CN110951694B - 一种自体滋养细胞的制备方法和snk细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种自体滋养细胞的制备培养方法和SNK细胞的培养方法，属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，包括以下步骤：1)将41BBL‑MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL‑MICA融合基因的慢病毒；2)将所述步骤1)得到的含有41BBL‑MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3‑41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞。采用本发明提供的培养方法培养得到的滋养细胞为自体来源，保证安全性，无需经过照射，操作方便。

Description

一种自体滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法
技术领域
本发明属于医学、免疫学、细胞生物学和分子生物学技术领域，尤其涉及一种自体滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法。
背景技术
常见的NK细胞培养方法有一下几种：1.从自体的PBMC中，分离NK 细胞，进行培养，缺点，扩增数量少，CD56+CD16+比例不高，NK活性不高；2.异体干细胞来源，诱导培养NK细胞，缺点，异体来源风险， CD56+CD16+比例不高，NK活性不高；3.使用的滋养细胞为K562，由于K562为肿瘤细胞系，在应用时，存在一定风险，且必须经过辐照方能使用，增加使用难度，且，CD56+CD16+比例不高，NK仅对B细胞或淋巴瘤有一定杀伤活性，对实体瘤的杀伤活性不高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种自体滋养细胞的制备方法和SNK 细胞的培养方法，采用本发明提供的方法制备得到的自体滋养细胞为自体来源(即和外周血单核细胞一个来源)，保证安全性，无需经过照射，操作方便，并且可刺激PBMC(外周血单核细胞)中的CD56+CD16+NK细胞扩增，得到的NK细胞对多种实体瘤均有较强的杀伤作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种自体滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；
2)将所述步骤1)得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3-41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞。
优选的，所述步骤1)41BBL-MICA融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述步骤1)慢病毒表达载体包括pCDH载体。
优选的，所述步骤1)感受态细胞包括大肠杆菌感受态细胞。
优选的，所述步骤2)培养使用的培养基以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2。
本发明还提供了一种SNK细胞的培养方法，采用上述技术方案所述的制备方法得到自体滋养细胞，将所述自体滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14～28d，得到SNK细胞。
优选的，所述自体滋养细胞与外周血单核细胞的数量比为1～500:1～10。
优选的，所述培养的温度为35～42℃，所述培养的CO2体积浓度为5％。
本发明提供了一种自体滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：1)将 41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；2)将所述步骤1)得到的含有 41BBL-MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3-41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞。采用本发明提供的制备方法得到的自体滋养细胞为自体来源，保证安全性，无需经过照射，操作方便。
本发明还提供了一种SNK细胞的培养方法，采用上述技术方案所述的制备方法得到自体滋养细胞，将所述自体滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14～28d，得到SNK细胞。得到的自体滋养细胞可刺激PBMC(人外周血单核细胞)中的CD56+CD16+NK细胞扩增，得到的NK细胞对多种实体瘤均有较强的杀伤作用。
附图说明
图1为流式检测MICA的表达情况；
图2为流式检测41BBL的表达情况；
图3为流式检测CD3的表达情况；
图4为流式分析SNK的细胞表型；
图5为SNK对不同肿瘤细胞系的杀伤比较；
图6为不同肿瘤模型中肿瘤体积的变化情况。
具体实施方式
本发明提供了本发明提供了一种自体滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；
2)将所述步骤1)得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3-41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞。
