CN114703191A - 基于crsipr技术构建rictor基因敲除细胞株的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株的方法及其应用，属于生物技术领域，所述方法包括：首先设计用于RICTOR基因敲除的sgRNA，合成sgRNA‑RICTOR‑F和sgRNA‑RICTOR‑R两种引物序列；将合成的两条核苷酸链经退火形成双链，并与载体质粒连接，验证正确后获得重组真核表达质粒；将经构建的重组真核表达质粒转染DF‑1细胞，经筛选、验证，获得RICTOR基因敲除细胞株。该基因敲除细胞株DF‑1ΔRICTOR与DF‑1正常细胞株在细胞活性上没有显著的差异，且传代稳定，RICTOR基因mRNA转录水平几乎接近于0，敲低效果显著。

Description

基于CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株的方法及其应用。
背景技术
雷帕霉素的机制靶点蛋白(The mechanistic Target of Rapamycin，mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K相关激酶(PI3K-related kinase，PIKK)蛋白家族中的一员。mTOR在细胞中以两种不同的多蛋白复合物形式存在，分别是mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。mTORC1的核心组分包括mTOR、mTOR相关的调节蛋白(regulatoryprotein associated with mTOR，RAPTOR)和哺乳动物致死的Sec13蛋白8(mammalianlethal with Sec13 protein 8，mLST8)。
mTORC2的核心组分包含mTOR对雷帕霉素不敏感伴侣(rapamycin insensitivecompanion of mTOR，RICTOR)。mTORC2作为AKT最主要的激酶，能够磷酸化Ser473位点以最大程度地激活AKT是mTORC2唯一明确的刺激物，它通过磷酸化和激活下游激酶(包括Akt、蛋白激酶C和血清/糖皮质激素诱导的激酶1)促进细胞存活、增殖和迁移以及肌动蛋白细胞骨架重组。
RICTOR蛋白由1 708个氨基酸组成，最初于2004年被确定为mTORC2复合物的新成分。RICTOR含有大约37个磷酸化位点，主要是位于C末端区域的丝氨酸或苏氨酸残基。mTORC2的核心组分RICTOR的体外激酶测定试验证实了RICTOR对AKT在Ser473位点的磷酸化至关重要，而用RAPTOR并不能取代RICTOR在磷酸化AKT上的作用。事实上，mTOR的抑制剂缺乏特异性，因为它们同时靶向mTORC1和mTORC2两种复合物，同时激活了mTORC1诱导的PI3K负调节和mTORC1诱导的PI3K激活。选择性抑制mTOR2-RICTOR对mTOR通路的研究具有很大帮助，构建RICTOR敲除细胞株势在必行。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的一在于提供一种用于RICTOR基因敲除的sgRNA序列，目的二在于提供基于CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株的方法，目的三在于提供所述sgRNA序列或方法在RICTOR基因敲除细胞株制备中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
本发明提供一种用于RICTOR基因敲除的sgRNA序列，合成所述sgRNA的引物序列为sgRNA-RICTOR-F和sgRNA-RICTOR-R，所述sgRNA-RICTOR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示，所述sgRNA-RICTOR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示。
本发明还提供基于CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株的方法，包括以下步骤：
步骤一：sgRNA的设计与合成：设计用于RICTOR基因敲除的sgRNA，合成sgRNA-RICTOR-F和sgRNA-RICTOR-R两种引物序列，所述sgRNA-RICTOR-F的核苷酸序列如SEQ IDNO：01所示，所述sgRNA-RICTOR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示；
步骤二：重组真核表达质粒的构建：将步骤一合成的两条核苷酸链经退火形成双链，并与载体质粒连接，验证正确后获得重组真核表达质粒；
步骤三：将经步骤二构建的重组真核表达质粒转染DF-1细胞，经筛选、验证，获得RICTOR基因敲除细胞株。
优选地，步骤二所述载体质粒为PX459-puro载体。
本发明还另外提供所述的sgRNA或上述构建方法在RICTOR基因敲除细胞株制备中的应用。
有益效果：本发明通过设计和合成RICTOR的sgRNA，利用CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株，RICTOR基因敲除细胞株DF-1ΔRICTOR与DF-1正常细胞株通过CCK8实验检测，发现二者在细胞活性上没有显著的差异。在连续传代后，检测细胞的RICTOR基因mRNA的转录以及对该段基因组测序，发现构建的细胞株十分稳定。
附图说明
图1是CRISPR-Cas9系统敲除鸡源RICTOR基因测序结果图；
图2是RICTOR基因敲除细胞系qRT-PCR验证结果图；
图3是重组真核表达质粒PX459-RICTOR-puro谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
1.sgRNA设计与合成。
根据ensembl公布的鸡源RICTOR(ENSGALG00000002661)基因下载相应核苷酸序列，利用在线sgRNA设计工具(http://crispor.tefor.net)设计RICTOR的sgRNA(smallguide RNA)，引物送到生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成的引物序列如下表1所示。
表1：sgRICTOR序列。
Figure BDA0003603474540000031
2.重组真核表达质粒PX459-RICTOR-puro的构建。
退火：
将两条设计好的sgRNA-RICTOR单链用无菌超纯水溶解成终浓度为100μmol/L，轻弹混匀，使用T4连接酶配成以下体系，在PCR仪中退火形成双链。
退火体系如下表2所示。
表2：退火体系。
Figure BDA0003603474540000032
Figure BDA0003603474540000041
酶切：
用BbsI内切酶将PX459-puro载体进行酶切，酶切体系如下。
产物胶回收：
(1)使用琼脂糖凝胶电泳分离出线性化载体的DNA片段，在紫外灯下迅速切下所需条带；
(2)按照每1g凝胶加入1mL Binding Buffer的量加入适量溶胶液，在55～60℃水浴至凝胶完全溶解，溶解过程中每隔2～3min震荡1次；
