CN105238752A

CN105238752A - 一种高效体外扩增自体nk细胞的培养体系及培养方法

Info

Publication number: CN105238752A
Application number: CN201510690590.XA
Authority: CN
Inventors: 姬云; 周艳; 王珏; 孙石磊; 吴守亮; 姬星河
Original assignee: SUZHOU KEBEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU KEBEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2016-01-13

Abstract

本高效体外扩增自体NK细胞的培养体系及培养方法，培养体系包括含GT-T551基础培养基、白细胞介素IL-2、白细胞介素IL-12、白细胞介素IL-15、白细胞介素IL-18、白细胞介素IL-17、白细胞介素IL-22和天然中药物质。培养方法为：采集并分离自体40ml外周血单个核细胞，用含10％自身血浆培养基重悬细胞，加入到用CD3抗体或CD56抗体包被的细胞培养瓶中，细胞因子组合A刺激，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育并振摇，6-7天后转入细胞培养袋中培养并补加含细胞因子组合B培养基，培养期间，每隔3-4天在含有IL-2基础培养基培养，共培养17-19天可得到高纯度性的NK细胞。本培养基及培养方法能使NK细胞体外扩增1000倍以上，获得超过5X10⁹次方的高纯度NK细胞。

Description

一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系及培养方法

技术领域

本发明涉及免疫细胞体外培养领域，具体涉及一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系，同时涉及一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(naturalkillercells，NK)起源于骨髓造血祖细胞，并在骨髓微环境中发育成熟，是机体对抗病原体侵袭和正常细胞恶性变的重要天然免疫系统效应细胞。2007年ZamaiLorisⅢ撰文指出NK细胞对肿瘤在机体内的增殖及转移扩散均起到“控制”作用，基于NK细胞的肿瘤免疫治疗具有良好的临床应用前景，近年来一直是国内外学者研究的热点。但是，作为淋巴细胞中的稀有细胞亚群，NK细胞在人的外周血淋巴细胞中约只占5％～10％。

目前体外获取人NK细胞，主要以PBMC(或以磁珠分离的NK细胞)为原始材料，通过特定细胞因子的刺激，使NK细胞在体外得到特异的扩增，这种方法是目前被认为比较有应用前景的方法，通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备，使临床应用成为可能。但是迄今为止多数的体外刺激扩增培养也只能使NK细胞在体外扩增数十到百倍，且纯度也不理想。

另外也有研究报道采用滋养细胞系方法(如使用K562细胞本身作为滋养细胞系)，该方法得到NK细胞纯度较高，但是存在K562本身是一种肿瘤细胞，存在安全隐患。也有报道采用胚胎干细胞体外诱导分化形成NK细胞，干细胞体外诱导具有不确定性，存在一定安全隐患，因此也暂不能应用于临床。

发明内容

为解决上述技术问题，我们提出了一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系及方法，根据本培养体系及方法可以使NK细胞体外扩增1000倍以上，获得超过5X10⁹次方的高纯度NK细胞。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系，所述的培养体系包括含GT-T551基础培养基、特异因子组合A和特异因子组合B；所述的特异因子组合A包含IL-2、IL-12、IL-15、lL-17，IL-18、IL-22，其中IL-2浓度为1000u/ml、IL-12的浓度为100-200ng/ml、IL-15的浓度为100-200ng/ml、IL-17的浓度为200-400ng/ml、IL-18的浓度为100-200ng/ml、IL-22的浓度为100-200ng/ml；所述的特异因子组合B包含来自天然中药物质提取物的单个成分或多个成分组合：为人参皂苷、三七皂苷、紫杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、黄芩素、沙苑子总黄酮、姜黄素、云芝多糖中的一种或两种物质组合，其浓度分别为人参皂苷2-5ug/ml、三七皂苷2-5ug/ml、紫杉醇2-6ug/ml、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)5-8ug/ml、黄芩素5-8ug/ml、沙苑子总黄酮3-5ug/ml、姜黄素3-5ug/ml、云芝多糖5-10ug/ml。

