CN116333986A - 一种外泌体激活nk细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体激活NK细胞的培养方法。本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法包括：基因修饰的K562细胞培养扩增、K562细胞促外泌体释放、K562细胞外泌体提取与纯化和NK细胞活化、扩增培养等步骤。本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法利用基因修饰过的K562细胞，经特殊培养方式，促进K562细胞的外泌体释放，再进行收集纯化，添加至NK细胞培养中，避免了直接K562细胞使用带来的风险，同时也解决纯因子培养NK细胞的增值能力有限、细胞纯度低等问题。

Description

一种外泌体激活NK细胞的培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体激活NK细胞的培养方法。
背景技术
NK细胞，即自然杀伤细胞，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。自然杀伤细胞属于粒状淋巴细胞，是人体免疫系统的组成部分，它能迅速溶解某些肿瘤细胞，因此开发它的抗癌功能是近年来癌症研究的重点。
目前NK细胞的体外活化与增值，主要有饲养层细胞培养和纯因子刺激两大类。饲养层细胞培养方法主要是利用基因修饰饲养层细胞，使细胞的膜表面表达刺激分子和膜绑定的细胞因子，比如常见的IL15和IL21刺激因子，再经辐照灭火后与NK细胞共培养，实现NK细胞的激活与增值。此种方法的培养效果优于纯细胞因子刺激的培养方法。
除此之外，也有一些利用间充质干细胞或PBMC(单个核细胞)作为饲养层细胞进行NK细胞的激活与培养，比如专利申请号为：CN 112662626 A其方案是利用同源的脐带间充质干细胞作为饲养层细胞培养脐血有核细胞，促进有核细胞向NK细胞及其前提细胞的分化和扩增。此方案无法明确其刺激原理(无刺激因子成分等)，在实际培养中，难以实现。
其他常规的基因修饰的K562作为饲养层细胞培养NK细胞，流程为：K562细胞经辐照灭火后与单个核细胞按比例混合共培养，在第7天，灭火的K562细胞与NK细胞再次按比例添加培养，二次刺激，实现NK细胞的大量增值与活化。但K562细胞属于肿瘤细胞系，虽然经灭火处理，但仍存在一定的风险。
纯因子培养方案主要是借助IL-2(白介素2)、IL-15(白介素15)、IL-21(白介素21)、CD16单抗等细胞因子，在NK细胞培养过程中，按一定浓度比例添加，实现NK细胞的活化与增值。目前也有不少方案在以上因子种类基础上，通过因子包被、添加其他成分的方式进行NK细胞的增值培养，如专利申请号为CN 108624559A，就是纯因子组合，利用IL-2\IL-15\IL-21\OK432\OKT3\CD16单抗等进行激活和扩增培养；专利号为CN 112626018 A，利用
IL-2\IL-15\IL-18\CD16单抗\CD314抗体等细胞因子，结合注射用A群链球菌进行NK细胞培养。该纯因子培养方法很难实现真正的NK细胞活化与增值，即使实现扩增培养，其效果比不上饲养层细胞培养的NK细胞。
因此，研究和开发出一种NK细胞增值能力高和细胞纯度高的方法仍是目前亟需解决的难题。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，本发明提供一种外泌体激活NK细胞的培养方法，该方法是利用基因修饰过的K562细胞，经特殊培养方式，促进K562细胞的外泌体释放，再进行收集纯化，添加至NK细胞培养中，避免直接K562细胞使用带来的风险，同时也解决纯因子培养NK细胞的增值能力有限、细胞纯度低等问题。
本发明提供了一种外泌体激活NK细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1.K562细胞培养：将基因修饰过的K562-IL21工程细胞，用DMEM/F12培养基+5％胎牛血清进行细胞的扩增培养，2～3天传代一次；
S2.K562细胞促外泌体分泌：将步骤S1扩增后的K562细胞按1～2*106/mL的密度至T75瓶，接着添加促外泌体分泌营养液进行培养，2～3天收集一次上清液，同时再次补充同等量的促外泌体分泌营养液，继续收集上清，共收集2次，得上清液；
S3.K562细胞外泌体提取与纯化：采用PEG6000溶液对步骤S2制得的上清液进行外泌体纯化处理，得K562外泌体；
S4.NK细胞活化、扩增培养：从外周血或脐血中分离出单个核细胞，接着加入步骤S3制得的K562外泌体活化培养0～7天，然后扩增培养7～14天，即得。
进一步地，所述步骤S2中的促外泌体分泌营养液由DMEM/F12培养基、人血小板衍生生长因子BB、促红细胞生成素和γ干扰素混合组成。
进一步地，所述步骤S2中的促外泌体分泌营养液由15mL DMEM/F12培养基、10ng/mL人血小板衍生生长因子BB、20mg/mL促红细胞生成素和20mg/mLγ干扰素混合组成。
进一步地，所述步骤S3中K562细胞外泌体提取与纯化的具体步骤为：
将步骤S2制得的上清液在速度为2000g的条件下离心30min，弃沉淀，得过滤液，接着加入乙酸调pH至4～5，加入浓度为24％(m/v)的PEG6000溶液，放4℃冰箱沉降过夜，次日离心，弃上清，生理盐水重悬沉淀，接着加入浓度为15％(m/v)的PEG6000溶液二次沉降，再次离心，沉降的产物用生理盐水重悬，即得。
