CN107022524A - 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法 - Google Patents
一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107022524A CN107022524A CN201710151061.1A CN201710151061A CN107022524A CN 107022524 A CN107022524 A CN 107022524A CN 201710151061 A CN201710151061 A CN 201710151061A CN 107022524 A CN107022524 A CN 107022524A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell
- large amount
- amplification
- pmnc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
- C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
- C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,包括:采集外周血的单个核细胞,先将单个核细胞放入被CD16单抗包被过的培养瓶中培养,培养基中加入IL‑2、IL‑15、OK432和灭活的自体血清;随后将细胞转入到没有被CD16单抗包被过的培养瓶中培养,培养基中加入IL‑2、IL‑15和灭活的自体血清;再把细胞转移到培养袋中培养,倒数第三天培养基中加入IL‑4继续培养,即得大量NK细胞。本发明不含动物血清和肿瘤细胞成分,从而很大程度上提高了NK细胞的安全性和可靠性,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞分化和培养领域,特别涉及一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer,NK)来源于骨髓淋巴样干细胞,其分化、发育依赖于骨髓或胸腺微环境,主要分布于外周血和脾脏,在淋巴结和其他组织中也有少量存在。NK细胞不表达特异性抗原识别受体,是不同于T、B淋巴细胞的第三类淋巴细胞。NK细胞表达CD56但是缺失CD3,通常用标志物组合CD3-CD56+来定义NK细胞。NK细胞主要存在于外周血和脾脏中,大概占到外周血淋巴细胞的5%~15%。
NK细胞在无需抗原预先致敏的情况下就能直接杀伤肿瘤细胞和被感染的细胞。NK细胞可以通过多种方式杀伤靶细胞:1、与靶细胞接触后,NK细胞通过释放穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞;2、通过自身表达的配体,来激活靶细胞表面的死亡受体;3、通过抗体依赖的细胞毒性作用对靶细胞造成杀伤;4、活化的NK细胞通过释放TNF引发靶细胞的细胞凋亡。
NK细胞是人体的第一道抵御防线,是机体抵抗恶性肿瘤细胞和抗病毒感染的重要免疫调节细胞,也是连接天然免疫和特异性免疫的重要桥梁。外周血中的NK细胞数量非常有限,所以限制了NK细胞的临床应用。当今获得临床级NK细胞的方法是体外培养,即分离患者外周血的单个核细胞进行诱导和扩增,使其增加数百甚至数千倍并且细胞毒性得到很大的提高,再把NK细胞回输到患者的体内,但是常规的NK细胞的制备方法并不理想。
NK细胞在体外难以得到大量增殖,常见的NK细胞的扩增方法包括免疫磁珠分选法(Miller JS,et al.,Blood 105(8):3051-7,2005)、滋养层细胞培养法(Fujisaki H,etal.,Cancer Res 69(9):4010-7,2009)和使用动物血清(Iliopoulou EG,et al.,CancerImmunol Immunother 59(12):1781-9,2010)。动物血清能提供细胞培养所需要的营养物质,还能提供激素和各种生长因子。然而,动物血清成分复杂,在临床治疗中有一些潜在的风险。使用滋养层细胞(例如肿瘤细胞株K562)是一种有效的NK细胞培养方法。不使用滋养层细胞其培养效果和培养纯度均不够理想,使用滋养层细胞会得到纯度较高的NK细胞,但是K562细胞本身是一种肿瘤细胞,所以其安全性仍然是一个问题。免疫磁珠的方法过程繁琐,成本较高,并且纯的NK细胞增殖速度较慢,还会引入外源性物质(磁珠、洗脱液中的成分和抗体等)。
发明内容
为了解决现有技术中NK细胞纯度不够、扩增倍数不高、扩增方法成本高且比较麻烦以及安全性不够的问题,本发明提供了一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,该方法不含动物血清和肿瘤细胞成分,从而很大程度上提高了NK细胞的安全性和可靠性,具有良好的应用前景。
本发明的一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,包括:
采集100~200ml外周血的单个核细胞,先将单个核细胞放入被CD16单抗包被过的培养瓶中培养,培养基中加入IL-2、IL-15、OK432和灭活的自体血清;随后将细胞转入到没有被CD16单抗包被过的培养瓶中培养,培养基中加入IL-2、IL-15和灭活的自体血清;再把细胞转移到培养袋中培养,倒数第三天培养基中加入IL-4继续培养,即得大量NK细胞。
所述CD16单抗浓度为0.01~3.0mg/mL,包被温度为4℃,包被时间为2~16小时。优选浓度为0.15mg/mL,优选包被时间为16小时。
