CN106811484B

CN106811484B - 一种牛pdhb基因腺病毒干扰载体构建及其鉴定方法

Info

Publication number: CN106811484B
Application number: CN201710018350.4A
Authority: CN
Inventors: 李安宁; 昝林森; 武丽娟; 王晓宇
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2017-01-11
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2037-01-11
Also published as: CN106811484A

Abstract

本发明公开了一种牛PDHB基因腺病毒干扰载体构建及其鉴定方法，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。构建方法包括：载体用BamH I，EcoR I双酶切；酶切完成后胶回收；目的片断利用3’和5’的单链退火获得：目的片段与载体连接反应；转化感受态细胞:DH5a；转化后挑菌，摇菌14小时，测序；将重组腺病毒载体质粒PDHB shRNA与pHBAd‑BHG骨架载体共转染HEK293A细胞，获得重组腺病毒Ad‑PDHB shRNA。本发明的shRNA1、shRNA2和shRNA3对PDHB基因的干扰效率分别为：95.12％、12.69％和97.76％。

Description

一种牛PDHB基因腺病毒干扰载体构建及其鉴定方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种牛PDHB基因腺病毒干扰载体及其构建方法。

背景技术

牛丙酮酸脱氢酶β亚基(Pyruvate dehydrogenaseβsubunit，PDHB)基因催化丙酮酸成为乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，是将糖酵解和三羧酸循环代谢途径连接起来的关键酶。研究表明PDHB基因的表达水平与IMF含量成正相关。通过对大理石纹含量高和低的两组牛骨骼肌进行差显PCR(ddPCR)分析，发现PDHB基因的表达存在显著差异(Sasaki,Nagai etal.2006)。在对猪IMF的研究中，也发现PDHB基因的表达水平与IMF成正相关(Serao,Veroneze et al.2011)。在对瘦肉型和脂肪型北京鸭的肝脏进行蛋白质组学比较研究发现，PDHB基因的蛋白表达量存在显著差异(Zheng,Chang et al.2014)。我们的前期研究中也发现：在瘦肉型(长白猪)和脂肪型(蓝塘猪)猪中的PDHB基因的蛋白表达量存在显著差异(Bernard,Torbati et al.2013)。因此，我们推测PDHB基因可能在肌内脂肪的形成过程中起着重要的作用。我们还对牛PDHB基因的启动子进行研究发现CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinα，C/EBPβ)和肌细胞生成素(Myogenin，MYOG)很可能是调控该基因表达的关键转录因子(Li,Zhang et al.2016)。通过构建牛PDHB基因腺病毒干扰载体，能够有效解决在牛肌内前体脂肪细胞中持续敲低PDHB基因的表达，为研究牛PDHB基因的功能提供有效的技术支撑。

综上所述，现有的牛肌内前体脂肪细胞中PDHB基因的表达持续敲低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛PDHB基因腺病毒干扰载体构建及其鉴定方法，旨在解决现有的牛肌内前体脂肪细胞中PDHB基因的表达持续敲低的问题。

本发明是这样实现的，一种牛PDHB基因腺病毒干扰载体，所述牛PDHB基因腺病毒干扰载体的序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。

本发明的另一目的在于提供一种所述牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法，所述牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法包括以下步骤：

步骤一，载体用BamH I，EcoR I双酶切；

步骤二，酶切完成后胶回收；

步骤三，目的片断利用3’和5’的单链退火获得：

步骤四，处理好的目的片段与载体连接反应；

步骤五，转化感受态细胞:DH5a；

步骤六，转化后的B-PDHB shRNA平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，将菌液送测序公司测序。

进一步，所述酶切体系如下。

进一步，所述酶切完成后胶回收具体包括：

1)DNA电泳结束后，用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段；

2)含DNA的琼脂糖胶块装入1.5ml离心管，估算其体积；加入500μl(<150μl凝胶)或3～4倍(>150μl凝胶)凝胶体积的Buffer PS溶胶结合液；