优选的，所述的NK细胞是来自体，其来源为健康人或肿瘤患者的外周血液。

优选的，在分离单个核细胞开始记第1天，细胞因子组合A加样于第1天，特异组合物B加样于第7天，前7天，每2天添加含IL-2的GT-T551培养基，后10-12天每3-4天添加含IL-2的GT-T551培养基。

一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，包括以下步骤：采集并分离自体40ml外周血的单个核细胞，用含10％自身血浆的培养基重悬细胞，加入到用CD3抗体或CD56抗体包被的细胞培养瓶中，细胞因子组合A刺激，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育，并以一定速度振摇，6-7天后转入细胞培养袋中培养并补加含细胞因子组合B的培养基，培养期间，每隔3-4天在含有IL-2的基础培养基培养，共培养17-19天即可得到高纯度性的NK细胞。

优选的，所述细胞培养瓶中包被抗CD-56单克隆抗体。

优选的，所述细胞培养瓶振摇时，在约1-2下/分钟的振摇频率下进行，振摇角度为0-4度。

优选的，培养的NK细胞含量在5X10⁹细胞数，培养的NK细胞纯度不低于80％。

优选的，培养的NK细胞中不含T细胞及B细胞。

通过上述技术方案，本发明的培养体系具有如下有益效果：

1、成分简单，避免了动物血清中的动物成分对细胞治疗带来的风险及动物血清中不确定的成分对细胞培养造成的不确定性，提高了NK细胞得率，所获得的活化的NK细胞肿瘤杀伤效果显著，因此除了能应用于科研，也可应用于临床治疗。

2、操作简单，并且采用1次/分钟的振摇，进一步增加细胞与培养体系的接触，防止细胞团中间缺乏营养物质而得不到充分扩增。

3、以组合物形式将培养添加物质进行分类组合，简化了加样步骤，使得加样更加简便。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为表示根据本发明的NK细胞培养体系及方法进行培养后的NK细胞数的变化示意图；

图2为表示根据本发明的NK细胞培养体系及方法进行培养的NK细胞进行流式细胞术免疫表型分析示意图；

图3位表示采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定NK细胞对靶细胞K562的杀伤活性分析示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面结合实施例和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例.

如图1、图2和图3所示，一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系，所述的培养体系包括含GT-T551基础培养基、特异因子组合A和特异因子组合B；所述的特异因子组合A包含IL-2、IL-12、IL-15、lL-17，IL-18、IL-22，其中IL-2浓度为1000u/ml、IL-12的浓度为100-200ng/ml、IL-15的浓度为100-200ng/ml、IL-17的浓度为200-400ng/ml、IL-18的浓度为100-200ng/ml、IL-22的浓度为100-200ng/ml；所述的特异因子组合B包含来自天然中药物质提取物的单个成分或多个成分组合：为人参皂苷、三七皂苷、紫杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、黄芩素、沙苑子总黄酮、姜黄素、云芝多糖中的一种或两种物质组合，其浓度分别为人参皂苷2-5ug/ml、三七皂苷2-5ug/ml、紫杉醇2-6ug/ml、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)5-8ug/ml、黄芩素5-8ug/ml、沙苑子总黄酮3-5ug/ml、姜黄素3-5ug/ml、云芝多糖5-10ug/ml。

其中，所述的NK细胞是来自体，其来源为健康人或肿瘤患者的外周血液；在分离单个核细胞开始记第1天，细胞因子组合A加样于第1天，特异组合物B加样于第7天，前7天，每2天添加含IL-2的GT-T551培养基，后10-12天每3-4天添加含IL-2的GT-T551培养基。本NK细胞的培养体系成分简单，避免了动物血清中的动物成分对细胞治疗带来的风险及动物血清中不确定的成分对细胞培养造成的不确定性，提高了NK细胞得率，所获得的活化的NK细胞肿瘤杀伤效果显著，因此除了能应用于科研，也可应用于临床治疗。