进一步地，所述24％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:1进行添加，所述15％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:50进行添加。
进一步地，所述步骤S4中NK细胞活化、扩增培养的具体步骤为：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，1000g离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭火30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭火的血浆降温至4℃，经1200g离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液12.5mL，再加入稀释重悬后的血液25mL，配平后600g离心30min，升降速调至最低；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再300g离心10min，获得单个核细胞(PBMC)；
B.活化培养：
a.培养瓶包被，T75瓶，加50ng/mL的CD16单抗和50ng/mL的CD3单抗，平铺底部，在37℃的条件下放置2h或4℃过夜；
b.用免疫细胞培养基配制活化培养基和增值培养基；
c.取出包被的培养瓶，倒掉包被液，用PBS清洗1遍，将步骤A制得的单个核细胞加入活化培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/ml，体积不大于20mL；
d.重悬的单个核细胞转入已包被的培养瓶，加入步骤S3制得的K562外泌体和10％的自体灭火血浆；
e.前2天静置培养，第3天，补加20mL活化培养基和5％自体灭火血浆，后面根据细胞增值情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加步骤S3制得的K562外泌体，持续培养；
C.扩增培养：
待500mL活化培养基用完后，再补加增值培养基，控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
进一步地，所述B.活化培养中步骤b的培养基配制为：取500mL免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2制得活化培养基，在免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2制得增值培养基。
进一步地，所述B.活化培养中步骤d的K562外泌体的添加量为1～5*108/mL。
进一步地，所述B.活化培养中步骤e的K562外泌体的添加量为0.5～2*108/mL。
鉴于目前利用基因修饰的饲养层细胞培养NK细胞容易引入饲养层细胞的生物风险，而纯因子刺激NK细胞培养增殖能力低和纯度低等缺陷。本发明首次提出将基因修饰的K562细胞外泌体添加替代K562细胞作为饲养层细胞进行NK细胞培养，降低生物风险，同时对比纯因子培养NK细胞，有K562外泌体的协同刺激，NK细胞在增值数量和流式结果方面都更优。
与现有技术相比，本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法具有以下优点：
(1)本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法对比K562细胞作为饲养层细胞培养NK细胞，在保证NK细胞增值和活性的基础上，减少了K562细胞系直接使用带来的风险；
(2)本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法对比纯细胞因子培养NK细胞，有K562膜蛋白成分(外泌体)的协同刺激，在细胞增值、比例、活性等方面都有更好的效果。
附图说明：
图1为各组的细胞增值曲线图；
图2为组1的细胞流式检测图；
图3为组2的细胞流式检测图；
图4为组3的细胞流式检测图；
图5为组4的细胞流式检测图；
图6为组5的细胞流式检测图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
所述基因修饰过的K562-IL21工程细胞购于上海抚生实业有限公司，K562/IL-21。
实施例1、一种外泌体激活NK细胞的培养方法
S1.K562细胞培养：将基因修饰过的K562-IL21工程细胞，用DMEM/F12培养基+5％胎牛血清进行细胞的扩增培养，2～3天传代一次；
S2.K562细胞促外泌体分泌：将步骤S1扩增后的K562细胞按1～2*106/mL的密度至T75瓶，接着添加促外泌体分泌营养液进行培养，2～3天收集一次上清液，同时再次补充同等量的促外泌体分泌营养液，继续收集上清，共收集2次，得上清液；
所述促外泌体分泌营养液由15mL DMEM/F12培养基、10ng/mL人血小板衍生生长因子BB、20mg/mL促红细胞生成素和20mg/mLγ干扰素混合组成；
S3.K562细胞外泌体提取与纯化：将步骤S2制得的上清液在速度为2000g的条件下离心30min，弃沉淀，得过滤液，接着加入乙酸调pH至4，加入浓度为24％(m/v)的PEG6000溶液，所述24％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:1进行添加，接着放4℃冰箱沉降过夜，次日离心，弃上清，生理盐水重悬沉淀，接着加入浓度为15％(m/v)的PEG6000溶液二次沉降，所述15％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:50进行添加，接着再次离心，沉降的产物用生理盐水重悬，得K562外泌体；
