CN111944754A - 一种自然杀伤细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自然杀伤细胞的培养方法：(一)包被：用Erb‑B2作为包被液预先包被培养容器底部；(二)培养：用激活培养液A重悬外周血单个核细胞，置于上述预先包被的培养容器中，转移至培养箱中培养；培养第3～5天，补加1～2次活化培养液B，培养第7～8天补加扩增培养液C，之后每2～3天补加一次；共培养14～21天。所述激活培养液A，是由基础培养液、IL‑15、IL‑18、IL‑21、IL‑27和NK细胞外泌体组成的；所述活化培养液B，是由基础培养液和IL‑15组成的；所述扩增培养液C，是由基础培养液和IL‑2组成的。本发明的培养方法，所得NK细胞的比例高，扩增倍数可达210倍，操作简单，能够收获较高比例的NK细胞，提高生产效率和治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种自然杀伤细胞的培养方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural Killer cell；NK细胞)是先天免疫系统的淋巴细胞。它们通过识别和杀死感染的、转化的或自反应的细胞(stressed cell)而发挥先天的前哨作用，这些细胞利用专门的细胞毒性颗粒的定向胞吐机制(其中含有穿孔素，颗粒酶和Fas配体)，通过种系编码的抑制和激活受体传递的负信号和正信号之间的平衡，控制了NK细胞的功能。除了杀死靶细胞外，NK细胞也是细胞因子和趋化因子的主要来源。在与易感的靶细胞相互作用后或在被细胞因子(例如IL-15，IL-12和IL-18)激活后，NK细胞产生IFN-γ和TNF-α或其他细胞因子。因此，NK细胞还通过分泌细胞因子和趋化因子来促进或抑制其他免疫细胞的功能，从而发挥调节作用。NK细胞可通过与其他免疫细胞(例如T细胞，B细胞和树突状细胞)相互影响并产生细胞因子或趋化因子来塑造适应性免疫反应。它们可以通过杀死抗原呈递细胞(APC)或过度活化的T细胞或产生抗炎细胞因子(例如IL-10)来调节免疫反应，以防止过强的炎症反应。近年来，有大量文献报道NK细胞在肿瘤免疫及治疗中的临床疗效，而NK细胞的体外培养技术做为影响其应用及发展的关键技术越来越被重视。
NK细胞的体外培养主要包括滋养层细胞法和纯因子培养法。滋养层细胞法利用人白血病K562细胞系，经过基因工程改造后与单个核细胞进行共培养，以激活诱导NK细胞。纯因子培养法仅需选择不同配比的细胞因子，即可实现NK细胞的激活和扩增，相比之下，操作更加简单便捷。目前市面上在售的NK细胞试剂盒多采用纯因子培养法，广泛使用的因子包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和TNFα等。目前市场上已有的试剂盒或者NK细胞大多存在增殖速度缓慢、扩增效率较低，或者NK细胞纯度较低(30％～70％)等不足之处。申请人在之前的生产过程中，分别使用过国内多个公司的NK培养试剂盒，结果发现实际培养并未达到其宣传的效果，培养后CD3-CD56+细胞比率偏低且差异较大，所以有必要研发更高效的NK细胞培养试剂盒，可提高NK细胞的比例和数量，同时降低生产成本、缩短培养时间。
根据相关文献报道，IL-15、IL-18、IL-21和IL-27四种因子对NK细胞活化具有促进作用，IL-15，IL-18和IL-21是在NK和T细胞中具有重要功能的细胞因子。IL-15和IL-18是巨噬细胞衍生的细胞因子，而IL-21主要由活化的T细胞产生。IL-15是外周T细胞成熟必不可少的，对IL-15和IL-15R敲除(KO)小鼠的研究表明，缺乏功能性IL-15系统也会导致NK细胞数量严重减少。相反，由于NK和记忆CD8+T细胞的早期扩增，IL-15转基因小鼠患有致命性白血病。IL-18KO小鼠的NK细胞反应也受损。此外，IL-18中的一个重要辅助因子IFN-γ基因活化和它需要两个无细菌和病毒诱导的IFN-γ产生。IL-21在结构上与IL-15相关，其受体主要在B细胞，NK细胞和T细胞上表达。与IL-15R KO小鼠相反，IL-21R KO小鼠的NK和T细胞正常发育。但是，这些小鼠的NK细胞功能受损。公共细胞因子受体γ链(γ
