CN110904052A

CN110904052A - 一种snk细胞的培养方法

Info

Publication number: CN110904052A
Application number: CN201911401401.7A
Authority: CN
Inventors: 焦顺昌; 张嵘; 李营营
Original assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Dingcheng Taiyuan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明提供了一种SNK细胞的培养方法，属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，包括将携带有IL‑2基因的PBMC和携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC进行共培养，得到SNK细胞。携带有41BBL基因和MICA基因能够刺激CD56+CD16+NK细胞的增殖，使获得的SNK细胞对多种实体瘤的杀伤效果好，携带有IL‑2基因的PBMC在满足PBMC生长的条件下，不断表达IL‑2，无需再向培养体系中添加IL‑2。

Description

一种SNK细胞的培养方法

技术领域

本发明属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，尤其涉及一种SNK细胞的培养方法。

背景技术

外周血分离的外周血单个核细胞(以下简称PBMC)体外培养时需要适量的细胞因子IL-2的诱导，使其分化成NK细胞，因此PBMC的细胞培养基中IL-2的作用相当关键。现有的NK细胞培养基OKM-100和OKM-200由于成本较高，细胞培养周期较长，从经济方面不利于生产使用。通用的RPMI-1640培养基价格虽低，但由于其不含细胞因子IL-2，因此需要每天向培养体系中补加适量的IL-2，造成实验操作繁琐和不便，因此寻找简便又经济的新型细胞培养体系变得尤为重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种SNK细胞的培养方法，不需要每天向培养体系中添加IL-2，就能够获得SNK细胞。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种SNK细胞的培养方法，包括以下步骤：

1)将IL-2基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有IL-2基因的PBMC；

2)将41BBL基因和MICA基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC；

3)将所述步骤1)得到的携带有IL-2基因的PBMC和步骤2)得到的携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC进行共培养，得到SNK细胞。

优选的，所述步骤1)IL-2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

优选的，所述步骤2)41BBL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述步骤2)MICA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述41BBL基因和MICA基因通过第一连接基因进行连接，将得到的连接序列连接到载体中，所述第一连接基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述步骤3)携带有IL-2基因的PBMC和携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC的体积比为(450～550):(0.5～1.5)。

优选的，所述步骤1)IL-2基因与GFP基因通过第二连接基因连接后，将得到的连接序列连接到载体中，所述第二连接基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，所述载体包括pCDH载体。

优选的，所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

优选的，所述培养的温度为35～42℃，所述培养在5％CO₂下进行。

本发明提供了一种SNK细胞的培养方法，包括以下步骤：1)将IL-2基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有IL-2基因的PBMC；2)将41BBL基因和MICA基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有41BBL基因和MICA基因的PBMC；3)将所述步骤1)得到的携带有IL-2基因的PBMC和步骤2)得到的携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC进行共培养，得到SNK细胞。

在本发明中，携带有41BBL基因和MICA基因的PBMC，与携带有IL-2基因的PBMC共培养时，可以定向刺激CD56+CD16+NK细胞的扩增，这类细胞对多种实体瘤有广泛的杀伤作用，因此，称之为SNK。41BBL基因和MICA基因能够刺激CD56+CD16+NK细胞的增殖，使获得的SNK细胞对多种实体瘤的杀伤效果好，携带有IL-2基因的PBMC在满足PBMC生长的条件下，不断表达IL-2，无需再向培养体系中添加IL-2。

附图说明

图1为以PBMC-A培养SNK的生长曲线，其中PBMC-A+IL-2是培养过程中补加细胞因子IL-2，PBMC-A-Lv-IL-2是，PBMC-A中导入IL-2基因，培养过程中不添加细胞因子IL-2；PBMC-A-control是指PBMC-A没有导入IL-2基因，且培养过程中不添加细胞因子IL-2；

图2为以PBMC-B培养SNK的生长曲线，其中PBMC-B+IL-2是培养过程中补加细胞因子IL-2，PBMC-B-Lv-IL-2是，PBMC-B中导入IL-2基因，培养过程中不添加细胞因子IL-2；PBMC-B-control是指PBMC-B没有导入IL-2基因，且培养过程中不添加细胞因子IL-2；

图3为以PBMC-C培养SNK的生长曲线，其中PBMC-C+IL-2是培养过程中补加细胞因子IL-2，PBMC-C-Lv-IL-2是，PBMC-C中导入IL-2基因，培养过程中不添加细胞因子IL-2；PBMC-C-control是指PBMC-C没有导入IL-2基因，且培养过程中不添加细胞因子IL-2；