所述含IL-2、IL-15、OK432和灭活的自体血清的培养基的具体组成为:100~1000U/mL的IL-2、10~200ng/mL的IL-15、0.01~1KE/mL的OK432和5~10%灭活的自体血清。优选:700U/mL的IL-2、100ng/mL的IL-15、0.01KE/mL的OK432和10%灭活的自体血清。
所述含IL-2、IL-15和灭活的自体血清的培养基的具体组成为:100~1000U/mL的IL-2、10~200ng/mL的IL-15和5~10%灭活的自体血清。
所述培养基为GT-T551无血清培养基。
所述单个核细胞放入被CD16单抗包被过的培养瓶中培养三至五天,优选五天。
所述转移到培养袋中培养后每2-3天细胞传代或者换液一次。
所述倒数第三天培养基中加入300~500U/mL的IL-4,优选500U/mL。
能用于NK细胞的培养基有很多种,只要可以把外周血单个核细胞诱导成为NK细胞并使之增殖即可,常见NK细胞的培养基通常有x-vivo 10、x-vivo 20、GT-T551无血清培养基、OpTmizer CST T-cell expansion无血清培养基和CellGro无血清培养基等。本发明使用的NK培养基是GT-T551无血清培养基。
本发明所添加的细胞因子包含白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素15(IL-15)。在缺失受体γc(common chain gama)的老鼠中未能检测到NK细胞,因此认为受体γc对NK细胞的发育起到至关重要的作用(DiSanto JP,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A92(2):377-81,1995)。细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的细胞受体都包含受体γc(Waldmann TA,Cancer Immunol Res 3(3):219-27,2015)。敲除基因IL-2会造成NK细胞的缺失(DiSanto JP,et al.,J.Exp.Med 171(5):1697-704,1990),IL-2能够提高NK细胞的增殖能力(Shibuya A,et al.,Blood 85(12):3538-46,1995)。IL-15同样对NK细胞的发育和增殖起着至关重要的作用(Huntington ND et al.,J.Exp.Med 206(1):25-34,2009);其他的细胞因子例如IL-4,和IL-15合作能增强NK细胞的杀伤能力(Kiniwa T,etal.,Proc Natl Acad Sci U S A 113(36):10139-44,2016)。
OK432是一种能激活免疫能力的制剂,对免疫系统有多重激活作用,而且OK432还能提高NK细胞的毒性(Bonavida B,et al.,Cell Immunol 102(1):126-35,1986)。CD16即FcγRⅢ,为分子量为50 000~70 000的糖蛋白,属Ig超家族成员,NK细胞上交联的CD16直接导致细胞内Ca+水平的增加和一系列的类似于T细胞受体激活的级联生化反应,CD16单克隆抗体可激活NK细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用。本发明在培养基中联合使用IL-2等多种细胞因子、OK432和CD16单抗,很大程度上提高了NK细胞的扩增倍数,又提高了NK细胞的杀伤能力。
有益效果
(1)本发明用灭活的自体血清代替动物血清,解决了使用动物血清在培养NK细胞中带来的不安全问题。
(2)对于传统的NK细胞培养方法,使用滋养层细胞会得到纯度很高的NK细胞,不使用滋养层细胞的话,NK细胞的纯度会比较低。本发明绕开了滋养层细胞,在培养基中加入了免疫激活剂OK432,使用CD16单抗直接快速有效的激活了NK细胞的增殖信号;所以本发明在没有滋养层细胞的条件下,仍然能够得到高纯度的NK细胞。
(3)本发明在细胞培养的最后三天加入了IL-4,极大的提高了NK细胞的杀伤能力。
(4)在细胞的增殖处于对数期的时候,把细胞从培养瓶转到培养袋中培养:第一,保证了NK细胞被充分激活;第二,稀释了细胞代谢产物对细胞的不利影响;第三,在同等条件下,培养袋的培养效果要优于培养瓶。
附图说明
图1是常规培养方法与本发明所得NK细胞扩增倍数的比较图;
图2是常规培养方法与本发明所得NK细胞的活力比较图;
图3是常规培养方法与本发明所得NK细胞的纯度比较图;
图4是本发明所得NK细胞的其他标志物的表达水平;
图5是常规培养方法与本发明所得NK细胞对K562杀伤能力的曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、PBMC的分离过程
用25mL生理盐水溶解500μg人CD16单抗,然后完全加入到一个T175的培养瓶中。使液体铺满瓶底,把培养瓶平放在4℃冰箱中包被过夜(16个小时)。
从患者外周血中分离外周血,用注射器吸出血液缓缓滴入50ml离心管中。用600g的转速离心20分钟;分离后的血液上层为血浆层,下层为血细胞层。吸取上层血浆,封口,56℃灭活30分钟,灭活完毕;4℃放置15分钟,用1800g的速度离心15分钟,自体血浆离心结束后,分装到15mL离心管中,根据当前需要把血浆保存在-20℃或4℃中。用与血细胞沉淀等体积的生理盐水重悬下层血细胞沉淀,混合均匀。
预先把人淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(密度为1.077g/mL)平衡到室温。把20mL Ficoll缓慢加入到50mL体积的无菌离心管中,倾斜离心管45度,在离Ficoll液面上1cm处把等体积的细胞悬液缓慢加到Ficoll上面。把离心管放入水平离心机,用500g的速度离心20分钟。