)受体对IL-2，IL-4，IL-7，IL-9和IL-15共享，也是IL-21R复合物的功能部件。IL-27能够提高NK细胞细胞毒性颗粒的胞外分泌，增强抗肿瘤活性。外泌体作为细胞分泌物，具有免疫应答、信号呈递、激活NK细胞等功能。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种自然杀伤细胞的培养方法。本发明选择多种白介素及NK细胞外泌体的组合，考察其对NK细胞活化和增殖的影响，并选择最优方案转化为产品，用于生产和临床应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种自然杀伤细胞的培养方法，包括以下步骤：
(一)包被：用Erb-B2(酪氨酸激酶受体2)作为包被液预先包被培养容器底部；
(二)培养：用激活培养液A重悬外周血单个核细胞(PBMC细胞)，置于上述预先包被的培养容器中，转移至二氧化碳培养箱中培养，培养条件：37℃、95％饱和湿度、5％二氧化碳浓度；培养第3～5天，补加1～2次活化培养液B，培养第7～8天补加扩增培养液C，之后每2～3天补加一次扩增培养液C；共培养14～21天。
所述激活培养液A，是由基础培养液、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27和NK细胞外泌体(NK细胞外泌体，是现有技术中已有的常规产品，可常规市场购买得到，也可用常规方法制备得到)组成的，其中，IL-15的浓度为80～120ng/ml，IL-18的浓度为80～120ng/ml，IL-21的浓度为80～120ng/ml，IL-27的浓度为80～120ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为0.8～1.2×106个/ml。
所述活化培养液B，是由基础培养液和IL-15组成的，IL-15的浓度为80～120ng/ml。
所述扩增培养液C，是由基础培养液和IL-2组成的，IL-2的浓度为450～550ng/ml。
所述基础培养液选自淋巴细胞无血清培养液，优选Corning KBM 581淋巴细胞无血清培养液。
进一步的，所述步骤(一)用Erb-B2作为包被液预先包被培养容器底部的具体方式为：取培养容器，加入Erb-B2包被液，轻轻摇晃，使溶液在培养容器底部扩散，铺满瓶底；4℃下保存，备用；使用前移出包被液，用PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)洗涤培养容器，立即使用(用于培养NK细胞)。
进一步的，所述PBMC细胞，是通过以下方式提取得到的：向采集的外周血中加入适量PBS缓冲液进行稀释，加入适量淋巴细胞分离液，离心分层，分为四层：血浆层，单个核细胞层，分离液层，多形核白细胞和红细胞层；吸取单个核细胞层，加入适量PBS缓冲液，离心，得PBMC细胞，备用。
进一步的，所述步骤(二)培养的具体方式为：
(1)用激活培养液A重悬PBMC细胞，调整细胞密度至0.6×106～1.2×106cells/mL，转移至二氧化碳培养箱中培养，培养条件：37℃、95％饱和湿度、5％二氧化碳浓度；
(2)培养第3天，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×106～1.2×106cells/mL；
(3)培养第5天，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×106～1.2×106cells/mL；
(4)培养第7天，加入扩增培养液C，调整细胞密度至1.5×106cells/mL，此后每两天补液(扩增培养液C)一次，连续培养14～21天。
进一步的，所述激活培养液A中IL-15、IL-18、IL-21、IL-27的浓度均为100ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为1.0×106个/ml。
进一步的，所述活化培养液B中IL-15的浓度为100ng/ml。
进一步的，所述扩增培养液C中IL-2的浓度为500ng/ml。