图4为PBMC感染慢病毒后的荧光百分比；

图5为ELISA检测IL-2的表达-D3(第3天)；

图6为ELISA检测IL-2的表达-D7(第7天)；

图7为流式分型结果-PBMC-A-Lv-IL-2；

图8为流式分型结果-PBMC-A+IL-2；

图9为流式分型结果-PBMC-B-Lv-IL-2；

图10为流式分型结果-PBMC-B+IL-2；

图11为流式分型结果-PBMC-C-Lv-IL-2

图12为流式分型结果-PBMC-C+IL-2；

图13为PBMC-A-add-IL-2-对靶细胞的杀伤效率；

图14为PBMC-A-Lv-IL-2-对靶细胞的杀伤效率；

图15为PBMC-B-add-IL-2-对靶细胞的杀伤效率；

图16为PBMC-B-Lv-IL-2-对靶细胞的杀伤效率；

图17为PBMC-C-add-IL-2-对靶细胞的杀伤效率；

图18为PBMC-C-Lv-IL-2-对靶细胞的杀伤效率。

具体实施方式

本发明提供了一种SNK细胞的培养方法，包括以下步骤：

本发明将IL-2基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有IL-2基因的PBMC。

本发明对所述PBMC的来源没有特殊限定，采用常规途径购买或者制备即可。

在本发明中，所述IL-2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下所示：

atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagtgcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgctggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactgact。

在本发明中，所述IL-2基因优选与GFP基因通过第二连接基因连接后，将得到的连接序列连接到载体中，所述第二连接基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下所示：

ggcggcggcggctccggcggcggcggctccggcggcggcggc。

在本发明中，所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下所示：

atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttcggttatggtgttcaatgctttgcgagatacccagatcatatgaaacagcatgactttttcaagagtgccatgcctgaaggttatgtacaggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaattggaatacaactataactcacacaatgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataa。

在本发明中，所述GFP基因在后续检测时，用于荧光表达。

本发明对所述IL-2基因连接到载体中的方法没有特殊限定，采用常规方法即可，本发明对IL-2基因连接到载体后进行慢病毒包装的方法没有特殊限定，采用常规慢病毒包装的方法即可。本发明对所述载体的种类没有特殊限定，优选包括pCDH载体。

本发明将41BBL基因和MICA基因连接到载体中，经慢病毒包装后感染PBMC，得到携带有41BBL基因和MICA基因的PBMC。

在本发明中，所述41BBL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下所示：

atggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctgccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaa。

在本发明中，所述MICA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下所示：

atggggctgggcccggtcttcctgcttctggctggcatcttcccttttgcacctccgggagctgctgctgagccccacagtcttcgttataacctcacggtgctgtcctgggatggatctgtgcagtcagggtttcttgctgaggtacatctggatggtcagcccttcctgcgctatgacaggcagaaatgcagggcaaagccccagggacagtgggcagaagatgtcctgggaaataagacatgggacagagagaccagggacttgacagggaacggaaaggacctcaggatgaccctggctcatatcaaggaccagaaagaaggcttgcattccctccaggagattagggtctgtgagatccatgaagacaacagcaccaggagctcccagcatttctactacgatggggagctcttcctctcccaaaacctggagactgaggaatggacagtgccccagtcctccagagctcagaccttggccatgaacgtcaggaatttcttgaaggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgcatgcagactgcctgcaggaactacggcgatatctagaatccggcgtagtcctgaggagaacagtgccccccatggtgaatgtcacccgcagcgaggcctcagagggcaacatcaccgtgacatgcagggcttccagcttctatccccggaatatcatactgacctggcgtcaggatggggtatctttgagccacgacacccagcagtggggggatgtcctgcctgatgggaatggaacctaccagacctgggtggccaccaggatttgccgaggagaggagcagaggttcacctgctacatggaacacagcgggaatcacagcactcaccctgtgccctctgggaaagtgctggtgcttcagagtcattggcagacattccatgtttctgctgttgctgctggctgctgctatttttgttattattattttctatgtccgttgttgtaa。