从离心管中吸取中间白膜层,加入到新的50mL离心管中。吹打均匀,用生理盐水定容至45mL,600g离心10分钟。离心后弃上清,补加40~45mL生理盐水吹打细胞至混匀,再次以500g离心10分钟,弃上清得到外周血单个核细胞。用20~30mL培养基重悬细胞,同时细胞计数。
二、NK细胞的扩大培养过程:
从培养瓶中吸走CD16单抗液体。用含有700U/mL IL-2、100ng/mL IL-15、0.01KE/mL的OK432和10%灭活的自体血清的OpTmizer CST T-cell expansion培养基培养把PBMC的浓度调整为1.5×106个/mL,把25mL PBMC细胞悬液加入到被CD16单抗包被过的T175的培养瓶中培养。
细胞在37℃的培养箱中培养5天后,把所有的细胞用25~30mL新鲜的培养基重悬,全部转移到另外一个新的没有被CD16单抗包被过的T175的培养瓶中(培养基中含有700U/mLIL-2、100ng/mL IL-15和10%灭活的自体血清)。
在第八天的时候,把细胞转移到培养袋中培养,细胞的接种密度是1.5~2.0×106个/mL,此时使用的培养基仍然是用含有700U/mL IL-2、100ng/mL IL-15和10%灭火的自体血清的OpTmizer CST T-cell expansion培养基。细胞每2到3天换液或者传代一次;在第18天的时候,培养基中添加500U/mL IL-4,总共培养21天以后就能够得到大量高纯度的NK细胞。三、扩大培养后细胞的表型分析:
从培养瓶中取出细胞,每个5mL流式细胞仪检测管中加入1×106个细胞,用800rpm的转速离心5分钟,丢掉上清;用PBS洗细胞一次,用800rpm的转速离心5分钟,丢掉上清。
用10μg human IgG封闭每管细胞,室温下封闭15分钟。然后根据抗体说明书上指定的抗体使用量把抗体直接加到细胞里面,4℃孵育30分钟。
用4mL的PBS洗细胞2次,用300μL的PBS重悬细胞。
使用流式细胞仪之前加入PI或者7-AAD燃料。
流式细胞仪数据显示:用本发明所得CD3-CD56+NK细胞的纯度能高达98.7%;而用常规方法所得NK细胞的纯度仅仅是40.5%。所以用本发明所得的NK细胞的纯度明显高于常规培养方法所得的细胞纯度。
本发明所得NK细胞表达高水平的的IFN-γ和其他NK细胞标志物NKp30,NKp44,NKp46和NKG2D。21天以后,本发明所得NK细胞的扩增倍数是290±20,而用常规方法所得NK细胞的扩增倍数是145±26,所以本发明的NK细胞扩增效率几乎是常规培养方法的两倍。
四、扩大培养和免疫细胞的活力(viability)分析
用细胞凋亡检测试剂盒(556547,BD Biosciences)检测免疫细胞的活力。收集免疫细胞,离心去除上清,用预冷的PBS(phosphate buffer saline)缓冲液洗两遍。
用1×binding buffer把细胞稀释成1×106个/mL的细胞悬液;把100μL的细胞悬液加到一个5mL的圆底离心管中;加入5μL PI和5μL Annexin V试剂,轻轻混匀细胞,室温下避光放置15分钟,然后加入400μL 1×binding buffer,用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况。
在细胞活力方面,用本发明和常规方法没有明显的区别;两种培养制备方法所得的细胞活力都能在95%以上。
五、扩大培养后免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤实验:
白血病细胞株K562培养在含有10%胎牛血清的1640培养基中,取处于对数生长期的K562细胞计数并用于实验。
整个杀伤实验中用到的培养基是含有1%灭活的胎牛血清的1640培养基。用到的试剂盒是非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega,G1780)。
用新鲜的培养基把K562细胞制成1×105个/mL的细胞悬液,加入到圆底的96孔板中,每孔100μL。用同样的培养基调整一系列NK细胞的浓度,把80μL NK细胞按照效应细胞:靶细胞为1:1、10:1、30:1、50:1的比例加入到K562细胞中;同时设置NK细胞对照和K562细胞对照组,培养基对照组和K562细胞最大释放组,每孔的最终体积矫正为200μL,均设三个复孔,250g离心4分钟,把细胞放在37度的培养箱中培养6个小时。
在反应结束前45分钟,把20μL裂解液加入到靶细胞最大释放组。反应结束后从每个孔吸走50μL细胞上清至另一个新的96孔板,再加入50μL LDH酶反应液,混匀30秒,室温下避光放置30分钟,再加入50μL终止液,用酶标仪测量每个孔的OD值。
计算NK细胞杀伤活力的公式:自然杀伤活性%=(实验组OD值-NK细胞对照组OD值-K562细胞对照组OD值)/(K562细胞最大释放组OD值-K562细胞对照组OD值)×100%
在不同的效靶比条件下,本发明所得NK细胞的杀伤效率均明显的高于常规方法所得NK细胞的杀伤效率,见表1。效靶比越高,NK细胞的杀伤效率越高;在效靶比是30:1的时候,本发明制备的NK细胞的杀伤效率是90±8.3%,50:1的时候达到最大,93.2±5.2%。
表1杀伤效率的具体数值
注:对于每个组别,常规组和实验组的杀伤率存在显著的差异,p<0.01。
Claims (8)
1.一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,包括:
采集100~200ml外周血的单个核细胞,先将单个核细胞放入被CD16单抗包被过的培养瓶中培养,培养基中加入IL-2、IL-15、OK432和灭活的自体血清;随后将细胞转入到没有被CD16单抗包被过的培养瓶中培养,培养基中加入IL-2、IL-15和灭活的自体血清;再把细胞转移到培养袋中培养,倒数第三天培养基中加入IL-4继续培养,即得大量NK细胞。
2.根据权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,其特征在于:所述CD16单抗浓度为0.01~3.0mg/mL,包被温度为4℃,包被时间为2~16小时。
3.根据权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,其特征在于:所述含IL-2、IL-15、OK432和灭活的自体血清的培养基的具体组成为:100~1000U/mL的IL-2、10~200ng/mL的IL-15、0.01~1KE/mL的OK432和5~10%灭活的自体血清。
4.根据权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,其特征在于:所述含IL-2、IL-15和灭活的自体血清的培养基的具体组成为:100~1000U/mL的IL-2、10~200ng/mL的IL-15和5~10%灭活的自体血清。
5.根据权利要求3或4所述的一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,其特征在于:所述培养基为GT-T551无血清培养基。
6.根据权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,其特征在于:所述单个核细胞放入被CD16单抗包被过的培养瓶中培养三至五天。
7.根据权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,其特征在于:所述转移到培养袋中培养后每2-3天细胞传代或者换液一次。
8.根据权利要求1所述的一种从外周血单个核细胞中大量扩增NK细胞的方法,其特征在于:所述倒数第三天培养基中加入300~500U/mL的IL-4。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710151061.1A CN107022524B (zh) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710151061.1A CN107022524B (zh) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107022524A true CN107022524A (zh) | 2017-08-08 |
CN107022524B CN107022524B (zh) | 2019-10-22 |
Family
ID=59526052
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710151061.1A Active CN107022524B (zh) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107022524B (zh) |
Cited By (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107326008A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-11-07 | 上海莱馥医疗科技有限公司 | 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法 |
CN108004210A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-08 | 吉林大学 | 一种大量诱导扩增具有adcc效应的nk细胞的方法 |
CN108103020A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-06-01 | 上海莱馥生命科学技术有限公司 | 一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法 |
CN108642012A (zh) * | 2018-07-03 | 2018-10-12 | 广东龙帆生物科技有限公司 | 一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法 |
CN109161527A (zh) * | 2018-09-25 | 2019-01-08 | 深圳市五零生命科技有限公司 | 一种高效的nk细胞扩增方法 |
CN109666639A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-04-23 | 浙江大学 | 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法 |
CN109957543A (zh) * | 2017-12-26 | 2019-07-02 | 上海尚泰生物技术有限公司 | 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法 |
US10450547B1 (en) | 2018-10-25 | 2019-10-22 | Purecell Biomedical Technology Company Limited | Medium system and method for ex vivo expansion of NK cells |