一种用于培养自然杀伤细胞的培养液，由激活培养液A、活化培养液B和扩增培养液C构成，其中，所述激活培养液A，是由基础培养液、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27和NK细胞外泌体组成的，其中，IL-15的浓度为80～120ng/ml，IL-18的浓度为80～120ng/ml，IL-21的浓度为80～120ng/ml，IL-27的浓度为80～120ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为0.8～1.2×106个/ml。
所述活化培养液B，是由基础培养液和IL-15组成的，IL-15的浓度为80～120ng/ml。
所述扩增培养液C，是由基础培养液和IL-2组成的，IL-2的浓度为450～550ng/ml。
所述基础培养液选自淋巴细胞无血清培养液，优选Corning KBM 581淋巴细胞无血清培养液。
进一步的，所述激活培养液A中IL-15、IL-18、IL-21、IL-27的浓度均为100ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为1.0×106个/ml。
进一步的，所述活化培养液B中IL-15的浓度为100ng/ml。
进一步的，所述扩增培养液C中IL-2的浓度为500ng/ml。
本发明的自然杀伤细胞培养方法，选择Erb-B2作为包被液预先包被培养容器底部；利用特定组分组成的培养液A、培养液B、培养液C培养，所得NK细胞的比例高，扩增倍数可达210倍，明显优于常规方法。
本发明的培养方法，操作简单，省时省力，只需有过无菌操作经验即可进行操作，且避免了繁琐的操作降低出现污染的风险，同时能够收获较高比例的NK细胞，提高生产效率和治疗效果。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：实施例1的培养结果示意图(培养第7天)。
图2：实施例1的培养结果示意图(培养第9天)。
图3：实施例1的培养结果示意图(培养第11天)。
图4：实施例1的培养结果示意图(培养第14天)。
其中，a组为无包被液处理组，其中a1为培养第7天，a2为培养第9天，a3为培养第11天，a4为培养第14天，b组为本发明试剂盒处理组，其中b1为培养第7天，b2为培养第9天，b3为培养第11天，b4为培养第14天，c组为经典NK细胞培养方法处理组，其中c1为培养第7天，c2为培养第9天，c3为培养第11天，c4为培养第14天。
图5：实施例1的NK细胞比例变化统计结果示意图。
图6：实施例1的细胞扩增倍数示意图。
图7：实施例2的培养结果示意图(培养第7天)。
图8：实施例2的培养结果示意图(培养第11天)。
图9：实施例2的培养结果示意图(培养第14天)。
图10：实施例2的培养结果示意图(培养第17天)。
图11：实施例2的培养结果示意图(培养第21天)。
其中，a组为本发明试剂盒处理组，其中a1为培养第7天，a2为培养第11天，a3为培养第14天，a4为培养第17天，a5为培养第21天，b组为经典NK细胞培养方法处理组，其中b1为培养第7天，b2为培养第11天，b3为培养第14天，b4为培养第17天，b5为培养第21天。
图12：实施例2的NK细胞比例变化统计结果示意图。
图13：实施例2的细胞扩增倍数示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1
(一)外周血PBMC提取
1.以200ml采血袋(含总枸橼酸1.916％～2.118％，g/ml)采集外周血150～200ml，分装至50ml离心管中，每管10ml，加入等体积PBS(磷酸缓冲盐溶液)稀释。
2.另取50ml离心管加入20ml淋巴细胞分离液，倾斜放置，沿侧壁缓缓加入上述稀释的血液。
3.轻轻竖起离心管，室温，975g，离心20分钟，升降速加速度均为1。
4.离心后分离液分为四层，由上至下分别为：血浆层，单个核细胞层，分离液层，多形核白细胞和红细胞层；用巴氏吸管小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新的50ml离心管中。
5.每管收集10～20ml PBMC悬液，补加PBS至40ml，室温，300g离心10分钟，重复2～3次。
(二)NK细胞活化
1.培养瓶抗体包被：