在此基础上，本发明还提出了一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，包括以下步骤：采集并分离自体40ml外周血的单个核细胞，用含10％自身血浆的培养基重悬细胞，加入到用CD3抗体或CD56抗体包被的细胞培养瓶中，细胞因子组合A刺激，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育，并以一定速度振摇，6-7天后转入细胞培养袋中培养并补加含细胞因子组合B的培养基，培养期间，每隔3-4天在含有IL-2的基础培养基培养，共培养17-19天即可得到高纯度性的NK细胞。

操作时，在分离单个核细胞开始记第1天，细胞因子组合A加样于第1天，特异组合物B加样于第7天，前7天，每2天添加含IL-2的GT-T551培养基，后10-12天每3-4天添加含IL-2的GT-T551培养基。所述细胞培养瓶中包被抗CD-56单克隆抗体。所述细胞培养瓶振摇时，在约1-2下/分钟的振摇频率下进行，振摇角度为0-4度。培养的NK细胞含量在5X10⁹细胞数，培养的NK细胞纯度不低于80％。培养的NK细胞中不含T细胞及B细胞。

从自体外周血中分离PBMC细胞，并进行NK细胞培养：

1、抽取健康人或患者外周血40ml，肝素抗凝。将血加入到悬浮液中(血：悬浮液＝5:1)，轻轻混匀。将细胞分离液加入50ml离心管中，将血液及悬浮液混合物沿着管壁缓慢加入分离液中(血：分离液＝4：1)。放入离心机中离心2000r，30min，离心结束后将PBMC层取出，放于一个新的50ml离心管中。向取出的PBMC层中加入细胞洗液10ml，用吸管吹打数次，吹打匀后，放入离心机离心2000r，8min，离心结束，弃上清。依照上述步骤，加入6ml洗液，1500r，5min再洗一次。用PBS将包被好的培养瓶洗涤两次备用。向离心好的细胞中加入GT-T551基础培养基，用电动助吸器吹打数次，吹打匀后，转入准备好的培养瓶里，细胞接种浓度为1.5X10⁵个/ml。37℃，5％CO2饱和湿度下继续培养

2、抽取健康人或患者外周血10ml，促凝剂促凝，放入离心机中离心2000r，30min，分离血浆。将血浆收集56℃加热30分钟。将组合物A及组合物B用血清稀释至所需浓度。

3、在培养的第一天，加入组合物A。每隔两天加入基础培养基。至第七天时，离心收集细胞。对细胞进行计数。将细胞转移至包被好的培养袋中培养。

4、在第七天时，加入组合物B。每隔3-4天添加与原体积等量的基础培养基。第十二天，第十八天时对细胞进行计数。

流式细胞仪分析MACS分选后NK细胞的情况：

抽取最后一天的150μl细胞悬液，转移至1.5mlEP管中，300×g离心5min，弃上清。CD3/CD16+CD56免疫标记。使用移液器小心吸取各100μL样本置于三个标记管管底，注意不要碰到管壁。低速涡旋振荡3s，室温(20到25℃)避光孵育30分钟。孵育结束后，300×g离心5min，弃上清。每管加入0.5mL1×PBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5mL1％多聚甲醛，放4℃冰箱保存，48h内上机检测。

对培养的NK细胞进行细胞杀伤能力评价：

1.制备效应细胞在培养自然杀伤细胞第15天时，收取150ul细胞悬液，以2000rpm的转速进行离心分离，弃上清，加入2ml细胞培养液进行稀释。调整细胞浓度至3X10⁶个/ml，调节效应细胞与靶细胞比为30：1。

2.制备靶细胞将K562细胞复苏，培养。人白细胞K562细胞系为悬浮细胞,培养条件为含10％胎牛血清GT551，5％C02孵育。调整细胞浓度为1x10⁵/ml。

3.LDH底物溶液的配置NBT(硝基氯化四氮唑蓝)4mg、NAD+(氧化型辅酶I)10mg、PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)1mg加入2mLddH₂O溶解，混匀后取1.6ml，加1mol/L乳酸钠0.4ml后，加入0.1mol/LpH7.4的PBS至10ml。