S4.NK细胞活化、扩增培养：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，1000g离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭火30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭火的血浆降温至4℃，经1200g离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液12.5mL，再加入稀释重悬后的血液25mL，配平后600g离心30min，升降速调至最低；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再300g离心10min，获得单个核细胞(PBMC)；
B.活化培养：
a.培养瓶包被，T75瓶，加50ng/mL的CD16单抗和50ng/mL的CD3单抗，平铺底部，在37℃的条件下放置2h或4℃过夜；
b.用免疫细胞培养基配制活化培养基和增值培养基：
取500mL lonza的X-VIVO15的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2制得活化培养基，
在lonza的X-VIVO15的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2制得增值培养基；
c.取出包被的培养瓶，倒掉包被液，用PBS清洗1遍，将步骤A制得的单个核细胞加入活化培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于20mL；
d.重悬的单个核细胞转入已包被的培养瓶，加入1*108/mL的步骤S3制得的K562外泌体和10％的自体灭火血浆；
e.前2天静置培养，第3天，补加20mL活化培养基和5％自体灭火血浆，后面根据细胞增值情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加0.5*108/mL的步骤S3制得的K562外泌体，持续培养；
C.扩增培养：
待500mL活化培养基用完后，再补加增值培养基，控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
实施例2、一种外泌体激活NK细胞的培养方法
S1.K562细胞培养：将基因修饰过的K562-IL21工程细胞，用DMEM/F12培养基+5％胎牛血清进行细胞的扩增培养，2～3天传代一次；
S2.K562细胞促外泌体分泌：将步骤S1扩增后的K562细胞按1～2*106/mL的密度至T75瓶，接着添加促外泌体分泌营养液进行培养，2～3天收集一次上清液，同时再次补充同等量的促外泌体分泌营养液，继续收集上清，共收集2次，得上清液；
所述促外泌体分泌营养液由15mL DMEM/F12培养基、10ng/mL人血小板衍生生长因子BB、20mg/mL促红细胞生成素和20mg/mLγ干扰素混合组成；
S3.K562细胞外泌体提取与纯化：将步骤S2制得的上清液在速度为2000g的条件下离心30min，弃沉淀，得过滤液，接着加入乙酸调pH至5，加入浓度为24％(m/v)的PEG6000溶液，所述24％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:1进行添加，接着放4℃冰箱沉降过夜，次日离心，弃上清，生理盐水重悬沉淀，接着加入浓度为15％(m/v)的PEG6000溶液二次沉降，所述15％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:50进行添加，接着再次离心，沉降的产物用生理盐水重悬，得K562外泌体；
S4.NK细胞活化、扩增培养：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，1000g离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭火30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭火的血浆降温至4℃，经1200g离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液12.5mL，再加入稀释重悬后的血液25mL，配平后600g离心30min，升降速调至最低；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再300g离心10min，获得单个核细胞(PBMC)；
B.活化培养：
a.培养瓶包被，T75瓶，加50ng/mL的CD16单抗和50ng/mL的CD3单抗，平铺底部，在37℃的条件下放置2h或4℃过夜；
b.用免疫细胞培养基配制活化培养基和增值培养基：
取500mL康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2制得活化培养基，
在康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2制得增值培养基；