(3)当凝胶完全溶解后，将HiBind DNA柱子套在2mL收集管上，把溶胶液转移至HiBind DNA柱子中10 000xg离心1min，弃掉滤液，收集柱子，直至溶胶液全部转移；
(4)在柱子中加入300μL Binding Buffer,以最大转速离心1min，弃掉滤液，收集柱子；
(5)在柱子中加入700μL SPW Wash Buffer,以最大转速离心1min，弃掉滤液，收集柱子；
(6)重复步骤(5)1次；
(7)最大转速离心空柱2min；
(8)将柱子转移到干净的1.5mL EP管中，加入30μL预热的Elution Buffer，静置2min，以最大转速离心1min，洗脱出DNA。
连接：
将线性化载体的胶回收产物及sgRNA的退火产物测定浓度，根据载体长度、sgRNA长度以及两者的浓度，计算T4连接酶连接体系，16℃过夜连接。
构建的重组真核表达质粒PX459-RICTOR-puro如图3所示。
转化：
(1)从-80℃超低温冰箱中取出感受态细胞Dh5α(100μL/管)和需要转化的质粒，置于冰上融化10min；
(2)吸取50μL感受态细胞至预冷的新的灭菌1.5mL离心管中，加入1μg真核表达质粒，用移液器轻柔搅拌混匀，然后置于冰上冰浴25min；
(3)将冰浴后的菌液从冰中取出，迅速置于42℃水浴锅中热冲击75s，再迅速放回冰上修复3min；
(4)加入500μL无抗LB液体培养基，置于37℃摇床以150～200rpm的频率，振荡培养45min；
(5)取100μL培养好的菌液均匀涂抹于与载体抗性相应的LB固体培养基平板上，晾干后，于37℃培养箱中倒置培养12～16h；
(6)待平板出现针尖样大小的单菌落时，用灭菌的镊子夹取灭菌的10μL吸头轻柔刮取单个菌落，置于2mL的灭菌离心管中，并加入1mL与载体抗性相应的LB液体培养基，置于37℃摇床以150～200rpm的频率，振荡培养4～6h；
(7)待离心管中的LB液体培养基变浑浊时，置于4℃保存，并选取浑浊的送至上海生工生物有限公司测序鉴定；
(8)测序正确的阳性菌液可用于扩大培养，扩大培养后进行质粒提取。
质粒提取：
(1)将测序正确的阳性菌液以1:100的比例加入与载体抗性相应的LB液体培养基中，置于37℃摇床以150～200rpm的频率，振荡培养12～16h；
(2)取10～15mL的菌液，用15mL离心管，室温8 000g离心1min，弃去上清液；
(3)加入500μL已预混了RNase A的Solution I，充分振荡2min；
(4)加入500μL Solution II，将离心管轻柔上下颠倒混匀10次或以上，至管中液体清亮，室温静置2～3min；
(5)加入250μL已预冷至4℃的Buffer N3，将离心管轻柔上下颠倒混匀10次或以上，至管中白色絮状沉淀不再增加，室温12 000g离心10min，若管中上清液中仍有少量白色沉淀，则将管中上清液转移至新的15mL离心管中再次离心；
(6)吸取上清液并与等体积的ETR Binding Buffer上下颠倒充分混匀；
(7)取700μL的混合液加入HiBind DNA Mini吸附柱中，室温10 000g离心1min，弃去滤液，直至所有混合液过滤完毕；
(8)加入500μL的ETR Wash Buffer，室温10 000g离心1min，弃去滤液；
(9)加入500μL的HBC Buffer，室温10 000g离心1min，弃去滤液；
(10)加入700μL的DNA Wash Buffer，室温10 000g离心1min，弃去滤液，重复1次；
(11)空柱室温13 000g离心4min，弃去收集管，将吸附柱置于无菌的1.5mL离心管中，将65μL预热至65℃的Elution Buffer加至吸附柱的滤膜上，65℃温箱中静置2min，13000g离心1min。
质粒转染：
在6孔细胞培养板中，每孔吸入2.5mL DF-1细胞悬液，细胞培养条件同上；在贴壁密度达到40％～50％时，转染质粒，步骤如下：
(1)将100μL Opti-MEM和2μg质粒加入1.5mL无菌EP管中制成A液，混匀室温静置3min；
(2)另一个EP管中将100μL Opti-MEM和5μL Lipofectamine 2000制成B液，轻微震荡后放置3min；
(3)A和B混合为C液，室温静置15min，静置期间2mL PBS清洗细胞2次，最后1次吸干净剩余PBS；
(4)细胞孔吸入C液，并用补1mL的Opti-MEM，反复倾斜并晃动细胞培养板，混匀后置于培养箱中4～6h，PBS洗2次后吸干净，细胞孔内吸入2mL维持培养基(2％FBS)，培养条件同上。
药物筛选敲除细胞株：
(1)将上一步构建好的质粒转染进一个T25细胞培养瓶的DF-1细胞中；
经转染24h后弃去培养基，用PBS缓冲液润洗3次，加入含1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基，39℃、5％CO2细胞培养箱中培养24～48h；
(2)当显微镜下观察到细胞数减少至约10 000个时，弃去培养基，用PBS缓冲液润洗3次后加入含20％FBS的DMEM培养基，39℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h；
(3)将细胞用胰酶消化下来，用含20％FBS的DMEM培养基将细胞梯度稀释铺至24孔细胞培养板中，39℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h；
(4)将1孔中只有一个细胞的孔标记出来，待细胞培养至汇合度为90％时，即可挑取细胞进行敲除验证试验。
敲除细胞株验证：
抽提目的细胞的基因组DNA作为模板，扩增RICTOR片段后送上海生工公司对敲除段进行序列分析，扩增引物如表3。如图1所示，RICTOR基因组被成功敲除掉1个碱基，表明筛选到了DF-1ΔRICTOR细胞系。
表3：扩增引物表。
Figure BDA0003603474540000071
将筛选的DF-1ΔRICTOR细胞培养后收集细胞沉淀样品，抽提RNA进行qRT-PCR试验，验证RICTOR基因的敲除效果。结果如图2显示，DF-1ΔRICTOR细胞系中RICTOR基因mRNA转录水平几乎接近于0，敲低效果显著(P<0.0001)。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 基于CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株的方法及其应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
caccggcacc tccgcatccg aggta 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aaactacctc ggatgcggag gtgcc 25
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ggagaggttt ccggtgtt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tggattatgc ctgtagtg 18