在本发明中，所述41BBL基因和MICA基因通过第一连接基因进行连接，将得到的连接序列连接到载体中，所述第一连接基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下所示：

gccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcct。

本发明对所述41BBL基因和MICA基因连接到载体中的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。本发明对所述41BBL基因和MICA基因连接到载体中，经慢病毒包装的方法没有特殊限定，采用常规慢病毒包装的方法即可。本发明对所述载体的种类没有特殊限定，优选包括pCDH载体。

本发明将得到的携带有IL-2基因的PBMC和得到的携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC进行共培养，得到SNK细胞。

在本发明中，所述携带有IL-2基因的PBMC和携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC的体积比优选为(450～550):(0.5～1.5)，更优选为500:1。在本发明中，所述培养的温度优选为35～42℃，更优选为37℃，所述培养优选在5％CO₂下进行。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一、实验材料和方法：

1.MICA基因(SEQ ID No.3)通过第一连接基因(SEQ ID No.4)与41BBL基因(SEQID No.2)连接。

2.IL-2基因(SEQ ID No.1)通过第二连接基因(SEQ ID No.5)与GFP基因(SEQ IDNo.6)连接。

3、慢病毒包装

IL-2-GFP融合基因和MICA+41BBL融合基因进行全基因合成，通过慢病毒包装收获病毒上清，浓缩后转染PBMC，具体操作流程为：

1)利用基因合成技术合成IL-2-GFP的融合基因和MICA+41BBL的融合基因(金维智生物技术有限公司)，分别克隆到pCDH载体上，通过转化扩增提质粒，获取足量目的基因质粒，具体操作如下：

a)在-80℃冰箱取出感受态细胞，冰上放置10min，使其缓慢溶解,取1ul质粒加入100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α中，冰上放置30min。

b)将上述离心管插在浮漂上置42℃水浴锅热击45s，然后置冰盒上冰浴2min，冰浴后在超净台中将1000μl液体LB培养基加入上述离心管中，然后放到摇床上37℃振荡培养60min。

c)在超净台中提前把涂布菌液的棒子用酒精棉擦净并在酒精灯上烧灼，以杀死上面的细菌和除掉污染物，置试管架上放凉。

d)振荡培养后，取一个含氨苄抗性的LB-琼脂平板，将上述液体离心去上清留下大约150μl，然后用枪尖吹打混匀，在超净台中用棒子将液体涂布到培养板中，涂匀后封口，放37℃培养箱中培养，培养大约12-15h待长出菌斑。

e)将培养板中长出的菌斑挑取单个菌落放到5ml液体LB培养基中，摇床上振荡培养8小时至培养基浑浊。

f)收集菌液至1.5ml离心管中，10000rpm离心1min去上清，用移液枪将液体尽量吸干，收集沉淀菌体，向离心管中加入250μLP1溶液(P1溶液使用前加入RNA酶)，用枪尖吹打重悬至看不到沉淀菌体，然后再向离心管中加入250μLP2溶液裂解菌体，盖好盖子轻轻上下翻转混匀至透亮(时间不超过10min)，向离心管中加入350μL P3溶液，同样盖好盖子轻轻上下翻转混匀，混匀后将离心管放入离心机中10000rmp离心10min。

g)将试剂盒中的的离心柱套在离心管中，加入500μL平衡液在柱子中，放入离心机中10000rmp离心1min，弃去滤液并标记好柱子标号。

h)将离心后的裂解液吸取上清加入平衡后的柱子中，37℃培养箱孵育5min，放入离心机中10000rmp离心1min，将滤液重新倒入柱子中，再次10000rmp离心1min，弃去滤液。

i)在柱子中加入600μL洗涤液PW(使用前加入无水乙醇混匀)，10000rmp离心1min，弃去滤液，再次向柱子中加入600μL洗涤液PW，10000rmp离心1min，弃去滤液。

j)将离心柱放到离心机中10000rmp空离2min，甩干柱子上的液体基质，空离后取出离心管打开盖子室温放置3-5min，使乙醇蒸发,取出柱子套在标记好的1.5mL的离心管中，向离心柱中央的膜上加入50ul去离子水(为了提高质粒提取浓度可将去离子水在水浴锅中提前预热)，静置1min，使膜充分结合。