CN110684731A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-14 | 成都益安博生物技术有限公司 | 一种nk细胞的体外扩增培养方法 |
CN111394310A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-07-10 | 北京荟科柘生物科技有限公司 | 一种强免疫调节,强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强nk细胞和其制备方法与试剂盒 |
CN111500535A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-08-07 | 上海近岸生物科技有限公司 | 用于体外培养人自然杀伤细胞的方法和培养基 |
CN111748524A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-10-09 | 嘉禾弘生(深圳)健康产业集团有限公司 | 一种因子法体外高效扩增nk细胞的方法 |
CN112626018A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-04-09 | 圣至同合(北京)生物科技有限公司 | 一种高纯度的同种异体nk细胞培养基以及体外扩增方法 |
CN114058583A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-02-18 | 厦门大学 | 一种体外诱导外周血单核细胞扩增nk细胞的方法 |
CN114196630A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-03-18 | 顾加明 | 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法 |
CN114231487A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-25 | 博雅干细胞科技有限公司 | 胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法 |
CN114921411A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-08-19 | 闫书印 | 一种nk细胞的培育方法及应用 |
CN115058393A (zh) * | 2022-07-13 | 2022-09-16 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103756963A (zh) * | 2012-12-13 | 2014-04-30 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种体外扩增nk细胞的方法 |
CN105238754A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-13 | 赵顺英 | 一种高增殖力和高杀伤力nk细胞的体外培养方法 |
CN105754942A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-07-13 | 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 | 一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞 |
CN106434554A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 北京同立海源生物科技有限公司 | Nk细胞的制备方法 |
-
2017
- 2017-03-14 CN CN201710151061.1A patent/CN107022524B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103756963A (zh) * | 2012-12-13 | 2014-04-30 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种体外扩增nk细胞的方法 |
CN105238754A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-01-13 | 赵顺英 | 一种高增殖力和高杀伤力nk细胞的体外培养方法 |
CN105754942A (zh) * | 2016-05-18 | 2016-07-13 | 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 | 一种体外扩增nk细胞的方法及其获得的nk细胞 |
CN106434554A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-22 | 北京同立海源生物科技有限公司 | Nk细胞的制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
DUCK CHO等: "Expansion and Activation of Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy", 《KOREAN J LAB MED》 * |