本发明将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒。在本发明中，所述 41BBL-MICA融合基因具有激活NK细胞，刺激NK细胞扩增的作用，在本发明中，所述41BBL-MICA融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
atggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctg ccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcg cctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcc cgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaat gttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctg agctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcg gcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggg gccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagg gccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcct ggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcacc gaggtcggaagccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgggcctatggggctg ggcccggtcttcctgcttctggctggcatcttcccttttgcacctccgggagctgctgctgagccccacagtcttcgtta taacctcacggtgctgtcctgggatggatctgtgcagtcagggtttcttgctgaggtacatctggatggtcagcccttc ctgcgctatgacaggcagaaatgcagggcaaagccccagggacagtgggcagaagatgtcctgggaaataagac atgggacagagagaccagggacttgacagggaacggaaaggacctcaggatgaccctggctcatatcaaggacc agaaagaaggcttgcattccctccaggagattagggtctgtgagatccatgaagacaacagcaccaggagctccca gcatttctactacgatggggagctcttcctctcccaaaacctggagactgaggaatggacagtgccccagtcctcca gagctcagaccttggccatgaacgtcaggaatttcttgaaggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgct atgcatgcagactgcctgcaggaactacggcgatatctagaatccggcgtagtcctgaggagaacagtgcccccca tggtgaatgtcacccgcagcgaggcctcagagggcaacat caccgtgacatgcagggcttccagcttctatccccggaatatcatactgacctggcgtcaggatggggtatctttgag ccacgacacccagcagtggggggatgtcctgcctgatgggaatggaacctaccagacctgggtggccaccagga tttgccgaggagaggagcagaggttcacctgctacatggaacacagcgggaatcacagcactcaccctgtgccctc tgggaaagtgctggtgcttcagagtcattggcagacattccatgtttctgctgttgctgctggctgctgctatttttgttattattattttctatgtccgttgttgtaa。
在本发明中，所述41BBL基因激活NK细胞，刺激NK细胞扩增，核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，具体如下：
atggaatacgcctctgacgcttcactggaccccgaagccccgtggcctcccgcgccccgcgctcgcgcctg ccgcgtactgccttgggccctggtcgcggggctgctgctgctgctgctgctcgctgccgcctgcgccgtcttcctcg cctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggctccgcggccagcccgagactccgcgagggtcc cgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaat gttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctg agctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcg gcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggg gccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagg gccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcct ggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcacc gaggtcggaa。