3)离心管置于50℃～60℃水浴5～10min，每隔2～3min取出混悬震荡10sec，至琼脂糖凝胶完全溶解，室温放置5min冷却；

4)将少于700μl融化胶液转移至插入套管的离心柱内，于台式离心机上高速离心1min，弃去套管内废液，再将离心柱插入套管；

5)多于700μl的剩余融化胶液，加入同一离心柱内，重复步骤4)；

6)向离心柱内加入Buffer PW洗涤液)700μl，高速离心1min，弃去套管内废液，将离心柱插入套管；

7)高速离心1～2min后，取出离心柱，弃去套管；

8)将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心柱内硅胶膜中心位置加入30～50μl Elution Buffer洗脱液；室温放置2～5min，高速离心1min，离心管中即得纯化的DNA溶液；

9)获得的DNA溶液，可直接应用于后续实验中，或保存于-20℃备用。

进一步，所述目的片断利用3’和5’的单链退火获得包括：

退火程序：

进一步，所述转化感受态细胞:DH5a具体包括：

1)吸取连接产物(体积≤10uL)于50-100uL感受态细胞中，混合均匀，在冰上放置30min；

2)将离心管放到42℃水浴中，热激90s，取出后迅速放于冰上，冷却1-2min；

3)向离心管中加入5倍体积的LB液体培养基，37℃振荡培养45-60min；

4)8,000rpm离心30s，去部分上清，留100uL左右培养液，移液枪吸打均匀后，用三角涂布棒涂布在选择性LB平板上；

5)倒置培养皿于37℃培养12-16h，待单菌落长出后，挑取单菌落。

本发明的另一目的在于提供一种由所述牛PDHB基因腺病毒干扰载体构建的重组腺病毒的PDHB shRNA。

本发明对构建的重组腺病毒PDHB shRNA进行鉴定，腺病毒PDHB shRNA侵染牛肌内前体脂肪细胞48h，shRNA1、shRNA2和shRNA3对PDHB基因的干扰效率分别为：95.12％、12.69％和97.76％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP干扰载体图谱。

图3是本发明实施例提供的酶切完成后胶回收示意图；

图中：左：回收载体pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP；右：DNA Marker；(Marker从上至下依次为：12000bp,8000bp,6000bp,5000bp,4000bp,3000bp,2500bp,2000bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。

图4是本发明实施例提供的干扰效率检测结果示意图。

图5是本发明实施例提供的病毒Ad-shRNA2侵染牛肌内前体脂肪细胞示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的牛PDHB基因腺病毒干扰载体的序列为：

牛-PDHB shRNA1的序列为：SEQ ID NO：1

AATTCGAGGATCATAGATACTCCCATATCTTTCAAGAGAAGATATGGGAGTATCTATGATCCTCTTTTTTG。

牛-PDHB shRNA2的序列为：SEQ ID NO：2

AATTCGCTGCAACAGTACTGTCTAAATTCAAGAGATTTAGACAGTACTGTTGCAGCTTTTTTG。

牛-PDHB shRNA3的序列为：SEQ ID NO：3

AATTCGCCTCAGGTTAAGGACATCATATTTGTTCAAGAGACAAATATGATGTCCTTAACCTGAGGTTTTTTG。

如图1所示，本发明实施例提供的牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法包括以下步骤：

S101:载体用BamH I，EcoR I双酶切；

S102：酶切完成后胶回收；

S103：目的片断利用3’和5’的单链退火获得：

S104：处理好的目的片段与载体连接反应；

S105：转化感受态细胞:DH5a；

S106：转化后的B-PDHB shRNA平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，将菌液送测序公司测序。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

一、腺病毒载体构建

1.1实验材料

实验试剂

载体及目的基因信息

pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP干扰载体图谱如图2。

首先用EcoR I，BamH I酶切载体，切掉Scramble序列获得骨架，之后把目的序列插入U6启动子之后来调控其表达，该腺病毒载体中含有CMV启动子调控的GFP基因表达。

干扰序列设计如下：

SiRNA1序列：GAGGATCATAGATACTCCCATATCT

shRNA1序列：

SiRNA2序列：GCTGCAACAGTACTGTCTAAA

shRNA2序列：

SiRNA3序列：CCTCAGGTTAAGGACATCATATTTG

shRNA3序列：

1.2实验流程

B-PDHB shRNA的构建

1.2.1引物由上海桑尼生物合成PAGE胶纯化的oligo序列，分别稀释至100uM

1.2.2载体用BamH I，EcoR I双酶切，酶切体系如下。

1.2.3酶切完成后胶回收，如图3所示。

1)DNA电泳(建议使用TAE缓冲液进行琼脂糖凝胶电泳)结束后，用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段。仔细将胶块中无DNA部分去除掉。