(1)取2个T-75cm2培养瓶，分别加入5ml Erb-B2(酪氨酸激酶受体2)包被液；
(2)轻轻摇晃，使溶液在培养瓶瓶底扩散，铺满瓶底；
(3)保存在4℃，使用前取出；
(4)移除包被溶液，用10mlPBS洗涤瓶底1次，洗过的培养瓶要立即使用。
2.根据实验分组配制活化培养液
基础培养液：本发明中基础培养液选择Corning KBM 581淋巴细胞无血清培养液。
激活培养液A：将IL-15、IL-18、IL-21和IL-27四种因子均以终浓度100ng/ml加入到基础培养液中，将NK细胞外泌体以1×106个/ml加入到基础培养液中，形成培养液A。
活化培养液B：将IL-15以终浓度100ng/ml加入到基础培养液中，形成培养液B。
扩增培养液C：将IL-2以终浓度500u/ml加入到基础培养液中，形成培养液C。
实验分组方式为：实验组1为无包被液处理组，实验组2为包被液处理组，实验组3为经典NK细胞培养方法处理组【IL-2(10ng/ml),IL-15(20ng/ml),IL-12(20ng/ml)，IL-21(30ng/ml)，PHA-P(5μg/ml)】。
3.PBMC细胞接种：取步骤(一)中的PBMC细胞，975g离心10分钟，使用激活培养液A重悬细胞，补加激活培养液A调整细胞密度至0.6×106～1.2×106cells/mL，每个包被的T75培养瓶中加入20ml细胞悬液，转移至37℃、95％饱和湿度、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培养。
4.第一次补液：培养第三天，计数细胞密度，取样进行流式检测，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×106～1.2×106cells/mL。
5.第二次补液：培养第五天，计数细胞密度，取样进行流式检测，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×106～1.2×106cells/mL。
6.当培养液总体积接近容器最大值时，将细胞整体转移至更大的容器。
7.更换扩增培养液:培养第七天，计数细胞密度，取样进行流式检测，加入扩增培养液C，调整细胞密度至1.5×106cells/mL，此后每两天补液(扩增培养液C)一次，连续培养14～21天。
(三)NK细胞鉴定
1.将1ml上述培养的细胞悬液转移至1.5ml离心管中。4℃，300g离心5分钟，仔细吸掉上清。
2.用适量PBS清洗细胞，4℃，300g离心5分钟，仔细吸掉上清。
3.用预冷的PBS重悬细胞，调整细胞终浓度为1×107cells/ml，轻轻吹打混匀。
4.取100μl细胞悬液作为空白对照组，取100μl细胞悬液作为平行对照组加入ISOtype FITC、PerCP、PE-Cy7和PE抗体，取200μl作为实验组加入CD45-PerCP、CD3-FITC、CD16-PE-Cy7和CD56-PE抗体，4℃孵育30～40分钟。
5.加入适量PBS清洗细胞，4℃，300g离心5分钟，仔细吸掉上清。
6.500μl PBS重悬细胞，上机检测。
(四)流式细胞收集
1.提前开启SA3800全光谱流式细胞分析仪，进行预热及设备自检。
2.新建实验：选择“Preparation”向导标签，进入实验预备界面，点击“ExperimentTemplate”按钮，选择“Blank Template”，在Name文本框输入命名信息，点击“CreateExperiment”，即可创建新的实验模板。
3.放入Sample-S样本管，点击“Preview”，设置“Fluorescence PMT Voltage”值，使Intensity_H最高值在105附近，点击“Stop”卸载Sample-S样本管。
4.放入Unstained样本管，点击“Preview”，设置其他参数，进行绝对计数时切勿使用FSC设置阈值！
5.收集各组细胞：放入待测样本管，点击“Preview”，待Flow condition状态变为Stable时，点击“Acquire”进行收集。收集开始后同组实验必须采用相同参数，如有更改，则全部重新收集。
(五)流式结果分析
1.添加所用Marker及其对应荧光信号。
2.导入数据库中对应的荧光曲线。对于新的荧光信号应单独设立阳性对照管建立曲线。