c.取出包被的培养瓶，倒掉包被液，用PBS清洗1遍，将步骤A制得的单个核细胞加入活化培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于20mL；
d.重悬的单个核细胞转入已包被的培养瓶，加入5*108/mL的步骤S3制得的K562外泌体和10％的自体灭火血浆；
e.前2天静置培养，第3天，补加20mL活化培养基和5％自体灭火血浆，后面根据细胞增值情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加2*108/mL的步骤S3制得的K562外泌体，持续培养；
C.扩增培养：
待500mL活化培养基用完后，再补加增值培养基，控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
实施例3、一种外泌体激活NK细胞的培养方法
S1.K562细胞培养：将基因修饰过的K562-IL21工程细胞，用DMEM/F12培养基+5％胎牛血清进行细胞的扩增培养，2～3天传代一次；
S2.K562细胞促外泌体分泌：将步骤S1扩增后的K562细胞按1～2*106/mL的密度至T75瓶，接着添加促外泌体分泌营养液进行培养，2～3天收集一次上清液，同时再次补充同等量的促外泌体分泌营养液，继续收集上清，共收集2次，得上清液；
所述促外泌体分泌营养液由15mL DMEM/F12培养基、10ng/mL人血小板衍生生长因子BB、20mg/mL促红细胞生成素和20mg/mLγ干扰素混合组成；
S3.K562细胞外泌体提取与纯化：将步骤S2制得的上清液在速度为2000g的条件下离心30min，弃沉淀，得过滤液，接着加入乙酸调pH至5，加入浓度为24％(m/v)的PEG6000溶液，所述24％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:1进行添加，接着放4℃冰箱沉降过夜，次日离心，弃上清，生理盐水重悬沉淀，接着加入浓度为15％(m/v)的PEG6000溶液二次沉降，所述15％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:50进行添加，接着再次离心，沉降的产物用生理盐水重悬，得K562外泌体；
S4.NK细胞活化、扩增培养：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，1000g离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭火30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭火的血浆降温至4℃，经1200g离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液12.5mL，再加入稀释重悬后的血液25mL，配平后600g离心30min，升降速调至最低；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再300g离心10min，获得单个核细胞(PBMC)；
B.活化培养：
a.培养瓶包被，T75瓶，加50ng/mL的CD16单抗和50ng/mL的CD3单抗，平铺底部，在37℃的条件下放置2h或4℃过夜；
b.用免疫细胞培养基配制活化培养基和增值培养基：
取500mL康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2制得活化培养基，
在康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2制得增值培养基；
c.取出包被的培养瓶，倒掉包被液，用PBS清洗1遍，将步骤A制得的单个核细胞加入活化培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于20mL；
d.重悬的单个核细胞转入已包被的培养瓶，加入2*108/mL的步骤S3制得的K562外泌体和10％的自体灭火血浆；
e.前2天静置培养，第3天，补加20mL活化培养基和5％自体灭火血浆，后面根据细胞增值情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加1*108/mL的步骤S3制得的K562外泌体，持续培养；
C.扩增培养：
待500mL活化培养基用完后，再补加增值培养基，控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
试验例一、对比试验
1、试验方法：
参考实施例3的外泌体激活NK细胞的培养方法，以外周血或脐血为材料，通过淋巴细胞分离液获得单个核细胞(PBMC)，将获得的PBMC均分4组，细胞量为5*107，分组测试培养，具体分组如下：
组1：K562饲养层细胞培养NK细胞
①培养的K562细胞经辐照灭活处理，与PBMC按1：1进行混合，加10％血浆，接种T75瓶，体积20mL；
②根据细胞增值情况，补加免疫细胞培养基及1％～5％的血浆；
③持续培养至第7天，取样计数，补加同等数量辐照灭活处理的K562细胞，继续培养；
④继续根据细胞增值情况补加免疫细胞培养基，培养至14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
组2：纯因子法培养NK细胞
①培养基配制：500mL康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和IL-2，为培养基1；
康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2，为培养基2；
②CD3和CD16单抗按50ng/mL包被T75瓶，体积5mL，放37℃包被2h；
③包被后，弃包被液，加PBS清洗一遍，5*107个PBMC，加入18mL培养基1和2mL灭活的血浆混匀细胞，转入培养瓶，再加入1000IU/mL的IL-21，放二氧化碳培养箱培养；
④根据细胞增长情况，先补加完培养基1，再用培养基2，每次补液补加1～5％的血浆；持续培养14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
组3：K562外泌体(1*108/ml)+因子组合培养NK细胞(本发明实施例1)
①培养基配制：500mL康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和IL-2，为培养基1；
康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2，为培养基2；
②CD3和CD16单抗按50ng/ml包被T75瓶，体积5mL，放37℃包被2h；
③包被后，弃包被液，加PBS清洗一遍，5*107个PBMC，加入18mL培养基1和2mL灭活的血浆混匀细胞，转入培养瓶，再加入1*108/mL的K562细胞外泌体，放二氧化碳培养箱培养；
④根据细胞增长情况，先补加完培养基1，再用培养基2，每次补液补加1～5％的血浆；第7天补液，同时补加0.5*108/ml的K562细胞外泌体，持续培养至14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
组4：K562外泌体(5*108/ml)+因子组合培养NK细胞(本发明实施例2)
①培养基配制：康宁的KBM581的500mL免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和IL-2，为培养基1；
康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2，为培养基2；
②CD3和CD16单抗按50ng/ml包被T75瓶，体积5ml，放37℃包被2h；
③包被后，弃包被液，加PBS清洗一遍，5*107个PBMC，加入18mL培养基1和2mL灭活的血浆混匀细胞，转入培养瓶，再加入5*108/mL的K562细胞外泌体，放二氧化碳培养箱培养；
④根据细胞增长情况，先补加完培养基1，再用培养基2，每次补液补加1-5％的血浆；第7天补液，同时补加2*108/mL的K562细胞外泌体，持续培养至14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测；
组5：K562外泌体(2*108/ml)+因子组合培养NK细胞(本发明实施例3)
①培养基配制：500mL康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和IL-2，为培养基1；
康宁的KBM581的免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2，为培养基2；
②CD3和CD16单抗按50ng/ml包被T75瓶，体积5ml，放37℃包被2h；
③包被后，弃包被液，加PBS清洗一遍，5*107个PBMC，加入18mL培养基1和2mL灭活的血浆混匀细胞，转入培养瓶，再加入2*108/mL的K562细胞外泌体，放二氧化碳培养箱培养；
④根据细胞增长情况，先补加完培养基1，再用培养基2，每次补液补加1～5％的血浆；第7天补液，同时补加1*108/mL的K562细胞外泌体，持续培养至14天，收集细胞，分别进行细胞计数和流式检测。
其中：
(1)细胞计数：采用细胞计数器进行测定，
(2)流式检测：分别取各组成熟NK细胞2*10^6个左右，各分成2管；细胞清洗后，1管阴性对照，1管加入流式抗体CD3-FITC、CD16-APC、CD56-PE，孵育20分钟，上流式细胞仪进行流式检测。
2、试验结果：
2.1、细胞计数检测结果如表1和图1所示。
2.1.1、细胞计数结果如表1所示：
表1细胞计数结果
Figure BDA0004125959440000121
2.1.2、细胞增值曲线图如图1所示。
从表1和图1的细胞增值情况可以看出，组2的纯细胞因子培养NK在增值能力上是不及其他组别。
2.2、流式检测结果如表2和图2～图6所示。
2.2.1、细胞流式检测结果如表2所示：
表2细胞流式检测结果
组别 组1 组2 组3 组4 组5
CD3-(CD16+CD56+) 88.59％ 72.20％ 89.76％ 90.73％ 92.28％
2.2.2、细胞流式图如图2～图6所示，其中，组1的细胞流式图如图2所示，组2的细胞流式图如图3所示，组3的细胞流式图如图4所示，组4的细胞流式图如图5所示，组5的细胞流式图如图6所示。
从细胞流式结果可知，组1饲养层细胞组和组3、4、5，NK效应细胞比例达到90％左右，而组2的纯因子方法，NK效应细胞比例不足80％，说明本发明提供的外泌体激活NK细胞的培养方法获得的NK细胞纯度达到甚至超过饲养层细胞培养方案，明显优于纯因子培养方案。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.K562细胞培养：将基因修饰过的K562-IL21工程细胞，用DMEM/F12培养基+5％胎牛血清进行细胞的扩增培养，2～3天传代一次；