4.取96孔圆底培养板，每孔三个复孔，按效靶比30:1加入靶细胞与效应细胞，并设效应细胞自然释放对照孔，每孔100ul效应细胞+100ul培养液，靶细胞对照孔设最大和最小孔，每孔100ul靶细胞+100ul培养液，并设本底和体积纠正孔，每孔200ul培养液，将培养板放置37℃，5％CO₂孵箱4小时，在最大孔和体积纠正空内加入20ul的lysisbuffer,放置30分钟。以1000转/分钟的转速离心10分钟后，每孔吸取50ul上清到相应平底培养板，再在避光的条件下加50ul反应底物，室温避光20至30分钟，待各孔液体颜色转深，加终止液50ul/孔，用振荡器将色素颗粒打散。将96孔板置于酶标仪检测492nm波长处的吸光度。

5.按下列公式计算杀伤率：

本发明的高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，操作简单，并且采用1次/分钟的振摇，进一步增加细胞与培养体系的接触，防止细胞团中间缺乏营养物质而得不到充分扩增。以组合物形式将培养添加物质进行分类组合，简化了加样步骤，使得加样更加简便。

以上所述的仅是本发明的一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系及培养方法优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系，其特征在于，所述的培养体系包括含GT-T551基础培养基、特异因子组合A和特异因子组合B；所述的特异因子组合A包含IL-2、IL-12、IL-15、lL-17，IL-18、IL-22，其中IL-2浓度为1000u/ml、IL-12的浓度为100-200ng/ml、IL-15的浓度为100-200ng/ml、IL-17的浓度为200-400ng/ml、IL-18的浓度为100-200ng/ml、IL-22的浓度为100-200ng/ml；所述的特异因子组合B包含来自天然中药物质提取物的单个成分或多个成分组合：为人参皂苷、三七皂苷、紫杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、黄芩素、沙苑子总黄酮、姜黄素、云芝多糖中的一种或两种物质组合，其浓度分别为人参皂苷2-5ug/ml、三七皂苷2-5ug/ml、紫杉醇2-6ug/ml、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)5-8ug/ml、黄芩素5-8ug/ml、沙苑子总黄酮3-5ug/ml、姜黄素3-5ug/ml、云芝多糖5-10ug/ml。

2.根据权利要求1所述的一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系，其特征在于，所述的NK细胞是来自体，其来源为健康人或肿瘤患者的外周血液。

3.根据权利要求2所述的一种高效体外扩增自体NK细胞的培养体系，其特征在于，所述的培养体系中不含动物血清。

4.一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：采集并分离自体40ml外周血的单个核细胞，用含10％自身血浆的培养基重悬细胞，加入到用CD3抗体或CD56抗体包被的细胞培养瓶中，细胞因子组合A刺激，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育，并以一定速度振摇，6-7天后转入细胞培养袋中培养并补加含细胞因子组合B的培养基，培养期间，每隔3-4天在含有IL-2的基础培养基培养，共培养17-19天即可得到高纯度性的NK细胞。

5.根据权利要求4所述的一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，其特征在于，在分离单个核细胞开始记第1天，细胞因子组合A加样于第1天，特异组合物B加样于第7天，前7天，每2天添加含IL-2的GT-T551培养基，后10-12天每3-4天添加含IL-2的GT-T551培养基。

6.根据权利要求4所述的一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，其特征在于，所述细胞培养瓶中包被抗CD-56单克隆抗体。

7.根据权利要求4所述的一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，其特征在于，所述细胞培养瓶振摇时，在约1-2下/分钟的振摇频率下进行，振摇角度为0-4度。

8.根据权利要求4所述的一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，其特征在于，培养的NK细胞含量在5X10⁹细胞数，培养的NK细胞纯度不低于80％。

9.根据权利要求4所述的一种高效体外扩增自体NK细胞的培养方法，其特征在于，培养的NK细胞中不含T细胞及B细胞。