k)将离心管放入离心机中10000rmp离心2min，弃去柱子，离心管中的下清液即为所得质粒，提取的质粒送测序鉴定为阳性的质粒。

2)常规方法接种293T细胞，利用脂质体体系包装慢病毒，收获的病毒上清通过病毒浓缩柱将病毒上清浓缩200倍后分装冻存-80℃冰箱，备用，具体方法如下：

a)接种3瓶293T细胞，细胞密度大约3×10⁶cell/10ml/T75，摇匀置37℃，CO₂培养箱过夜培养：次日，待细胞密度长到80％进行慢病毒包装；

b)取AB两支15ml离心管，分别加入1.5ml opti-MEM，A管依次加入60μg IL-2-GFP质粒、24μg(4K)质粒、36μg(6K)质粒，混匀，B管加入300ng脂质体3000，混匀，室温静置5min；

c)5min后将B管液体加入A管，混匀(力度较第一次要轻)，室温静置30min；

d)将密度为80％的293T细胞弃去上清，加入5ml opti-MEM清洗一遍后再加入4mlopti-MEM；

e)30min后将AB混合液轻轻滴加到293T细胞中，平均每瓶1ml，轻轻摇匀置37℃，CO₂培养箱孵育4h；

f)孵育完成后，更换10ml新鲜的opti-MEM培养基，轻轻摇匀置37℃，CO2培养箱过夜培养；

g)培养48h后收获病毒上清置4℃冰箱保存，293T细胞继续加入10mlopti-MEM培养基培养；

h)培养72h后收获病毒上清，与48h收获的病毒上清合并，经2000rmp，4℃离心10min，上清液经0.45μm针头滤器过滤后经病毒浓缩柱离心浓缩(60ml病毒上清)，3000rmp离心30min，最终用300μl无菌PBS重悬，获得的病毒上清冻-80℃备用。

3.外周血单个核细胞的分离

a)抗凝采血管抽取三位健康志愿者外周血50ml，分别命名为A、B、C；

b)将三份外周血分别转移到250ml离心管中，向管中加入等体积PBS(50ml)，轻轻吹打成细胞悬液；

c)另新取50ml离心管，各加入20ml淋巴细胞分离液，细胞分离液与细胞悬液的比例为1：1；用移液管吸取细胞悬液，在离心管上方将细胞悬液小心而缓慢的加入，使细胞悬液重叠于淋巴细胞分离液上，2000rpm，离心20min；

d)取出离心管，移液管吸去最上层的血浆，移液枪吸取中间白膜层的单个核细胞置入新离心管中，加入10ml RPMI-1640培养基，轻轻吹打均匀后再次离心，2000rpm，离心5min，去掉上清液，共洗涤2次；

e)洗涤最后一次计数，将细胞密度调整到1×10⁶cell/ml的密度接种细胞培养6孔板，8ml/孔，每组PBMC接种3个孔，细胞培养基均为RPMI-1640+10％FBS，细胞标记为D0。

4.慢病毒感染PBMC以及SNK的培养

a)PBMC接种后当天感染病毒，分为两组，每组分别加入IL-2和MICA+41BBL的冻存的300μl慢病毒浓缩液解冻后，按照体积比例混合，IL-2：MICA+41BBL＝500：1。

b)细胞培养48h后，每孔取样计数，按照500：1的比例加入滋养细胞。

c)之后三组细胞每天取样计数，观察细胞生长曲线以及细胞活力，适当补加RPMI-1640+10％FBS，维持细胞培养密度在0.5-3×10⁶cell/ml，同时感染病毒组细胞每天或隔天取样计数GFP荧光率，初步评估感染效率。

d)细胞培养Day 3、Day 7天时分别取2×10⁶cells接种于细胞培养6孔板，2ml/孔，每个样本做两个孔，培养基为RPMI-1640+10％FBS，其中一个孔培养24h后收集上清，冻-80℃冰箱，另一孔培养24h后收集上清，冻-80℃冰箱，待样品收集齐全经ELISA试剂盒检测IL-2的表达。

5.SNK细胞的检测

1)ELISA检测细胞上清中IL-2的表达

具体检测方法按照试剂盒说明书操作，主要步骤如下：

a)使用前将所有试剂充分混匀，避免产生气泡，取出已包被的酶标板平衡至室温。

b)将标准品稀释成1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml和0pg/ml。

c)取出样品加样，标准品和样品分别每孔加100μl，空白孔加100μl标准品稀释液，然后每孔加50μl Biotinylated antibody工作液，封膜，室温孵育1h。