3.选择Unstained组，圈出主要细胞群，设定为A门。设FSC-H/FSC-A，显示A门内细胞，圈出单细胞群B。
4.设侧向角散射SSC-H/CD45，显示B门内细胞，设定C门：包括所有CD45非阴性细胞。
5.设FSC-H/FSC-A，显示C门内细胞，设定D门：包括所有单个细胞。
6.设SSC-H/CD3，显示D门内细胞，设定R3：包括所有CD3非阴性细胞。
7.设SSC-H/CD56，显示D门内细胞，设定R56：包括所有CD56非阴性细胞。
8.设CD3/CD56，显示D门内细胞，设定十字象限门W：参考步骤5和7确定X轴和Y轴位置，第一象限包含CD3-、CD56+细胞。
9.保存数据，清洗并关闭仪器。
(六)实验结果
如图1～6所示，实验组2的NK细胞比例最高(68.32％～90.16％，且随着培养时间的增加，比例逐渐增加)，明显优于实验组1、3(均在70％以下，在同样的培养天数时，明显低于实验组2的NK细胞比例；且实验组1在培养第14天时比例反而有所降低)；在培养第14天，实验组2的细胞的扩增倍数可达210倍，而实验组1、3的扩增倍数为170倍，实验组2明显优于实验组1、3。
实施例2
(一)脐带血CBMC提取
1.以200ml采血袋(含总枸橼酸1.916％～2.118％，g/ml)采集脐带血150～200ml，分装至50ml离心管中，每管10ml，加入等体积PBS稀释。
2.另取50ml离心管加入20ml淋巴细胞分离液，倾斜放置，沿侧壁缓缓加入上述稀释的血液。
3.轻轻竖起离心管，室温，975g，离心20分钟，升降速加速度均为1。
4.离心后分离液分为四层，由上至下分别为：血浆层，单个核细胞层，分离液层，多形核白细胞和红细胞层。用巴氏吸管小心吸取中间白膜层，即单个核细胞层，转移至新的50ml离心管中。
5.每管收集10～20mlPBMC悬液，补加PBS至40ml，室温，300g离心10分钟，重复2～3次。
(二)NK细胞活化
1.培养瓶抗体包被：
(1)取2个T-75cm2培养瓶，分别加入5ml Erb-B2(酪氨酸激酶受体2)包被液；
(2)轻轻摇晃，使溶液在培养瓶瓶底扩散，铺满瓶底；
(3)保存在4℃，使用前取出；
(4)移除包被溶液，用10mlPBS洗涤瓶底1次，洗过的培养瓶要立即使用。
2.根据实验分组配制活化培养液
基础培养液：本发明中基础培养液选择Corning KBM 581淋巴细胞无血清培养液。
激活培养液A：将IL-15、IL-18、IL-21和IL-27四种因子以终浓度100ng/ml加入到基础培养液中，NK细胞外泌体以1×106个/ml加入到基础培养液中形成培养液A。
活化培养液B：将IL-15以终浓度100ng/ml加入到基础培养液中，形成培养液B。
扩增培养液C：将IL-2以终浓度500u/ml加入到基础培养液中，形成培养液C。
实验组1为本发明处理组，实验组2为经典NK细胞培养方法处理组【IL-2(10ng/ml),IL-15(20ng/ml),IL-12(20ng/ml)，IL-21(30ng/ml)，PHA-P(5μg/ml)】。
3.PBMC细胞接种：取步骤(一)中的PBMC细胞，975g离心10分钟，使用激活培养液A重悬细胞，补加激活培养液A调整细胞密度至0.6×106～1.2×106cells/mL，每个包被的T75培养瓶中加入20ml细胞悬液，转移至37℃、95％饱和湿度、5％二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培养。
4.第一次补液：外周血第三天，计数细胞密度，取样进行流式检测，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×106～1.2×106cells/mL。
5.第二次补液：外周血第五天，计数细胞密度，取样进行流式检测，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×106～1.2×106cells/mL。
6.当培养液总体积接近容器最大值时，将细胞整体转移至更大的容器。
7.更换扩增培养液:外周血第七天，计数细胞密度，取样进行流式检测，加入扩增培养液C，调整细胞密度至1.5×106cells/mL，此后每两天补液一次，连续培养14～21天。
(三)NK细胞鉴定