在本发明中，所述gccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagatgttgaagaaaaccccgg gcct为连接基因。
在本发明中，所述MICA基因激活NK细胞，刺激NK细胞扩增，核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，具体如下：
atggggctgggcccggtcttcctgcttctggctggcatcttcccttttgcacctccgggagctgctgctgagcc ccacagtcttcgttataacctcacggtgctgtcctgggatggatctgtgcagtcagggtttcttgctgaggtacatctgg atggtcagcccttcctgcgctatgacaggcagaaatgcagggcaaagccccagggacagtgggcagaagatgtc ctgggaaataagacatgggacagagagaccagggacttgacagggaacggaaaggacctcaggatgaccctgg ctcatatcaaggaccagaaagaaggcttgcattccctccaggagattagggtctgtgagatccatgaagacaacagc accaggagctcccagcatttctactacgatggggagctcttcctctcccaaaacctggagactgaggaatggacagt gccccagtcctccagagctcagaccttggccatgaacgtcaggaatttcttgaaggaagatgccatgaagaccaag acacactatcacgctatgcatgcagactgcctgcaggaactacggcgatatctagaatccggcgtagtcctgagga gaacagtgccccccatggtgaatgtcacccgcagcgaggcctcagagggcaacatcaccgtgacatgcagggctt ccagcttctatccccggaatatcatactgacctggcgtcaggatggggtatctttgagccacgacacccagcagtgg ggggatgtcctgcctgatgggaatggaacctaccagacctgggtggccaccaggatttgccgaggagaggagca gaggttcacctgctacatggaacacagcgggaatcacagcactcaccctgtgccctctgggaaagtgctggtgcttc agagtcattggcagacattccatgtttctgctgttgctgctggctgctgctatttttgttattattattttctatgtccgttgttg taa。
本发明对将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上的方法没有特殊限定，采用常规基因连接到慢病毒表达载体上即可。在本发明中，所述慢病毒表达载体优选包括pCDH载体。本发明对连接有基因的慢病毒表达载体转入感受态细胞的方法没有特殊限定，采用常规方法即可。在本发明中，所述感受态细胞优选包括大肠杆菌感受态细胞。
本发明将得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3-41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞。在本发明中，所述培养使用的培养基优选以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2，更优选包括质量百分含量为10％的胎牛血清和浓度为200IU/mL的IL-2。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明优选使用流式分选仪对培养后的细胞进行分选，得到CD3-41BBL+MICA+细胞即为自体滋养细胞，本发明对使用流式分选仪分选的方法没有特殊限定，采用常规即可。
本发明还提供了一种SNK细胞的培养方法，采用上述技术方案所述的制备方法得到自体滋养细胞，将所述自体滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14～28d，得到SNK细胞。
在本发明中，所述自体滋养细胞与外周血单核细胞的数量比优选为 1～500:1～10，更优选为200：1。在本发明中，所述培养的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述培养的CO2体积浓度为5％；所述培养使用的培养基优选以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2，更优选包括质量百分含量为10％的胎牛血清和浓度为200IU/mL的IL-2。本发明优选在培养的过程中每天补加 50～500IU/mL的IL-2，当在培养的过程中培养基变黄时，优选进行半量换培养基。
