CN110564684A - 一种体外稳定、大量扩增、高细胞毒活性的nk细胞的方法及应用 - Google Patents

一种体外稳定、大量扩增、高细胞毒活性的nk细胞的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适合于病人自体NK细胞扩增的方法，病人自体的NK细胞在体外稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞的方法，步骤为：(1)NK细胞的分血、分选；(2)NK细胞培养；(3)NK细胞收集；本发明NK细胞扩增方法适合于病人自体NK细胞扩增，解决了受者的异体NK细胞治疗时免疫排斥等副反应，采用自体NK细胞的体外分选扩增培养，获得稳定的、高纯度、高活性NK细胞体系，从而能够有效的提供满足临床应用所需的NK细胞，实验操作简单可行。且该培养方法可以获得高扩增倍数的NK细胞数量，可以满意临床需求。

Description

一种体外稳定、大量扩增、高细胞毒活性的NK细胞的方法及 应用
技术领域：
本发明涉及到免疫细胞治疗领域，具体是一种适合于病人自体NK细胞扩增的方法，病人自体的NK细胞在体外稳定的、大量扩增高纯度、高细胞毒活性的NK细胞的方法。
背景技术：
细胞免疫治疗是目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者自身免疫功能从而抵抗肿瘤。目前，NK细胞免疫治疗受到越来越多的重视。NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％，一般定义其表型为CD3-CD56+，NK细胞又可以进一步细分为两个主要的亚群：具有免疫调节功能的CD56highCD16-细胞和具有细胞毒活性的CD56dimCD16+细胞。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制肿瘤的生长和转移。最新的研究表明，阻断NK细胞表面的免疫检测点受体TIGIT，可以有效的阻止NK细胞的耗竭，促进NK细胞依赖的肿瘤免疫，抑制多种小鼠恶性肿瘤的生长。阻断PD-1/PD-L1信号通路可以激活NK细胞和T细胞、逆转肿瘤免疫微环境，增强机体内源性抗肿瘤免疫效应。因此，NK细胞在机体免疫系统抵抗肿瘤的反应中发挥必不可少的作用，机体NK细胞功能紊乱，是肿瘤发生、发展的可能原因之一。自体或者同种异体NK细胞已经用于治疗恶性淋巴瘤、难治性非霍奇金淋巴瘤、复发性/难治性急性白血病、急性髓性白血病、儿童复发/难治性神经母细胞瘤、晚期胃癌、结直肠癌、结直肠癌/胰腺癌肝转移以及多种复发性、转移性实体瘤。临床显示出良好的耐受性和一定的治疗效果。NK细胞的治疗效果和回输的NK细胞的纯度和数量呈正相关。
目前已经有一些可提供临床使用的NK细胞扩增技术，但是多采用饲养细胞(例如，表达IL-15和41BB配体的K562细胞、EBV转化的类淋巴母细胞细胞系、Wilm’s肿瘤细胞、射线辐照的PBMCs等)进行刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)或者纯化富集后的NK细胞获得大量功能完备的NK细胞。现有的NK细胞扩增方法要么NK细胞的扩增数量较低，难以满足临床应用需求；要么采用饲养细胞的培养方法，临床应用存在一定的风险，而且NK细胞扩增培养步骤繁琐，成本较高，NK细胞比例相对较低，有残留的T细胞和B细胞，具有引起GVHD的风险。目前一些专利文献报道的无饲养细胞的NK细胞扩增方法，多采用anti-CD3抗体和anti-CD16抗体包被细胞培养瓶刺激、活化NK细胞，细胞培养方法繁琐、不稳定、扩增的NK细胞纯度较低。
而且在现有的技术研究中，试验又发现，供者在提供NK细胞时，并不能达到完全的纯化目的，有一定量的T细胞跟着NK细胞一起输入到了受者的体内。而这些跟着NK细胞一起输注的T细胞由于膜上的相关配体的影响，将对NK细胞的KIR的表达产生一定的干扰作用。当受者输入异体的NK细胞治疗时，因为异体NK细胞扩增存在纯度不够，带有T细胞等，NK细胞输入受者体内，造成受者的免疫排斥等副反应，不但治疗效果不佳，反而带来一些列的副作用，从而针对一些受者存在免疫排斥副反应时，可以考虑自体NK细胞的体外分选扩增培养。但是受者自身条件在疾病状态下不佳，不易大量多次抽血等。