2)含DNA的琼脂糖胶块装入1.5ml离心管，估算其体积。加入500μl(<150μl凝胶)或3～4倍(>150μl凝胶)凝胶体积的Buffer PS(溶胶结合液)。

3)离心管置于50～60℃水浴5～10min，每隔2～3min取出混悬震荡10sec，至琼脂糖凝胶完全溶解，室温放置5min冷却。

4)将少于700μl融化胶液转移至插入套管的离心柱内，于台式离心机上高速离心1min，弃去套管内废液，再将离心柱插入套管。

5)多于700μl的剩余融化胶液，加入同一离心柱内，重复步骤4。

6)向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)700μl，高速离心1min，弃去套管内废液，将离心柱插入套管。

7)此步骤可省略，直接进行步骤8。向离心柱内加入Buffer PW(洗涤液)200μl，高速离心1～2min。

8)高速离心1～2min后，小心取出离心柱，不要沾上套管内的废液。弃去套管。

9)将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心柱内硅胶膜中心位置加入30～50μl Elution Buffer(洗脱液)，不要触及硅胶膜；室温放置2～5min，高速离心1min，离心管中即得纯化的DNA溶液。

10)获得的DNA溶液，可直接应用于后续实验中，或保存于-20℃备用。

1.2.4目的片断利用3’和5’的单链退火获得：

退火程序：

1.2.5处理好的目的片段与载体连接反应体系：

以上连接液在

16℃过夜。

1.2.6转化(感受态细胞:DH5a)，具体步骤：

1)吸取连接产物(体积≤10uL)于50-100uL感受态细胞中，轻轻混合均匀，在冰上放置30min；

2)将离心管放到42℃水浴中，热激90s(严格控制热击时间)，取出后迅速放于冰上，冷却1-2min；

4)8,000rpm离心30s，去部分上清，留100uL左右培养液，移液枪吸打均匀后，用三角涂布棒涂布在选择性LB平板(含相应抗生素)上；

5)倒置培养皿于37℃培养12-16h，待单菌落长出后，挑取单菌落进行后续实验步骤。

抗性:Amp；37℃，培养过夜

1.2.7转化后的B-PDHB shRNA平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，将菌液送测序公司测序。

1.3实验结果：

B-PDHB shRNA1测序结果：(下划线区域为目的序列)TGAATTACGATCTGGCTTTATATATCTTGTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGAGGATCATAGATACTCCCATATCTTTCAAGAGAAGATATG GGAGTATCTATGATCCTCTTTTTTGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGTCGAGCTGGACGGCGACGTAACGGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCG

B-PDHB shRNA2测序结果：(下划线区域为目的序列)

TGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGCTGCAACAGTAC TGTCTAAATTCAAGAGATTTAGACAGTACTGTTGCAGCTTTTTTGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCC

B-PDHB shRNA3测序结果：(下划线区域为目的序列)

ACCCGAGCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGCCTCAGGTTAA GGACATCATATTTGTTCAAGAGACAAATATGATGTCCTTAACCTGAGGTTTTTTGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGGCAGTGCTTCAG

二、重组腺病毒PDHB shRNA腺病毒的生产实验流程

2.1材料

人胚肾细胞系HEK293cell由汉恒生物公司长期保存；DMEM购于Hyclone公司；LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品；胎牛血清、胰酶购于Hyclone公司；60mm培养皿、10cm培养皿、96孔板、移液管(5ml,10ml)、15ml及50ml离心管均购自NEST公司；双抗购自invitrogen公司；滤膜滤器购自Millipore公司。

2.2方法

2.2.1大量制备重组质粒

1)将对数生长期的菌液2ml加入100mL含100ug/ml Amp的LB培养基中；

2)37℃300rpm震荡摇菌过夜；

3)用康为世纪中提质粒试剂盒提取质粒；

2.2.2重组腺病毒载体的包装，收毒及扩增；

2.2.2.1铺细胞：

转染前一天，将293细胞接种于60mm培养皿，培养基为DMEM+10％Hyclon胎牛血清，置37℃含5％CO₂的培养箱中培养过夜。

2.2.2.2转染

待细胞生长至底面积的长满到70～80％时，取重组腺病毒载体质粒PDHB shRNA及骨架质粒pHBAd-BHG，用LipofiterTM转染试剂进行转染。具体步骤为：

a.转染前2小时更换完全培养基。取2ug重组腺病毒载体质粒PDHB shRNA，4ug骨架质粒pHBAd-BHG。用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

b.取15ul的LipofiterTM，用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

c.将两者混和，室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中，8字摇晃后置于37℃含5％CO₂的培养箱中培养。