在本发明中，所述SNK细胞为Super-NK细胞，简称SNK细胞，对多种实体瘤均有较强的杀伤作用。在本发明中，所述实体瘤优选包括肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌和脑胶质瘤。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、融合基因41BBL-MICA(SEQ ID No.1)。
2、慢病毒包装
MICA-41BBL融合基因进行全基因合成，通过慢病毒包装收获病毒上清，浓缩后转染PBMC，具体操作流程为：
1)利用基因合成技术合成MICA+41BBL的融合基因(金维智生物技术有限公司)，克隆到pCDH载体上，通过转化扩增提质粒，获取足量目的基因质粒，具体操作如下：
a)在-80℃冰箱取出感受态细胞，冰上放置10min，使其缓慢溶解，取 1μl质粒加入100μl大肠杆菌感受态细胞DH5α中，冰上放置30min。
b)将上述离心管插在浮漂上置42℃水浴锅热击45s，然后置冰盒上冰浴2min，冰浴后在超净台中将1000μl液体LB培养基加入上述离心管中，然后放到摇床上37℃振荡培养60min。
c)在超净台中提前把涂布菌液的棒子用酒精棉擦净并在酒精灯上烧灼，以杀死上面的细菌和除掉污染物，置试管架上放凉。
d)振荡培养后，取一个含氨苄抗性的LB-琼脂平板，将上述液体离心去上清留下大约150μl，然后用枪尖吹打混匀，在超净台中用棒子将液体涂布到培养板中，涂匀后封口，放37℃培养箱中培养，培养大约12～15h待长出菌斑。
e)将培养板中长出的菌斑挑取单个菌落放到5ml液体LB培养基中，摇床上振荡培养8小时至培养基浑浊。
f)收集菌液至1.5ml离心管中，10000rpm离心1min去上清，用移液枪将液体尽量吸干，收集沉淀菌体，向离心管中加入250μLP1溶液(P1溶液使用前加入RNA酶)，用枪尖吹打重悬至看不到沉淀菌体，然后再向离心管中加入250μLP2溶液裂解菌体，盖好盖子轻轻上下翻转混匀至透亮(时间不超过10min)，向离心管中加入350μL P3溶液，同样盖好盖子轻轻上下翻转混匀，混匀后将离心管放入离心机中10000rmp离心10min。
g)将试剂盒中的的离心柱套在离心管中，加入500μL平衡液在柱子中，放入离心机中10000rmp离心1min，弃去滤液并标记好柱子标号。
h)将离心后的裂解液吸取上清加入平衡后的柱子中，37℃培养箱孵育 5min，放入离心机中10000rmp离心1min，将滤液重新倒入柱子中，再次 10000rmp离心1min，弃去滤液。
i)在柱子中加入600μL洗涤液PW(使用前加入无水乙醇混匀)，10000 rmp离心1min，弃去滤液，再次向柱子中加入600μL洗涤液PW，10000rmp 离心1min，弃去滤液。
j)将离心柱放到离心机中10000rmp空离2min，甩干柱子上的液体基质，空离后取出离心管打开盖子室温放置3～5min，使乙醇蒸发，取出柱子套在标记好的1.5mL的离心管中，向离心柱中央的膜上加入50μl去离子水(为了提高质粒提取浓度可将去离子水在水浴锅中提前预热)，静置1min，使膜充分结合。
k)将离心管放入离心机中10000rmp离心2min，弃去柱子，离心管中的下清液即为所得质粒，提取的质粒送测序鉴定为阳性的质粒。
慢病毒包装：
a)接种3瓶293T细胞，细胞密度大约3×106cell/10ml/T75，摇匀置37℃， CO2培养箱过夜培养：次日，待细胞密度长到80％进行慢病毒包装；
b)取AB两支15ml离心管，分别加入1.5ml opti-MEM，A管依次加入 60μg IL-2-GFP质粒、24μg(4K)质粒、36μg(6K)质粒，混匀，B管加入300ng脂质体3000，混匀，室温静置5min；
c)5min后将B管液体加入A管，混匀(力度较第一次要轻)，室温静置30min；
d)将密度为80％的293T细胞弃去上清，加入5ml opti-MEM清洗一遍后再加入4mlopti-MEM；
e)30min后将AB混合液轻轻滴加到293T细胞中，平均每瓶1ml，轻轻摇匀置37℃，CO2培养箱孵育4h；
f)孵育完成后，更换10ml新鲜的opti-MEM培养基，轻轻摇匀置37℃， CO2培养箱过夜培养；
g)培养48h后收获病毒上清置4℃冰箱保存，293T细胞继续加入 10mlopti-MEM培养基培养；
h)培养72h后收获病毒上清，与48h收获的病毒上清合并，经2000rmp， 4℃离心10min，上清液经0.45μm针头滤器过滤后经病毒浓缩柱离心浓缩 (60ml病毒上清)，3000rmp离心30min，最终用300ul无菌PBS重悬，获得的病毒上清冻-80℃备用。
3、外周血单个核细胞的分离
a)抗凝采血管抽取三位健康志愿者外周血50ml，分别命名为A、B、C；
b)将三份外周血分别转移到250ml离心管中，向管中加入等体积PBS (50ml)，轻轻吹打成细胞悬液；
c)另新取50ml离心管，各加入20ml淋巴细胞分离液，细胞分离液与细胞悬液的比例为1：1；用移液管吸取细胞悬液，在离心管上方将细胞悬液小心而缓慢的加入，使细胞悬液重叠于淋巴细胞分离液上，2000rpm，离心 20min；
d)取出离心管，移液管吸去最上层的血浆，移液枪吸取中间白膜层的单个核细胞置入新离心管中，加入10ml RPMI-1640培养基，轻轻吹打均匀后再次离心，2000rpm，离心5min，去掉上清液,共洗涤2次；
慢病毒感染PBMC：