d)洗板，每孔加300μl 1XWashingbuffer工作液，停留1min后弃去孔内液体，重复三次，每次在滤纸上扣干。

e)加酶：100μl/孔加入Streptavidin-HRP工作液，封膜，室温孵育20min。

f)显色：100μl/孔加入TMB，室温避光孵育，待颜色变为蓝色加入终止液终止反应。

g)读板：终止后10min内用酶标仪检测450nm的OD值，根据标准曲线计算样品浓度。

2)流式检测SNK的表型

细胞培养至14天做流式检测CD3、CD4、CD8、CD56的表达，分析SNK的表型。具体步骤如下：

a)取培养至14天的三组SNK，1000rpm,5min离心后弃上清，加入10ml PBS洗涤一遍，弃洗液。

b)三组细胞分别用6ml PBS重悬，各分装5个流式管内，每管1ml，1000rpm，5min离心后弃上清，然后每管细胞用50ul PBS重悬。

c)孵育抗体：每组细胞各6管，分别为阴性对照组不加抗体，单染管分别加10μlCD3、CD4、CD8、CD56，CD16样品管各加抗体，室温避光孵育30min。

d)抗体孵育后，每管加2ml PBS洗涤，1000rpm，5min离心后弃上清，然后分别加1mlPBS重悬，流式仪上样检测。

3)NK与靶细胞共培养检测杀伤

细胞培养至14天，分别与293T、H358和U87三种靶细胞共培养，观察不同培养体系培养的NK细胞对靶细胞的杀伤效率。具体操作步骤如下：

a)取293T、H358和U87三种靶细胞，用细胞刮刀轻轻将细胞刮下，10mlPBS洗涤，收集到离心管中，1000rpm，5min离心后弃上清，10ml RPMI-1640+2％FBS重悬，取样计数后按照细胞数量将细胞密度调整到8×10⁴cells/ml。

b)接种靶细胞：将调整密度后的靶细胞分别用排枪接种到96孔细胞培养板中，每孔50μl，同时设不加靶细胞的对照组，每孔加50μl RPMI-1640+2％FBS。细胞布局如表1所示：

表1细胞布局

293T

3T3

U87

1640

293T

H358

U87

1640

293T

H358

U87

1640

293T

H358

U87

1640

293T

H358

U87

1640

293T

H358

U87

1640

293T

H358

U87

1640

293T

H358

U87

1640

c)取2种PBMC(对照组PBMC数量不够)离心，30ml PBS重悬，取样计数后离心洗涤，弃上清，根据计数结果用RPMI-1640+2％FBS重悬，将细胞密度调整到3.2×10⁶cells/ml，然后依次倍比稀释成1.6×10⁶cells/ml、0.8×10⁶cells/ml、0.4×10⁶cells/ml、0.2×10⁶cells/ml、0.1×10⁶cells/ml六个密度。

d)接种SNK：将稀释好的不同密度的SNK按照顺序加入含有靶细胞的对应的96孔板中，50μl/孔，使效靶比分别为40：1、20：1、10：1、5：1、2.5：1、1.25：1，同时设T高和T低组，各加50μl RPMI-1640+2％FBS，具体加样顺序如表2所示：

表2加样顺序

3.2*106

1.6*106

0.8*106

0.4*106

0.2*106

0.1*106

1640

d)细胞接种完毕后置37℃，CO2培养箱共培养4h

e)细胞共培养4h后将T高组每孔加10ul细胞裂解液，置37℃，CO2培养箱充分裂解1h。

f)细胞裂解后，取出细胞，每孔加入100ul Working Solution，室温避光30min

g)每孔加入50ul Stop Solution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度，根据公式计算细胞杀伤效率。

对比例1

在实施例1的4.慢病毒感染以及SNK的培养中，步骤a设置不转IL-2基因的对照组(携带MICA和41BBL两种基因的PBMC与不携带IL-2基因的PBMC共培养)，培养过程中，每天补加IL-2，使其终浓度为200IU/ml，步骤b细胞培养48h后，补加IL-2，使其终浓度为200IU/ml。

其它步骤同实施例1。

对比例2

不加IL-2和MICA+41BBL的冻存的300ul慢病毒浓缩液，也不加IL-2。

其它条件同实施例1。

实施例2

实验结果：

实施例1：自体PBMC构建滋养细胞，记为PBMC-A

对比例1：异体PBMC(HLA匹配)构建滋养细胞，记为PBMC-B

对比例2：异体PBMC(HLA不匹配)构建滋养细胞，记为PBMC-C

1.不同培养体系培养的SNK的细胞生长曲线

三种不同来源的滋养细胞与同一种PBMC共培养，每天取样计数发现(图1～3)，感染IL-2的PBMC在感染病毒之后的两天，细胞活力下降，细胞总数也随之降低，从病毒感染后第三天开始(即D5)细胞逐渐开始呈曲线生长，生长曲线几乎与每天补加IL-2的PBMC组相同，直到细胞培养至第17天仍然生长，细胞活力维持在85％以上。而对照组细胞由于培养体系中缺乏内源性和外源性细胞因子IL-2，细胞活力和总数日渐降低，生长至第14天时，细胞几乎全部死亡。