Claims (4)

1.一种用于RICTOR基因敲除的sgRNA，其特征在于：合成所述sgRNA的引物序列为sgRNA-RICTOR-F和sgRNA-RICTOR-R，所述sgRNA-RICTOR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示，所述sgRNA-RICTOR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示。
2.基于CRSIPR技术构建RICTOR基因敲除细胞株的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：sgRNA的设计与合成：设计用于RICTOR基因敲除的sgRNA，合成sgRNA-RICTOR-F和sgRNA-RICTOR-R两种引物序列，所述sgRNA-RICTOR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示，所述sgRNA-RICTOR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：02所示；
步骤二：重组真核表达质粒的构建：将步骤一合成的两条核苷酸链经退火形成双链，并与载体质粒连接，验证正确后获得重组真核表达质粒；
步骤三：将经步骤二构建的重组真核表达质粒转染DF-1细胞，经筛选、验证，获得RICTOR基因敲除细胞株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤二所述载体质粒为PX459-puro载体。
4.权利要求1所述的sgRNA序列或权利要求2-3任意一种所述的方法在RICTOR基因敲除细胞株制备中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950656A (zh) * 2016-05-31 2016-09-21 青岛农业大学 一种快速获得基因敲除细胞株的方法
WO2020257504A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Function Oncology, Inc. A genetic pharmacopeia for comprehensive functional profiling of human cancers
WO2021086830A1 (en) * 2019-10-28 2021-05-06 Celgene Corporation Use of biomarkers to predict clinical sensitivity to 2-(4-chlorophenyl)-n-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1- oxoisoindolin-5-yl)methyl)-2,2-difluoroacetamide
CN113151277A (zh) * 2021-05-10 2021-07-23 安徽农业大学 鸡DF-1细胞IHH基因敲除稳定细胞株的构建方法及其特异性sgRNA

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950656A (zh) * 2016-05-31 2016-09-21 青岛农业大学 一种快速获得基因敲除细胞株的方法
WO2020257504A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Function Oncology, Inc. A genetic pharmacopeia for comprehensive functional profiling of human cancers
WO2021086830A1 (en) * 2019-10-28 2021-05-06 Celgene Corporation Use of biomarkers to predict clinical sensitivity to 2-(4-chlorophenyl)-n-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1- oxoisoindolin-5-yl)methyl)-2,2-difluoroacetamide
CN113151277A (zh) * 2021-05-10 2021-07-23 安徽农业大学 鸡DF-1细胞IHH基因敲除稳定细胞株的构建方法及其特异性sgRNA

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BYUNG-WHI KONG等: "Proteomics of Breast Muscle Tissue Associated with the Phenotypic Expression of Feed Efficiency within a Pedigree Male Broiler Line: I. Highlight on Mitochondria", PLOS ONE, pages 20 *
LIDIA WROBEL等: "mTORC2 Assembly Is Regulated by USP9X-Mediated Deubiquitination of RICTOR", CELL REPORTS, vol. 33, pages 1 *

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