ZHAO-LIANG HU等: "Effective Induction of Human NK Cells with OK-432 and Further Augmentation of Their Cytolytic Function by rIL-2", 《MICROBIOL. IMMUNOL.》 * |
潘梅萍等: "NK细胞体外扩增的影响因素", 《药物生物技术》 * |
靳保利: "利用滤除白细胞分离培养NK细胞方法的优化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107326008A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-11-07 | 上海莱馥医疗科技有限公司 | 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法 |
CN107326008B (zh) * | 2017-08-09 | 2019-10-22 | 上海莱馥医疗科技有限公司 | 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法 |
CN108004210A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-08 | 吉林大学 | 一种大量诱导扩增具有adcc效应的nk细胞的方法 |
CN108004210B (zh) * | 2017-12-18 | 2020-09-04 | 吉林省吉恩致合生物治疗技术有限公司 | 一种大量诱导扩增具有adcc效应的nk细胞的方法 |
CN109957543A (zh) * | 2017-12-26 | 2019-07-02 | 上海尚泰生物技术有限公司 | 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法 |
CN108103020A (zh) * | 2018-02-01 | 2018-06-01 | 上海莱馥生命科学技术有限公司 | 一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法 |
CN108642012A (zh) * | 2018-07-03 | 2018-10-12 | 广东龙帆生物科技有限公司 | 一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法 |
CN108642012B (zh) * | 2018-07-03 | 2019-11-05 | 广东龙帆生物科技有限公司 | 一种外周血来源nk细胞高效扩增的方法 |
CN109161527A (zh) * | 2018-09-25 | 2019-01-08 | 深圳市五零生命科技有限公司 | 一种高效的nk细胞扩增方法 |
US10450547B1 (en) | 2018-10-25 | 2019-10-22 | Purecell Biomedical Technology Company Limited | Medium system and method for ex vivo expansion of NK cells |
CN109666639A (zh) * | 2018-12-24 | 2019-04-23 | 浙江大学 | 一种杀伤活性增强的nk细胞及其制备方法 |
CN110684731A (zh) * | 2019-10-29 | 2020-01-14 | 成都益安博生物技术有限公司 | 一种nk细胞的体外扩增培养方法 |
CN111394310A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-07-10 | 北京荟科柘生物科技有限公司 | 一种强免疫调节,强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强nk细胞和其制备方法与试剂盒 |
CN111500535A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-08-07 | 上海近岸生物科技有限公司 | 用于体外培养人自然杀伤细胞的方法和培养基 |
CN111500535B (zh) * | 2020-04-30 | 2023-04-14 | 惠和生物技术(上海)有限公司 | 用于体外培养人自然杀伤细胞的方法和培养基 |
CN111748524A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-10-09 | 嘉禾弘生(深圳)健康产业集团有限公司 | 一种因子法体外高效扩增nk细胞的方法 |
CN112626018A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-04-09 | 圣至同合(北京)生物科技有限公司 | 一种高纯度的同种异体nk细胞培养基以及体外扩增方法 |
CN114058583A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-02-18 | 厦门大学 | 一种体外诱导外周血单核细胞扩增nk细胞的方法 |
CN114058583B (zh) * | 2021-11-10 | 2023-10-13 | 厦门大学 | 一种体外诱导外周血单核细胞扩增nk细胞的方法 |
CN114231487A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-25 | 博雅干细胞科技有限公司 | 胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法 |