慢病毒感染PBMC：将冻存的300μl 41BBL-MICA融合基因的慢病毒浓缩液解冻后，加入到分离得到的1×106cell PBMC中，以 1640+10％FBS+200IU/mL IL-2培养14天；以流式分选仪对 CD3-41BBL+MICA+的细胞，进行分离；得到细胞即为自体来源的滋养细胞，以1640+10％FBS+200IU/mL IL-2进行培养。
滋养细胞表型的鉴定：
获得自体滋养细胞后，以流式细胞分析仪对CD3、41BBL和MICA的表达情况及比例进行鉴定，结果如图1-3所示：自体滋养细胞的表型为 CD3-41BBL+MICA+。
实施例2
1、SNK细胞的培养：
a)分离人外周血单核细胞，离心计数，以1640+10％FBS+200IU/mL IL-2 重悬；
b)按照200：1的比例，加入上述自体来源的滋养细胞；37℃，CO2培养箱培养；
c)按照实际的体积，每天补加500IU/mL的IL-2，根据细胞生长情况，在培养基变黄时，进行半量换液；
d)培养到14～28天时，即得到SNK细胞。
2、流式检测SNK的表型
细胞培养至14d做流式检测CD3、CD4、CD8、CD56、CD16的表达，分析SNK的表型。具体步骤如下：
a)取培养14d的SNK细胞，1000rpm，5min离心后弃上清，加入10ml PBS洗涤一遍，弃洗液。
b)细胞分别用6ml PBS重悬，各分装5个流式管内，每管1ml，1000rpm， 5min离心后弃上清，然后每管细胞用50ul PBS重悬。
c)孵育抗体：每组细胞各6管，分别为阴性对照组不加抗体，单染管分别加10μlCD3、CD4、CD8、CD56，CD16样品管各加抗体，室温避光孵育30min。
d)抗体孵育后，每管加2ml PBS洗涤，1000rpm，5min离心后弃上清，然后分别加1mlPBS重悬，流式仪上样检测。
3、NK与靶细胞共培养检测杀伤
细胞培养至14d时，分别对肺癌细胞H358、结直肠癌细胞HT29、SW48、 SW480、脑胶质瘤细胞U87、肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MCF7、胃N87 细胞进行杀伤效率的检测，具体操作步骤如下：
a)取不同的靶细胞，用细胞刮刀轻轻将细胞刮下，10mlPBS洗涤，收集到离心管中，1000rpm，5min离心后弃上清，10ml RPMI-1640+2％FBS重悬，取样计数后按照细胞数量将细胞密度调整到8×104cells/ml。
b)接种靶细胞：将调整密度后的靶细胞分别用排枪接种到96孔细胞培养板中，每孔50μl，同时设不加靶细胞的对照组，每孔加50μl RPMI-1640+2％FBS。
c)取培养14d的SNK细胞，离心，30ml PBS重悬，取样计数后离心洗涤，弃上清，根据计数结果用RPMI-1640+2％FBS重悬，将细胞密度调整到 3.2×106cells/ml，然后依次倍比稀释成1.6×106cells/ml、0.8×106cells/ml、 0.4×106cells/ml、0.2×106cells/ml、0.1×106cells/ml六个密度。
d)接种SNK：将稀释好的不同密度的SNK按照顺序加入含有靶细胞的对应的96孔板中，50μl/孔，使效靶比分别为40：1、20：1、10：1、5：1、 2.5：1、1.25：1，同时设T高和T低组，各加50μl RPMI-1640+2％FBS。
e)细胞接种完毕后置37℃，CO2培养箱共培养4h。
f)细胞共培养4h后将T高组每孔加10μl细胞裂解液，置37℃，CO2培养箱充分裂解1h。
g)细胞裂解后，取出细胞，每孔加入100μl Working Solution，室温避光30min。
h)每孔加入50μl Stop Solution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度，根据公式计算细胞杀伤效率。
4、SNK的体内药效实验-免疫缺陷小鼠模型
分别以肺癌H358、胃癌N87、结直肠癌DLD-1、肝癌、脑胶质瘤U87、乳腺癌MCF7建立小鼠荷瘤模型；选取5周龄的雌性小鼠，每组6只；当肿瘤长至200mm3-300 mm3之间时，回输5×107SNK细胞，每72h进行一次肿瘤测量。
结果如下：
1、流式检测SNK细胞表型
SNK培养至14d后，进行流式检测，结果如图4所示，82.5％为 CD56+CD3-的NK细胞，5.89％为CD56+CD3+的NKT细胞，其中CD56+CD3- 的NK细胞中，90.3％的细胞为CD16+。
2、SNK细胞对多种实体瘤的杀伤效果
以LDH方法检测SNK细胞对不同肿瘤细胞：以肺癌H358、胃癌N87、结直肠癌HT29、肝癌HepG2、脑胶质瘤U87、乳腺癌MCF7的杀伤效率，结果如图5所示，SNK对不同肿瘤细胞的杀伤效率随着效靶比的升高而升高，在16：1时，杀伤效率均超过60％，对MCF7、HT29的杀伤效率超过 90％。
3、SNK的体内药效实验
分别以肺癌H358、胃癌N87、结直肠癌HT29、肝癌HepG2、脑胶质瘤 U87、乳腺癌MCF7建立小鼠荷瘤模型，当瘤体积达到200mm3时，进行第一次SNK细胞回输，剂量为5×107SNK细胞/只，每周回输一次，对照小鼠，回输PBS，肿瘤体积情况如图6所示，不同的细胞系，肿瘤体积变化略有不同，但回输PBS的小鼠，肿瘤体积有不同程度的增加，回输SNK细胞的小鼠，肿瘤体积呈下降趋势，说明，SNK细胞对肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤均有明显的清除肿瘤的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京鼎成肽源生物技术有限公司