针对上述所述问题，因此，急需开发一种适合受者不产生免疫副反应的自体NK细胞体外扩增方法，从而获得稳定的、高纯度、高活性NK细胞体系。
发明内容：
为解决现有技术存在的不足，解决受者输入异体的NK细胞治疗时，因为异体NK细胞扩增存在纯度不够，带有T细胞等，NK细胞输入受者体内，造成受者的免疫排斥等副反应，不但治疗效果不佳，反而带来一些列的副作用，从而针对一些受者存在免疫排斥副反应时，采用自体NK细胞的体外分选扩增培养，获得稳定的、高纯度、高活性NK细胞体系，从而能够有效的提供满足临床应用所需的NK细胞。
为了达到上述目的，本发明设计的一种体外扩增培养NK细胞方法，扩增方法由以下步骤：
1、NK细胞的分血、分选；
2、NK细胞培养；
3、NK细胞收集。
所述NK细胞的分血、分选及培养实验过程：
1、生物安全柜紫外照射30min，室温平衡所需培养基30min；
2、将采集的20-40ml外周血均分至2个无菌50ml离心管中，补加DPBS至50ml，颠倒混匀；
3、取4个无菌50ml离心管，均加入15ml Ficoll-PaqueTM Plus，将稀释好的外周血缓慢加至15ml Ficoll-PaqueTM Plus上；
4、调整离心机参数，升速1，降速0，400×g，20℃，离心30min；
5、收集上层血清层于无菌50ml离心管；56℃水浴灭活30-35min；调整离心机参数，升速9，降速9，800×g，20℃，离心8min，将上清转至一个新的无菌50ml离心管中备用；
6、吸取步骤4中间细胞层于无菌50ml离心管，补加DPBS至50ml，混匀；
7、调整离心机参数，升速9，降速9，600×g，20℃，离心10min；
8、弃上清，加入10ml DPBS重悬细胞后补加DPBS至50ml，混匀，取100μl细胞悬液稀释后计数；
9、根据计数结果，取出100万细胞用于表型检测，剩余细胞400×g，20℃，离心10min；
10、弃上清，用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将细胞浓度调整至5×107cells/ml，转移至无菌5ml流式管中；
11、按50μl/ml样品加入EasysepTM Human NK Cell Isolation Cocktail TM，室温孵育5min；
12、EasysepTM Dextran RapidSpheresTM50103充分混匀，按50μl/ml样品加入EasysepTM Dextran RapidSpheresTM50103；
13、用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将上述流式管中的细胞悬液的体积补加至2.5ml，混匀；
14、将流式管放入Easysep Magnet磁铁中，室温放置3min；
15、将磁铁拿起，将上清倒至无菌15ml离心管中，用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将体积补至2.5ml，混匀，吸取100μl细胞悬液稀释后计数；
16、根据计数结果，取出100万细胞用于表型检测，剩余细胞400×g，20℃，离心5min；
17、弃上清，用含10％自体血浆的SuperCultureTM L500培养基将细胞浓度调整至1×106cells/ml，转移至无菌T-25培养瓶中；加入Anti-human CD16Monoclonal Antibody，IL-12，IL-21及IL-15使其终浓度100-500ng/ml，加入IL-2使其终浓度为500-1000IU/ml，混匀；
18、将细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养。
19、培养第5天-第21天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的自体血清的SuperCultureTM L500培养基，维持细胞浓度1×106cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养，16-21天收获混合细胞培养物。
所述NK细胞全换液天数优选为第4天，细胞浓度优选为1×106cells/ml。
所述NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果：
与现有NK细胞扩增方法相比，所述NK细胞扩增方法适合于病人自体NK细胞扩增，解决了受者的异体NK细胞治疗时免疫排斥等副反应，采用自体NK细胞的体外分选扩增培养，获得稳定的、高纯度、高活性NK细胞体系，从而能够有效的提供满足临床应用所需的NK细胞，实验操作简单可行。且该培养方法可以获得高扩增倍数的NK细胞数量，可以满意临床需求。
附图说明：
图1为扩增培养NK细胞生长曲线。
图2为扩增培养NK细胞在第14天和第21天的扩增倍数。
图3为实施例3扩增培养NK细胞生长曲线。
图4为实施例3扩增培养NK细胞在第14天和第21天的扩增倍数。
图5为扩增NK细胞在第14天时的表型。
图6为加入NK细胞对NCI-N87细胞的细胞毒活性实时监测。
图7为加入NK细胞4h时对NCI-N87细胞的细胞毒活性。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1 NK细胞的分血、分选
1.NK细胞的分血、分选
(1)生物安全柜紫外照射30min，室温平衡所需培养基30min；
(2)将采集的20-40ml外周血均分至2个无菌50ml离心管中，补加DPBS至50ml，颠倒混匀；
(3)取4个无菌50ml离心管，均加入15ml Ficoll-PaqueTM Plus，将稀释好的外周血缓慢加至15ml Ficoll-PaqueTM Plus上；
(4)调整离心机参数，升速1，降速0，400×g，20℃，离心30min；
(5)收集上层血清层于无菌50ml离心管；56℃水浴灭活30-35min；调整离心机参数，升速9，降速9，800×g，20℃，离心8min，将上清转至一个新的无菌50ml离心管中备用；
(6)吸取步骤4中间细胞层于无菌50ml离心管，补加DPBS至50ml，混匀；
(7)调整离心机参数，升速9，降速9，600×g，20℃，离心10min；
(8)弃上清，加入10ml DPBS重悬细胞后补加DPBS至50ml，混匀，取100μl细胞悬液稀释后计数；
(9)根据计数结果，取出100万细胞用于表型检测，剩余细胞400×g，20℃，离心10min；
(10)弃上清，用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将细胞浓度调整至5×107cells/ml，转移至无菌5ml流式管中；
(11)按50μl/ml样品加入EasysepTM Human NK Cell Isolation Cocktail TM，室温孵育5min；
(12)EasysepTM Dextran RapidSpheresTM50103充分混匀，按50μl/ml样品加入EasysepTM Dextran RapidSpheresTM50103；
(13)用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将上述流式管中的细胞悬液的体积补加至2.5ml，混匀；
(14)将流式管放入Easysep Magnet磁铁中，室温放置3min；
(15)将磁铁拿起，将上清倒至无菌15ml离心管中，用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将体积补至2.5ml，混匀，吸取100μl细胞悬液稀释后计数；
(16)根据计数结果，取出100万细胞用于表型检测，剩余细胞400×g，20℃，离心5min；
(17)弃上清，用含10％自体血浆的SuperCultureTM L500培养基将细胞浓度调整至1×106cells/ml，转移至无菌T-25培养瓶中；加入Anti-human CD16MonoclonalAntibody，IL-12，IL-21及IL-15使其终浓度200ng/ml，加入IL-2使其终浓度为500IU/ml，混匀；
(18)将细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养。
实施例2 NK细胞体外扩增-NK细胞培养
2.1上述细胞培养第4天，将细胞吹匀，取20μl细胞悬液置于1.5ml EP管中，用于计数。剩余细胞转至50ml无菌离心管中，20℃，400×g，离心5min；
2.2弃上清，用新鲜配制的含10％自体血浆的SuperCultureTM L500培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至1×106cells/ml，同时加入IL-2使其终浓度为600U/ml和另加入细胞因子(IL-15、Il-12、IL-21终浓度均为200ng/ml)，混匀。
2.3将上述细胞置于37℃、饱和湿度、5.0％CO2培养箱中继续培养。
2.4培养第5天-第21天，每天观察细胞生长状态，补加含细胞因子的SuperCultureTM L500培养基(如有足够血浆，可继续维持10％自体血浆含量)，维持细胞浓度1×106cells/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱继续培养，至达到所需细胞数量时收获细胞。期间，如果细胞体积超过240ml，则分瓶培养或转入细胞培养袋中传代培养。
在培养第0、4、6、8、10、12、14、16、18和21天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图1所示，扩增21天，细胞总数可达约42亿，完全满足临床应用需要。统计第0天、第14天和第21天，计算NK细胞扩增倍数，可见采用本发明方法可以获得大量的NK细胞，结果参见图2。
实施例3传统方法体外扩增病人自体NK细胞
扩增方法由以下步骤构成：
(1)单核细胞提取：从外周血、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤、胸水、腹水、或脐带血中提取单核细胞；
(2)采用细胞激活剂包被液包被细胞培养瓶；其中，细胞激活剂包被液为采用PBS稀释4-1BB抗体细胞激活剂至8～12ug/mL；
(3)将单核细胞用NK细胞扩增基础培养基调整细胞浓度为1×106～2×106/mL后接种于包被好的T75细胞培养瓶中，并加入30～50mLNK细胞刺激液以及体积分数为2～8％的自体血浆，开始刺激细胞，并记为D0天；其中，NK细胞扩增基础培养基含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及IL-12，NK细胞刺激液含有细胞扩增添加剂、L-谷氨酰胺、以及OK-432；
(4)D3天解除刺激，从T75细胞培养瓶中取出细胞悬液进行计数，余下细胞转移离心管离心，弃掉上清，将沉淀打散，用NK细胞扩增培养基调整细胞浓度为0.5×106～2.0×106个/mL后接种于新的包被好的T75细胞培养瓶中，并加入NK细胞扩增培养基和体积分数为7～15％的自体血浆，每隔一天计数并补液；其中，NK细胞扩增培养基含有IL-2以及IL-15；
(5)D5天补液，取出T75细胞培养瓶，然后用移液管混匀，取出细胞悬液进行台盼蓝染色计数，按照1.0×105～1.0×106个/mL补加NK细胞扩增培养基和体积分数为2～8％的自体血浆，依据补液量更换包被好的175cm2细胞培养瓶或1000ml细胞培养袋；
(6)D14～D21收取细胞培养瓶或细胞培养液中的全部细胞。
在培养第0、4、6、8、10、12、14、16、18和21天统计接种细胞数和扩增培养的细胞数，制作细胞生长曲线，如图3所示，扩增21天，细胞总数可达约1.2亿，不能满足临床应用需要。统计第0天、第14天和第21天，计算NK细胞扩增倍数，结果参见图4。
实施例4 NK细胞表型检测
4.本发明扩增培养的NK细胞表型检测
4.1取第21天的细胞，放入1.5mL的EP管中，每管1×106个细胞，400×g离心5分钟，去上清；
4.2分别加入1mLDPBS洗一遍，400×g离心5分钟，去上清；
4.3加入100μL的DPBS，分别加入APC Mouse IgG1,κIsotype Ctrl，-PerCP MouseIgG1,κ
Isotype Ctrl和-PerCPanti-human CD3，APC anti-human CD56荧光抗体，4℃放置30分钟。
4.4 DPBS洗两遍，弃上清，最终使用150μLDPBS重悬细胞。
使用AECANovocyte流式细胞仪对培养得到的NK细胞进行检测，如图5，培养21天的细胞，NK细胞的纯度分别可达95.51％。
实施例5NK细胞杀伤活性检测
5.本发明方法扩增得到的NK细胞杀伤活性检测
使用艾森生物的实时无标记细胞功能分析仪检测不同效靶比NK细胞对NCI-N87细胞杀伤活性。
具体操作步骤如下：
5.1消化NCI-N87细胞，调整细胞悬液浓度至1×105cells/mL；
5.2将细胞加至实时无标记细胞功能分析仪E-Plate 8检测板上，每孔加入300μL，37℃培养18-24小时。
5.3取实施例3的NK细胞，将100μL的NK细胞悬液或等体积的培养基(空白对照)以不同的效靶比(E:T＝0:1，5:1，10:1，20:1)加入E-Plate 8检测板内。
5.4将E-Plate 8检测板置于实时无标记细胞功能分析仪检测台上实时监测，观察NK细胞对NCI-N87细胞的影响，结果见图6所示：实时监测显示加入NK细胞后，NK细胞对NCI-N87细胞的杀伤活性随着效靶比的增加而增强。
5.5分析实验结果，在加入NK细胞的时间点，均一化细胞指数值，获得均一化细胞指数(NCI)，统计加入NK细胞4小时后的NCI值，计算不同效靶比NK细胞对NCI-N87的细胞杀伤活性，如图7所示，NK细胞对NCI-N87细胞的杀伤活性随NK细胞比例增加而增加。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种体外稳定、大量扩增、高细胞毒活性的NK细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)NK细胞的分血、分选；
(2)加入无血清培养基、扩增因子；
(3)培养第2-5天全换液；
(4)NK细胞收获；
其中步骤2中加入的扩增因子为：IL-15、IL-12、IL-21、IL-2。
2.根据权利要求1所述体外稳定、大量扩增、高细胞毒活性的NK细胞的方法，其特征在于：所述NK细胞的分血、分选步骤如下：
(1)生物安全柜紫外照射30min，室温平衡所需培养基30min；
(2)将采集的20-40ml外周血均分至2个无菌50ml离心管中，补加DPBS至50ml，颠倒混匀；
(3)取4个无菌50ml离心管，均加入15ml Ficoll-PaqueTM Plus，将稀释好的外周血缓慢加至15ml Ficoll-PaqueTM Plus上；
(4)调整离心机参数，升速1，降速0，400×g，20℃，离心30min；
(5)收集上层血清层于无菌50ml离心管；56℃水浴灭活30-35min；调整离心机参数，升速9，降速9，800×g，20℃，离心8min，将上清转至一个新的无菌50ml离心管中备用；
(6)吸取步骤4中间细胞层于无菌50ml离心管，补加DPBS至50ml，混匀；
(7)调整离心机参数，升速9，降速9，600×g，20℃，离心10min；
(8)弃上清，加入10mlDPBS重悬细胞后补加DPBS至50ml，混匀，取100μl细胞悬液稀释后计数；
(9)根据计数结果，取出100万细胞用于表型检测，剩余细胞400×g，20℃，离心10min；
(10)弃上清，用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将细胞浓度调整至5×107cells/ml，转移至无菌5ml流式管中；
(11)按50μl/ml样品加入EasysepTM Human NK Cell Isolation Cocktail TM，室温孵育5min；
(12)EasysepTM Dextran RapidSpheresTM50103充分混匀，按50μl/ml样品加入EasysepTM Dextran RapidSpheresTM50103；
(13)用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将上述流式管中的细胞悬液的体积补加至2.5ml，混匀；
(14)将流式管放入Easysep Magnet磁铁中，室温放置3min；
(15)将磁铁拿起，将上清倒至无菌15ml离心管中，用含2％FBS、1mMEDTA的DPBS将体积补至2.5ml，混匀，吸取100μl细胞悬液稀释后计数；
(16)根据计数结果，取出100万细胞用于表型检测，剩余细胞400×g，20℃，离心5min；
(17)弃上清，用含10％自体血浆的SuperCultureTM L500培养基将细胞浓度调整至1×106cells/ml，转移至无菌T-25培养瓶中；加入Anti-human CD16Monoclonal Antibody，IL-12，IL-21及IL-15使其终浓度100-500ng/ml，加入IL-2使其终浓度为500-1000IU/ml，混匀；
(18)将细胞于37℃、5％CO2培养箱中培养。
3.一种体外稳定、大量扩增、高细胞毒活性的NK细胞的方法的应用，其特征在于：将权利要求1所述的扩增方法用于病人自体NK细胞扩增。
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