CN114231487B (zh) * | 2021-12-14 | 2023-08-15 | 博雅干细胞科技有限公司 | 胎盘来源的自然杀伤细胞的培养方法 |
CN114196630A (zh) * | 2022-01-17 | 2022-03-18 | 顾加明 | 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法 |
CN114921411A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-08-19 | 闫书印 | 一种nk细胞的培育方法及应用 |
CN115058393A (zh) * | 2022-07-13 | 2022-09-16 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法 |
CN115058393B (zh) * | 2022-07-13 | 2024-05-24 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 一种包被刺激物、培养试剂盒和自然杀伤细胞的培养方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN107022524B (zh) | 2019-10-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107022524B (zh) | 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法 | |
CN107326008B (zh) | 一种从外周血中高效高纯度扩增自然杀伤细胞的方法 | |
CN108220239B (zh) | 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用 | |
CN104357390B (zh) | 同时扩增cd3+cd56+cik细胞和cd3‑cd56+nk细胞的方法 | |
CN108103020A (zh) | 一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法 | |
CN102618498B (zh) | Hla-a0201限制性抗原特异性ctl制备方法 | |
CN102321581B (zh) | 腹水肿瘤细胞致敏dc-cik的制备方法 | |
CN103756963A (zh) | 一种体外扩增nk细胞的方法 | |
CN105754941A (zh) | 一种外周血nk细胞的体外诱导扩增培养方法 | |
CN105925527A (zh) | 一种用于制备nk细胞的试剂盒及其应用方法 | |
CN113151168B (zh) | 一种人nk细胞培养体系及制备方法 | |
CN108251365A (zh) | 免疫细胞培养基体系 | |
JP2017012010A (ja) | 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物 | |
CN111944754A (zh) | 一种自然杀伤细胞的培养方法 | |
CN107446888B (zh) | Nk细胞培养基、培养方法及二者的应用 | |
CN110272871B (zh) | 一种刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞的组合物及其应用 | |
CN106754704B (zh) | 免疫细胞体外诱导扩增的方法 | |
CN115044552A (zh) | 一种自然杀伤细胞的体外培养方法及试剂盒 | |
US20210361711A1 (en) | CIML NK cells and Methods Therefor | |
CN109486758A (zh) | 一种外周血nk细胞体外高效扩增试剂及操作说明 | |
CN110747167B (zh) | 一种半合子bak细胞的制备方法及其应用 | |
CN108486055B (zh) | 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用 | |
CN103834614A (zh) | 一种附子多糖诱导nkt细胞增殖的制备方法及其应用 | |
CN114058584B (zh) | 一种临床用自然杀伤细胞的制备方法 | |
CN114438028B (zh) | 一种体外扩增外周血nk的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170822 Address after: 201114, Shanghai, Minhang District, Chun Chun Road, No. 4, 138, 5, Room 501 Applicant after: Shanghai Lai Fu Medical Technology Co Ltd Address before: 201799, Qingpu District, Shanghai Zhao Gang Ping Road, No. 1, 3398, 2, E District, room 219 Applicant before: Shanghai Laifu Life Science and Biotechnology Co., Ltd. |
|
TA01 | Transfer of patent application right | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |