CN110938595A - 一种高效体外培养脐血cik细胞的培养基及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效体外培养脐血CIK细胞的培养基及培养方法，属于生物技术领域。所述培养基组分包括AlyS505N‑0无血清基础培养基、细胞因子组合物A和天然的中药提取物。培养方法为：采集分离脐带血单个核细胞，重悬细胞，加入IFN‑γ活化，置于37℃、6%CO2培养箱中孵育，第二天加入细胞因子组合物A刺激，3‑5天后补充含中药提取物B的培养基，培养期间每隔2‑3天补充含中药提取物组合B的培养基，共培养15‑17天的到大量的CIK细胞。本培养基及培养方法能使CIK细胞大量增殖，其中细胞中CD3+CD56+双阳性细胞能达70%以上。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效体外培养CIK细胞的培养基及培养方法。
背景技术
CIK又称多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血或者脐带血的单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
CIK细胞在正常的人外周血中极其罕见，仅1%-5%，通过我们体外培养15天左右细胞迅速增殖，较培养前可扩增1000倍以上，其中效应细胞即同时表达CD3+CD56+的细胞不仅绝对数量增加1000倍以上，且所占比例也大幅提升。
而传统的培养基组合，培养时间需要25-28天细胞数量才达到平台期，细胞数量及细胞毒活性才能达到峰值。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种高效体外培养CIK细胞的培养基及培养方法。该方法能使CIK细胞15-17天快速扩增1000倍以上，获得高浓度的CIK细胞。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种高效体外培养CIK细胞的培养基，其组分包含：在AlyS505N-0无血清基础培养基中加入细胞因子组合物A和中药提取物B；其中细胞因子组合物A包含浓度为20-200IU/ml 的IL-1α、浓度为500-2000IU/ml的IL-2、浓度为20-100μg/ml的Lymactin-T；中药提取物B包含浓度1-5μg/ml的虫草素、浓度1-5μg/ml的人参皂苷、浓度3-8μg/ml的紫杉醇、浓度5-10μg/ml的茯苓多糖、浓度2-6μg/ml的黄芪甲苷和浓度3-5μg/ml的姜醇。
优选的，上述培养基中所述中药提取物B包含浓度2μg/ml的虫草素、浓度4μg/ml的人参皂苷、浓度4.5μg/ml的紫杉醇、浓度4μg/ml的茯苓多糖、浓度2.5μg/ml的黄芪甲苷和浓度4μg/ml的姜醇。
一种利用上述培养基高效体外培养CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）采集健康脐带血并分离脐带血单个核细胞，向核细胞中加入AlyS505N-0基础培养基，轻轻吹打，重悬混匀，转入细胞培养瓶中，细胞接种浓度为1.5×106个/ml，加入800IU/ml的IFN-γ，置入37℃，6%CO2饱和湿度下培养；
（2）培养至24小时，按培养基组分添加细胞因子组合A；继续置于37℃，6%CO2饱和湿度下培养；
（3）培养至72小时，按培养基组分添加含中药提取物B和300-800IU/ml IL-2的AlyS505N-0基础培养基，并继续置于37℃，6%CO2饱和湿度下培养；
（4）之后每隔2-3天，添加含300-800IU/ml IL-2的AlyS505N-0基础培养基，共培养15-17天的到大量的CIK细胞。
通过上述技术方案，本发明的培养体系具有如下有益效果：
1、成分明确，避免了动物血清中的动物成分，对细胞治疗带来的风险及动物血清中不确定成分对细胞培养造成的不确定性，提高了CIK细胞的增殖效率，用尽可能短的时间，获得所需的细胞数量，并且所得细胞中CD3+CD56+双阳性细胞能达50%以上。除了可应用于科研，也可应用于临床治疗。
2、以因子组合的形式添加细胞所需营养物质，简化了加样流程，使操作更为简便。
附图说明：
图1CIK细胞的细胞免疫表型结果图。
具体实施方式
参考下列实施例和具体实施方式将更容易理解本发明，给出的实施例不是限制本发明的范围。
实施例1：