1.将1ml细胞悬液转移至1.5ml离心管中。4℃，300g离心5分钟，仔细吸取或倒掉上清。
2.用适量PBS清洗细胞，4℃，300g离心5分钟，仔细吸掉上清。
3.用预冷的PBS重悬细胞，调整细胞终浓度为1×107cells/ml，轻轻吹打混匀。
4.取100μl细胞悬液作为空白对照组，取100μl细胞悬液作为平行对照组加入ISOtype FITC、PerCP和PE抗体，取200μl作为实验组加入CD45-PerCP、CD3-FITC和CD56-PE抗体，4℃孵育30～40分钟。
5.加入适量PBS清洗细胞，4℃，300g离心5分钟，仔细吸掉上清。
6.500μl PBS重悬细胞，上机检测。
(四)流式细胞收集
1.提前开启SA3800全光谱流式细胞分析仪，进行预热及设备自检。
2.新建实验：选择“Preparation”向导标签，进入实验预备界面，点击“ExperimentTemplate”按钮，选择“Blank Template”，在Name文本框输入命名信息，点击“CreateExperiment”，即可创建新的实验模板。
3.放入Sample-S样本管，点击“Preview”，设置“Fluorescence PMT Voltage”值，使Intensity_H最高值在105附近，点击“Stop”卸载Sample-S样本管。
4.放入Unstained样本管，点击“Preview”，设置其他参数，进行绝对计数时切勿使用FSC设置阈值！
5.收集各组细胞：放入待测样本管，点击“Preview”，待Flow condition状态变为Stable时，点击“Acquire”进行收集。收集开始后同组实验必须采用相同参数，如有更改，则全部重新收集。
(五)流式结果分析
1.添加所用Marker及其对应荧光信号。
2.导入数据库中对应的荧光曲线。对于新的荧光信号应单独设立阳性对照管建立曲线。
3.选择Unstained组，圈出主要细胞群，设定为A门。设FSC-H/FSC-A，显示A门内细胞，圈出单细胞群B。
4.设侧向角散射SSC-H/CD45，显示B门内细胞，设定C门：包括所有CD45非阴性细胞。
5.设FSC-H/FSC-A，显示C门内细胞，设定D门：包括所有单个细胞。
6.设SSC-H/CD3，显示D门内细胞，设定R3：包括所有CD3非阴性细胞。
7.设SSC-H/CD56，显示D门内细胞，设定R56：包括所有CD56非阴性细胞。
8.设CD3/CD56，显示D门内细胞，设定十字象限门W：参考步骤5和7确定X轴和Y轴位置，第一象限包含CD3-、CD56+细胞。
9.保存数据，清洗并关闭仪器。
(六)实验结果
如图7～13所示，实验组1的NK细胞比例最高(由44.78％逐渐增加至98.47％)，明显优于实验组2(在同样的培养天数时，明显低于实验组1，且随着培养天数的增加，比例并未有明显变化)；在培养第21天，实验组1的细胞的扩增倍数可达210倍，而实验组2的扩增倍数为50倍，实验组1明显优于实验组2。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(一)包被：用Erb-B2(酪氨酸激酶受体2)作为包被液预先包被培养容器底部；
(二)培养：用激活培养液A重悬外周血单个核细胞(PBMC细胞)，置于上述预先包被的培养容器中，转移至培养箱中培养；培养第3～5天，补加1～2次活化培养液B，培养第7～8天补加扩增培养液C，之后每2～3天补加一次扩增培养液C；共培养14～21天；
所述激活培养液A，是由基础培养液、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27和NK细胞外泌体组成的，其中，IL-15的浓度为80～120ng/ml，IL-18的浓度为80～120ng/ml，IL-21的浓度为80～120ng/ml，IL-27的浓度为80～120ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为0.8～1.2×106个/ml；
所述活化培养液B，是由基础培养液和IL-15组成的，IL-15的浓度为80～120ng/ml；
所述扩增培养液C，是由基础培养液和IL-2组成的，IL-2的浓度为450～550ng/ml；
所述基础培养液选自淋巴细胞无血清培养液。