<120> 一种自体滋养细胞的制备方法和SNK细胞的培养方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1818
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aagccacgaa cttctctctg 780
ttaaagcaag caggagatgt tgaagaaaac cccgggccta tggggctggg cccggtcttc 840
ctgcttctgg ctggcatctt cccttttgca cctccgggag ctgctgctga gccccacagt 900
cttcgttata acctcacggt gctgtcctgg gatggatctg tgcagtcagg gtttcttgct 960
gaggtacatc tggatggtca gcccttcctg cgctatgaca ggcagaaatg cagggcaaag 1020
ccccagggac agtgggcaga agatgtcctg ggaaataaga catgggacag agagaccagg 1080
gacttgacag ggaacggaaa ggacctcagg atgaccctgg ctcatatcaa ggaccagaaa 1140
gaaggcttgc attccctcca ggagattagg gtctgtgaga tccatgaaga caacagcacc 1200
aggagctccc agcatttcta ctacgatggg gagctcttcc tctcccaaaa cctggagact 1260
gaggaatgga cagtgcccca gtcctccaga gctcagacct tggccatgaa cgtcaggaat 1320
ttcttgaagg aagatgccat gaagaccaag acacactatc acgctatgca tgcagactgc 1380
ctgcaggaac tacggcgata tctagaatcc ggcgtagtcc tgaggagaac agtgcccccc 1440
atggtgaatg tcacccgcag cgaggcctca gagggcaaca tcaccgtgac atgcagggct 1500
tccagcttct atccccggaa tatcatactg acctggcgtc aggatggggt atctttgagc 1560
cacgacaccc agcagtgggg ggatgtcctg cctgatggga atggaaccta ccagacctgg 1620
gtggccacca ggatttgccg aggagaggag cagaggttca cctgctacat ggaacacagc 1680
gggaatcaca gcactcaccc tgtgccctct gggaaagtgc tggtgcttca gagtcattgg 1740
cagacattcc atgtttctgc tgttgctgct ggctgctgct atttttgtta ttattatttt 1800
ctatgtccgt tgttgtaa 1818
<210> 2
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aa 762
<210> 3
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60
gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120
gtgcagtcag ggtttcttgc tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctatgac 180
aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240
acatgggaca gagagaccag ggacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300
gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360
atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420
ctctcccaaa acctggagac tgaggaatgg acagtgcccc agtcctccag agctcagacc 480
ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540
cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctagaatc cggcgtagtc 600
ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660
atcaccgtga catgcagggc ttccagcttc tatccccgga atatcatact gacctggcgt 720
caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780
aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc gaggagagga gcagaggttc 840
acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900