一种高效体外培养CIK细胞的培养基组分，在AlyS505N-0无血清基础培养基中加入细胞因子组合A和中药提取物B。
培养基具体组分及含量如下：
1号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/mlIFN-γ +100IU/ml IL-1α+ 1200IU/mlIL-2+60μg/mlLymactin-T+3μg/ml虫草素；
2号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ + 200IU/ml IL-1α+500IU/mlIL-2+ 20μg/ml Lymactin-T+3μg/ml人参皂苷；
3号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ + 20IU/ml IL-1α+ 2000IU/ml IL-2+ 100μg/ml Lymactin-T+5μg/ml紫杉醇；
4号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ + 80IU/ml IL-1α+1000IU/mlIL-2+ 80μg/ml Lymactin-T+8μg/ml茯苓多糖；
5号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ +40IU/ml IL-1α+800IU/mlIL-2+50μg/ml Lymactin-T+4μg/ml黄芪甲苷；
6号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ +120IU/ml IL-1α+1500IU/mlIL-2+ 40μg/ml Lymactin-T+4μg/ml姜醇；
7号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ +100IU/ml IL-1α+1200IU/mlIL-2+ 60μg/ml Lymactin-T+2.5μg/ml虫草素+2.5μg/ml人参皂苷+3.5μg/ml紫杉醇+4.5μg/ml茯苓多糖+2μg/ml黄芪甲苷+3μg/ml姜醇；
8号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ +100IU/ml IL-1α+1200IU/mlIL-2+ 60μg/ml Lymactin-T+2μg/ml虫草素+4μg/ml人参皂苷+4.5μg/ml紫杉醇+4μg/ml茯苓多糖+2.5μg/ml黄芪甲苷+4μg/ml姜醇；
9号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ +100IU/ml IL-1α+ 1200IU/mlIL-2+ 60μg/mlLymactin-T+1μg/ml虫草素+5μg/ml人参皂苷+3μg/ml紫杉醇+7μg/ml茯苓多糖+5μg/ml黄芪甲苷+4.5μg/ml姜醇；
10号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ + 100IU/ml IL-1α+1200IU/mlIL-2+60μg/mlLymactin-T+4μg/ml虫草素+1.5μg/ml人参皂苷+6.5μg/ml紫杉醇+6μg/ml茯苓多糖+6μg/ml黄芪甲苷+5μg/ml姜醇；
11号：AlyS505N-0无血清基础培养基+ 800IU/ml IFN-γ +100IU/ml IL-1α+ 1200IU/mlIL-2+60μg/mlLymactin-T+5μg/ml虫草素+1μg/ml人参皂苷+7.5μg/ml紫杉醇+5.5μg/ml茯苓多糖+5.5μg/ml黄芪甲苷+3.5μg/ml姜醇。
所述的用于体外培养脐血CIK的制备方法，包括如下步骤；
（1）分离人脐带血单个核细胞：用含枸橼酸钠抗凝剂的釆血袋采集脐带血；将脐带血倒入50ml离心管中，800g，10min离心；离心结束后吸取上层血浆层到新的离心管中，将血浆1000g，离心15min；将血层等比例添加PBS缓冲液，轻轻混匀，缓慢加入到准备好的分离液（外周血：淋巴分离液=1.5:1）离心管中，保证界面清晰；放入离心机中离心，800g，20min，慢升慢降（升速1，降速0）；离心结束后将外周血单个核细胞（PBMC）层取出，放于一个新的50ml离心管中。向取出的PBMC层中加入PBS缓冲液，用移液管轻轻吹打数次，混匀后取少量液体计数，剩余离心1000g，6min；完成后，加入AlyS505N-0基础培养基，轻轻吹打，重悬混匀，转入准备好的培养瓶中，细胞接种浓度为1.5×106个/ml，加入800IU/mlIFN-γ，置入37℃，6%CO2饱和湿度下培养。