2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(一)用Erb-B2作为包被液预先包被培养容器底部的具体方式为：取培养容器，加入Erb-B2包被液，轻轻摇晃，使溶液在培养容器底部扩散，铺满瓶底；4℃下保存，备用；使用前移出包被液，用PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)洗涤培养容器。
3.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述PBMC细胞，是通过以下方式提取得到的：向采集的外周血中加入适量PBS缓冲液进行稀释，加入适量淋巴细胞分离液，离心分层，分为四层：血浆层，单个核细胞层，分离液层，多形核白细胞和红细胞层；吸取单个核细胞层，加入适量PBS缓冲液，离心，得PBMC细胞，备用。
4.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(二)中，在培养箱中培养的具体条件为：37℃、95％饱和湿度、5％二氧化碳浓度。
5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(二)培养的具体方式为：
(1)用激活培养液A重悬PBMC细胞，调整细胞密度至0.6×106～1.2×106cells/mL，转移至二氧化碳培养箱中培养；
(2)培养第3天，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×106～1.2×106cells/mL；
(3)培养第5天，加入活化培养液B，调整细胞密度至1.0×106～1.2×106cells/mL；
(4)培养第7天，加入扩增培养液C，调整细胞密度至1.5×106cells/mL，此后每两天补液一次，连续培养14～21天。
6.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述激活培养液A中IL-15、IL-18、IL-21、IL-27的浓度均为100ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为1.0×106个/ml；
或/和：所述活化培养液B中IL-15的浓度为100ng/ml；
或/和：所述扩增培养液C中IL-2的浓度为500ng/ml。
7.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：所述基础培养液选自Corning KBM 581淋巴细胞无血清培养液。
8.一种用于培养自然杀伤细胞的培养液，其特征在于：由激活培养液A、活化培养液B和扩增培养液C构成，其中，所述激活培养液A，是由基础培养液、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27和NK细胞外泌体组成的，其中，IL-15的浓度为80～120ng/ml，IL-18的浓度为80～120ng/ml，IL-21的浓度为80～120ng/ml，IL-27的浓度为80～120ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为0.8～1.2×106个/ml；
所述活化培养液B，是由基础培养液和IL-15组成的，IL-15的浓度为80～120ng/ml；
所述扩增培养液C，是由基础培养液和IL-2组成的，IL-2的浓度为450～550ng/ml。
所述基础培养液选自淋巴细胞无血清培养液。
9.根据权利要求8所述的用于培养自然杀伤细胞的培养液，其特征在于：所述激活培养液A中IL-15、IL-18、IL-21、IL-27的浓度均为100ng/ml，NK细胞外泌体的浓度为1.0×106个/ml；
或/和：所述活化培养液B中IL-15的浓度为100ng/ml；
或/和：所述扩增培养液C中IL-2的浓度为500ng/ml。
10.根据权利要求8所述的用于培养自然杀伤细胞的培养液，其特征在于：所述基础培养液选自Corning KBM 581淋巴细胞无血清培养液。
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