ctggtgcttc agagtcattg gcagacattc catgtttctg ctgttgctgc tggctgctgc 960
tatttttgtt attattattt tctatgtccg ttgttgtaa 999

Claims (1)

1.一种SNK细胞的培养方法，其特征在于，将自体滋养细胞与外周血单核细胞混合后培养14～28d，得到SNK细胞；
所述自体滋养细胞与外周血单核细胞的数量比为1～500:1～10；
所述培养的温度为35～42℃，所述培养的CO2体积浓度为5％；
所述自体滋养细胞的制备方法，由以下步骤组成：
1)将41BBL-MICA融合基因连接到慢病毒表达载体上，转入感受态细胞，得到含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒；
2)将所述步骤1)得到的含有41BBL-MICA融合基因的慢病毒感染外周血单核细胞，培养14d以上，得到的CD3-41BBL+MICA+细胞为自体滋养细胞；
所述步骤1)41BBL-MICA融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述步骤1)慢病毒表达载体包括pCDH载体；
所述步骤1)感受态细胞包括大肠杆菌感受态细胞；
所述步骤2)培养使用的培养基以1640培养基为基础培养基，包括质量百分含量为8～12％的胎牛血清和浓度为180～220IU/mL的IL-2；
所述SNK细胞杀伤肺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、结直肠癌细胞和脑胶质瘤细胞。
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CN111041048B (zh) * 2019-12-30 2021-07-06 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种有限代数的滋养细胞的制备方法和snk细胞的培养方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102268405B (zh) * 2011-07-06 2013-08-14 安徽省立医院 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基
CN102586185A (zh) * 2012-03-12 2012-07-18 浙江中赢方舟生物工程股份有限公司 一种k562细胞扩增激活nk细胞的方法
CN105238752A (zh) * 2015-10-22 2016-01-13 苏州科贝生物技术有限公司 一种高效体外扩增自体nk细胞的培养体系及培养方法
CN105985931A (zh) * 2016-06-21 2016-10-05 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种nk细胞体外扩增组合物及nk细胞扩增方法
CN106350487B (zh) * 2016-09-13 2019-01-25 北京多赢时代转化医学研究院 联合制备car-nk细胞和car-nkt细胞的方法
CN106754730A (zh) * 2017-02-22 2017-05-31 上海科医联创生物科技有限公司 一种高效扩增nk细胞的方法
CN107177548B (zh) * 2017-06-26 2021-01-05 杭州中赢生物医疗科技有限公司 一种体外扩增淋巴细胞的培养体系及扩增方法和应用
CN110623981B (zh) * 2017-12-11 2022-07-01 浙江大学 NK细胞外泌体hsa-miR-330-5p在抗菌中的应用
CN108300693A (zh) * 2018-01-25 2018-07-20 河北省健海生物芯片技术有限责任公司 一种自然杀伤细胞体外扩增方法
CN108220247A (zh) * 2018-03-20 2018-06-29 杭州史迪姆生物科技有限公司 一种双car-t细胞及其制备方法和应用
CN109504660B (zh) * 2018-11-02 2021-08-06 温州启星生物技术有限公司 一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用
CN109371062A (zh) * 2018-12-12 2019-02-22 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种重组慢病毒表达载体、重组细胞及其在自然杀伤细胞培养中的应用
CN109666639B (zh) * 2018-12-24 2021-03-26 浙江大学 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法
CN109486758A (zh) * 2018-12-28 2019-03-19 青岛麦迪赛斯生物科技有限公司 一种外周血nk细胞体外高效扩增试剂及操作说明
CN109576220B (zh) * 2018-12-28 2022-07-05 青岛麦迪赛斯生物科技有限公司 一种灭活饲养细胞联合细胞因子刺激nk细胞扩增的方法
CN110331132B (zh) * 2019-08-09 2021-08-24 侯宗柳 一种体外大规模诱导nk细胞扩增的方法

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