（2）培养至24小时，添加细胞因子组合A，继续置于37℃，6%CO2饱和湿度下培养。
（3）培养至72小时，按配不同培养基组分添加含中药提取物B和含300IU/ml IL-2的AlyS505N-0基础培养基，并继续置于37℃，6%CO2饱和湿度下培养。
（4）之后每隔2天，补充添加含添加含300IU/ml IL-2的AlyS505N-0基础培养基，共培养15天得到大量的CIK细胞。
（5）流式细胞仪分析CIK细胞情况：抽取第15天的200μl细胞悬液，转移至5ml离心管中，300g离心5min，弃上清，加入PBS重悬细胞，使细胞密度在5×106-10×106之间。CD3+，CD3+CD56+，CD3+CD8+免疫标记。使用移液器小心吸取各100μl样本置于三个标记管管底，注意不要碰到管壁。低速旋涡震荡4s，室温避光孵育15min，再次低速旋涡震荡混匀3s，室温避光孵育15min。孵育结束后，每管加入1mlPBS洗涤细胞，300g离心5min，弃上清。每管加入0.5ml PBS重悬混匀，4℃避光1h上机检测。
表1. CIK细胞培养基中药提取物B各组分添加表
注！表1基础方案培养基中不添加药提取物B，其余组分同实施方案。
表2. 不同培养基组分培养获得CIK细胞的细胞免疫表型
由表1和表2可以看出，1-6号培养基与基础培养基对照组相比差异不明显；而7-11号培养基与基础培养基对照组相比较具有显著性的差异；7-11号培养基组细胞增殖倍数平均是基础培养基对照组的1.7倍以上；7-11号培养基组CD3+细胞占比高于对照组的10%以上，7-11号培养基组CD3+CD56+双阳性细胞最高超过对照组20%以上。其中8号组其扩增比例最大，CD3+和CD3+CD56+双阳性差异也最明显，8号培养基培养所得CIK细胞的细胞免疫表型结果见图1。
本发明的高效体外培养脐血CIK细胞的培养方法，采用6%CO2浓度，进一步提高了细胞增殖效率，大大缩短了培养时间。以因子组合的形式添加细胞所需营养物质，简化了加样流程，使操作更为简便。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种高效体外培养CIK细胞的培养基，其特征在于，所述培养基组分包含：在AlyS505N-0无血清基础培养基中添加细胞因子组合物A和中药提取物B；其中细胞因子组合物A包含浓度为20-200IU/ml 的IL-1α、浓度为500-2000IU/ml的IL-2、浓度为20-100μg/ml的Lymactin-T；中药提取物B包含浓度1-5μg/ml的虫草素、浓度1-5μg/ml的人参皂苷、浓度3-8μg/ml的紫杉醇、浓度5-10μg/ml的茯苓多糖、浓度2-6μg/ml的黄芪甲苷和浓度3-5μg/ml的姜醇。
2.根据权利要求1所述的一种高效体外培养CIK细胞的培养基，其特征在于：所述中药提取物B包含浓度2μg/ml的虫草素、浓度4μg/ml的人参皂苷、浓度4.5μg/ml的紫杉醇、浓度4μg/ml的茯苓多糖、浓度2.5μg/ml的黄芪甲苷和浓度4μg/ml的姜醇。
3.一种利用如权利要求1所述培养基高效体外培养CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采集健康脐带血并分离脐带血单个核细胞，向核细胞中加入AlyS505N-0基础培养基，轻轻吹打，重悬混匀，转入细胞培养瓶中，细胞接种浓度为1.5×106个/ml，加入800IU/ml的IFN-γ，置入37℃，6%CO2饱和湿度下培养；
（2）培养至24小时，按培养基组分添加细胞因子组合A，继续置于37℃，6%CO2饱和湿度下培养；
（3）培养至72小时，按培养基组分添加含中药提取物B和300-800IU/ml IL-2的AlyS505N-0基础培养基，并继续置于37℃，6%CO2饱和湿度下培养；
（4）之后每隔2-3天，补充添加含300-800IU/ml IL-2的AlyS505N-0基础培养基，共培养15-17天的到大量的CIK细胞。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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