNo.13-16所示；
②PCR及TA克隆
提取绵羊基因组DNA，以此为模板用步骤①的两对引物进行PCR扩增，分别获得450bp、530bp的片段，与T载体连接并测序，选取无突变的质粒用于后续酶切试验；
③用AscI和SalI酶切步骤②所得质粒及序列如SEQ ID No.19所示的SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN质粒，将回收的450bp或530bp的片段和SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN的载体骨架连接，获得SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体，序列如SEQ ID No.20所示；
(4)将上述获得的pX335-sgRNA-F1载体、pX335-sgRNA-R2载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体，作为一个实验组；将pX335-sgRNA-F3载体、pX335-sgRNA-R2载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体为一个实验组；pX335-sgRNA-F4载体、pX335-sgRNA-R5载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体为一个实验组；以pX335载体和SSA-hRluc-psiCHECK-DKK2载体组合作为阴性对照组，各组分别转染预先培养好的细胞，即可获得绵羊DKK2基因敲除细胞株。
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