注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipofiterTM说明书。

2.2.2.3换液

转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。

2.2.2.4收毒(P1)：

每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15ml离心管中。

2.2.2.5冻融：

打开恒温水浴锅至37℃，将15ml离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为Ad-PDHB shRNA第一代毒种(P1)，将作为随后大量病毒扩增的毒种。

三、重组腺病毒PDHB shRNA干扰效率检测

3.1材料

本试验用到的牛肌内前体脂肪细胞分离自出生3日龄的秦川公牛背最长肌；DMEM培养基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶Trypsin 0.25％EDTA均购自美国invitrogen公司；荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)公司；DNA引物合成由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。

3.2方法

当牛肌内前体脂肪细胞生长到80％左右时，分别侵染高滴度病毒Ad-PDHB和Ad-EGFP。侵染48h后观察绿色荧光表情况，收集细胞提取总RNA，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测检测PDHB基因的表达情况。定量引物为PDHB-RT-F：TCTGAGATGGGCTTTGCTGG，PDHB-RT-R：TGACCTGGTCGATGGCTTGC，PCR产物大小为109bp。以牛GAPDH基因(Accession No.NM_001034034)作为内参，引物为：GAPDH-RT-F：CCAACGTGTCTGTTGTGGAT，GAPDH-RT-R：CTGCTTCACCACCTTCTTGA，PCR产物大小为80bp。

3.3结果

如图4所示，腺病毒PDHB shRNA侵染牛肌内前体脂肪细胞48h，shRNA1、shRNA2和shRNA3对PDHB基因的干扰效率分别为：95.12％、12.69％和97.76％。

如图5所示，腺病毒Ad-shRNA2侵染牛肌内前体脂肪细胞48h，检测到荧光表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110>西北农林科技大学

<120> 一种牛PDHB基因腺病毒干扰载体及其构建方法

<160> 3

<210>1

<211> 71

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

AATTCGAGGATCATAGATACTCCCATATCTTTCAAGAGAAGATATGGGAGTATCTATGATCCTCTTTTTTG

<210>2

<211> 63

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

AATTCGCTGCAACAGTACTGTCTAAATTCAAGAGATTTAGACAGTACTGTTGCAGCTTTTTTG

<210>3

<211> 72

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

AATTCGCCTCAGGTTAAGGACATCATATTTGTTCAAGAGACAAATATGATGTCCTTAACCTGAGGTTTTTTG

Claims

1.一种牛PDHB基因腺病毒干扰载体，其特征在于，所述牛PDHB基因腺病毒干扰载体的shRNA序列为：SEQ ID NO：2。

2.一种如权利要求1所述牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，所述牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法包括以下步骤：

步骤一，载体用BamH I，EcoR I双酶切；

步骤二，酶切完成后胶回收；

步骤三，目的片断利用3’和5’的单链退火获得：

步骤四，处理好的目的片段与载体连接反应；

步骤五，转化感受态细胞:DH5a；

3.如权利要求2所述的牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，所述酶切体系如下：

4.如权利要求2所述的牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，所述酶切完成后胶回收具体包括：

1)DNA电泳结束后，用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段；

7)高速离心1～2min后，取出离心柱，弃去套管；

8)将离心柱插入一个新的1.5ml离心管，在离心柱内硅胶膜中心位置加入30～50μlElution Buffer洗脱液；室温放置2～5min，高速离心1min，离心管中即得纯化的DNA溶液；

5.如权利要求2所述的牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，所述目的片断利用3’和5’的单链退火获得包括：

体系：20ul

10X Buffer：2ul；

100mM Tris-cl pH7.5；

1M NaCl；

10mM EDTA；

shDNA-R/shDNA-F：1/1ul；

H2O：16ul；

退火程序：

95℃ 10分钟；

75℃ 10分钟；

55℃ 10分钟；

35℃ 10分钟；

15℃ 10分钟。

6.如权利要求2所述的牛PDHB基因腺病毒干扰载体的构建方法，其特征在于，所述转化感受态细胞:DH5a具体包括：