2.感染病毒IL-2的PBMC的荧光率

PBMC感染病毒IL-2后每天取样计数荧光率，初步评估病毒的感染效率结果见图4。PBMC感染慢病毒第二天的荧光率最高，随后每天逐渐下降。

3.ELISA检测细胞上清中IL-2的表达

细胞培养Day 3、Day 7天时分别取2×10⁶cells接种，分别培养24h和48h后收集上清，经ELISA试剂盒检测IL-2的表达，结果如图5～6，感染慢病毒的PBMC第三天接种的细胞培养24和48h的上清表达量高于第七天接种的细胞培养24和48h的上清，可能是PBMC生长前期对IL-2的需求低于后期，也可能是慢病毒感染PBMC后随着时间的延长分泌IL-2的能力有所下降。总而言之，慢病毒感染PBMC后其分泌的IL-2能够满足细胞的生长，无需每天向培养基中补加IL-2。

4.流式细胞仪对NK的表型分析

细胞培养至D14经抗体CD3、CD4、CD8、CD56、CD16染色后流式分析PBMC的表型。流式分析表明PBMC感染慢病毒IL-2和每天补加IL-2的PBMC的表型差异不大(图7～12)：

5.LDH释放检测SNK对靶细胞的杀伤作用

不同培养体系培养的PBMC细胞分别与293T、H358和U87三种靶细胞共培养，4h后经检测LDH释放评估SNK对靶细胞的杀伤作用。细胞杀伤效率如图13～18。

从图13～18中可以得出，携带基因IL-2的慢病毒感染PBMC与携带41BBL和MICA基因的PBMC共培养得到的SNK对靶细胞的杀伤作用比PBMC与携带41BBL和MICA基因的PBMC共培养，同时每天补加IL-2的NK相同，甚至前者的杀伤作用略微高于后者的杀伤作用，三次重复实验结果一致。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的培养方法，无需向培养体系中添加IL-2，也能够得到SNK细胞。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司

<120> 一种SNK细胞的培养方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60

gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120

ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180

acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240

gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300

agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360

acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420

tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgact 459

<210> 2

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60

gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120

ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180

tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240

cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300

ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360

acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420

tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480

gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540

ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600

ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660

agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720

acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aa 762

<210> 3

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60

gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120

gtgcagtcag ggtttcttgc tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctatgac 180

aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240

acatgggaca gagagaccag ggacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300

gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360

atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420

ctctcccaaa acctggagac tgaggaatgg acagtgcccc agtcctccag agctcagacc 480

ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540

cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctagaatc cggcgtagtc 600

ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660

atcaccgtga catgcagggc ttccagcttc tatccccgga atatcatact gacctggcgt 720

caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780

aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc gaggagagga gcagaggttc 840

acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900

ctggtgcttc agagtcattg gcagacattc catgtttctg ctgttgctgc tggctgctgc 960

tatttttgtt attattattt tctatgtccg ttgttgtaa 999

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggagatgttg aagaaaaccc cgggcct 57

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcggcggcg gctccggcgg cggcggctcc ggcggcggcg gc 42

<210> 6

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcggttatgg tgttcaatgc tttgcgagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcctgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

Claims

1.一种SNK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)IL-2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤2)41BBL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤2)MICA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求1、3或4所述的培养方法，其特征在于，所述41BBL基因和MICA基因通过第一连接基因进行连接，将得到的连接序列连接到载体中，所述第一连接基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)携带有IL-2基因的PBMC和携带有41BBL基因、MICA基因的PBMC的体积比为(450～550):(0.5～1.5)。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤1)IL-2基因与GFP基因通过第二连接基因连接后，将得到的连接序列连接到载体中，所述第二连接基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

8.根据权利要求1、5或7所述的培养方法，其特征在于，所述载体包括pCDH载体。

9.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述GFP基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。

10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为35～42℃，所述培养在5％CO₂下进行。