S2.K562细胞促外泌体分泌：将步骤S1扩增后的K562细胞按1～2*106/ml的密度至T75瓶，接着添加促外泌体分泌营养液进行培养，2～3天收集一次上清液，同时再次补充同等量的促外泌体分泌营养液，继续收集上清，共收集2次，得上清液；
S3.K562细胞外泌体提取与纯化：采用PEG6000溶液对步骤S2制得的上清液进行外泌体纯化处理，得K562外泌体；
S4.NK细胞活化、扩增培养：从外周血或脐血中分离出单个核细胞，接着加入步骤S3制得的K562外泌体活化培养0～7天，然后扩增培养7～14天，即得。
2.如权利要求1所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的促外泌体分泌营养液由DMEM/F12培养基、人血小板衍生生长因子BB、促红细胞生成素和γ干扰素混合组成。
3.如权利要求2所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的促外泌体分泌营养液由15mL DMEM/F12培养基、10ng/mL人血小板衍生生长因子BB、20mg/mL促红细胞生成素和20mg/mLγ干扰素混合组成。
4.如权利要求1所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S3中K562细胞外泌体提取与纯化的具体步骤为：
将步骤S2制得的上清液在速度为2000g的条件下离心30min，弃沉淀，得过滤液，接着加入乙酸调pH至4～5，加入浓度为24％(m/v)的PEG6000溶液，放4℃冰箱沉降过夜，次日离心，弃上清，生理盐水重悬沉淀，接着加入浓度为15％(m/v)的PEG6000溶液二次沉降，再次离心，沉降的产物用生理盐水重悬，即得。
5.如权利要求4所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述24％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:1进行添加，所述15％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:50进行添加。
6.如权利要求1所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S4中NK细胞活化、扩增培养的具体步骤为：
A.单个核细胞的分离：
a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，1000g离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭火30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；
b.灭火的血浆降温至4℃，经1200g离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；
c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液12.5mL，再加入稀释重悬后的血液25mL，配平后600g离心30min，升降速调至最低；
d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再300g离心10min，获得单个核细胞；
B.活化培养：
a.培养瓶包被，T75瓶，加50ng/mL的CD16单抗和50ng/mL的CD3单抗，平铺底部，在37℃的条件下放置2h或4℃过夜；
b.用免疫细胞培养基配制活化培养基和增值培养基；
c.取出包被的培养瓶，倒掉包被液，用PBS清洗1遍，将步骤A制得的单个核细胞加入活化培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*106/mL，体积不大于20mL；
d.重悬的单个核细胞转入已包被的培养瓶，加入步骤S3制得的K562外泌体和10％的自体灭火血浆；
e.前2天静置培养，第3天，补加20mL活化培养基和5％自体灭火血浆，后面根据细胞增值情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加步骤S3制得的K562外泌体，持续培养；
C.扩增培养：
待500mL活化培养基用完后，再补加增值培养基，控制补液后NK细胞密度不低于1*106/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。
7.如权利要求6所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述B.活化培养中步骤b的培养基配制为：取500mL免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2制得活化培养基，在免疫细胞培养基加入1000IU/mL的IL-2制得增值培养基。
8.如权利要求6所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述B.活化培养中步骤d的K562外泌体的添加量为1～5*108/mL。
9.如权利要求6所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述B.活化培养中步骤e的K562外泌体的添加量为0.5～2*108/mL。
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